Summary
דלקת של רקמות עם וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) ex-vivo מספק דגם תלת-ממד חשוב של וירוס פתוגנזה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לעבד, להדביק דגימות רקמות מן האדם את השקדים mucosae באברי המין הנשי עם HIV-1 ולשמור אותם בתרבות-הממשק נוזלי-אייר.
Abstract
Histocultures אפשר ללמוד אינטראקציות המערכת בתוך רקמות אנושיות, הם יכול להיות מועסק כדי דגם אינטראקציות פתוגן-פונדקאי בתנאי מעבדה מבוקרת. Ex-vivo זיהום של רקמות עם וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV), בין וירוסים אחרים, שימש בהצלחה לחקור מוקדם בפתוגנזה של המחלה, כמו גם פלטפורמה כדי לבדוק את יעילות ורעילות של תרופות אנטי. בפרוטוקול הנוכחי, נסביר כיצד לעבד, להדביק עם HIV-1 explants רקמת השקדים אנושי, mucosae צוואר הרחם וכן לשמור על אותם בתרבות מעל ג'לטין ספוגים-הממשק נוזלי-אייר למשך שבועיים בערך. הגדרה זו תרבות שאינם מקוטב הגדלת גישה המזינים תרבות בינונית, חמצן, למרות אובדן הדרגתי של רקמות תקינות וארכיטקטורות פונקציונלי נשאר הגבלה הראשי שלה. שיטה זו מאפשרת פיקוח על שכפול HIV-1 ו פתוגנזה בעזרת מספר טכניקות, כולל immunoassays, qPCR של cytometry זרימה. חשיבות, ההשתנות הפיזיולוגיות בין רקמות תורמים, ובין explants מאזורים שונים של הדגימה זהה, עלול להשפיע באופן משמעותי על תוצאות הניסוי. כדי להבטיח תוצאה הפארמצבטית, זה קריטי להשתמש מספר explants, משכפל טכני והתנאים מתאימים התורם שליטה לנרמל את התוצאות של טיפולים ניסיוניים בעת הידור נתונים ניסויים מרובים (כלומר ., מתנהל באמצעות רקמות מתורמים שונים) לשם ניתוח סטטיסטי.
Introduction
תרביות תאים דו מימדית סוג, התייחס כאן כמו קונבנציונאלי, לא חשבון התקשורת המרחבית ופונקציונליים בין מגוון גדול של סוגי תאים שמרכיבים רקמות ואיברים. היבט זה הוא בחשיבות עליונה עבור גרסאות ניסיוניות של מחלות, כמו הפרעה homeostatic אינטראקציות המערכת היא הגורם המניע של כל פתולוגיות. רקמת explants מציעים יתרונות חשובים עבור מידול בריאות ומחלות בבני כי הם שומרים את cytoarchitecture והיבטים רבים חשוב פונקציונלי של איברים כמו הם ויוו, למרות כמות מוגבלת של זמן1. לדוגמה, בעת שמחוץ אתגר עם אנטיגנים האחזור, כגון דיפתריה טוקסואידי או טטנוס טוקסואידי, רקמת השקדים מגיב עם הפקה נמרצת של אנטיגן ספציפי נוגדנים2. כמו שמחוץ מודל אחר, histoculture יש מגבלות משלו: התורם בין השתנות, קיטוב רקמות, רקמות מוגבל הישרדות, הקושי ניטור תאי מעבר עומק מיקרוסקופיה קונפוקלית1. למרות זאת, רקמה אנושית explants נשארים מודל של הבחירה ללמוד תהליכים אימונולוגי homeostatic פתוגניים בבני אדם, כולל אינטראקציות פתוגן-פונדקאי, התערבויות טיפוליות אפשריות3.
האירועים הקריטיים של פתוגנזה HIV-1 מתקיימים ברקמות. דלקת של רירית איברי המין חשבונות עבור הרוב המכריע של כל HIV-1 שידור אירועים ברחבי העולם4. רקמות הלימפה נמצא האתר העיקרי של וירוס שכפול במהלך זיהום אקוטי בנמלים מאגר משמעותי של תאים הנגועים לחשוף5ו ההתמדה שלהם מייצג את המכשול העיקרי להשגת התרופה6. האתגר תרבות, ex-vivo של רקמות הלימפה ואת הרירית לספק כמה יתרונות לעומת מערכות קונבנציונאלי המבוסס על תאים מבודדים עבור המחקר של HIV-1. למשל, שוכנת רקמת תאים יכול לתמוך זיהום ב- HIV-1 בהיעדרו של הפעלה אקסוגני, לעומת תאי תאי דם היקפיים1. השימוש של רקמת הלימפה explants אפשרה הבנה טובה יותר של כמה מנגנונים מרכזיים שבבסיס CD4 T תא דלדולכלומר, אפקט הצופה מהצד7, וזה סימן ההיכר של דלקת חריפה. שימור מבנים כמו תא B זקיקי הלימפה ברקמות8 ו האפיתל רירית איברי המין הנשי explants9 מציע הזדמנות ייחודית לשלב תכונות המרחבי פונקציונלי של זיהום ב- HIV-1 באתרים אלה. לבסוף, histocultures שימשו בהצלחה מודל המחקר HIV-1 וההרפס ושיתוף הידבקות10,11, כמו גם לניסויים פרה של antiretrovirals ו multitarget microbicides12, 13 , 14 , 15.