Summary
ويرد بروتوكولا اقتصادا والأمثل، وبسيطة في هذه المادة، الذي يستخدم الأسلوب صبغة زرقاء إيفانز لتقييم التسرب البلازما في الأجهزة من الفئران ففبن التي يمكن تكييفها للاستخدام في السلالات الأخرى، والأنواع، والأخرى أو الأنسجة.
Abstract
تسرب في الأوعية الدموية، أو التسرب البلازما، يحتوي على عدد من الأسباب، وقد يكون نتيجة خطيرة أو أعراض الاستجابة الالتهابية. هذه الدراسة قد تؤدي في نهاية المطاف إلى المعارف الجديدة بشأن الأسباب أو طرق جديدة لمنع أو علاج التسرب البلازما. من المهم أن الباحثين لها الأدوات المناسبة، بما في ذلك أفضل الطرق المتاحة، لدراسة التسرب البلازما. في هذه المقالة، نحن تصف بروتوكول، استخدام أسلوب صبغة زرقاء إيفانز، من أجل تقييم التسرب البلازما في الأجهزة من الفئران ففبن. هذا البروتوكول بسيط عن عمد، لكبيرة بدرجة ممكن، لكنه يوفر بيانات عالية الجودة. تم اختيار صبغ إيفانز الأزرق أساسا لأنه من السهل للمختبر متوسط لاستخدام. أننا استخدمنا هذا البروتوكول أن تقدم الأدلة وتقديم الدعم للفرضية القائلة بأن نيبريليسين الإنزيم قد تحمي المفرج ضد التسرب البلازما. ومع ذلك، قد تستخدم تجريبيا هذا البروتوكول وتكييفها بسهولة للاستخدام في سلالات أخرى من الفئران أو في الأنواع الأخرى، وفي كثير من الأعضاء أو الأنسجة، مختلف الدراسات التي قد تنطوي على العوامل الأخرى التي تعتبر مهمة في فهم أو منع أو علاج التسرب البلازما. وقد تم تحسين هذا البروتوكول على نطاق واسع وتعديل البروتوكولات القائمة، ويجمع بين الموثوقية، وسهولة الاستخدام، والاقتصاد، والتوافر العام للمواد والمعدات، مما يجعل هذا البروتوكول متفوقة للمختبر متوسط لاستخدامها في تحديد كمية التسرب البلازما من الأجهزة.
Introduction
تسرب الأوعية الدموية في الأجهزة تشير إلى التسرب، أو تسرب لبلازما الدم من خلال الثغرات التي أنتجت في البطانة من وظيفة الأوردة الشعرية في الأجهزة. هذا التسرب البلازما أو زيادة نفاذية الأوعية الدموية، التي قد تنشأ من بعض نوع استجابة التحريضية، قد يؤدي إلى عواقب خطيرة. وبالتالي، فمن المهم أن دراسة هذه الظاهرة وأسبابها، والمغيرون، وعواقبه، ويفهم، وعلى نحو مماثل، أن المحققين لديهم جيدة الأدوات والبروتوكولات الملحقة بها لدراستها. الثغرات غشائي قد تنتج عن طريق عدد من المحفزات، ولكن عادة ما يتم إنتاجها بفعل العصبية الببتيد و/أو تاتشيكينينس على الجهاز. أحد الوسطاء طبيعيا الرئيسية لهذه العملية، مما يؤدي إلى زيادة البلازما التسرب، هو أونديكابيبتيدي تاتشيكينين نيوروبيبتيدي، فماده1.
أساليب التحقيق وقياس نفاذية الأوعية الدموية أو التسرب البلازما، التي تستخدم خاصية الربط الزلال من صبغة زرقاء إيفانز، قد وضعت، وعادة ما تكون معروفة بدقتها، البساطة، والاقتصاد، والسلامة، وقدرة على السماح تحديد التسرب البلازما من أنسجة عدة في وقت واحد، إذا كان الأمر كذلك المطلوب2،3،4،،من56،،من78،9 . هذا البروتوكول إيفانز الأزرق لتقييم التسرب البلازما في الأجهزة من الفئران ففبن يستخدم كل هذه، ولكنها تضيف بعض التعديلات الهامة التي تجعل من عموما مفيدة وقابلة للتكيف للدراسات المستقبلية، التي تشمل المختبر متوسط التي تنظم أو سوف إجراء دراسات هامة من العوامل المرتبطة بالتسرب البلازما أو نفاذية الأوعية الدموية. في هذا البروتوكول، وهو عرض فماده للفئران نمول 1/كغ، التي تقوي التسرب البلازما ب 1.5-fold. وهذا يزيد من الحساسية للبروتوكول، وأسفر عن نتائج قابلة للملاحظة ويمكن الحصول عليها بسهولة أكبر. قد تستخدم العوامل الأخرى التي تؤثر على نفاذية، مثل الببتيدات الأخرى المختلفة، والمواد الكيميائية، أو بعض أشكال الإصابة السامة، أو درس بمختبرات أخرى، كما هو مطلوب. وتستخدم حقن الوريد في هذا البروتوكول ﻹدخال الأزرق إيفانز ومضمون فالنظاميه، الأمر الذي يتطلب جراحة المحطة الطرفية. حبل الوريد الحقن5،،من710، حتى بعد النظر في التقنيات الجراحية اللازمة المحطة الطرفية، غير أسهل السيطرة ويؤدي إلى إنتاج نتائج أكثر اتساقا أكثر من دولة أخرى الحقن الوريدية، بما في ذلك الذيل الوريد الحقن4،9. على الرغم من أنه قد يكون من الممكن إيفانز الأزرق سيدلي به حقن الجيوب الوريدية الرجعية-المداري، لا مراجع في الأدب قد وجد أن استخدام هذا الأسلوب لتسليم الأزرق إيفانز. بيد أما بالنسبة لحقن الوريد الذيل، درجة عالية من الخبرة والممارسة لتكاثر إتقان هذا الأسلوب إلى حد كبير حدود استعماله لنجاح إيفانز الأزرق الحقن. وفي المقابل، أسلوب الحقن بالوريد البديلة كما هو موضح في البروتوكول، ولدينا يقدم حلاً يمكن الحصول عليها من الناحية الفنية. تنفيذ إجراء حاسما لنضح عروق الماوس، فقط بعد التضحية بالماوس perfused الأزرق إيفانز، يزيل صبغ إيفانز الأزرق الزائدة، وقد تم توحيدها في هذا البروتوكول. الأساليب المذكورة سابقا من نضح قد درست بعناية وتعديلها للحصول على الإجراء الحالي. التعديلات الأخرى الموصوفة هنا جميع الأمثل ومباشرة، وغير مكلفة.
