Summary
この記事で経済的、最適化、および単純なプロトコルは、エバンス ブルー色素法を使用して他の株、種と他の臓器や組織での使用に適応することができます FVBN マウスの臓器に血漿漏出を評価するため説明します。
Abstract
血管漏出または血漿漏出の原因の数があり深刻な結果や炎症反応の症状があります。本研究は、原因に関する新しい知識や抑制または血漿漏出を治療する新しい方法に最終的につながる可能性があります。研究者が血漿漏出を勉強するため、利用可能な最善の方法をなど、適切なツールを持つことが重要です。この記事では FVBN マウスの臓器に血漿漏出を評価するためエバンス ブルー色素メソッドを使用して、プロトコルを説明します。このプロトコルは意図的にシンプルに偉大な可能な限り程度が高品質データを提供します。主に使用する平均の所の簡単だ、エバンス ブルー色素を選ばれています。私たちは、酵素ネプリライシンが血漿漏出に対して血管を保護するかもしれないこと仮説の証拠とサポートを提供するためにこのプロトコルを使用しています。ただし、このプロトコルが実験的に使用されマウスの他の系統や他の種の多くの異なる器官またはティッシュの使用研究の理解、予防、または治療に重要な他の要因を伴う可能性がありますに適合しやすい血漿漏出。このプロトコルは広範囲に最適化されているし、既存のプロトコルと組み合わせた信頼性から変更、使いやすさ、経済、そしてこのプロトコルで使用する平均の所の優れたを作る機材の一般の可用性臓器から血漿漏出を定量化します。
Introduction
臓器に血管漏出は、血管外漏出、または血漿の血管内皮細胞で生産の隙間からの漏れは臓器の毛細血管細静脈を投稿します。この血漿漏出、または炎症性応答のいくつかのタイプから生じる、増加の血管透過性重大な結果があります。したがって、この現象、その原因、変調器、および結果は、研究し、理解と同様に、調査官が良い持っているツールやプロトコルが重要ですそれらを勉強します。内皮ギャップ数刺激によって作られるが、通常、ペプチド神経伝達物質タキキニン、内皮細胞上のアクションによって生成されます。Undecapeptide タキキニン神経ペプチド、サブスタンス P1増加血漿漏出の結果、このプロセスの主要な自然発生するメディエーターの一つです。
エバンス ブルー色素のアルブミン結合プロパティを使用して、調査し、血管透過性亢進や血漿漏出を測定する方法が開発されているし、通常その精度、シンプルさ、経済、安全と許可する機能のために知られている、一度に、いくつかの組織から血漿漏出による場合は希望2,3,4,5,6,7,8,9.FVBN マウスの臓器に血漿漏出を評価するためには、このエバンス ブルー プロトコルはこれらのすべてを使用しますが、一般的に役に立つと、又は平均の実験室を含む、将来の研究に適応できるように、いくつかの重要な変更を追加血漿漏出または血管透過性と関連因子の重要な研究を実施します。このプロトコルでは、サブスタンス P が 1 nmol/kg、1.5 倍による血漿の血管外漏出を強化するマウスを紹介します。これはより簡単に観測し、得られる結果の結果、プロトコルの感度を増加します。その他種々 のペプチドを化学物質、毒性傷害のいくつかのフォームなどの透磁率に影響を与えるその他の要因を使用または必要に応じて、その他の研究所で研究します。頚静脈注射は、ターミナルの手術を必要とする全身、エバンス ブルーとサブスタンス P を紹介するこのプロトコルで使用されます。ただし、頚静脈注射5,7,10、必要なターミナル手術手技を考慮した後も易くマスター、他よりもより一貫した結果の生産につながる尾を含む静脈注射、静脈注射4,9。レトロな軌道静脈洞注射によって配信されるブルー ・ エヴァンスのそれは可能ですが、参照文献の見つかっていないこのエバンス ブルーの配信方法を使用します。ただし、尾静脈注射については高度な専門知識と再現性をもって大きくこのテクニックをマスターする練習は成功したエバンス ブルー注射での使用を制限します。対照的に、代替の頚静脈注入法のプロトコルで説明するようソリューションを提供技術的に得られる。マウスの静脈の血流の重要な手順は、エバンス ブルー潅流マウスの犠牲余分なエバンス ブルー色素を削除し、このプロトコルで標準化された直後後に実行されます。灌流の上記の方法は注意深く検討され現在の手順を取得するように変更します。ここで説明したその他の変更はすべて最適化された、簡単で安価です。