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור התרבות של רקמה אנושית explants המתקבל השקדים ורקמות הרירית מ נמוך יותר בדרכי המין הנשי (צוואר הרחם), כיסוי לנתיחה רקמות כדי explant אתגר עם HIV-1 בדרך הלא מקוטב. התרבות של רקמת explants-הממשק אוויר נוזלי, בעזרת ג'לטין ספוגים כמשענת, הגדלת החשיפה מהאוויר חמצן תוך מתן גישה תרבות בינוני חומרים מזינים באמצעות הספוג נימים, ובכך לעכב את הריקבון הטבעי שלהם. הדרך המיידית ביותר להערכת שכפול HIV-1 במערכת שלנו היא למדוד את כמות וירוס שפורסם המדיום תרבות explant לאורך זמן על-ידי מתכלה או qPCR. זיהום ב- HIV-1, פתוגנזה (למשל., דלדול תאי CD4 T) גם ניתן להעריך רקמת explants על-ידי בצובר מיצוי RNA/DNA ו- qPCR, בחיי עיר מכתים או תא בודד-אנליזה על עיכול רקמת מאת cytometry זרימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול עבור אוסף של רקמות עשויים לדרוש אישור מוסרי על ידי הרשויות המוסמכות מקומיים. במקרה של ניתוחים המצוין כגון ניתוח שקדים, כריתת רחם, הדגימות לא שנאספו במיוחד לצורך המחקר, המחקר אינו נחשב ניסויים מחקר (המכון הלאומי לבריאות. מחקר בנושאים האנושית. https://humansubjects.nih.gov/walkthrough-investigator#tabpanel11). עם זאת, קבלת נתונים אישי וטיפול רפואי רקמות התורמים (למשל., מין, גיל, שימוש בסמים הנוכחי, היסטוריה של דלקות, וכו ') זה עשוי לעזור לפרש תוצאות ניסויית, תנוחות חששות לגבי מדעת ופרטיות זה צריך להיות התייחס בפרוטוקול לאיסוף רקמות.
התראה: במהלך כל התהליך צריך להתבצע בבטיחות ביולוגית ארון. כל דגימות האנושי, כולל אלה אנשים "בריאים", ייתכן הנמל מדבקים. המפעיל צריכים לקבל הכשרה לעבוד עם נישא בדם פתוגנים להתמודד בבטחה דגימות רקמה, אפילו אם הניסויים לא לערב את השימוש ב- HIV. הערכת סיכונים של ההליך של רקמות לנתיחה, זיהום בנגיף ה-HIV צריכה להתבצע על ידי צוות מיומן כדי להבטיח את שלומם של המפעיל, עמיתים לעבודה. השימוש של HIV זיהומיות דורשת אבטחה ייעודי רמה 2 או 3 סביבות בהתאם המדינה והתקנות המכון ספציפי על ביולוגים. מסוכנים, נישא בדם פתוגנים.
1. הכנת ספוגים ג'לטין
הערה: למרות שזה לא הכרחי להכין את הג'לטין ספוגים לפני ניתוח רקמה, זה יותר נוח לעקוב אחר סדר המתוארים כאן, במיוחד בעת טיפול כמות גדולה של רקמות ו/או מתורמים רבים.
- להכין תרבות בינוני (ס מ), משלימים את זה עם פתרון לאנטיביוטיקה (Tircacillin-clavulanate mix) לפני השימוש כדי להפוך CMT (טבלה של חומרים). למחוק את כל שאריות פתרון לאנטיביוטיקה.
הערה: Ticarcillin ו- clavulanate ב- CMT יציבים לקוי. אם יש צורך, מחדש תוספת CMT עם פתרון אנטיביוטי לאחר כ 24 שעות של הכנה. לא נדרש להוסיף פתרון אנטיביוטי explant בינוני כל 24 שעות במהלך תרבות. - מילוי של 100 מ מ x 20 מ מ פטרי עם בערך 20-30 מ של CMT.
הערה: הגדרה זו היא אופטימלית כדי להכין מספיק ספוגים ג'לטין שתי צלחות 6-ובכן או לוח 12-ובכן אחד באותו הזמן. אם הצלחות רבות נדרשים, השתמש רחב יותר פטרי בעלת נפח גדול של CMT כדי להאיץ את ההכנות. - להעביר את sponge(s) הג'לטין לתוך הפטרי באמצעות מלקחיים סטרילי. להרטיב את הספוגים משני הצדדים ולאפשר את הספוגים לספוג בינונית עבור מינימלית 1 הקש את הספוגים בתחתית הפטרי למשך כ 2 דקות בעזרת מרית סטרילי.
הערה: השלב זה חשיבות מכרעת כי הנוכחות של בועות אוויר בתוך הספוג יחסום את נימי הדם דרך אשר מזינים תרבות בינונית להגיע הרקמה. ג'לטין ספוגים שבירות מאוד כשהוא מיובש. דחף בעדינות על הספוג עם המרית, במיוחד בהתחלה, כדי למנוע שבירת הספוג. - שימוש סטרילי מספריים כדי לגזור את הספוגים ולמיומנות הג'לטין לחתיכות בגודל זהה של 1 ס מ2. העברת 1 חתיכת ספוג באמצעות מלקחיים לתוך כל טוב של צלחת תרבות. להוסיף 3-4 מ של CMT לבאר כל צלחת 6-טוב (שקדים), 1 מ"ל לכל טוב על פלטה 12-טוב (צוואר הרחם). מקם את הצלחות בחממה, להגדיר ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, ≥ 90% לחות, עד explants הרקמה הם מוכנים להיות טעון על הספוגים.
