Summary
İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) ex vivo insan kurcalayarak enfeksiyon virüs Patogenez değerli bir 3D modeli sağlar. Burada, işlemek ve doku örnekleri insan bademcikler ve kadın genital mucosae HIV-1 enfekte ve kültür sıvı-AIR arabirimiyle, proje için bir protokol açıklayın.
Abstract
Hücreler arası etkileşimler insan dokularda okuyan Histocultures izin ve onlar modeli ana bilgisayar-patojen etkileşimleri kontrollü laboratuvar koşullarında için istihdam edilebilir. Ex vivo enfeksiyon ile arasında diğer virüs, insan immün yetmezlik virüsü (HIV), insan dokuların erken hastalık patogenezinde yanı sıra etkinlik ve antiviral ilaçlar toksisite test etmek için bir platform araştırmak için başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Mevcut iletişim kuralında, biz nasıl işlemek ve HIV-1 doku explants insan bademcikler ve servikal mucosae bulaştırmak ve yaklaşık iki hafta süreyle kültür üzerine Jelatin sünger sıvı-AIR arabirimiyle, proje için açıklar. Her ne kadar doku bütünlüğü ve fonksiyonel mimarileri ilerici kaybı onun ana sınırlama kalır bu sigara polarize kültür ayarı kültür orta ve oksijen, besin erişimin en üst düzeye çıkarır. Bu yöntem, HIV-1 çoğaltma ve uzun, qPCR ve akış sitometresi dahil olmak üzere çeşitli yöntemlerle Patogenez izleme sağlar. Önemi, fizyolojik değişkenliğine doku bağışçılar arasında yanı sıra aynı örnek farklı alanlardan explants arasında deneysel sonuçlar önemli ölçüde etkileyebilir. Sonuç tekrarlanabilirlik emin olmak için deneysel tedavilerin sonuçları birden fazla deneyler veri derleme zaman normalize etmek explants, teknik çoğaltır ve donör eşlemeli denetim koşullar yeterli sayıda kullanmak için önemlidir (yani ., yapılan doku farklı bağışçılardan kullanarak) istatistiksel analiz için.
Introduction
Monotypic iki boyutlu hücre kültürleri, burada için geleneksel olarak, sevk dokuları oluşturan hücre türleri çok çeşitli ve organlar arasındaki kayma ve işlevsel iletişim için hesap yapmak. Tüm patolojiler itici faktör homeostatik hücreler arası etkileşimler ile girişim olduğu gibi bu hastalık, deneysel modeller için büyük önem yönüdür. Doku explants sınırlı bir zaman1rağmen için in vivo, oldukları gibi cytoarchitecture ve birçok önemli işlevsel açıdan organları korumak için sağlık ve hastalık insanlarda modelleme için önemli avantajlar sunuyor. Örneğin, difteri toksoidi veya tetanoz toksoidi gibi hatırlama antijenleri ile ex vivo meydan okuma üzerine Bademciklere doku antijen spesifik antikorlar2güçlü bir üretim ile birlikte yanıt verir. Başka bir ex vivo model gibi histoculture kendi sınırlamaları vardır: arası donör değişkenliği, doku polarizasyon, sınırlı doku hayatta kalma ve confocal mikroskobu1derinliği ötesinde hücreleri izleme zorluk. Yine de, insan dokusu explants bir model tercih insanlar ana bilgisayar-patojen etkileşimleri ve potansiyel terapötik müdahaleler3de dahil olmak üzere, homeostatik ve patojenik immünolojik işlemlerinde çalışmaya kalır.
HIV-1 patogenezinde önemli olaylar doku gerçekleşecek. Tüm HIV-1 iletim olaylar Dünya çapında4çoğunluğu genital mukoza hesaplarında enfeksiyonu. Lenfoid doku virüs çoğaltma sırasında akut enfeksiyon önemli sitedir ve gizlice enfekte hücreleri5önemli bir havuz limanlar ve onların kalıcı bir tedavi6elde etmek için ana engel temsil eder. İnsan lenfoid ve mukozal doku kültürü ve ex vivo meydan geleneksel sistemleri izole hücreler HIV-1 çalışma için temel bazı avantajlar sağlar. Örneğin, yerleşik doku hücreleri yokluğunda periferik kan mononükleer hücreler1aksine eksojen harekete geçirmek, HIV-1 enfeksiyonu destekleyebilir. Lenfoid doku explants kullanımı CD4 T hücre tükenmesiyani, seyirci etkisi7, akut enfeksiyon damgasını olan altta yatan bazı anahtar mekanizmaları daha iyi anlaşılmasını sağladı. B hücre köklerinin lenfoid doku8 ve epitel kadın genital mukoza explants9 gibi yapılar korunması HIV-1 enfeksiyonu bu sitelerdeki kayma ve fonksiyonel özellikleri bütünleştirmek için eşsiz bir fırsat sunmaktadır. Son olarak, histocultures başarıyla modeli ve çalışma HIV-1 ve herpesvirus Co enfeksiyon10,11yanı sıra preklinik antiretrovirals ve multitarget microbicides12, test etmek için kullanılmıştır 13 , 14 , 15.