هناك بعض القيود الهامة للأسلوب صبغة زرقاء إيفانز. على سبيل المثال، قد تمنع حساسية منخفضة في بعض الأحيان المرتبطة بهذا الأسلوب بعض الفحص الإجمالي المرضية ونسيجية إضافية من الأنسجة من إيفانز الأزرق حقن الحيوانات. ومع ذلك، هذه وغيرها من القيود التي أدت إلى تطوير طرق بديلة والنماذج التي، على الرغم من ذلك، لا تزال تستخدم إيفانز الأزرق. قياس الأزرق إيفانز بالأسفار (بدلاً من مدى البصر) التحليل الطيفي قد تزيد حساسية الأسلوب. بالإضافة إلى ذلك، وضعت الأسفار مجهرية من الأنسجة الملطخة بالأزرق إيفانز للسماح لمراقبة تسرب الأوعية الدموية في مواقع متميزة أكثر11. أيضا، كامل الجسم التصوير والمسح الحيوانات الحية سابقا حقن مع إيفانز الأزرق12 يسمح للتحقيق في تركيزات إيفانز الأزرق بطريقة مستمرة، بدلاً من واحدة خاصة باختيار وقت نقطة من التجربة. ومع ذلك، هذا الأسلوب يتطلب توافر مرافق التصوير المناسبة، وقد تكون مكلفة للغاية. تعديلات تشمل إيفانز الأزرق والمؤداة في نوع في المختبر من النموذج، كما هو الحال في خلية الثقافة أو الفرخ النموذجي تشوريوالانتويك13 (كام) أيضا قد وصف. هذه النماذج تتم مراقبتها بواسطة الأسفار والفحص المجهري إينترافيتال14 ، والسماح للتحديد الكمي للتغييرات نفاذية الأوعية الدموية على مر الزمن، ولكن قد تثير مسائل تتعلق بالنمذجة الدقيقة في فيفو الظروف وقد تكون أيضا باهظة الثمن.
وهناك أساليب أخرى لتحديد وقياس تسرب الأوعية الدموية أو النفاذية، التي لا تنطوي على إدارة إيفانز الأزرق. قد تستخدم هذه الأساليب جزيء فلوري مناسبة (مثل الزلال أو فلوريسسين)، أو جزيء المعلمة نظير مسماة أو خلاف ذلك، الحيوانات الحية (أو إلى الخلية الثقافة أو تشوريوالانتويك (كام) نماذج13، تليها غير الغازية التصوير (المسح الحيوانات الأليفة، التصوير بالرنين المغناطيسي، مجهرية إينترافيتال، ومسح الجسم بأكمله) أو بواسطة الغازية التصوير (مجهر فلوري)3،،من1215. على الرغم من أن هذه التقنيات قد توفر عددا من المزايا أكثر من غيرها إيفانز أساليب الأزرق، لديهم أيضا العيوب، التي قد تتضمن تعقيدات كبيرة، والخبرة المطلوبة، ومواردها، وارتفاع التكاليف النقدية.
نيبريليسين16 (peptidase الإنزيم NEP، المعروف أيضا CD10 أو مدام أو انكيفاليناسي) قد اقترح أن تشارك في منع التسرب البلازما، على الأقل جزئيا، من خلال التمثيل الغذائي الانزيمية والمنظمة الذاتية الجوهر ص وهكذا، في الأنسجة التي يحدث فيها بيبتيداسي الخلية السطحية NEP، قد يكون هناك تخفيف أثر فالجوهر، يفترض بنشاط بيبتيداسي NEP.
في البداية، قمنا باختبار للتسرب الناجم عن فماده البلازما استخدام هذا البروتوكول إيفانز الأزرق المعدلة، مع نوع البرية ففبن (وزن) والفئران (كو) بالضربة القاضية NEP. كان يشتبه في تورط NEP في التسرب المعقم فماده البلازما من هذه الدراسات الأولية، ونحن تصف هذه، وكذلك تجارب دور تشمل NEP في التسرب البلازما. ومع ذلك، التركيز في هذه المخطوطة ليست NEP أو دورها في التسرب البلازما، ولكن بدلاً من التسرب البلازما التجارب نفسها. النتائج NEP هي الممثل لهذا النوع من النتائج التي يمكن الحصول عليها من خلال استخدام هذا البروتوكول المعدل. وقد الأمثل الأسلوب إيفانز الأزرق لقياس التسرب البلازما وتعديلها، كما هو موضح بالتفصيل أدناه للفئران ففبن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتلت جميع المبادئ الدولية والوطنية، و/أو المؤسسية من التوجيهية المطبقة لرعاية واستخدام الحيوانات (الفئران) في التجارب الموصوفة في هذه المخطوطة.
يستخدم هذا الأسلوب ففبن الفئران الكبار، الذين تتراوح أعمارهم بين 16-20 أسبوعا، تبين أن أمثل لأغراض هذه الدراسة. 1 اليوم الخطوات من 1-5 ويوم 2 تشمل الخطوات 6-7 (الشكل 1).
1-معدات التحضير
- تأمين إمدادات كافية من المحاقن المعقمة، والمتاح والإبر، وإذا استخدم كالمخدر الكيتامين/إكسيلازيني (على النحو الموصى به). إذا تم استخدام إيسوفلوراني كالمخدر، التحقق من خزان الأكسجين ومستوى السائل إيسوفلوراني للتأكد من أن هناك إمدادات كافية للتجربة قبل البدء. كما أن تجميع نوسيكوني التنفس الدوائر وإرفاقها بمربع التعريفي؛ إرفاق الدموع الفحم الجديدة للدوائر في التنفس. إعداد مربع التعريفي بتحول على الأكسجين، والتأكد من أن يقرأ المرحلة الثانية حوالي 50 رطل/بوصة مربعة.
- قم بتشغيل لوحة التدفئة إلى 37 درجة مئوية.
- إعداد التحقيق درجة حرارة المستقيم لعملية جراحية.
2. إعداد الماوس
وتشمل هذه الخطوة التخدير، وإزالة الشعر، وتحديد المواقع (ففبن الفئران-سن البلوغ 16-20 أسبوعا).
- وزن الفئران وتسجيل الأوزان.
- تخدير الفئران.
- إدارة الملكية الفكرية الكيتامين و xylazine (80-100 مغ/كغ و 7.5-16 مغ/كغ، على التوالي). ومع ذلك، من المستحسن أن تبدأ بجرعات أقل من الكيتامين و xylazine (حول 30 ملغ/كغ و 6 مغ/كغ، على التوالي).
- المحافظة على التخدير مع حوالي 0.1-0.25 مرات الأولى جرعات من الكيتامين/xylazine طوال عملية جراحية. الكيتامين و xylazine، مخدر (المحليون) الاختيار في هذه الدراسة خاصة، كما لوحظت أكثر من إمكانية تكرار نتائج والبقاء على قيد الحياة. يمكن الاطلاع على مخدر (المحليون) الاختيار في دراسات أخرى أن تكون مختلفة. إذا تم استخدام إيسوفلوراني، ضع الماوس في دائرة التعريفي وقم بتشغيل إيسوفلوراني إلى 5% حتى الماوس يفقد وعيه الكامل. ثم استخدم نوسيكوني الآنف تعيين في إيسوفلوراني 1.5-2.5 في المائة طوال ما تبقى من هذا الإجراء.