הערה: הנפח של CMT להוסיף לתוך הצלחת צריך להתאימו כך עובי הספוג כדי לשמור על explants את הממשק נוזלי-אייר.
2. ניתוח השקדים רקמה אנושית
הערה: השקדים תעובד בהקדם האפשרי לאחר הניתוח, אידיאלי באותו היום של הניתוח. לחלופין, דגימות יכול להיות שמאל CMT המשוקע ב לילה ב 4 º C.
- לאפשר את ס מ מספיק זמן להגיע לטמפרטורת החדר (RT) או לשים בתוך אמבט המים מראש חימם ב 37 º C. תוספת של ס"מ עם פתרון לאנטיביוטיקה (CMT) לפני השימוש. להתעלם כל פתרון לאנטיביוטיקה נשאר. שופכים 70% אתנול פתרון לתוך מיכל נקי לספוג מלקחיים ואזמל בכל פעם שיש צורך במהלך ההליך לנתיחה. לנקות את הכלים ולשנות את הלהב האזמל בין ניתוח של דגימות מתורמים שונים.
- להעביר את השקדים מהגורם תחבורה 100 מ מפטרי המכיל 10-20 מ של CMT באמצעות מלקחיים סטרילי.
הערה: דגימות עם אזורים נרחבת של נצרבו, ארור, או רקמת נמק צריכים להיות מושלך. - להשתמש את המכסה של הפטרי משטח חיתוך לנתח רקמות. מחזיק את הרקמה בעדינות עם מלקחיים, וחותכים כל שקדים כמה חתיכות גדולות באמצעות אזמל סטרילי ולהב.
התראה: טיפול בכלים חדים לנתח דגימות האנושי מגביר את הסיכון לפציעה וזיהום. המפעיל לשקול לובש מתכת, רשת, בהיפרבולואיד בתור הגנה נוספת. - הסר צרב, דם, רקמות שרירנים ואת כל חלקים המכילים tonsilloliths (חומר מסויד) ו/או בצבע ירוק-חום באמצעות מלקחיים ואזמל.
הערה: בעת עבודה על פיסת רקמה אחת, חשוב לשמור את שארית הרקמה שקועים בינוני כדי להימנע רקמות לייבוש. - חותכים כל פיסת רקמה לפרוסות כ- 2 מ מ עובי. להסיר כל חלק לא רצויים כמו השלב הקודם. חותכים את הפרוסות רקמות לרצועות בעובי מ מ 2. חותכים את רצועות רקמות 2 רחובות מ מעבה. זה אמור לגרום רקמת explants של בערך 8 מ מ3.
- להעביר את explants לתוך צלחת פיטרי 100 מ מ חדש המכיל 10 – 20 מ של CMT להימנע רקמות לייבוש תוך המשך הקרע. בסופו של ניתוח, מערבולת בלוח אקראי ההתפלגות explant. מקום 9 רקמת explants על גבי כל ספוג הג'לטין לתוך צלחת 6-ובכן באמצעות מלקחיים, ומאפשר שביניהם. להחזיר את הצלחות החממה.
הערה: בדרך כלל, explants מתורבתים בן לילה, חיסון של תרבויות עם HIV-1 מבוצעת למחרת. זה כדי לוודא כי אין חשש לזיהום חיידקי או פטרייתי מפתחת בתרבות. בנוסף, תאים נוטות ליציאה רקמת השקדים explants לאחר ניתוח. תהליך זה הושלם ברובו בתוך 24 השעות הראשונות של תרבות1. - השלך כל פסולת ביולוגית במיכלים apposite לפי התקנות של המכון על טיפול ביולוגים מסוכנים את הערכת הסיכונים הספציפיים.
3. דלקת של רקמת השקדים Explants עם HIV-1
הערה: כדי לצמצם את התוצאה השתנות בין ניסויים עצמאית, הכנת וירוס אותו אמור לשמש למחקר שלם. וירוס יכול להיות מופצות בתאי תאי דם היקפיים exogenously מופעל, אז התרבות supernatant יכול להיות aliquoted עבור אחסון ב- 80 ° C כדי להימנע חוזרות הקפאה והפשרה של (טבלה של חומרים).
- לשים את ס מ בתוך אמבט מים להתחמם מראש ב- 37 מעלות צלזיוס. תוספת של ס"מ עם פתרון לאנטיביוטיקה (CMT) לפני השימוש. למחוק את כל שאריות פתרון לאנטיביוטיקה.
- תשאף המדיום, plate(s) 6-ובכן עם פיפטה וזורקים אותו במיכל עם פתרון החיטוי. להטות את הצלחת ודחף בעדינות את הספוגים ג'לטין על חלקו העליון של הבאר כדי לאפשר המדיום לאסוף בתחתית, ואת תשאף ולמחוק אותו. להוסיף 3-4 מ"ל של CMT מכל קידוח.
- להפשיר את הכנת וירוס HIV-1 באמבט מים בטמפרטורה 37 º c במידת הצורך, לדלל את המניה וירוס עם ס מ (טבלה 1).
הערה: וירוס המניה צריך להיות מדולל כך inoculum הנבחר נכלל נפח של 5-8 µL (טבלה 1). זיהום יעיל, חיוני להשתמש את הזמן המינימלי הנדרש בין מפשיר ההכנה HIV-1. ולהדביק רקמות explants. - Pipette את inoculum וירוס ישירות על גבי כל אחת explants 9 בספוג ג'לטין. להחזיר את plate(s) החממה ברגע הזיהום הושלמה. להתעלם כל הכנת וירוס שיורית. המשך סעיף 5.