Burada, biz meydan okuma ile HIV-1 sigara polarize bir şekilde explant için doku diseksiyon kapsayan bademcikler ve alt kadın genital sistem (serviks), mukozal doku elde edilen insan dokusu explants kültür için detaylı bir protokol tanımlamak. Doku explants olarak bir destek, Jelatin sünger kullanarak sıvı-hava arabirimi, kültür oksijen kılcal, böylece onların doğal çürüme geciktirerek kültür orta besin sünger aracılığıyla erişim sağlarken hava maruz en üst düzeye çıkarır. HIV-1 çoğaltma sistemimizde değerlendirme en acil virüs explant kültür ortamda zamanla immunoassay veya qPCR tarafından yayımlanan miktarını ölçmek için yoludur. HIV-1 enfeksiyonu ve Patogenez (Örn., CD4 T hücre tükenmesi) Ayrıca doku explants tarafından toplu RNA/DNA ekstraksiyon ve qPCR, in situ boyama veya tek hücre-doku sindirim üzerine analiz akış sitometresi tarafından değerlendirilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İnsan doku topluluğu için iletişim kuralı yerel yetkili makamlar tarafından etik onay gerektirebilir. Belirtilen ameliyatları tonsillektomi ve histerektomi gibi durumunda örnekler özellikle araştırma amaç için toplanan değildir ve çalışma insan denekler araştırma (Ulusal Sağlık Enstitüleri. kabul edilmez İnsan denek üzerinde araştırma. https://humansubjects.nih.gov/Walkthrough-investigator#tabpanel11). Ancak, doku bağış kişisel ve tıbbi veri alma (Örn., cinsiyet, yaş, geçerli uyuşturucu kullanımı, tarih enfeksiyonlar, vb) Bu deneysel sonuçlar, aydınlatılmış onam ve olmalıdır gizlilik pozlar kaygıları yorumlama yardımcı olabilir doku koleksiyonu için protokolündeki ele.
Dikkat: Biyolojik emanet dolabı yordamın tamamını yapılmalıdır. 'Sağlıklı' bireyler de dahil olmak üzere tüm insan örnekler bulaşıcı olabilir liman. Operatör eğitim patojenler ile kan yoluyla güvenli bir şekilde doku örnekleri, işlemek için deneyler HIV kullanımını içermeyen bile işe almanız gerekir. Risk değerlendirmesi yordam doku diseksiyon ve enfeksiyon HIV ile operatör ve iş arkadaşlarınızla güvenliği sağlamak için eğitilmiş personel tarafından yapılmalıdır. Enfeksiyon HIV kullanımını adanmış Biyogüvenlik düzeyi 2 veya 3 ortamlar bağlı olarak ülke ve tehlikeli biyolojik madde ve kan yoluyla bulaşan patojenler Enstitüsü özel düzenlemeler gerektirir.
1. Jelatin sünger hazırlanması
Not: Jelatin sünger doku diseksiyon önce hazırlamak kesinlikle gerekli olmasa da, burada, özellikle büyük miktarda doku ve/veya birçok bağışçılardan işlerken özetlenen siparişi takip etmek daha uygun olur.
- Kültür orta (CM) hazırlamak ve CMT (Tablo reçetesi) yapmak için kullanmadan önce antibiyotik çözüm (Tircacillin-clavulanate mix) ile ek. Artık herhangi bir antibiyotik çözüm atın.
Not: Ticarcillin ve clavulanate CMT içinde kötü stabildir. Gerekirse, CMT antibiyotik solüsyonla hazırlık yaklaşık 24 saat sonra yeniden ek. Bu orta her 24 h kültür sırasında explant için antibiyotik çözüm eklemek için gerekli değildir. - 100 mm x 20 mm Petri dish ile yaklaşık 20-30 mL-CMT, doldurun.
Not: Bu ayar yeterli Jelatin sünger iki 6-şey tabak veya bir 12-şey plaka için zaman hazırlamak için en iyi yöntemdir. Birçok tabak gerekiyorsa, bir daha geniş Petri kabına ve CMT hacmin daha büyük hazırlık kadar hızlandırmak için kullanın. - Jelatin sponge(s) steril forseps kullanarak Petri kabına aktarın. Her iki tarafta sünger ıslak ve yaklaşık 2 dakika için steril bir spatula kullanarak sünger Petri kabına alt karşı 1 dk. basın için orta kadar emmek sünger sağlar.
Not: sünger hava kabarcıkları varlığı üzerinden doku kültürü orta besin ulaşmak kılcal engeller çünkü bu adım çok önemli önem taşımaktadır. Jelatin sünger ne zaman susuz son derece kırılgan. Yavaşça sünger başında özellikle spatula ile sünger bozulmaması için aşağı doğru itin. - Kullanım steril rehydrated Jelatin sünger içine yaklaşık 1 cm2eşit büyüklükte parçalara kesmek için makas. Her bir kültür kalıbının kuyuya forseps kullanarak 1 sünger adet aktarın. CMT 3-4 mL her kuyuya 6-şey plaka (bademcikler) ve 1 mL başına iyi bir 12-şey plaka (serviks) ekleyin. Doku explants sünger yüklenecek hazır olana 37 ° C, % 5 CO2, ≥ % 90 nem, ayarla kuluçka, tabak yerleştirin.