エバンス ブルー色素法のいくつかの重要な制限事項があります。たとえば、低感度時このメソッドに関連付けられているは、いくつか追加総病理組織学的および組織学的検討エバンス ブルーを注入した動物からのティッシュを防ぐことができます。ただし、これらやその他の制限は、別の方法と、それにもかかわらず、まだエバンス ブルーを使用するモデルの開発につながっています。エバンス ブルーの測定 (視覚範囲ではなく) 蛍光分光法は方法の感度を高める可能性があります。さらに、複数の別個の場所11血管漏出の観察を許可するエバンス ブルー染色組織の蛍光顕微鏡が開発されました。また、全身イメージングし生きている動物のスキャン以前エバンス ブルー12により継続的に、エバンス ブルーの濃度の調査のための注入ではなく実験の時点で 1 つの特定の時間を選択。ただし、このメソッドは適切なイメージング施設の可用性を必要とする、非常に高価になることがあります。エバンス ブルー、モデルの体外型で行われますを含む変更などセルの文化またはニワトリ漿モデル13 (CAM) も記載されています。これらのモデル蛍光と生体14顕微鏡によって監視されると時間をかけて血管透過性変化の定量化を許可するが、生体内での条件の正確なモデリングに関する質問を上げるかもしれないし、もあります。高価です。
他のメソッドは、エバンス ブルーの管理を伴わない決定し、血管漏出または透過性を定量化するために開発されています。これらのメソッドを使用するかもしれません (アルブミン、フルオレセインなど)、適切な蛍光分子または生きている動物に、同位体標識あるいはタグ分子 (または文化または漿 (CAM) をセルにモデル13、非侵襲的に続いてイメージング (PET スキャン、MRI、生体顕微鏡観察、全身スキャン) または侵襲的イメージング (蛍光顕微鏡)3,12,15。これらの技術は、青いメソッド エヴァンス他上の利点の多数を提供可能性がありますがまた彼らのかなりの複雑さ、必要な専門知識、リソース、および金銭的コストが高いなど欠点があります。
ネプリライシン16 (ペプチダーゼ酵素ネップ、cd 10、MME、またはエンケファリナーゼとして知られている) 酵素代謝や内因性物質 p の不活性化の部分で少なくとも血漿漏出を抑制に関与することが示唆されています。したがって、セル表面ペプチダーゼ ネップが発生した組織でありますネップのペプチダーゼの活動によっておそらくのサブスタンス P の効果の減衰
当初、このエバンス ブルーの修正されたプロトコル FVBN 野生型 (WT) とネップ ノックアウト (KO) マウスを用いたサブスタンス P 誘発される血漿漏出テスト。これらの初期の研究からサブスタンス P 増強血漿漏出にネップの関与が疑われ、これらについて説明を行い, さらに血漿漏出に伴うネップの役割を実験.しかし、本稿の焦点ではないネップまたは血漿漏出におけるその役割、血漿漏出が彼ら自身を実験ではなく。ネップの結果がこの修正されたプロトコルの使用によって得られる結果の種類です。血漿漏出を測定するエバンス ブルー メソッドを最適化されており、FVBN マウスの下に詳細の記載に従って変更します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ケアと動物 (マウス) の使用のためのすべての該当する国際、国家、および/または制度ガイドラインは、本稿に記載されている実験に続いていた。
このメソッドは、FVBN アダルト マウス、本研究の目的のために最適なこと判明した 16-20 週、高齢者を使用します。日 1、手順 1-5、日 2 には手順 6-7 (図 1) が含まれます。
1. 機器の準備
- (推奨) とケタミン ・ キシラジンは麻酔薬として使用される場合は、滅菌、使い捨ての注射器や針の十分な供給を確保します。イソフルラン麻酔薬として使用する場合は、酸素タンクとイソフルラン麻酔開始前に実験のための十分な供給があることを確認するための流体のレベルを確認します。また、ノーズ呼吸回路を組み立てるし、誘導ボックスにそれらを添付新しい炭缶を呼吸回路に接続します。第二段階が約 50 psi を読み取っていることを見極め、酸素をオンして誘導ボックスを準備します。
- 37 ° C に加熱パッドをオンに
- 手術用直腸温度プローブを準備します。
2. マウス作製
この手順には、麻酔、脱毛、(大人 FVBN マウス-年齢 16-20 週) の配置が含まれます。
- マウスの重量を量る、重量を記録します。
- マウスを麻酔します。