- مراقبة الفئران كل دقيقة 2-3 برشة إصبع القدم للتأكد من ملائمة عمق التخدير.
- حلاقة منطقة الرقبة البطني من الماوس.
- ضع الماوس في وضع ضعيف على لوح مسخن. تأمين آثار أقدام واقدام من الماوس على سطح الجراحية مع الشريط.
- ضع مرهم المسيل للدموع الاصطناعية على العينين لمنع الجفاف أثناء الجراحة.
3-العمليات الجراحية التفاصيل
- جعل شق 1 سم في الرقبة حق البطني أكثر من حبل الوريد.
- تطبيق قطرات واحد أو اثنين من يدوكائين (1-2 ٪) في منطقة شق لإدارة الألم وتعزيز توسع الأوعية. انتظر 2 دقيقة ليدوكائين المفعول.
- فضح وعزل حبل الوريد الداخلي الحق عن طريق تشريح كليلة. ربط الوريد قبالة مع خياطة 4-0، وسحب بلطف نهاية السفينة مع هيموستات روسترال. قطع حفرة، استخدام مقص جيد، حوالي 3 مم أدناه أو والذيلية للتعادل، تقريبا في منتصف الطريق من خلال قطر الوريد.
- مارك قسطرة البولي فينيل الكهروضوئية-1 1.5 سم من النهاية وأدخله في الوريد من خلال الثقب في استخدام ديلاتور سفينة، والخيط القسطرة نهاية والذيلية للسفينة، وحوالي 1.5 سم.
- التعادل القسطرة بأمان داخل الجزء والذيلية من السفينة (تحت القص) مع الحرير 4-0. ربط الجزء روسترال من السفينة إلى خارج القسطرة مع نهايات فضفاض خياطة الجروح التي استخدمت لربط قبالة روسترال حبل الوريد، في الخطوة 3، 3.
- تك الجلد فضفاضة معا مرة أخرى حول القسطرة مع الحرير 4-0 للمساعدة في منع فقدان حرارة الجسم وجفاف الأنسجة.
- توصيل القسطرة بحقنه تحتوي على هيبارينيزيد المالحة (10 U/mL) وتدفق القسطرة.
4-حقن
- حقن قسطرة الوريد، تليها كمية صغيرة من المحلول الملحي هيبارينيزيد لمسح الخط الحل إيفانز الأزرق (50 ميكروليتر من حل 30 ملغ/مل في المحلول الملحي العادي، أونهيبارينيزيد 0.9 في المائة، أو ما يقارب 50 مغ/كغ).
- 2 دقيقة في وقت لاحق، حقن مادة ف (100 ميكروليتر من حل 0.3 ميكرومتر في المحلول الملحي العادي، أونهيبارينيزيد 0.9%، أو نمول 1/كجم)، تليها كمية صغيرة من المحلول الملحي هيبارينيزيد لمسح الخط. فماده تقوي التسرب بروتينات البلازما من خلال الطبقة غشائي؛ في هذا البروتوكول، فإنه يدفع بشكل روتيني زيادة قيم التسرب البلازما 1.5-fold تقريبا، مما يجعل البلازما القيم التسرب الأسهل لقياس.
- انتظر 18 دقيقة بعد أن يتم حقن مادة P. خلال هذا الوقت، سوف حجته الصبغة الزرقاء إيفانز وتعميمها.
- إنهاء هذه التجربة 18 دقيقة بعد حقن مادة ف (20 دقيقة بعد الحقن إيفانز الأزرق) بالتضحية بالماوس مع التفكك عنق الرحم. ومن المرجح أن الماوس يمكن أن مباشرة سيرفيكالي خلع، دون إعطاء أول جرعة زائدة من مخدر، أن الفأر هو على الأرجح لا يزال جيدا أنيسثيتيزيد من الجراحة. ومع ذلك، إذا لزم الأمر، جرعة زائدة من المسكنات الكيتامين/إكسيلازيني أو إيسوفلوراني، أو بينتوباربيتال قد تمنح، يليه سرطان عنق الرحم التفكك.
5-عزل الأجهزة
- قص فتح تجويف الصدر من الماوس والجاذبية-نتخلل (من على ارتفاع حوالي 51 سم أو 20 بوصة) بالقلب والأوعية الدموية مع 50 مل سترات الصوديوم 50 مم، 3.5 درجة الحموضة. يفترض أن يحفظ pH 3.5 ملزمة إيفانز الأزرق للزلال.
- المكوس الأجهزة ذات الصلة (الأنسجة) 1-5 مع مشرط تشريح (المثانةمثل الكلي، المعدة، الكبد، البنكرياس، القريبة أو البعيدة القولون، الدقاق، العفج، الجلد الجناح، آذان، الذيل، القلب والرئتين) وإزالة أي محتويات المتبقية، إذا الحالية.
- شطف الأجهزة في درجة حرارة الغرفة (RT) مخزنة الفوسفات المالحة (برنامج تلفزيوني؛ ز 1.44 غ2HPO4، 0.24 ز خ2PO4, 8.0 g من كلوريد الصوديوم، وز 0.20 من بوكل في 1 لتر، درجة الحموضة 7.4).
- لطخة الأجهزة مع الأنسجة وقطع كل جهاز في النصف، وتزن كل نصف (الرطب الأوزان، في ز).
- الجاف لواحد نصف الأنسجة في فرن تجفيف عند 150 درجة مئوية، في إحباط، عن ح 48.
- ضع الأنسجة الأخرى نصف في وحدة متسقة (تصل إلى 200 ميليلتر) من ميثلامين في [ميكروفوج] أنابيب ح 48 (وما يصل إلى 72 ساعة) لاستخراج إيفانز الأزرق.
6-قياس الأنسجة OD
- إزالة 50 ميليلتر من ميثلامين الأزرق-أكسب إيفانز (بعد 48-72 ح RT الحضانة) من [ميكروفوج] أنابيب ومكان في بئر واحدة للوحة البوليستيرين 96-جيدا. كن حذراً لا لنقل قطع الأنسجة جنبا إلى جنب مع ميثلامين.
- مكان 50 ميليلتر من ميثلامين نقية وجديدة في كل من بئرين فارغة من لوحة 96-جيدا للفراغات.
- قياس وتسجيل OD620 من كل بئر من لوحة 96-جيدا على قارئ لوحة امتصاص. 620 نانومتر هو امتصاص ماكس الأزرق إيفانز.
7-حساب التسرب البلازما
- وزن الأنسجة الجافة النصف الذي تم في الفرن ح 48.