Not: CMT kalenin eklemek için hacmi explants hava-sıvı arayüzü tutmak için sünger kalınlığı için ayarlanmalıdır.
2. insan Bademciklere dokusu diseksiyon
Not: Bademcikler en kısa zamanda ameliyat sonrası, ideal olarak aynı gün cerrahi işlenip. Alternatif olarak, numuneler gecede içinde batık CMT 4 ° C'de bırakılabilir
- CM izin oda sıcaklığında (RT) ulaşmak veya bir su banyosunda koymak için yeterli bir süre önceden 37 ° C'de ısındı CM antibiyotik çözüm (CMT) ile kullanmadan önce ek. Kalan herhangi bir antibiyotik çözüm atın. % 70 etanol çözüm forseps ve diseksiyon işlem sırasında gerektiğinde neşter emmek için temiz bir kaba dökün. Araçlar temiz ve neşter bıçak diseksiyonlarının farklı bağışçılardan örneklerin arasında değiştirin.
- Bademcikler ulaşım kapsayıcıdan steril forseps kullanarak CMT 10-20 mL içeren 100 mm-Petri kabına aktarın.
Not: Numune dağlanmış, kanlı yaygın alanlar ile veya nekrotik doku atılmalıdır. - Petri kabına kapağını doku incelemek için bir kesme yüzeyi olarak kullanın. Doku yavaşça forseps ile tutarak, her bademcik steril neşter ve bıçak kullanarak birkaç büyük parçalar halinde kesin.
Dikkat: işleme keskin araçları insan örnekleri incelemek için yaralanma ve kontaminasyon riskini artırır. Işleç ek koruma olarak metal, kafes, kesim dirençli eldiven giyiyor düşünmelisiniz. - Kanlı, dağlanmış kaldır ve myomlar doku ve herhangi bir parça tonsilloliths (kalsifiye malzeme) içeren ve/veya yeşil-kahverengi renk ile neşter ve forseps kullanarak.
Not: bir doku parçası üzerinde çalışırken, bu doku doku kuruma önlemek için ortamda sular altında kalan tutmak önemlidir. - Her doku parça kalınlığı yaklaşık 2 mm dilimler halinde kesin. Önceki adımı olduğu gibi istenmeyen herhangi bir bölümünü kaldırın. Dokusu dilimlerin 2 mm kalınlığında şeritler halinde kesin. Doku şeritler 2 mm kalınlığında bloklar halinde kesin. Bu kabaca 8 mm3doku explants içinde sonuçlanmalıdır.
- Explants içine doku kuruma diseksiyon ile devam ederken önlemek için CMT 10-20 mL içeren yeni 100 mm Petri kabına aktarın. Diseksiyon sonunda explant dağıtım randomize etmek plaka girdap. Üstünde tepe-in her Jelatin sünger forseps, aralarında boşluk izin kullanarak bir 6-şey plaka yer 9 doku explants. Tabakları da kuluçka için dönmek.
Not: Genellikle, explants gecede kültürlü ve HIV-1 kültürlerin aşı ertesi gün gerçekleştirilir. Bu hiçbir bakteriyel veya mantar kirlenme kültüründe geliştirir emin olmaktır. Ayrıca, hücreleri Bademciklere doku explants sonra diseksiyon çıkış eğilimindedir. Bu işlem büyük ölçüde kültür1ilk 24 saat içinde tamamlanır. - Tüm biyolojik atık işleme tehlikeli biyolojik madde ve belirli risk değerlendirmesi enstitünün düzenlemelere göre münasip kaplarda atmayın.
3. Bademciklere doku enfeksiyonu HIV-1 ile Explants
Not: bağımsız deneyler arasında sonuç değişkenliği azaltmak için aynı virüs hazırlık tüm bir çalışma için kullanılmalıdır. Virüs exogenously aktive periferik kan mononükleer hücrelerde yayılır ve sonra kültür süpernatant tekrarlanan dondurma ve çözme (Tablo reçetesi) önlemek için depolama-80 ° C'de bölünmemeli olabilir.
- 37 ° C'de önceden sıcak su banyosu CM sok CM antibiyotik çözüm (CMT) ile kullanmadan önce ek. Artık herhangi bir antibiyotik çözüm atın.
- 6-iyi plate(s) bir pipet ile ortamda Aspire edin ve dezenfektan solüsyonu ile bir kap içinde atın. Plaka eğilme ve Jelatin Sünger Orta en altında toplamak ve Aspire edin ve bunu atmak izin vermek için de üst kısmındaki yavaşça itin. 3-4 mL CMT her şey için ekleyin.
- HIV-1 virüs hazırlık 37 ° C'de su banyosunda tezcan Gerekirse, CM (Tablo 1) ile virüs stok oranında seyreltin.
Not: seçilen inoculum 5-8 µL (Tablo 1) bir hacim içinde yer böylece virüs hisse senedi seyreltilmiş. Verimli bir enfeksiyon için gerekli HIV-1 hazırlık çözdürme ve doku explants bulaşmasını arasındaki en az zaman kullanmak için önemlidir. - Virüs inoculum doğrudan her bir Jelatin sünger üzerinde 9 explants biri üzerine pipette. Enfeksiyon tamamlanmış olarak plate(s) kuluçka makinesi için dönmek. Herhangi bir kalıntı virüs hazırlık atmak. Bölüm 5'e devam.