- ケタミン ・ キシラジンの IP を管理 (80-100 mg/kg と 7.5-16 mg/kg、それぞれ)。ただし、低用量ケタミン ・ キシラジンで始まるお勧め (30 mg/kg の 6 mg/kg、それぞれ)。
- 約 0.1 で麻酔を維持する-0.25 倍初期用量ケタミン ・ キシラジン手術中の。ケタミン ・ キシラジンより再現性と生存性が認められたこの特定の研究の選択の麻酔エージェントをだった。他の研究で選択の麻酔エージェントは異なることが見つけられるかもしれません。 イソフルランを使用する場合、誘導の部屋にマウスを置くし、マウスは完全な意識を失うまでに 5% にイソフルランをオンに。設定手順の残り 1.5 2.5% イソフルラン鼻ノーズを使用します。
- 適切な麻酔深度をチェックするつま先ピンチしてマウスすべての 2 〜 3 分を監視します。
- マウスの腹側頸部領域を剃る。
- 予熱のパッドの上に仰臥位にマウスを配置します。足とテープで手術の表面には、マウスの足を保護します。
- 手術中に完全に乾くことを防ぐために目の上に人工涙軟膏を配置します。
3. 手術の詳細
- 頚静脈上右腹側の首で 1 cm の切開を行います。
- 痛みの管理と血管拡張を促進するために切開領域にリドカイン (1-2%) の 1 つまたは 2 つの滴を適用します。有効にするリドカイン 2 分を待ちます。
- 公開、鈍的切離を介して右内頚静脈を隔離します。4-0 縫合糸で静脈を縛るし、優しく、止血の容器の吻側端を撤回します。静脈径の中ほど高級はさみ、約 3 mm 以下または、ネクタイに尾を使用して、穴を開けます。
- 太陽光発電 1 ポリビニル カテーテル端から 1.5 cm をマークし、容器散大を使用して穴を頸静脈に挿入スレッドの容器、約 1.5 cm の尾側に向かってカテーテル。
- 4-0 絹と尾部 (カット) ・下容器の内で安全にカテーテルを結ぶ。手順 3.3 では、吻側の頚静脈を縛るに使用された縫合糸の宙ぶらりんでカテーテルの外側を容器の吻側部を結ぶ。
- 鋲皮は緩く体熱の損失と組織の乾燥を防ぐために 4-0 絹とカテーテルの周り再び一緒に。
- ヘパリン生理食塩水 (10 U/mL) の入った注射にカテーテルを接続し、カテーテルをフラッシュします。
4. 注射
- 続いてラインをフラッシュするヘパリン生理食塩水の量が少ない、頸静脈カテーテルにエバンス ブルー溶液 (0.9%、通常の unheparinized 生理食塩水、または約 50 mg/kg で 30 mg/mL の溶液 50 μ L) を注入します。
- 2 分後、サブスタンス P (0.9%、通常の unheparinized 生理食塩水、または 1 nmol/kg で 0.3 μ M 溶液 100 μ L)、続いてラインをフラッシュするヘパリン生理食塩水の少量を注入します。サブスタンス P 増強内皮層による血漿タンパク質の血管外漏出このプロトコルではそれは日常的に血管外漏出の値を簡単に測るプラズマを作るプラズマ血管外漏出値の約 1.5 倍の増強を誘導します。
- サブスタンス P を注入後、18 分を待ちます。この間、エバンス ブルー色素は平衡、循環します。
- サブスタンス P (エバンス ブルー注射後 20 分) の注入後頚部転位とマウスを犠牲にして 18 分実験を終了します。マウスが直接占拠にすることができます、そうだ脱臼、最初は麻酔薬の過剰摂取を与えることがなくマウスとしてはおそらくまだよく麻酔手術から。しかし、それが必要な場合、麻酔薬ケタミン ・ キシラジン、イソフルラン、またはペントバルビ タールの過剰摂取が与えられる、頚部転位が続きます。
5. 器官の分離
- マウスの胸の空洞を開いてカットし、重力-灌流 (約 51 cm または 20 インチの高さ) から心臓や血管 50 mM クエン酸ナトリウム、pH 3.5 の 50 mL の。pH 3.5 はおそらくアルブミンにエバンス ブルー バインドを保持します。
- 1-5 関係機関 (組織) を (例えば膀胱、腎臓、胃、肝臓、膵臓、近位または遠位結腸、回腸、十二指腸、側面皮膚、耳、尾、心、および/または肺) 解剖メスを消費税し、任意の残留の内容を削除する場合現在。
- 部屋の温度 (RT) リン酸緩衝生理食塩水 (PBS; ナ2HPO4、KH2PO4、8.0 g 0.24 g, 塩化ナトリウムの 1.44 g と 1 L、pH 7.4 の KCl の 0.20 g) で臓器をすすいでください。