- حساب نسبة وزن جاف الوزن الرطب جهاز معين من الفائدة من كل الماوس الفردية، بدءاً من الوزن الرطب لهذا النسيج نصف (التي تم الحصول عليها في الخطوة 5.4)، مقسوماً الوزن الجاف لهذا النسيج نفسه نصف (التي تم الحصول عليها في الخطوة 7، 1).
- حساب الوزن الجاف (في ز) الأنسجة نصف في ميثلامين بقسمة الوزن الرطب من الأنسجة النصف قبل أنه وضع في ميثلامين (التي تم الحصول عليها في الخطوة 5، 4) بواسطة الرطب: نسبة الوزن الجاف لجهاز معين للفائدة (المحسوبة في الخطوة 7، 2).
- حساب القيم620 OD تصحيحه . بدءاً OD620 القيمة من كل بئر تجريبية للوحة 96-جيدا (التي تحتوي على ميثلامين الأزرق-أكسب إيفانز من كل الأنسجة، والتي تم الحصول عليها في الخطوة 6.3)، طرح فارغ جيدا قيمة620 OD (يعني OD620 قيمة OD بئرين المحتوية على ميثلامين نقية، أعدت في الخطوة 6، 2،620 القيم التي تم الحصول عليها في الخطوة 6.3) من كل قيمة تجريبية.
- حساب قيمة التسرب البلازما بقسمة OD المصوبة620 (المحسوبة في الخطوة 7، 4) الوزن الجاف للأنسجة نصف في ميثلامين (المحسوبة في الخطوة 7، 3). وستكون وحدات بلازما التسرب OD620/g الوزن الجاف.
- تحليل البيانات وصريح كالمتوسط ± "sem. إحصائيا" مقارنة مجموعات اختبار t أو تحليل التباين أحادي الاتجاه واختبار متعددة-مقارنة في Scheffé (lycofs01.lycoming.edu)، حسب الاقتضاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في الشكل 1، تخطيطي للإجراء الذي يظهر، التي تم العثور عليها لتؤدي القيم التسرب البلازما المستحثة فماده موثوقة ومتسقة من الأجهزة للفئران ففبن. هذا الإجراء عادة ما يستغرق يومين عمل، مفصولة بواسطة مالا يقل عن 48 ساعة وقت الانتظار. فمن الممكن انتشرت حتى أكثر من ذلك، إذا كان يتم ذلك دائماً لجميع التجارب بالمقارنة. على سبيل المثال، بعد أن يتم عزل الأجهزة في اليوم 1، الأجهزة يمكن فلاش المجمدة في النتروجين السائل وتخزينه في-80 درجة مئوية؛ بعد ذوبان الجليد بعناية الأجهزة (في غضون بضعة أيام إلى أسبوع واحد)، ويمكن غسلها في برنامج تلفزيوني ومسح قبل بقية البروتوكول. أيضا، على الرغم من جفاف الأنسجة وينبغي أن يتم كما ذكر (عند 150 درجة مئوية ح 48)، استخراج إيفانز الأزرق الأنسجة نصف في ميثلامين قد تمدد من 48-72 ساعة، ما دام الوقت في ميثلامين متسقة لجميع التجارب.
هو مبين في الشكل 2 و الجدول 1 بيانات تثبت البلازما المستحثة بمضمون فالتسرب من الخزانات البولي ففبن البرية نوع (WT) والفئران NEP خروج المغلوب (كو)17، التي كانت متاحة أساسا بسبب هذا المختبر منذ أمد بعيد من المصالح في NEP والتنظيم والإجراءات neuropeptides المحددة،من18إلى19. لا تعبر الفئران كو NEP NEP في أي أنسجة. ومع ذلك، هو أعرب عن NEP داخل المثانة البولية من وزن الفئران، لو على مستويات منخفضة20،،من2122. الشكل 2 و الجدول 1 تشير إلى هناك فرق في البلازما المستحثة بمضمون فالتسرب من الخزانات البولي من هاتين المجموعتين من الفئران. وهذا يعني دوراً ل NEP في البلازما المستحثة بمضمون فالتسرب من المثانة البولية، نظراً للتعبير عن NEP يحتمل أن الفرق الرئيسي في أكياس البولي الفئران WT و NEP كو.
نظراً لأن البيانات الأصلية المقترحة دور محتمل للسياسة البيئية الجديدة في التسرب الناجم عن فماده البلازما في المثانة البولية (الشكل 2 و الجدول 1)، قررنا أن أكمل التحقيق في تورط NEP في التسرب البلازما في مكان آخر الجهاز. أولاً، أنشأنا ماوس مضاعف المعدلة وراثيا إلى أوفيريكسبريس NEP عالمياً تقريبا23. يسمح هذا الفأر هندسيا مقارنة البيانات من ثلاثة أنواع من الفئران ففبن: وزن الفئران16، التي بطبيعة الحال تعبر عن كمية محدودة من NEP في أنسجة عديدة؛ كو NEP الفئران17، التي تعبر عن لا NEP في أي أنسجة؛ ولدينا مضاعف المعدلة وراثيا NEP أوفيريكسبريسور الفئران23، NEP التي أوفيريكسبريس في تقريبا جميع الأنسجة لدى إدارة الدوكسيسيكلين. الفئران ويسمح بحرية الوصول إلى المحتوية على الدوكسي تشو لمدة أسبوع واحد قبل الجراحة (الشكل 1)؛ الجرعة الدوكسي 1 ملغ/كغ تشو، أوندييد. وردت تفاصيلها تشييد هذه الفئران المعدلة وراثيا مضاعف أن أوفيريكسبريس NEP، مع وصف لفحوصات NEP، والغرب، ومرناً NEP qPCR23.
ويبين هذا البروتوكول مع هذه 3 أنواع من الفئران، بدور ل NEP في التسرب البلازما في الأنسجة بما في ذلك العفج23 (الشكل 3 و الجدول 2). في هذه التجارب، overexpression NEP في الفئران أوفيريكسبريسور NEP مضاعف المحورة وراثيا تم تشغيله بالتغذية، تشاو 1 أسبوع قبل يوم 1، التي تتضمن الدوكسي (أوندييد؛ تشاو الدوكسي/mg 1 ملغ، الشكل 3). كعنصر تحكم، تم تغذية بعض الفئران WT وكو NEP أيضا تشاو الدوكسيسيكلين أوندييد خلال الأسبوع السابق ليوم 1 (الشكل 3ب و 3 ج).
وأكد الفئران أوفيريكسبريسور تغذية الدوكسي تشو لتأكيد دور NEP في البلازما التسرب إلى في العفج ففبن الفئران، التعبير عن NEP في العفج WT ففبن و NEP (المعدلة وراثيا على نحو مضاعف) تحليل الغربية مع جسم [بولكلونل] ضد NEP البشرية (التي كروسريكتس مع الماوس NEP)23. وأكدت هذا التحليل WT دودينومس مقادير معتدلة من البروتين NEP، لكنها دودينومس أوفيريكسبريسور NEP إكسبريس 2-3 x مبالغ NEP التي أبدتها دودينومس WT. الفئران NEP كو، بحكم التعريف، لا تعبر عن أي NEP في العفج.