Not: virüs inoculum işleç doğru bir şekilde teslim etmek için ters bir pipetting tekniği kullanarak ve her şey için belgili tanımlık uç değiştirme gözden geçirmelisiniz. Bu virüs inoculum çizmek için tasfiye pozisyon (ikinci durağı) aşağı pipet pistonu iterek içerir ve minimizing kabarcık oluşumu ve hata yardımcı olur inoculum teslim etmek için ilk durağı iterek küçük tekrarlanan örnekleme ile ilişkili birimler, yani, 5-8 µL.
4. diseksiyon ve rahim rahim ağzı mukozasında enfeksiyonu
Not: en iyi sonuçlar için servikal mucosae explants olmalı işlenen ve en kısa zamanda ameliyat sonrası, ideal olarak aynı gün cerrahi bulaşmış. Alternatif olarak, numuneler gecede 4 ° C'de CMT, batık ve virüslü hemen sonra diseksiyon depolanabilir.
- CM izin RT ulaşmak veya bir su banyosunda koymak için yeterli bir süre önceden 37 ° C'de ısındı CM antibiyotik çözüm (CMT) ile kullanmadan önce ek. Artık herhangi bir antibiyotik çözüm atın. % 70 etanol solüsyonu her diseksiyon işlem sırasında gerekli neşter ve forseps emmek için temiz bir kaba dökün. Araçlar temiz ve neşter bıçak diseksiyonlarının birden çok bağışçılardan örneklerin arasında değiştirin.
- Steril forseps kullanarak, örnek ulaşım kapsayıcıdan 100 mm Petri kabına CMT 10-20 mL içeren aktarın.
- Petri kabına kapağını doku incelemek için bir kesme yüzeyi olarak kullanın. Underneath stromal ayrı ectocervix ve/veya endocerviks mukoza doku yavaşça forseps ile tutarak ve kas dokusu (submukoza) bir neşter ve elde etmek için bıçak ile mukoza şeritler.
Not: bir doku parçası üzerinde çalışırken, bu doku doku kuruma önlemek için ortamda sular altında kalan tutmak önemlidir. - Mukoza 2 mm çapında şeritler halinde kesin, kaldırmak ve yalnızca 2 mm kalınlığında katmanı doku bırakarak mümkün olduğu kadar submukoza atın. Şeritler 2 mm kalınlığında bloklar halinde kesin. Bu kabaca 8 mm3doku explants içinde sonuçlanmalıdır.
Dikkat: işleme keskin araçları insan örnekleri incelemek için yaralanma ve kontaminasyon riskini artırır. Işleç ek koruma olarak metal, kafes, kesim dirençli eldiven giyiyor düşünmelisiniz. - Yeni 100 mm Petri kabına doku kuruma diseksiyon ile devam ederken önlemek için CMT 10-20 mL içeren içine transfer doku explants. Diseksiyon sonunda explant dağıtım randomize etmek plaka girdap.
- Steril forseps ile explants steril 1.5 mL konik tüpler (en fazla tüp 16 explants) içine aktarın. Herhangi bir ortamda bir pipet kullanarak tüpü çıkarması.
- Bir su banyosu 37 ° C'de HIV-1 hazırlanmasında tezcan Gerekirse, CM. Transfer virüs ile virüs stok explants içeren tüpler oranında seyreltin. Herhangi bir kalıntı virüs hazırlık atmak.
Not: seçilen inoculum en az 0,5 mL (Tablo 1) bir hacim içinde yer böylece virüs hisse senedi seyreltilmiş. Bağımsız denemeler arasında sonuç değişkenliği azaltmak için aynı virüs hazırlık tüm bir çalışma (Tablo reçetesi) kullanılmalıdır. - Tüpler bir termo-shaker aktarmak ve 300 devir / dakikada sallanan 37 ° C'de 2 h için kuluçkaya. Yavaşça tüpler birkaç kez her 30-60 dk tersine çevirin.
Not: etkin bir enfeksiyon için HIV-1 hazırlık çözdürme ve tüpler 37 ° C'ye aktarma arasında gereken en az süreyi kullanmak için kritik - 6-şey plaka 3-4 mL steril fosfat tampon serum (PBS) kuyu başı ile doldurun. İtibariyle kuluçka HIV-1 tüm virüs hazırlanmasında tüpler bir kaba bir pipet kullanarak dezenfektan solüsyonu ile atmak. Explants PBS forseps kullanarak içeren 6-şey plaka aktarın.
- Explants RT, 1 dk. için PBS içinde dinlenmek izin ver ve sonra onları hafifçe pipetting tarafından alçalarak PBS kuyuya yıkayın 2 - 3 kez. PBS bir pipet kullanarak dezenfektan solüsyonu ile bir konteyner içine atın. 3-4 mL yeni PBS her şey için ekleyin. Toplam üç yıkama için iki kez daha tekrarlayın. PBS sadece doku kuruma önlemek için sünger explants aktarmadan önce atmak.