- しみの組織と臓器、各器官は、半分にカット、それぞれの半分の重量を量る (g の重みを濡れている)。
- 1 つを乾燥乾燥オーブン 150 ° C、箔、48 h で組織の半分。
- 半分、および microfuge を順にフォルムアミドの一貫性のあるボリューム (最大 200 μ L) でチューブ 48 h (と最大 72 h) 他のティッシュを置きエバンス ブルーを抽出します。
6. 組織外径の測定
- および microfuge の管場所からポリスチレン 96 ウェル プレートの 1 つのウェルにエバンス ブルー注入フォルムアミド (48-72 時間 RT 培養) の後の 50 μ L を削除します。ホルムアミドと共に組織部分を転送しないように注意します。
- 空白の 96 ウェル プレートの 2 つの空井戸のそれぞれに新しい、純粋なフォルムアミドの場所 50 μ L。
- 測定し、各ウェルの吸光プレート リーダーに 96 ウェル プレートの外径620を記録します。620 nm 吸光度は、エバンス ブルーの最大。
7. 血漿漏出の計算
- 乾のティッシュ ペーパーの重さ半分の 48 時間のオーブンでされています。
- 特定臓器それぞれ個々 のマウス、半分この組織の湿重量で始まる (で得られたステップ 5.4) からの興味の半分この同じ組織の乾燥重量で割った値 (7.1 で得られたステップ) のぬれた重量/乾燥重量比を計算します。
- 組織の乾燥重量 (g) の前に、半分は濡れてフォルムアミド (ステップ 5.4 で得られた) に置かれていた組織の湿重量で割ってホルムアミドの半分を計算: (7.2 の手順で計算される) 興味の特定の臓器の乾燥重量比。
- 外径620の補正値を計算します。外径620から始まる (6.3 の手順で得られた各組織からエバンス ブルー注入フォルムアミドを含んでいる) 96 ウェル プレートの各実験の井戸から値減算空白も OD620値 (外径620の平均値純粋なフォルムアミド、6.2 の手順で準備を含んでいる 2 つの井戸は、6.3 の手順で取得した値は620 OD) 各実験値から。
- フォルムアミド (7.3 で計算されるステップ) で半分修正外径620 (7.4 で計算されるステップ) を組織の乾燥重量で除してプラズマ血管外漏出値を計算します。血漿漏出の単位は外径620/g 乾燥重量になります。
- データを分析し、平均 ± SEM. 統計的に比較 Scheffé の複数比較テスト (lycofs01.lycoming.edu)、適切な一方向の分散分析や t 検定によってグループを表現します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
図 1では手順の概略が表示されます、最も信頼性の高い、一貫性のあるサブスタンス P 誘起プラズマの血管外漏出値 FVBN マウスの臓器から発生するが検出されてきた。この手順は通常、仕事の待機時間の少なくとも 48 時間で区切られた 2 日をかかります。一貫してすべての実験を比較するこれはさらに多く普及することが可能です。たとえば、臓器は 1 日目に単弁、臓器することができますフラッシュ液体窒素で凍結し、-80 ° C で保存(1 週間に数日) 内で臓器を慎重に融解時に PBS で洗浄し、できるプロトコルの残りの部分の前に消されました。また、組織の乾燥されるべき組織のブルー ・ エヴァンスの抽出 (150 ° C で 48 h)、述べたようにフォルムアミドの半分可能性があります拡張するから 48-72 時間ホルムアミドの時間はすべての実験で一貫している限りです。
図 2と表 1はデータ実証 FVBN 野生型 (WT) とネップ ノックアウト (KO) マウス17, 尿ぼうこうからサブスタンス P 誘発される血漿漏出を示すこの研究室のために主に使用されました。ネップと規制と選択した神経ペプチド18,19の行動の長期的利益は。ネップの KO マウスは、任意の組織のネップを表現することはできません。ただし、ネップ、低レベル20,21,22でとはいえ WT マウス膀胱内で表されます。図 2と表 1は、マウスのこれらの 2 つのグループから、膀胱からサブスタンス P 誘発される血漿漏出で違いがある提案します。これは、膀胱からサブスタンス P 誘発される血漿漏出にネップの役割を意味、ネップの式は潜在的 WT とネップ KO マウスの尿ぼうこうの主な違い。