الشكل 1: المخطط العام للبروتوكول لقياس التسرب البلازما المستحثة بمضمون ف. التخطيطي للبروتوكول لقياس التسرب الناجم عن فماده البلازما من الأجهزة الفئران ففبن (سن 16-20 أسبوعا). هذا البروتوكول يشمل قياس التسرب البلازما الأنسجة بطريقة صبغة زرقاء إيفانز عن طريق الحقن في الوريد، وتتضمن مناشئ تدار فالجوهر، للحصول على البلازما المعزز وقياسها بسهولة التسرب القيم، بوحدات OD620/g الوزن الجاف. بروتوكول وصف قد وجد أن ينتج متسقة البلازما المستحثة بمضمون فالتسرب القيم من مختلف أجهزة ففبن الفئران، ويأخذ الحد ني يومين عمل. يتم فصل مالا يقل عن 48 ساعة وقت الانتظار للأنسجة الجافة واستخراج يوم 1 ويوم 2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : البلازما المستحثة بمضمون فالتسرب من المثانة البولية من الفئران WT و NEP كو- تعززها الإدارة فماده المثانة البلازما التسرب من الفئران ففبن (دون الدوكسي السابقة) ومعبرا عنها OD620 شمال البحر الأبيض المتوسط/غرام وزن جاف. أكياس البولي بمعزل عن نوع البرية ففبن (WT; شريط أبيض، n = 12) أو خروج المغلوب NEP ففبن (كو؛ وشريط أسود، n = 7) الفئران وتعرض للبروتوكول للتسرب البلازما كما هو مفصل أعلاه. وترد في الجدول 1القيم الفردية. تمثل الخطوط أعلاه الأشرطة الخطأ المعياري للوسط (SEM). القيم WT وكو NEP اتجاها نحو أ ف فرق كبير = 0.051 باختبار t. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : البلازما المستحثة بمضمون فالتسرب من العفج من الفئران أوفيريكسبريسور WT NEP كو و NEP. (أ-ج) التسرب البلازما الإثناعشرية تعززها الإدارة فماده ومعبرا OD620/g الوزن الجاف. دودينومس (A) كانت معزولة من الفئران WT ففبن دون الدوكسي السابقة (-؛ الأبيض بار، ن = 5)، كو NEP الفئران دون الدوكسي السابقة (-؛ والخفيفة شريط رمادي، ن = 5)، NEP أوفيكسبريسور الفئران المعدلة وراثيا مضاعف دون الدوكسي السابقة (DT-؛ وشريط رمادي داكن، n = 5) أو NEP الفئران المعدلة وراثيا مضاعف أوفيكسبريسور مع الدوكسي السابقة (DT +؛ أسود بار، n = 4) وتعرض للبروتوكول للتسرب البلازما كما هو مفصل أعلاه. تمثل الخطوط أعلاه الأشرطة sem. على الرغم من أن قيم NEP كو (-) اتجاها أعلى من الوزن (-) أو ديناراً (-) القيم، وهذا الفرق لم يكن معتدا به إحصائيا. بلازما الإثناعشرية التسرب القيم قد انخفضت بشكل ملحوظ فقط مع مجموعة الدوكسي تغذية، NEP أوفيكسبريسور الفئران المعدلة وراثيا مضاعف (DT +)، مقارنة بجميع الآخرين (* p < 0.05، تحليل التباين). (ب، ج) قيم البلازما الإثناعشرية التسرب من الفئران WT وكو NEP لم تتأثر إلى حد كبير بالإدارة الدوكسي (ف < 0.05). (ب) وزن الفئران دون الدوكسي (WT-؛ وشريط أبيض، ن = 5) والفئران WT مع الدوكسي (WT +؛ والمتوسط شريط رمادي، n = 7). (ج) NEP كو الفئران دون الدوكسي (كو-؛ وشريط رمادي الخفيفة، n = 5) و NEP كو مع الدوكسي (كو +؛ والمتوسط شريط رمادي، n = 2). القيم الفردية كما هو موضح من مركب في ألف، وباء، وجيم، وترد في الجدول 2. تتكرر مع تعديل طفيفة من سبرينغر المجلة المادة23 بإذن من العلم سبرينغر + وسائط الإعلام التجارية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| النمط الوراثي | الجنس | نسبة الوزن الرطب/الجافة من المثانة | الرطب وزن مثانة البولية النصف (ز؛ وفي 85 ميكروليتر ميثلامين) | حساب الوزن الجاف من المثانة البولية النصف (ز) | OD 620 نانومتر-فارغة | OD 620 نيوتن متر/غرام وزن جاف (المثانة) |
| WT | و | 4.737 | 0.0038 | 0.0008 | 0.0150 | 18.750 |
| WT | M | 4.632 | 0.0045 | 0.0010 | 0.0100 | 10.000 |
| WT | و | 4.700 | 0.0048 | 0.0010 | 0.0280 | 28.000 |
| WT | و | 4.625 | 0.0068 | 0.0015 | 0.0230 | 15.333 |
| WT | و | 4.546 | 0.0077 | 0.0017 | 0.0400 | 23.529 |
| WT | M | 4.800 | 0.0094 | 0.0020 | 0.0570 | 28.500 |
| WT | M | 5.500 | 0.0095 | 0.0017 | 0.0240 | 14.118 |
| WT | و | 4.316 | 0.0098 | 0.0023 | 0.0660 | 28.696 |
| WT | M | 5.061 | 0.0121 | 0.0024 | 0.0400 | 16.667 النسبة |
| WT | M | 5.061 | 0.0192 | 0.0038 | 0.0330 | 8.684 |
| يعني +/--ووزارة شؤون المرأة (من الإدخالات في العمود أعلاه) | 4.798 +/--0.105 | 0.0088 +/--0.0014 | 0.0018 +/--0.0003 | 0.0336 +/0.0056 | 19.228 +/--2.393 | |
| كو | M | 4.316 | 0.0196 | 0.0045 | 0.1610 | 35.778 |
| كو | M | 4.600 | 0.0134 | 0.0029 | 0.1020 | 35.172 |
| كو | M | 4.377 | 0.0104 | 0.0024 | 0.0410 | 17.083 |
| كو | M | 4.727 | 0.0258 | 0.0055 | 0.1410 | 25.636 |
| كو | و | 4.539 | 0.0025 | 0.0006 | 0.0250 | 41.667 |
| كو | M | 4.457 | 0.0149 | 0.0033 | 0.1420 | 43.030 |
| يعني +/--ووزارة شؤون المرأة (من الإدخالات في العمود أعلاه) | 4.503 +/--0.062 | 0.0144 +/--0.0032 | 0.0032 +/--0.0007 | 0.1020 +/--0.0233 | 33.061 +/--4.065 |
الجدول 1: البلازما المستحثة بمضمون فالتسرب من المثانة البولية من الفئران WT وكو NEP الفردية- قيم البلازما التسرب من الفئران ففبن (دون الدوكسي السابقة) أبديت منفردة ك OD620 شمال البحر الأبيض المتوسط/غرام وزن جاف، من "وزن ففبن" (n = 12) أو كو NEP (n = 7) الفئران وتعرض للبروتوكول للتسرب البلازما كما هو مفصل أعلاه. لم توجد فروق بين الجنسين كانت واضحة في قيم التسرب البلازما. أكياس البولي كانت معزولة؛ وترد القيم الفردية لنسبة الوزن الرطب/الجافة محسوب من المثانة، الوزن الرطب من المثانة البولية النصف في ميثلامين، والمحسوب الوزن الجاف من المثانة البولية النصف في ميثلامين (في ز)، نانومتر OD620 المصوبة (نموذج OD620 شمال البحر الأبيض المتوسط ناقص نموف meanOD620 الفراغات (نقية ميثلامين)، وقيمة التسرب البلازما المحسوبة في OD620 شمال البحر الأبيض المتوسط/ز (تصحيح OD620 شمال البحر الأبيض المتوسط، مقسوماً على الوزن الجاف المحسوب) الوزن الجاف. واستخدمت قيم التسرب البلازما الناتجة لبناء الشكل 2.