Not: Explants servikal mukoza ve belirli endocerviks, enfeksiyon sırasında büyük miktarda mukus serbest bırakın. Yıkama ve belirsiz saklama explants ve kültür süpernatant içine sonraki serbest bırakmak-in virüs virüs çoğaltma maske yapabilirsiniz çünkü mümkün olduğu kadar mukus kaldırın çok önemlidir. - Forseps kullanarak, 5-8 explants her Jelatin sünger bir 12-şey plaka üzerine aktarın. Plaka da kuluçka için dönmek.
- Tüm biyolojik atık işleme tehlikeli biyolojik madde ve belirli risk değerlendirmesi enstitünün düzenlemelere göre münasip kaplarda atmayın.
5. Histoculture
- CM 3 güne kadar enfeksiyon zaman 12-15 sonrası enfeksiyon başlayarak günde değiştirin. CM ve/veya explants diğer parametreler arasında HIV-1 çoğaltma değerlendirmek için kültür zaman boyunca düzenli aralıklarla tatmak mümkündür.
- 37 ° C'de önceden sıcak su banyosu CM sok
Not: Bu aşamada CM antibiyotik çözüm ile tamamlamak için gerekli değildir. - Cm örnek bir pipet ile toplamak ve depolama-80 ° C'de steril 1.5 veya 2 mL vidalı kapak tüpler içine aktar
Not: CM Çoğalt kuyulardan adresindeki koleksiyonu havuza. - Doku explants steril forseps ile hasat ve explants steril 1.5 veya 2 mL vidalı kapak tüpler transfer explants aşırı medyada bir parça kağıda (isteğe bağlı) yerleştirerek çıkarın. İşlemek veya doku örnekleri deneme gerektirdiği saklayabilirsiniz.
Not: akış sitometresi için explants hemen bir tek hücre süspansiyon (için daha fazla bilgi bkz: başvuru 1, 9, 16 ve 17) elde etmek için enzimatik bir kokteyl ile sindirmek. RNA çıkarma için explants 4 ° C'de bir RNA sabitleme çözümde gecede onları-80 ° C'de depolamadan önce tutulur DNA çekme ya da in situ (serviks) boyama için explants ek-sıvı azot veya kuru buz/etanol Bulamaç donmuş olabilir ve-80 ° C'de depolanan Alternatif olarak, Bademciklere explants in situ boyama için PBS ve % 4'paraformaldehyde bir çözümde batma tekrarlanmasıyla çözülebilir. - İyi bir pipet ile kalan CM Aspire edin ve dezenfektan solüsyonu ile bir kaba atın. Plaka eğilme ve yavaşça orta alt kısmında toplamak için izin vermek için de üst kısmı için Jelatin sünger itin ve sonra Aspire edin ve bunu atmak.
- 3-4 mL cm her şey için ekleyin. Steril forseps kullanarak, herhangi bir doku içine Jelatin sünger ortama düştü explants dönün. Plaka da kuluçka için dönmek.
- Kültür sonunda, tüm biyolojik atık işleme tehlikeli biyolojik madde ve belirli risk değerlendirmesi enstitünün düzenlemelere göre münasip kaplarda atmayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HIV-1 çoğaltma doku explants içinde değerlendirmek için çeşitli teknikler kullanılabilir. Bizim standart okuma zaman bir immunoassay18CM serbest HIV-1 p24gag miktarını ölçmek etmektir.
Doku explants ile aynı HIV-1 stokunun inoculum aynı enfekte farklı bağışçılardan virüsü (Tablo 1) farklı miktarlarda verim. Sayısı ve durumu HIV-1 hedef hücre ve doku16,19patojenler Co bulaşmasını varlığını gibi çeşitli faktörler nedeniyle bu. Şekil 1' de, biz donör eşlemeli explants tedavi antiretroviral ilaç lamivudin (3TC) ile karşılaştırıldığında CM yayımlanan p24gag miktarına göre tanımlanan servikal mukoza explants üretken ve abes HIV-1 enfeksiyonu örneği sağlar Bu tamamen HIV-1 çoğaltma bastırır. Bu denetim a donörden doku explants enfeksiyonu için gereksiz görünse de, (B) kimden verimli enfeksiyonu (C) HIV-1 çoğaltma seviyesinin düşük verim explants başarısız ayrımcılık yardımcı olur.
Antiretroviral ilaç kullanımı denetim koşulu olarak HIV-1 enfeksiyonu gibi servikal mukoza ve yavaş çoğaltılıyor HIV-1 türevleri, bazı birincil yalıtır gibi kullanırken hedef hücreleri az sayıda liman dokularda eğitim yararlı olabilir. Buna ek olarak, öyle virüs ile enfekte dokular için daha duyarlı algılama yöntemleri, örneğin qPCR kullanmayı düşünün önemlidir.