元のデータは、(図 2および表 1) 膀胱のサブスタンス P 誘発される血漿漏出にネップの可能な役割を示唆した、のでより完全に別の血漿漏出のネップの関与を調査することにしましたオルガン.まず、我々 はほぼ普遍的に過剰ネップに二重トランスジェニック マウスを作成23。この改変マウス FVBN マウスの 3 つのタイプからのデータの比較を可能に: WT マウス16、当然のことながら多くの組織のネップの限られた量を表現します。ネップの KO マウス17、任意組織でないネップを表現します。二重トランスジェニック ネップ overexpressor マウス23ドキシサイクリンの投与時にほぼすべての組織でどの過剰ネップ。マウスはドキシサイクリン含むへの無料アクセスを許可が 1 週間前に手術 (図 1) のための食事ドキシサイクリン投与量は 1 mg/kg のチョウ、非染め色です。ノザン ネップこれらの二重トランスジェニック マウスの建設はネップの試金, 西部劇、そして NEP mRNA qPCR23の説明で詳述されています。
マウスのこれらの 3 種類、このプロトコルは、十二指腸23 (図 3および表 2) を含む組織で血漿漏出にネップの役割を示しています。これらの実験二重トランスジェニック ネップ overexpressor マウスにおけるネップ過剰発現だったでオンになって餌、1 週間、1 日前にチョウ ドキシサイクリンを含むため (非染め色; 1 mg/mg のドキシサイクリン チョウ、図 3、)。コントロールとしていくつかの WT とネップ KO マウスも日 1 (図 3b 3 c) を前の週の間に亜麻のドキシサイクリンの食事を与えられました。
ポリクローナル抗体と西部の分析によって確認されたドキシサイクリン チョウを飼育 overexpressor マウス FVBN WT とネップ (二重遺伝子組換え) 十二指腸にネップの式 FVBN マウスの十二指腸に血漿漏出のネップの役割を確認するには人間の NEP (ネップのマウスを使って cross-reacts) を23。この分析は、WT duodenums 表現ネップ蛋白質の適度な量が、ネップ overexpressor duodenums WT duodenums 表されますネップの量 2 〜 3 倍を確認しました。ネップの KO マウス定義では、十二指腸に任意のネップを表現しないでください。
図 1:サブスタンス P 誘発される血漿漏出を測定するためのプロトコルの一般的なスキーマ。(年齢 16-20 週) FVBN マウスの臓器からサブスタンス P 誘発される血漿漏出を測定するためのプロトコルの概略図。このプロトコル頚静脈に注射を通してエバンス ブルー色素法による血漿漏出、組織の測定を含み、拡張で容易に測定血漿漏出を取得する、外投与サブスタンス P が組み込まれています外径620/g 乾燥重量の単位での値。記述のプロトコルは、FVBN マウスの臓器から一貫性のあるサブスタンス P 誘発血漿漏出値の結果が判明しているし、仕事の 2 日間の最小値を取る。1 日目と 2 日目は、乾燥、抽出し組織を待っている時間の少なくとも 48 時間で区切られます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: WT とネップ KO マウスの膀胱からサブスタンス P 誘発される血漿漏出します。(事前ドキシサイクリン) なし FVBN マウスから血漿漏出、膀胱はサブスタンス P 管理によって補強し、OD620 nm/グラムの乾燥重量で表されます。尿ぼうこうの FVBN 野生型から分離した (WT; 白いバー、n = 12) または FVBN ネップ ノックアウト (KO; 黒いバー、n = 7) マウスと上記のとおり血漿漏出のプロトコルを受けます。個々 の値は、表 1に与えられています。バーの上の線は、(SEM) 平均値の標準誤差を表しています。WT とネップ KO 値差 p 方向で進化 = 0.051 t 検定。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: WT、ネップは KO、ネップの overexpressor マウスの十二指腸からサブスタンス P 誘発される血漿漏出。(A ~ C)十二指腸血漿漏出サブスタンス P 管理がズラーリし、外径620/g 乾燥重量で表されます。