| النمط الوراثي والدوكسي تشاو، دون (-) أو (+) | الجنس | نسبة الوزن الرطب/الجافة من العفج | الرطب وزن العفج نصف (ز؛ وفي 85 ميكروليتر ميثلامين) | حساب الوزن الجاف من العفج نصف (ز) | OD 620 نانومتر-فارغة | OD620 شمال البحر الأبيض المتوسط/غرام وزن جاف (العفج) |
| وزن- | M | 4.927 | 0.0307 | 0.0062 | 0.0640 | 10.272 |
| وزن- | و | 4.912 | 0.0172 | 0.0035 | 0.0460 | 13.138 |
| وزن- | M | 5.333 | 0.0281 | 0.0053 | 0.0960 | 18.221 |
| وزن- | و | 5.433 | 0.0375 | 0.0069 | 0.1010 | 14.634 |
| وزن- | M | 5.179 | 0.0287 | 0.0055 | 0.0430 | 7.759 |
| يعني +/--ووزارة شؤون المرأة (من الإدخالات في العمود أعلاه) | 5.157 +/--0.105 | 0.0284 +/--0.0033 | 0.0055 +/--0.0006 | 0.0700 +/--0.0122 | 12.805 +/--1.798 | |
| وزن + | M | 5.342 | 0.0542 | 0.0101 | 0.1520 | 14.981 |
| وزن + | M | 5.653 | 0.0477 | 0.0084 | 0.1120 | 13.272 |
| وزن + | M | 5.700 | 0.0564 | 0.0099 | 0.1110 | 11.218 |
| وزن + | و | 5.542 | 0.0498 | 0.0090 | 0.1430 | 15.914 |
| وزن + | و | 5.723 | 0.0266 | 0.0046 | 0.0470 | 10.112 |
| وزن + | و | 5.186 | 0.0262 | 0.0051 | 0.0470 | 9، 304 |
| وزن + | M | 5.543 | 0.0342 | 0.0062 | 0.0480 | 7.779 |
| يعني +/--ووزارة شؤون المرأة (من الإدخالات في العمود أعلاه) | 5.527 +/--0.075 | 0.0422 +/--0.0049 | 0.0076 +/--0.0009 | 0.0943 +/--0.0175 | 11.797 +/--1.142 | |
| كو- | و | 5.763 | 0.0209 | 0.0036 | 0.0690 | 19.025 |
| كو- | M | 4.232 | 0.0164 | 0.0039 | 0.1010 | 26.061 |
| كو- | M | 4.810 | 0.0227 | 0.0047 | 0.0880 | 18.647 |
| كو- | و | 5.650 | 0.0363 | 0.0064 | 0.0600 | 9.339 |
| كو- | M | 5.212 | 0.0178 | 0.0034 | 0.0640 | 18.739 |
| يعني +/--ووزارة شؤون المرأة (من الإدخالات في العمود أعلاه) | 5.133 +/--0.282 | 0.0228 +/--0.0035 | 0.0044 +/-0.0005 | 0.0764 +/--0.0078 | 18.362 +/--2.659 | |
| كو + | M | 5.128 | 0.0193 | 0.0038 | 0.0600 | 15.941 |
| كو + | M | 5.030 | 0.0459 | 0.0091 | 0.1980 | 21.697 |
| يعني +/--النطاق (للإدخالات في العمود أعلاه) | 5.079 +/--0.049 | 0.0326 +/--0.0133 | 0.0065 +/--0.0027 | 0.1290 +/--0.0690 | 18.819 +/--2.878 | |
| DT- | M | 5.426 | 0.0322 | 0.0059 | 0.0775 | 13.058 |
| DT- | M | 4.255 | 0.0360 | 0.0085 | 0.0895 | 10.579 |
| DT- | M | 4.818 | 0.0306 | 0.0064 | 0.1460 | 22.989 |
| DT- | M | 5.189 | 0.0197 | 0.0038 | 0.0380 | 10.010 |
| DT- | و | 5.500 | 0.0256 | 0.0047 | 0.0390 | 8.379 |
| يعني +/--ووزارة شؤون المرأة (من الإدخالات في العمود أعلاه) | 5.038 +/--0.229 | 0.0288 +/--0.0028 | 0.0059 +/--0.0008 | 0.0780 +/--0.0198 | 13.003 +/--2.3607 | |
| DT + | M | 5.008 | 0.0694 | 0.0139 | 0.0270 | 1.948 |
| DT + | M | 4.750 | 0.0660 | 0.0139 | 0.0070 | 0.504 |
| DT + | M | 5.495 | 0.0587 | 0.0107 | 0.0692 | 6.478 |
| DT + | M | 5.233 | 0.0542 | 0.0104 | 0.0620 | 5.986 |
| يعني +/--ووزارة شؤون المرأة (من الإدخالات في العمود أعلاه) | 5.121--/+ 0.159 | 0.0621 +/--0.0034 | 0.0122 +/--0.0010 | 0.0413 +/--0.0147 | 3.729 +/--1.478 |
الجدول 2: التسرب البلازما المستحثة بمضمون فمن دودينومس من الفئران أوفيريكسبريسور WT NEP كو و NEP الفردية- قيم البلازما التسرب من الفئران ففبن (مع أو بدون الدوكسي السابقة) أبديت منفردة ك OD620 شمال البحر الأبيض المتوسط/غرام وزن جاف، من الفئران WT ففبن (n = 5 دون، ون = 7 مع الدوكسي)، كو NEP الفئران (n = 5 دون، ون = 2 مع الدوكسي)، و NEP أوفيريكسبريسور الفئران المعدلة وراثيا مضاعف (n = 5 دون، و n = 4 مع الدوكسي). تعرض الفئران للبروتوكول للتسرب البلازما كما هو مفصل أعلاه. لم توجد فروق بين الجنسين كانت واضحة في قيم التسرب البلازما. دودينومس كانت معزولة؛ وكانت القيم الفردية المستخدمة في حساب التسرب البلازما كما هو موضح في الجدول1. واستخدمت قيم التسرب البلازما الناتجة لبناء الشكل 3أ-ج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كما نوقش أعلاه، دراسة التسرب البلازما قد تؤدي في نهاية المطاف إلى المعارف الجديدة بشأن الأسباب أو طرق جديدة لمنع أو علاج التسرب البلازما. الاستخدام الناجح لبروتوكول التسرب البلازما (أعلاه)، باستخدام صبغة زرقاء إيفانز، قد تجلى في المخطوطة الحالية. على الرغم من أن البيانات أظهرت مرة أخرى الفرضية القائلة بأن NEP قد تحمي المفرج ضد التسرب البلازما، هدف ثانوي في الوقت الحاضر، مع الهدف الأساسي ويجري تقديم بروتوكولا أمثل الذي قد يمكن استخدامها بسهولة في المختبر متوسط دراسة في المستقبل من التسرب البلازما. بروتوكول أفادت هذه الوثيقة تركز على القدرة على التكيف للدراسات المستقبلية مع الأهداف المختلفة والحيوانات وأجهزة وغيرها من الشروط، ومفيد بشكل خاص لأن هذا البروتوكول سهلة الاستخدام، يمكن الاعتماد عليها، واقتصادا، ويأخذ في الاعتبار العام توافر مواد مشتركة والكاشفات وموظفين أكفاء. تجدر الإشارة، مع ذلك، أن هذا البروتوكول سوف تتطلب قدرا كبيرا من التكرار كل مجموعة من الحيوانات (8-12 التكرار اقترح) للحصول على نتائج صحيحة إحصائيا.