Resim 1 : HIV-1 çoğaltma servikal mukozasında explants üç farklı doku bağış. Explants HIV-1BaL aynı inoculum ile bulaştırmak yanında virüs hisse senedi batma ve 15 gün boyunca antiretroviral ilaç lamivudin (3TC) içinde 10 µM. kültür orta yoğunlukta kültürlü servikal doku örneklenmiş her 3 gün ve örnekleri çoğaltmak kuyulardan HIV-1 çoğaltma analiz için koleksiyon HIV-1 p24gag immunoassay tarafından havuza. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Doku türü | Virüs | İnoculum explant (HIV-1 p24gag, pg) başına | No explants | Kültür orta hacmi (mL) | No Kuyu (Teknik çoğaltır) | HIV-1 p24gag üretim (ng/mL) |
| Bademciklere | HIV-1BaL | 350-500 | 9 | 3-4 | 2-3 | 1 – 10 |
| HIV-1LAI.04 | 9 | 3-4 | 2-3 | 1-100 | ||
| Servikal | HIV-1BaL | 1500-2000 | 8 | 1 | 2 | 1 – 5 |
| HIV-1LAI.04 | 8 | 1 | 2 | Saptanamayan |
Tablo 1: referans değerleri için doku explants ve virüs üretim enfeksiyon HIV-1 inoculum. HIV-1 inoculum bireysel doku explant başına değerini 50 – 70 ng/mL konsantrasyonu, virüs stokları gösterir: seyreltilmemiş virüs stokunun 7 µL hacmi bir Jelatin sünger; üstüne Bademciklere her explant bulaştırmak için kullanılır su katılmamış virüs stokunun 500 µL hacmi, batma bir 1,5 mL tüp 16 servikal explants bulaştırmak için kullanılır. Servikal explants kapsamlı PBS içinde Jelatin sünger aktarmadan önce yıkanır. HIV-1 üretim doku explants tarafından değerini 1 ml (serviks) 8 explants veya 9 explants 3-4 ml (bademcikler) kültür 3 günde 12-15 gün içinde kültür örneklenmiş Orta (CM) tarafından yayımlanan p24gag toplam miktarını gösterir. CM Çoğalt kuyulardan koleksiyonu ile taze CM takmadan önce her zaman için havuza. Çünkü kısmen virüs emilimi için explants ve sonraki sürüm CM, yani, inoculum etkilenmişimdir hesapları p24gag konsantrasyonu gün 3 ölçülen değeri analizinden dışarıda bırakıldı. Tipik olarak, HIV-1LAI.04 ile servikal doku enfeksiyonu tespit HIV-1 çoğaltma bizim deneysel sistem16yol açmaz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İnsan dokusu kullanımını explants için HIV-1 enfeksiyonu çalışmanın geleneksel iki boyutlu ve monotypic deneysel sistemleri, primer hücre veya hücre hatları, üstün sizdirmaz kartu hücreler arası etkileşimler çoğaltmak gibi avantajlar sağlar ve vivo içindeoldukları gibi hücresel (Örneğin, sitokin üretim) çalışır. Yine de, Bademciklere ve servikal doku sayısı ve HIV hedef hücreleri1,16fenotipik ve fonksiyonel özellikleri de dahil olmak üzere birçok açıdan farklı. Aynı nedenle, HIV-1 türevleri farklı ortak reseptör tropism (Örneğin, CCR5 tropic HIV-1BaL CXCR4 tropic HIV-1LAI.04vs) ile farklı bademcikler ve serviks (Tablo 1) hem de gerçekleştirmek. HIV coreceptors hedef hücrelerde bağışıklık endüktif ve efektör dağıtımını kısmen enfeksiyona yerel duyarlılık hesaplarında siteleri: CXCR4 taşıyan CD4 T hücreleri daha CCR5 ifade hücre daha bol Bademciklere dokusunda, böylece HIV-1BaLama reseptörleri eşit servikal mukoza16temsil edilen daha yüksek çoğaltma düzeyde HIV-1LAI.04 açıklayan. Yine de, biz nadiren servikal doku ile HIV-1LAI.04doğrultusunda bireysel HIV-1 CCR5-tropic versiyonlarının içinde vivo20 gözlenen iletim tercihli, meydan verimli virüs çoğaltma algılandı . Bu HIV-1 hedef hücre farklılaşma ve harekete geçirmek durum sonuçta HIV-1 çoğaltma16destekleme yeteneklerini belirlemek göstermektedir.
Jelatin sünger tamamen birkaç hafta sonra insan vücut tarafından absorbe edilebilir için tasarlanmı arıtılmış domuz derisinden (kollajen), elde edilen kan durdurucu sargı aygıtlardır. Onlar daha iyi doku explants sıvı-AIR arabirimiyle, 2-3 hafta boyunca korumak amacına uygun olarak kültür yavaş bozulma hızı gösteren ürünleri kullanmanızı öneririz. Biz de explant kültür tutarlı performansını değerlendirmek için aynı ürünün farklı toplu işlemleri test etmenizi öneririz.
Benzer şekilde, türü ve fetal Sığır serum (FBS) sürü HIV-1 çoğaltma düzeyleri etkileyebilir. Biz FBS CM optimizasyonu için çeşitli bir sürü test tavsiye ve FBS aynı çok tüm bir çalışma için kullanın. Biz düzenli olarak doku explants 10 bağışçılardan FBS test ve yüksek HIV-1 çoaltma çok seçin.
Deneyler çoğu için explants endocerviks ve ectocervix deneysel koşullar sayısını en üst düzeye çıkarmak için havuz. Biri onları tutmak onların farklı yapısal ve immünolojik özellikleri21nedeniyle ayrılmış düşünebilirsiniz. Ayrıca, endocervical yayın explants ve mukus aşağı akım analizi ile etkileşebilir kültür büyük bir miktarda üretmeye devam. Endocerviks tarafından bölgeyi meydan okuyor sadece endocervical mukoza üzerinde HIV enfeksiyonu deney için ectocervix çok daha küçük olarak yeterli bir kullanarak explants sayısı ve teknik çoğaltır.