(A) Duodenums 事前ドキシサイクリンなし FVBN WT マウスから分離した (-; バー白、n = 5)、事前ドキシサイクリンなしネップ KO マウス (-; 光灰色のバーは、n = 5)、事前ドキシサイクリンなしネップ ovexpressor 二重トランスジェニック マウス (DT-; 濃いグレーのバーは、n = 5) またはネップovexpressor 二重トランスジェニック マウスに事前ドキシサイクリン (DT + 黒いバー、n = 4) 上記のとおり血漿漏出のプロトコルを受けると。バーの上の線は SEM を表しますWT (-) または DT (-) の値よりも高い傾向を示してネップ島 (-) の値が、この違いは統計的に有意でした。十二指腸の血漿の血管外漏出の値は供給、ネップ ovexpressor 二重トランスジェニック マウス (DT +)、他のすべてと比較してドキシサイクリンのグループでのみ有意に減少 (* p < 0.05、分散分析)。(B、C)WT とネップ KO マウスから十二指腸血漿の血管外漏出値が大幅ドキシサイクリン投与による影響を受けたない (p < 0.05)。ドキシサイクリンなし (B) WT マウス (WT-; 白いバー、n = 5)、ドキシサイクリンで WT マウス (WT +; 中灰色のバー、n = 7)。ドキシサイクリンなし (C) ネップ KO マウス (KO-; 薄いグレーのバーは、n = 5) NEP は、ドキシサイクリンで KO と (島 +; 中灰色のバーは、n = 2)。個々 の値は、B、および C は表 2に与えられた、複合体として表示されます。Springer 科学 + ビジネス メディアの許可を得てスプリンガー ジャーナル記事23からマイナーな変更で再現。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 遺伝子型 | セックス | 膀胱のウェット/ドライ重量比 | 膀胱の重量を半分濡れている (g; 85 μ L ホルムアミド) | 半分膀胱の乾燥重量を計算 (g) | 外径 620 nm - 空白 | 外径 620 nm/g 乾燥重量 (膀胱) |
| WT | F | 4.737 | 0.0038 | 0.0008 | 0.0150 | 18.750 |
| WT | M | 4.632 | 0.0045 | 0.0010 | 0.0100 | 10.000 |
| WT | F | 4.700 | 0.0048 | 0.0010 | 0.0280 | 28.000 |
| WT | F | 4.625 | 0.0068 | 0.0015 | 0.0230 | 15.333 |
| WT | F | 4.546 | 0.0077 | 0.0017 | 0.0400 | 23.529 |
| WT | M | 4.800 | 0.0094 | :0.0020 | 0.0570 | 28.500 |
| WT | M | 5.500 | 0.0095 | 0.0017 | 0.0240 | 14.118 |
| WT | F | 4.316 | 0.0098 | 0.0023 | 0.0660 | 28.696 |
| WT | M | 5.061 | 0.0121 | 0.0024 | 0.0400 | 16.667 |
| WT | M | 5.061 | 0.0192 | 0.0038 | 0.0330 | 8.684 |
| (列上のエントリ) の SEM の +/-を意味します。 | 0.105 円 +/4.798 | 0.0088 0.0014 +/- | ± 0.0003 0.0018 | 0.0056 ± 0.0336 | 2.393 +/19.228 | |
| KO | M | 4.316 | 0.0196 | 0.0045 | 0.1610 | 35.778 |
| KO | M | 4.600 | 0.0134 | 0.0029 | 0.1020 | 35.172 |
| KO | M | 4.377 | 0.0104 | 0.0024 | 0.0410 | 17.083 |
| KO | M | 4.727 | 0.0258 | 0.0055 | 0.1410 | 25.636 |
| KO | F | 4.539 | 0.0025 | 0.0006 | 0.0250 | 41.667 |
| KO | M | 4.457 | 0.0149 | 0.0033 | 0.1420 | 43.030 |
| (列上のエントリ) の SEM の +/-を意味します。 | 0.062 +/4.503 | 0.0032 ± 0.0144 | 0.0007 ± 0.0032 | 0.0233 ± 0.1020 | 4.065 +/33.061 |