هناك العديد من الدراسات والتقارير التي تتضمن تفاصيل محاولات لقياس نفاذية الأوعية الدموية والتسرب البلازما. حتى الآن، معظم هذه التقارير بالتفصيل التباديل لطرق استخدامها جنبا إلى جنب مع أسلوب صبغة زرقاء إيفانز للتحقيق في التسرب البلازما ونفاذية الأوعية الدموية2،3،،من611، 12،13. وكانت هناك تقارير أقل من أساليب نفاذية الأوعية الدموية التي لا تتضمن إيفانز الأزرق في جميع3،13،،من1524؛ هذه الأساليب الأخرى هي بشكل عام أقل موجوداً للمختبر متوسط، التي تتطلب أساليب معقدة والمعدات المتخصصة والأفراد، وهي مرتفعة بشكل عام.
تطوير البروتوكول إيفانز الأزرق أعلاه ينطوي اختبار التباديل المختلفة وتعديلات كثيرة. التجارب المبكرة تركزت على محاولات لحقن إيفانز الأزرق عن طريق الوريد ذيل الماوس. ومع ذلك، ذيل حقن الوريد أثبتت تحديا تقنيا وأسفرت عن نتائج غير متناسقة، مما يستلزم إدراج حقن الوريد والمحطة الطرفية التقنيات الجراحية المذكورة أعلاه. كانت العديد من التجارب الأولية كما فعلت تحاول أن تجد التركيزات المناسبة إيفانز الأزرق والجوهر ص لم يتم العثور على المبلغ المحدد للأزرق إيفانز ضرورة حتمية، طالما كان أقل حوالي 200 مغ/كغ (بالمقارنة مع 50 مغ/كغ المستخدمة حاليا)، ولكن المهم مقدار فالمواد المستخدمة في هذه التجارب. بعد الكثير من التجريب، وجد أن تركيز مثالية من مناشئ أضيفت مادة ف، مما أدى زيادة 1.5-fold إلى (وهكذا يمكن قياسها بسهولة أكبر) نمولي 1/كغ البلازما التسرب القيم. ووجد أيضا، أنه يجب أن يسمح الوقت الكافي للأزرق إيفانز حجته (> 10 دقيقة). تم العثور على نضح الأوعية الدموية لإزالة الزائدة إيفانز الأزرق، بعد تضحيات للماوس ولكن قبل عزل الجهاز، لتكون عنصرا أساسيا في هذا البروتوكول، خلافا لغيرها من البروتوكولات التي لا تتضمن هذه الخطوة نضح4. بيرفوساتي (ألقاه تدرج جاذبية لطيف) هو 50 مل حل 3.5 درجة الحموضة (التي تشجع ملزمة الأزرق إيفانز والزلال)؛ بارافورمالدهيد، منتشرة في العديد من غيرها إيفانز البروتوكولات الأزرق6،10،25، محذوفاً في هذا البروتوكول. وثمة عامل آخر قد تم حلها في هذا البروتوكول أن الصبغة المستخدمة في تشاو الدوكسي يتداخل مع قياس نانومتر OD620 الأزرق إيفانز في الأنسجة من المسار الهضمي. وبالتالي، من الضروري استخدام الدوكسيسيكلين أوندييد تشو في التجارب المذكورة أعلاه. أيضا، استنتاج الهام والمفيد هو أن ما يقرب من أي جهاز الماوس مرضية معزولة وبحثت عن طريق هذا البروتوكول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
الكتاب أود أن أشكر أندي بوكزوبوت والدكتور ميكو يشيشينسكي على مساعدتها القيمة والتحرير إلى هذه المخطوطة. تدعمها المنح الواردة من قلب الوطنية والرئة والدم معهد (نهلبي RO1 HL078929، HL014985 اندستريز و RO3 HL095439) وإدارة لشؤون المحاربين القدماء (استعراض الجدارة).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| isoflurane | Vet One | 200-070 | inhaled anesthetic |
| ketamine | Vet One | 200-055 | injectable anesthetic |
| xylazine | Lloyd Laboratories | 139-236 | injectable anesthetic |
| syringes (10,3 & 1 cc) | Becton Dickinson | 309604, 309657, 309659 | |
| needles (20G1,23G1 & 26G1/2) | Becton Dickinson | 305178, 305193, 305111 | |
| isoflurane induction chamber | VetEquip | 941443 | 1 Liter |
| nosecone breathing circuits | VetEquip | RC2 | Rodent Circuit Controller 2 |
| oxygen tank | Airgas | UN 1072 | 100% medical |
| heating pad | CWE Inc. | TC-1000 | temperature controller |
| rectal temperature probe | CWE Inc. | 10-09012 | mouse |
| balance (for rodents) | Ohaus | CS 2000 | |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 15000-00 | Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11151-10 | Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13009-12 | Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools -suture drivers | Fine Science tools | 12502-12 | Olsen-Hegar suture drivers (suturing) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11627-12 | Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14110-15 | Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 18025-10 | suture tying forceps (used for Millar cath) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14078-10 | Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14082-09 | Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11051-10 | 10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11251-35 | Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels) |
| surgical tools-retractors | Fine Science tools | 17012-11 | Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11294-00 | Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11297-00 | Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14058-11 | tough cut iris scissors (mouse dissection, bones) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11009-13 | serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13003-10 | Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11006-12 | Adson serrated forceps (tissue grasping) |
| clippers | Oster | A5 | |
| tape | Fisherbrand | 159015G | |
| artificial tear ointment | Akorn Inc | 13985-600-03 | |
| lidocaine | Hospira | 0409-4277-01 | 2% injectable |
| polyvinyl catheters | Tygon | PV-1 | |
| Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Substance P | Bachem | H-1890 | |
| heparin | Sagent Pharmaceuticals | 25201-400-10 | 1000 U/ml |
| saline solution | Hospira | 0409-7138-09 | 0.9% sodium chloride |
| phenobarbital | Vortech | 0298-9373-68 | |
| sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417-50TAB | |
| Kimwipes for blotting | Fisher Scientific | 06-666A | |