הערה: כדי למסור במדויק inoculum וירוס המפעיל לשקול בטכניקה הפוכה pipetting ולשנות את עצת עבור כל טוב. פעולה זו כרוכה דוחף את הבוכנה פיפטה אל המיקום מחק לצמיתות (התחנה השנייה) להכין את inoculum וירוס, דוחפים לעצור את הראשון כדי לספק את inoculum, אשר מסייע היווצרות בועה למזער את השגיאה המשויכים דגימה חוזרת ונשנית של קטן אמצעי אחסון, קרי, µL 5-8.
4. ניתוח, זיהום של הרחם רירית צוואר הרחם
הערה: לקבלת תוצאות אופטימליות, explants של צוואר הרחם mucosae צריך להיות מעובד, נגוע בהקדם האפשרי לאחר הניתוח, אידיאלי באותו היום של הניתוח. לחלופין, דגימות ניתן לאחסן המשוקע ב- CMT-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה, נגוע מיד לאחר ניתוח.
- לאפשר את ס מ מספיק זמן כדי להגיע RT או לשים את זה בתוך אמבט המים מראש חימם ב 37 º C. תוספת של ס"מ עם פתרון לאנטיביוטיקה (CMT) לפני השימוש. למחוק את כל שאריות פתרון לאנטיביוטיקה. שופכים 70% אתנול פתרון לתוך מיכל נקי לספוג את המלקחיים ואזמל בכל פעם שיש צורך במהלך ההליך לנתיחה. לנקות את הכלים ולשנות את הלהב האזמל בין ניתוח של דגימות מתורמים מרובים.
- בעזרת מלקחיים סטרילי, להעביר את הדגימה מהגורם תחבורה לתוך 100 מ מ המכיל 10 – 20 מ של CMT צלחת פטרי.
- להשתמש את המכסה של הפטרי משטח חיתוך לנתח את הרקמה. מחזיקה את הרקמה בעדינות עם מלקחיים, להפריד במסווה סטרומה רירית ectocervix ו/או endocervix, שקוף למחצה (submucosa) עם האזמל, להב להשיג רצועות של רירית.
הערה: בעת עבודה על פיסת רקמה אחת, חשוב לשמור את שארית הרקמה שקועים בינוני כדי להימנע רקמות לייבוש. - חתוך את רירית לרצועות ברוחב מ מ 2, להסיר ולמחוק submucosa רב ככל האפשר, משאיר רק 2 מ מ בעובי שכבה של רקמה. חותכים את הרצועות 2 רחובות מ מעבה. זה אמור לגרום רקמת explants של בערך 8 מ מ3.
התראה: טיפול בכלים חדים לנתח דגימות האנושי מגביר את הסיכון לפציעה וזיהום. המפעיל לשקול לובש מתכת, רשת, בהיפרבולואיד בתור הגנה נוספת. - העברת רקמות explants לתוך צלחת פיטרי 100 מ מ חדש המכיל 10 – 20 מ של CMT להימנע רקמות לייבוש תוך המשך הקרע. בסופו של ניתוח, מערבולת בלוח אקראי ההתפלגות explant.
- עם מלקחיים סטרילי, להעביר את explants לתוך צינור חרוטי 1.5-mL סטרילי (מרבי explants 16 למחזור). הסר כל מדיום בצינור באמצעות פיפטה.
- להפשיר את ההכנה HIV-1 באמבט מים בטמפרטורה 37 º c במידת הצורך, לדלל את המניה וירוס עם ס מ. העברת הנגיף לתוך צינור המכיל את explants. להתעלם כל הכנת וירוס שיורית.
הערה: וירוס המניה צריך להיות מדולל כך inoculum הנבחר נכלל נפח של מינימום 0.5 mL (טבלה 1). כדי לצמצם את התוצאה השתנות בין ניסויים עצמאית, הכנת וירוס אותו אמור לשמש למחקר כולו (טבלה של חומרים). - העברת הצינורות לתוך התרמו-מטרף, תקופת דגירה של 2 h ב 37 מעלות צלזיוס נדנדה-300 סל ד. בעדינות היפוך הצינורות כמה פעמים כל 30-60 דקות.
הערה: עבור דלקת יעיל, זה קריטי להשתמש את הזמן המינימלי הנדרש בין מפשיר ההכנה HIV-1 לבין העברת הצינורות 37 מעלות צלזיוס. - למלא צלחת 6-ובכן עם 3-4 מ"ל לכל טוב של פוספט סטרילי מאגר תמיסת מלח (PBS). -של הדגירה HIV-1, למחוק את כל ההכנה וירוס ב צינור לתוך מכולה עם פתרון חיטוי באמצעות פיפטה של. להעביר את explants המשקולת 6-ובכן, המכיל PBS באמצעות מלקחיים.
- לאפשר את explants לנוח ב- PBS 1 דקות ב- RT, ולאחר מכן לשטוף אותם על ידי בעדינות pipetting שיהיה מגניב לתוך הבאר 2 - 3 פעמים. למחוק את PBS לתוך מכולה עם פתרון חיטוי באמצעות פיפטה. להוסיף 3-4 מ"ל של PBS החדש בכל טוב. חזור עוד פעמיים על סכום כולל של שלושה שוטף. למחוק את PBS רק לפני העברת את explants הספוגים להימנע רקמות לייבוש.