HIV-1 enfeksiyon serviks explants batma tarafından performans üretken bir enfeksiyonu CD4 T hücreleri mevcut mukoza lenfoid doku ile karşılaştırıldığında daha düşük sayıda nedeniyle elde etme olasılığını en üst düzeye çıkarır. Aynı nedenle, servikal doku gecede depolama birimine daha duyarlı ve kısa bir süre sonra ameliyat ve hemen sonra diseksiyon bulaştığında daha yüksek HIV-1 çoğaltma verim. Batma virüs hisse senedi tarafından enfeksiyon mod da Bademciklere doku üniforma explants maruz virüs sağlamak için gerçekleştirilebilir rağmen bu yaklaşım daha yüksek doku manipülasyonu ve hücre kaybı açıklandığı gibi Jelatin sünger explants enfeksiyonu daha üzerine kuruludur iletişim kuralı.
HIV-1 Challenge polarize sistemleri ve mukozal doku kültürünün bulunur ve şu anda diğer laboratuvarlar3,22,23,24,25kullanılır. Bu sistemler HIV-1 katılımı ve mukoza içine nüfuz değerli bir model olmasına rağmen onların kurulum genellikle fazla zaman alır ve geniş doku manipülasyonu gerektirebilir. Sigara polarize modelleri mukozal iletim/Escherichia türleri hala HIV-1 çoğaltma düzenlenmesi ve HIV enfekte hücreleri yerel havuz endojen ve eksojen etken9,17 tarafından araştırmak için geçerli bir platform sunuyoruz , 26, dahil olmak üzere12,13,14,15uyuşturucu.
Bağımsız denemeleri birden çok bağışçılardan numuneler kullanılarak yapılan arasında sonuç tekrarlanabilirlik için büyük bir sorun arası donör değişkenlik gösterebilir. Hücresel kompozisyon değişkenlik da aynı numune, yani, içi-donör değişkenlik içindeki alanları etkileyebilir. Değişkenliği azaltmak ve düzgün sonuçlar yorumlamak için tüm koşulları içinde bir deney aynı donör (verici eşlemeli koşullar) elde edilen explants yeterli sayıda kullanarak ayarlamak için önemlidir. Sonuçları bir iç kontrol için birden fazla deneyler istatistiksel analiz için veri derleme zaman normalleştirilmiş. Intra-donör değişkenliği azaltmak için de dahil olmak üzere toplam 18 explants Bademciklere doku (9/de) ve servikal mukoza (5-8/de) (Tablo 1), 10-16 explants için deneysel her koşul için en az 2 Teknik çoğaltır öneririz. Tıbbi kayıtları kullanılabilirliğini ve hasta malzeme ve/veya örneğin adresine bir numune inflamatuar durumunu deneysel koşullar ek çözümleme dahil önemli ölçüde sonuç yorumu geliştirmek (başvurusu 9 için bkz: bir örnek).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser Vakfı Blanceflor Boncompagni Ludovisi nee Bildt (http://blanceflor.se/), Vakfı İsveçli Doktor AIDS (http://www.aidsfond.se/, ref. FOa2014-0006) ve Fondazione Andrea e Libi Lorini (http karşı gelen hibe tarafından desteklenmiştir : / / fondazionelorini.it/) Andrea Introini için.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge | Pfizer | NDC: 0009-0315-08 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge | Ferrosan Medical Devices | MS0002 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| RPMI 1640 with phenol red and glutamine | ThermoFisher Scientific | 21875034 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Modified Eagle's medium (MEM) non-essential aminoacids (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Sodium pyruvate, 100 mM (100x) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Gentamicin 50 mg/mL (1000x) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Amphotericin B 250 μg/mL (100x) | ThermoFisher Scientific | 15290018 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Fetal bovine serum (FBS) | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). | ||
| Ticarcillin disodium salt | Sigma-Aldrich | T5639-1G | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Potassium clavulanate | Sigma-Aldrich | 33454-100MG | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red | To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage. | ||
| Sterile cell culture grade water | |||
| Sterile transportation container | |||
| 70% ethanol solution | |||
| Disinfectant solution for biological waste disposal | |||
| Sterile metal forceps or tweezers | |||
| Sterile metal scissors | |||
| Sterile flat weighing metal spatula | |||
| Sterile scalpels and blades | |||
| 6-well cell culture plates | |||
| 12-well cell culture plates | |||
| Sterile Petri dish, 100 mm × 20 mm | |||
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL | NIH AIDS Reagent Program | 510 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04 | NIH AIDS Reagent Program | 2522 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Lamivudine (3TC) | NIH AIDS Reagent Program | 8146 | Resuspend in DMSO at 10 mg/mL, aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Biological safety cabinet | |||
| Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 °C, 5% CO2, ≥ 90% humidity | |||
| Water bath set at 37 °C | |||
| Sterile 1.5 and 2mL screw cap tubes | |||
| Dry bath shaker with heating block for 1.5 mL tubes, set at 37 °C, 300 rpm |
References
- Grivel, J. C., Margolis, L. Use of human tissue explants to study human infectious agents. Nature protoc. 4 (2), 256-269 (2009).