| formamide | Sigma Aldrich | 47670 | |
| microbalance | Denver Instrument | APX-60 | |
| microfuge tubes | Fisher Scientific | 07-200-534 | |
| polystyrene 96 well plate | Becton Dickenson | 351172 | |
| absorbance plate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| polyacrylamide gels | Bio-Rad | 3450014 | |
| protein molecular weight standard | Bio-Rad | 1610374 | |
| Protran supported nitrocellulose | Amersham (GE) | 10600015 | |
| gel box | Bio-Rad | 1658005 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P-1379 | |
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| primary NEP polyclonal antibody | R & D Systems | AF1182 | |
| doxycycline chow | Teklad (HARLAN) | TD.130750 | |
| FVB/NJ wild type mice | Jackson | 001800 | |
| secondary antibody (goat anti-rabbit) | ZyMed | 81-6120 | |
| ECL solution-Western Lightening Plus | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| film | Pierce | 34091 |
References
- Snijdelaar, D. G., Dirksen, R., Slappendel, R., Crul, B. J.
- Rubinstein, I., Iwamoto, I., Ueki, I. F., Borson, D. B., Nadel, J. A. Recombinant neutral endopeptidase attenuates substance P-induced plasma extravasation in the guinea pig skin. Int Arch Allergy Appl Immunol. 91 (3), 232-238 (1990).
- Szabo, A., Menger, M. D., Boros, M. Microvascular and epithelial permeability measurements in laboratory animals. Microsurgery. 26 (1), 50-53 (2006).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. J Vis Exp. (73), e50062 (2013).
- Moitra, J., Sammani, S., Garcia, J. G. Re-evaluation of Evans Blue dye as a marker of albumin clearance in murine models of acute lung injury. Transl Res. 150 (4), 253-265 (2007).
- Figini, M., et al. Substance P and bradykinin stimulate plasma extravasation in the mouse gastrointestinal tract and pancreas. Am J Physiol. 272 (4), Pt 1 785-793 (1997).
- Awad, A. S., et al. Selective sphingosine 1-phosphate 1 receptor activation reduces ischemia-reperfusion injury in mouse kidney. Am J Physiol Renal Physiol. 290 (6), 1516-1524 (2006).
- Lu, B., et al. The control of microvascular permeability and blood pressure by neutral endopeptidase. Nat Med. 3 (8), 904-907 (1997).
- Gendron, G., Simard, B., Gobeil, F., Sirois, P., D'Orleans-Juste, P., Regoli, D. Human urotensin-II enhances plasma extravasation in specific vascular districts in Wistar rats. Can J Physiol Pharmacol. 82 (1), 16-21 (2004).
- Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
- Saria, A., Lundberg, J. M. Evans blue fluorescence: quantitative and morphological evaluation of vascular permeability in animal tissues. J Neurosci Methods. 8 (1), 41-49 (1983).
- Fricke, I. B., et al. In vivo bioluminescence imaging of neurogenesis - the role of the blood brain barrier in an experimental model of Parkinson's disease. Eur J Neurosci. 45 (7), 975-986 (2017).
- Pink, D. B., Schulte, W., Parseghian, M. H., Zijlstra, A., Lewis, J. D. Real-time visualization and quantitation of vascular permeability in vivo: implications for drug delivery. PLoS One. 7 (3), 33760 (2012).
- Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat Rev Cancer. 2 (4), 266-276 (2002).
- Vandoorne, K., Addadi, Y., Neeman, M. Visualizing vascular permeability and lymphatic drainage using labeled serum albumin. Angiogenesis. 13 (2), 75-85 (2010).
- Turner, A. J., Nalivaeva, N. N. Proteinase dysbalance in pathology: the neprilysin (NEP) and angiotensin-converting enzyme (ACE) families. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 52 (4), 40-48 (2006).
- Lu, B., Gerard, N. P., Kolakowski, L. F., Finco, O., Carroll, M. C., Gerard, C. Neutral endopeptidase modulates septic shock. Ann N Y Acad Sci. 780, Mar 22 156-163 (1996).
- Dempsey, E. C., et al. Neprilysin null mice develop exaggerated pulmonary vascular remodeling in response to chronic hypoxia. Am J Pathol. 174 (3), 782-796 (2009).
- Karoor, V., Oka, M., Walchak, S. J., Hersh, L. B., Miller, Y. E., Dempsey, E. C. Neprilysin regulates pulmonary artery smooth muscle cell phenotype through a platelet-derived growth factor receptor-dependent mechanism. Hypertension. 61 (4), 921-930 (2013).
- Chu, P., Arber, D. A. Paraffin-section detection of CD10 in 505 nonhematopoietic neoplasms. Frequent expression in renal cell carcinoma and endometrial stromal sarcoma. Am J Clin Pathol. 113 (3), 374-382 (2000).
- Bircan, S., Candir, O., Kapucuoglu, N., Serel, T. A., Ciris, M., Karahan, N. CD10 expression in urothelial bladder carcinomas: a pilot study. Urol Int. 77 (2), 107-113 (2006).
- Koiso, K., Akaza, H., Ohtani, M., Miyanaga, N., Aoyagi, K. A new tumor marker for bladder cancer. Int J Urol. 1 (1), 33-36 (1994).
- Wick, M. J., et al. Protection against vascular leak in neprilysin transgenic mice with complex overexpression pattern. Transgenic Res. 25 (6), 773-784 (2016).
- Natah, S. S., Srinivasan, S., Pittman, Q., Zhao, Z., Dunn, J. F. Effects of acute hypoxia and hyperthermia on the permeability of the blood-brain barrier in adult rats. J Appl Physiol. 107 (4), (1985) 1348-1356 (2009).
- Scholzen, T. E., et al. Neutral endopeptidase terminates substance P-induced inflammation in allergic contact dermatitis. J Immunol. 166 (2), 1285-1291 (2001).