הערה: Explants של רירית צוואר הרחם, ובשנת endocervix מסוים, לשחרר כמות גדולה של ריר במהלך זיהום. זה חיוני כדי לשטוף ולהסיר כמה שיותר ריר ככל האפשר כי השמירה לא ספציפי על explants ועל שחרור עוקבות של וירוסים לתוך תרבות תגובת שיקוע מטשטשים את שכפול הוירוס. - באמצעות מלקחיים, להעביר 5-8 explants על גבי כל ספוג הג'לטין לתוך צלחת 12-. טוב. להחזיר את הצלחת החממה.
- השלך כל פסולת ביולוגית במיכלים apposite לפי התקנות של המכון על טיפול ביולוגים מסוכנים את הערכת הסיכונים הספציפיים.
5. Histoculture
- לשנות את ס מ כל 3 ימים החל מהפעם של זיהום עד יום 12-15 לאחר הפגיעה. ניתן לטעום את ס מ ו/או explants במרווחים קבועים לאורך כל הזמן תרבות כדי להעריך את שכפול HIV-1, בין פרמטרים אחרים.
- לשים את ס מ בתוך אמבט מים להתחמם מראש ב- 37 מעלות צלזיוס.
הערה: זה לא נדרש כדי להשלים את ס"מ עם פתרון אנטיביוטי בשלב זה. - לאסוף דגימה של ס מ עם פיפטה ולהעביר אותו לתוך סטרילי 1.5 או 2 מ"ל פקקי בורג צינור עבור אחסון ב- 80 ° c
הערה: ס מ שכפול בארות הם איחדו באוסף. - קציר הרקמה explants עם מלקחיים סטרילי, להסיר את המדיום עודף על explants על ידי הצבת אותם על פיסת נייר (אופציונלי) ולאחר העברת explants לתוך סטרילי 1.5 או 2 מ"ל פקקי בורג צינור. לעבד או לאחסן את דגימות רקמה כנדרש על ידי הניסוי.
הערה: עבור cytometry זרימה, explants מיד מתעכלים עם קוקטייל אנזימטי לקבל השעיה תא בודד (לקבלת יותר פרטים ראה הפניות 1, 9, 16 ו- 17). לחילוץ RNA, explants שמרו על פיתרון ייצוב RNA ב 4 ° C בלילה לפני אחסונם ב-80 מעלות צלזיוס. הפקת דנ א או ב באתרו מכתים (צוואר הרחם), explants יכול להיות snap-קפוא נוזל חנקן או קרח יבש/אתנול slurry ומאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס. לחלופין, ניתן לתקן explants השקדים באמצעות ועלייתו פתרון של paraformaldehyde PBS ו- 4% עבור בחיי עיר מכתים. - האחות של ס מ שיורית הבאר עם פיפטה ולמחוק את זה לתוך מיכל עם פתרון החיטוי. להטות את הצלחת ואת דחף בעדינות את הספוגים ג'לטין על חלקו העליון של הבאר כדי לאפשר המדיום לאסוף בתחתית, ואז האחות, למחוק אותו.
- להוסיף מ ל 3-4 ס מ מכל קידוח. בעזרת מלקחיים סטרילי, להחזיר שכל רקמות explants זה נפל לתוך המדיום כדי בספוג ג'לטין. להחזיר את הצלחת החממה.
- בקצה של תרבות, השלך כל פסולת ביולוגית במיכלים apposite לפי התקנות של המכון על טיפול ביולוגים מסוכנים את הערכת הסיכונים הספציפיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניתן להשתמש במספר טכניקות כדי להעריך את שכפול HIV-1 ברקמות explants. Read-out הסטנדרטי שלנו היא למדוד את כמות HIV-1 p24מחסום פה שיצא בס מ לאורך זמן עם מתכלה18.
רקמת explants מתורמים שונים, נגוע את inoculum באותה המניה HIV-1 זהה, תניב כמויות שונות של וירוס (טבלה 1). זאת בשל מספר גורמים, כגון המספר ואת המצב של התאים היעד HIV-1 ואת נוכחותם של שיתוף מדביק פתוגנים16,רקמת19. איור 1, אנו מספקים דוגמה של זיהום ב- HIV-1 שנכשל ויצרני של רירית צוואר הרחם explants כפי שהוגדרו על ידי כמות p24מחסום פה שיצא בס מ לעומת מתאימים התורם explants שטופלו את lamivudine הסמים תרופתי (3TC) זה לגמרי העלמת שכפול HIV-1. למרות פקד זה נראה מיותר עבור דלקת של רקמת explants מהתורם א', זה עוזר להפלות שנכשל (ב) מפני הידבקות פרודוקטיבי (ג) ב- explants כי תשואות רמות נמוכות של שכפול HIV-1.
השימוש של תרופה תרופתי כתנאי שליטה יכול להיות שימושי ללמוד HIV-1 דלקת ברקמות זה הנמל המספרים הנמוכים של היעד תאים, כמו רירית צוואר הרחם, ועל ידי שימוש איטי-שכפול HIV-1 גרסאות, כגון קצת מבודד העיקרי. בנוסף, בשביל לרקמות נגוע וירוסים כאלה, חשוב לשקול שימוש בשיטות זיהוי רגיש יותר, למשל qPCR.