- Glushakova, S., Grivel, J. C., Fitzgerald, W., Sylwester, A., Zimmerberg, J., Margolis, L. B. Evidence for the HIV-1 phenotype switch as a causal factor in acquired immunodeficiency. Nat Med. 4 (2), 346-349 (1998).
- Dezzutti, C. S. Animal and human mucosal tissue models to study HIV biomedical interventions: can we predict success. J Int AIDS Soc. 18 (1), 20301 (2015).
- Global epidemic Update 2016. UNAIDS. , Available from: http://www.unaids.org/en/resources/documents/2016/Global-AIDS-update-2016 (2016).
- Lederman, M. M., Margolis, L. The lymph node in HIV pathogenesis. Semin Immunol. 20 (3), 187-195 (2008).
- Chun, T. W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nat Immunol. 16 (6), 584-589 (2015).
- Biancotto, A., et al. HIV-1 induced activation of CD4+ T cells creates new targets for HIV-1 infection in human lymphoid tissue ex vivo. Blood. 111 (2), 699-704 (2008).
- Van Laar, J. M., et al. Sustained secretion of immunoglobulin by long-lived human tonsil plasma cells. Am J Pathol. 171 (3), 917-927 (2007).
- Introini, A., et al. Seminal plasma induces inflammation and enhances HIV-1 replication in human cervical tissue explants. PLoS Pathog. 13 (5), 1006402 (2017).
- Grivel, J. C., et al. Suppression of CCR5- but not CXCR4-tropic HIV-1 in lymphoid tissue by human herpesvirus 6. Nat Med. 7 (11), 1232-1235 (2001).
- Rollenhagen, C., Lathrop, M. J., Macura, S. L., Doncel, G. F., Asin, S. N. Herpes simplex virus type-2 stimulates HIV-1 replication in cervical tissues: implications for HIV-1 transmission and efficacy of anti-HIV-1 microbicides. Mucosal Immunol. 7 (5), 1165-1174 (2014).
- Lisco, A., et al. Acyclovir is activated into a HIV-1 reverse transcriptase inhibitor in herpesvirus-infected human tissues. Cell Host Microbe. 4 (3), 260-270 (2008).
- Vanpouille, C., et al. A common anti-cytomegalovirus drug, ganciclovir, inhibits HIV-1 replication in human tissues ex vivo. AIDS. 31 (11), 1519-1528 (2017).
- Andrei, G., et al. Topical tenofovir, a microbicide effective against HIV, inhibits herpes simplex virus-2 replication. Cell Host Microbe. 10 (4), 379-389 (2011).
- Greenhead, P., Hayes, P., Watts, P. S., Laing, K. G., Griffin, G. E., Shattock, R. J. Parameters of human immunodeficiency virus infection of human cervical tissue and inhibition by vaginal virucides. J Virol. 74 (12), 5577-5586 (2012).
- Saba, E., et al. HIV-1 sexual transmission: early events of HIV-1 infection of human cervico-vaginal tissue in an optimized ex vivo model. Mucosal Immunol. 3 (3), 280-290 (2010).
- Introini, A., Vanpouille, C., Lisco, A., Grivel, J. C., Margolis, L. Interleukin-7 facilitates HIV-1 transmission to cervico-vaginal tissue ex vivo. PLoS Pathog. 9 (2), 1003148 (2013).
- Biancotto, A., et al. A highly sensitive and dynamic immunofluorescent cytometric bead assay for the detection of HIV-1 p24. J Virol Methods. 157 (1), 98-101 (2009).
- Lisco, A., Vanpouille, C., Margolis, L. War and peace between microbes: HIV-1 interactions with coinfecting viruses. Cell Host Microbe. 6 (5), 403-408 (2009).
- Keele, B. F., et al. Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (21), 7552-7557 (2008).
- Pudney, J., Quayle, A. J., Anderson, D. J. Immunological microenvironments in the human vagina and cervix: mediators of cellular immunity are concentrated in the cervical transformation zone. Biol Reprod. 73 (6), 1253-1263 (2005).
- Ganor, Y., et al. Within 1h, HIV-1 uses viral synapses to enter efficiently the inner, but not outer, foreskin mucosa and engages Langerhans-T cell conjugates. Mucosal Immunol. 3 (5), 506-522 (2010).
- Cavarelli, M., Foglieni, C., Rescigno, M., Scarlatti, G. R5 HIV-1 envelope attracts dendritic cells to cross the human intestinal epithelium and sample luminal virions via engagement of the CCR5. EMBO Mol Med. 5 (5), 776-794 (2013).
- Cummins, J. E., et al. Preclinical testing of candidate topical microbicides for anti-human immunodeficiency virus type 1 activity and tissue toxicity in a human cervical explant culture. Antimicrob Agents Chemother. 51 (5), 1770-1779 (2007).
- Abner, S. R., et al. A human colorectal explant culture to evaluate topical microbicides for the prevention of HIV infection. J Infect Dis. 192 (9), 1545-1556 (2005).
- Saba, E., et al. Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle. Mucosal Immunol. 6 (6), 1081-1090 (2013).