איור 1 : שכפול HIV-1 ברירית צוואר הרחם explants מתורמים רקמות שונות שלוש. . בדקנו רקמות צוואר הרחם explants היו נגועים עם inoculum זהה של HIV-1BaL ועלייתו במלאי וירוס ותרבותית במשך 15 ימים נוכחות או העדר lamivudine סמים תרופתי (3TC)-ריכוז 10 מיקרומטר. תרבות בינוני כל 3 ימים ודוגמאות מבארות שכפל היו איחדו אוסף לניתוח של שכפול HIV-1 על ידי HIV-1 p24מחסום פה מתכלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| סוג הרקמה | וירוס | Inoculum לכל explant (עמוד של HIV-1 p24מחסום פה) | לא. של explants | נפח בינוני תרבות (mL) | לא. של בארות (משכפל טכני) | HIV-1 p24מחסום פה הפקה (ng/mL) |
| השקדים | HIV-1BaL | 350-500 | 9 | 3-4 | 2-3 | 1 – 10 |
| HIV-1LAI.04 | 9 | 3-4 | 2-3 | 1 – 100 | ||
| צוואר הרחם | HIV-1BaL | 1500-2000 | 8 | 1 | 2 | 1 – 5 |
| HIV-1LAI.04 | 8 | 1 | 2 | לא ניתן לגילוי |
טבלה 1: מפנה לערכים של HIV-1 inoculum עבור דלקת של רקמות explants והפקה וירוס. הערך של HIV-1 inoculum לכל רקמות בודדים explant מתייחס וירוס מניות בהריכוז של 50 – 70 ננוגרם למ"ל: נפח של µL 7 של וירוס מדולל מניות משמש כדי להדביק את כל explant השקדים מעל בספוג ג'לטין; נפח של 500 µL של וירוס מדולל מניות משמש כדי להדביק את 16 explants צוואר הרחם על ידי ועלייתו צינור 1.5 מ. Explants צוואר הרחם בהרחבה נשטפים ב- PBS לפני העברתן אל ספוגים ג'לטין. הערך של HIV-1 הייצור על ידי רקמת explants מתייחס הסכום המצטבר של p24מחסום פה שפורסמו על ידי explants 8 ב- 1 מ"ל (צוואר הרחם), או explants 9 ב 3-4 מ ל (שקדים) של תרבות בינוני (ס מ) לטעום כל 3 ימים במשך 12-15 ימים של תרבות. ס מ שכפל וולס הוא אספו אוסף עבור כל נקודת זמן לפני החלפתו ס"מ טריים. הערך של ריכוזמחסום פה p24 נמדד ביום 3 לא נכללו בניתוח כי הוא מהווה חלקית וירוס הקליטה על explants ועל שחרור עוקבות ס מ, קרי, inoculum carry-over. בדרך כלל, הזיהום של רקמות צוואר הרחם עם HIV-1LAI.04 לא להוביל לזיהוי שכפול HIV-1 שלנו מערכת ניסויית16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השימוש של רקמה אנושית explants עבור המחקר להידבקות ב- HIV-1 מספק יתרונות על פני המסורתית דו מימדית סוג ניסיוני ומערכות, כגון ראשי תאים או שורות תאים, בשל יכולתם מעולה לשחזור המערכת אינטראקציות ו סלולרי מתפקד (למשל, ייצור ציטוקינים) כפי שהם ויוו. למרות זאת, רקמת השקדים ואת צוואר הרחם שונים בהיבטים רבים, כולל מספר מאפיינים פנוטיפי ופונקציונליים של HIV היעד תאים1,16. מאותה סיבה, HIV-1 גרסאות עם קולטן שיתוף שונים tropism (למשל, CCR5-חוג HIV-1BaL נגד HIV-1 CXCR4-חוגLAI.04) לבצע בצורה שונה הן השקדים ואת צוואר הרחם (טבלה 1). ההתפלגות של HIV coreceptors בתאי היעד החיסון אינדוקטיבית, אפקטור אתרים באופן חלקי בלבד חשבונות עבור הרגישות המקומית זיהום: תאי CD4 T נושאת CXCR4 נמצאים בשפע רב יותר מאשר תאים CCR5 לבטא רקמת השקדים, ובכך מסבירה את שכפול רמות גבוהות של HIV-1LAI.04 מאשר HIV-1BaL, אבל קולטני מיוצגים באופן שווה רירית צוואר הרחם16. למרות זאת, לעתים נדירות שהבחנו שכפול הוירוס פרודוקטיבי ברקמת צוואר הרחם עם HIV-1LAI.04, אשר עולה בקנה אחד עם השידור מועדף של הפרט גרסאות HIV-1 CCR5-חוג ויוו20 . הדבר מצביע על כי המצב בידול והפעלה של התאים היעד HIV-1 עשוי בסופו של דבר לקבוע את היכולת שלהם תומך בשכפול HIV-116.
ג'לטין ספוגים הם התקנים hemostatic המתקבל מטוהרים חזירי עור (קולגן), אשר נועדו להיספג לגמרי על ידי הגוף האנושי אחרי כמה שבועות. אנו ממליצים להשתמש מוצרים המציגות קצב איטי השפלה בתרבות כפי שהם שישרת בצורה טובה יותר את המטרה של שמירה על רקמת explants-הממשק נוזלי-אוויר במשך 2-3 שבועות. אנו ממליצים גם בדיקות קבוצות שונות של המוצר כדי להעריך ביצועים עקביים בתרבות explant.
באופן דומה, ' סוג ' הרבה עוברי סרום שור (FBS) יכול להשפיע על רמות שכפול HIV-1. אנחנו לייעץ בדיקות מספר הרבה FBS למיטוב ס מ ומשתמשים אותו הרבה FBS המחקר כולו. אנחנו באופן שגרתי המבחן FBS על רקמת explants מתורמים 10 ובחר הרבה שנותן את שכפול HIV-1 הגבוהה ביותר.
עבור רוב הניסויים, אנחנו מצרפים את explants מן endocervix ectocervix כדי למקסם את מספר תנאים ניסיוני. ניתן לחשוב שמירתן מופרדות בגלל תכונות שונות אוטואימונית מבניים שלהם21. כמו כן, endocervical explants שחרור ולהמשיך לייצר כמות גדולה של ריר בתרבות שעלולות להפריע ניתוח במורד הזרם. היות השטח המכוסה endocervix היא הרבה יותר קטן מאשר ectocervix, זה מאתגר לערוך ניסויים זיהום ב- HIV באופן בלעדי על רירית endocervical באמצעות נאותה מספר explants וטכני משכפל.
ביצוע זיהום ב- HIV-1 מאת ועלייתו של צוואר הרחם explants מגדיל את סיכויי קבלת זיהום יצרניים עקב מספר נמוך יותר של תאי CD4 T נוכח רירית לעומת רקמת הלימפה. מאותה סיבה, הרקמה צוואר הרחם רגיש יותר לאחסון לילה ותשואות גבוהות שכפול HIV-1 כאשר נגוע זמן קצר לאחר הניתוח, ומיד לאחר ניתוח. למרות זיהום על ידי צלילה במלאי וירוס יכול להתבצע גם על רקמת השקדים להבטיח חשיפה אחידה של explants הוירוס, גישה זו מצריכה גבוהה יותר מניפולציה ותא איבוד רקמות מאשר זיהום של explants על ספוגים ג'לטין כמתואר בפרוטוקול.
מערכות מקוטבות של HIV-1 אתגר והתרבות של רקמות הרירית קיים, משמשים כיום אחרים מעבדות3,22,23,24,25. למרות שמערכות אלה מודל ערך של HIV-1 כניסה, חדירה לתוך רירית, שלהם להגדיר באופן כללי אורכת זמן רב ועשויה רקמה מקיף מניפולציה. Non-מקוטב מודלים של הרירית שידור/פתוגנזה עדיין להציע פלטפורמה חוקית לחקור ברגולציה של שכפול HIV-1, לבריכה המקומית של תאים נגועים ב- HIV על ידי גורמים אקסוגניים אנדוגני9,17 , 26, כולל תרופות12,13,14,15.
השתנות בין התורם יכול לייצג נושא מרכזי עבור תוצאה הפארמצבטית בין ניסויים עצמאית באמצעות דגימות מתורמים מרובים. השתנות בהרכב הסלולר עשוי להשפיע גם על אזורים בתוך הדגימה זהה, דהיינו, השתנות אינטרה-התורם. כדי להפחית את השתנות כראוי לפרש תוצאות, חיוני להגדיר כל התנאים בתוך אחד הניסוי באמצעות מספר explants המתקבל אותו התורם (תנאים מתאימים תורם). ניתן אפשרות לנרמל את התוצאות לפקד פנימית בעת הידור נתונים ניסויים מרובים לשם ניתוח סטטיסטי. כדי לצמצם את השתנות אינטרה-התורם, אנו ממליצים כולל משכפל טכנית לפחות 2 עבור כל תנאי הניסוי, עבור סכום כולל של 18 explants של רקמת השקדים (9/טוב), ו- 10-16 explants של רירית צוואר הרחם (5-8/טוב) (טבלה 1). הזמינות של הרשומות הרפואיות והכללה של ניתוח נוסף של החומר המטופל ו/או תנאי הניסוי, למשל לכתובת מצב דלקתי של הדגימה, עשויה לשפר באופן משמעותי כתוצאה פרשנות (ראה התייחסות 9 דוגמה).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים בילדט לבית של קרן Blanceflor Boncompagni לודוויזי (http://blanceflor.se/), הרופאים שבדי קרן נגד איידס (http://www.aidsfond.se/, הפניה למעורר FOa2014-0006), ו- e דל'אנג'לו אנדריאה Lorini ליבי (http : / / fondazionelorini.it/) כדי אנדראה Introini.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge | Pfizer | NDC: 0009-0315-08 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge | Ferrosan Medical Devices | MS0002 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| RPMI 1640 with phenol red and glutamine | ThermoFisher Scientific | 21875034 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Modified Eagle's medium (MEM) non-essential aminoacids (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Sodium pyruvate, 100 mM (100x) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Gentamicin 50 mg/mL (1000x) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Amphotericin B 250 μg/mL (100x) | ThermoFisher Scientific | 15290018 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Fetal bovine serum (FBS) | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). | ||
| Ticarcillin disodium salt | Sigma-Aldrich | T5639-1G | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Potassium clavulanate | Sigma-Aldrich | 33454-100MG | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red | To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage. | ||
| Sterile cell culture grade water | |||
| Sterile transportation container | |||
| 70% ethanol solution | |||
| Disinfectant solution for biological waste disposal | |||
| Sterile metal forceps or tweezers | |||
| Sterile metal scissors | |||
| Sterile flat weighing metal spatula | |||
| Sterile scalpels and blades | |||
| 6-well cell culture plates | |||
| 12-well cell culture plates | |||
| Sterile Petri dish, 100 mm × 20 mm | |||
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL | NIH AIDS Reagent Program | 510 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04 | NIH AIDS Reagent Program | 2522 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Lamivudine (3TC) | NIH AIDS Reagent Program | 8146 | Resuspend in DMSO at 10 mg/mL, aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Biological safety cabinet | |||
| Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 °C, 5% CO2, ≥ 90% humidity | |||
| Water bath set at 37 °C | |||
| Sterile 1.5 and 2mL screw cap tubes | |||
| Dry bath shaker with heating block for 1.5 mL tubes, set at 37 °C, 300 rpm |
References
- Grivel, J. C., Margolis, L. Use of human tissue explants to study human infectious agents. Nature protoc. 4 (2), 256-269 (2009).
- Glushakova, S., Grivel, J. C., Fitzgerald, W., Sylwester, A., Zimmerberg, J., Margolis, L. B. Evidence for the HIV-1 phenotype switch as a causal factor in acquired immunodeficiency. Nat Med. 4 (2), 346-349 (1998).
- Dezzutti, C. S. Animal and human mucosal tissue models to study HIV biomedical interventions: can we predict success. J Int AIDS Soc. 18 (1), 20301 (2015).
- Global epidemic Update 2016. UNAIDS. , Available from: http://www.unaids.org/en/resources/documents/2016/Global-AIDS-update-2016 (2016).
- Lederman, M. M., Margolis, L. The lymph node in HIV pathogenesis. Semin Immunol. 20 (3), 187-195 (2008).
- Chun, T. W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nat Immunol. 16 (6), 584-589 (2015).
- Biancotto, A., et al. HIV-1 induced activation of CD4+ T cells creates new targets for HIV-1 infection in human lymphoid tissue ex vivo. Blood. 111 (2), 699-704 (2008).
- Van Laar, J. M., et al. Sustained secretion of immunoglobulin by long-lived human tonsil plasma cells. Am J Pathol. 171 (3), 917-927 (2007).
- Introini, A., et al. Seminal plasma induces inflammation and enhances HIV-1 replication in human cervical tissue explants. PLoS Pathog. 13 (5), 1006402 (2017).
- Grivel, J. C., et al. Suppression of CCR5- but not CXCR4-tropic HIV-1 in lymphoid tissue by human herpesvirus 6. Nat Med. 7 (11), 1232-1235 (2001).
- Rollenhagen, C., Lathrop, M. J., Macura, S. L., Doncel, G. F., Asin, S. N. Herpes simplex virus type-2 stimulates HIV-1 replication in cervical tissues: implications for HIV-1 transmission and efficacy of anti-HIV-1 microbicides. Mucosal Immunol. 7 (5), 1165-1174 (2014).
- Lisco, A., et al. Acyclovir is activated into a HIV-1 reverse transcriptase inhibitor in herpesvirus-infected human tissues. Cell Host Microbe. 4 (3), 260-270 (2008).
- Vanpouille, C., et al. A common anti-cytomegalovirus drug, ganciclovir, inhibits HIV-1 replication in human tissues ex vivo. AIDS. 31 (11), 1519-1528 (2017).
- Andrei, G., et al. Topical tenofovir, a microbicide effective against HIV, inhibits herpes simplex virus-2 replication. Cell Host Microbe. 10 (4), 379-389 (2011).
- Greenhead, P., Hayes, P., Watts, P. S., Laing, K. G., Griffin, G. E., Shattock, R. J. Parameters of human immunodeficiency virus infection of human cervical tissue and inhibition by vaginal virucides. J Virol. 74 (12), 5577-5586 (2012).
- Saba, E., et al. HIV-1 sexual transmission: early events of HIV-1 infection of human cervico-vaginal tissue in an optimized ex vivo model. Mucosal Immunol. 3 (3), 280-290 (2010).
- Introini, A., Vanpouille, C., Lisco, A., Grivel, J. C., Margolis, L. Interleukin-7 facilitates HIV-1 transmission to cervico-vaginal tissue ex vivo. PLoS Pathog. 9 (2), 1003148 (2013).
- Biancotto, A., et al. A highly sensitive and dynamic immunofluorescent cytometric bead assay for the detection of HIV-1 p24. J Virol Methods. 157 (1), 98-101 (2009).
- Lisco, A., Vanpouille, C., Margolis, L. War and peace between microbes: HIV-1 interactions with coinfecting viruses. Cell Host Microbe. 6 (5), 403-408 (2009).
- Keele, B. F., et al. Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (21), 7552-7557 (2008).
- Pudney, J., Quayle, A. J., Anderson, D. J. Immunological microenvironments in the human vagina and cervix: mediators of cellular immunity are concentrated in the cervical transformation zone. Biol Reprod. 73 (6), 1253-1263 (2005).
- Ganor, Y., et al. Within 1h, HIV-1 uses viral synapses to enter efficiently the inner, but not outer, foreskin mucosa and engages Langerhans-T cell conjugates. Mucosal Immunol. 3 (5), 506-522 (2010).
- Cavarelli, M., Foglieni, C., Rescigno, M., Scarlatti, G. R5 HIV-1 envelope attracts dendritic cells to cross the human intestinal epithelium and sample luminal virions via engagement of the CCR5. EMBO Mol Med. 5 (5), 776-794 (2013).
- Cummins, J. E., et al. Preclinical testing of candidate topical microbicides for anti-human immunodeficiency virus type 1 activity and tissue toxicity in a human cervical explant culture. Antimicrob Agents Chemother. 51 (5), 1770-1779 (2007).
- Abner, S. R., et al. A human colorectal explant culture to evaluate topical microbicides for the prevention of HIV infection. J Infect Dis. 192 (9), 1545-1556 (2005).
- Saba, E., et al. Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle. Mucosal Immunol. 6 (6), 1081-1090 (2013).