表 1: 個々 の WT とネップ KO マウスの膀胱からサブスタンス P 誘発される血漿漏出します。(事前ドキシサイクリン) なし FVBN マウスから血漿漏出値個別に OD620 nm/g 乾燥重量、FVBN WT から表現された (n = 12) ネップ KO または (n = 7) マウスと上記のとおり血漿漏出のプロトコルを受けます。明らか血漿の血管外漏出値に男女差はありませんでした。膀胱が分離。個々 の値は、膀胱、膀胱の湿重量の計算のウェット/ドライ重量比のホルムアミドの半分を与えて、計算された乾燥重量, 膀胱のフォルムアミド (で与えられる g)、修正された OD620 nm (サンプル OD620 nm で半分meanOD620 nmof マイナス ブランク (純粋なフォルムアミド)、および OD620 nm/g で計算されるプラズマの血管外漏出値は乾物重 (修正 OD620 nm、計算の乾燥重量で割った値) です。結果血漿の血管外漏出の値は、図 2を構築に使用されました。
| 遺伝子型とドキシサイクリンのチョウ、なし (-) と (+) | セックス | 十二指腸のウェット/ドライ重量比 | 十二指腸の重量を半分濡れている (g; 85 μ L ホルムアミド) | 半分十二指腸の乾燥重量を計算 (g) | 外径 620 nm - 空白 | OD620 nm/g 乾燥重量 (十二指腸) |
| WT- | M | 4.927 | 0.0307 | 0.0062 | 0.0640 | 10.272 |
| WT- | F | 4.912 | 0.0172 | 0.0035 | 0.0460 | 13.138 |
| WT- | M | 5.333 | 0.0281 | 0.0053 | 0.0960 | 18.221 |
| WT- | F | 5.433 | 0.0375 | 0.0069 | 0.1010 | 14.634 |
| WT- | M | 5.179 | 0.0287 | 0.0055 | 0.0430 | 7.759 |
| (列上のエントリ) の SEM の +/-を意味します。 | 0.105 円 +/5.157 | 0.0033 ± 0.0284 | ± 0.0006 0.0055 | 0.0122 ± 0.0700 | 1.798 +/12.805 | |
| WT + | M | 5.342 | 0.0542 | 0.0101 | 0.1520 | 14.981 |
| WT + | M | 5.653 | 0.0477 | 0.0084 | 0.1120 | 13.272 |
| WT + | M | 5.700 | 0.0564 | 0.0099 | 0.1110 | 11.218 |
| WT + | F | 5.542 | 0.0498 | 0.0090 | 0.1430 | 15.914 |
| WT + | F | 5.723 | 0.0266 | 0.0046 | 0.0470 | 10.112 |
| WT + | F | 5.186 | 0.0262 | 0.0051 | 0.0470 | 9.304 |
| WT + | M | 5.543 | 0.0342 | 0.0062 | 0.0480 | 7.779 |
| (列上のエントリ) の SEM の +/-を意味します。 | 0.075 ± 5.527 | 0.0049 ± 0.0422 | ± 0.0009 0.0076 から | 0.0175 + 0.0943 | 1.142 +/11.797 | |
| 甲信越- | F | 5.763 | 0.0209 | 0.0036 | 0.0690 | 19.025 |
| 甲信越- | M | 4.232 | 0.0164 | 0.0039 | 0.1010 | 26.061 |
| 甲信越- | M | 4.810 | 0.0227 | 0.0047 | 0.0880 | 18.647 |
| 甲信越- | F | 5.650 | 0.0363 | 0.0064 | 0.0600 | 9.339 |
| 甲信越- | M | 5.212 | 0.0178 | 0.0034 | 0.0640 | 18.739 |
| (列上のエントリ) の SEM の +/-を意味します。 | 0.282 ± 5.133 | 0.0035 ± 0.0228 | ± 0.0005 0.0044 | 0.0078 ± 0.0764 | 2.659 +/18.362 | |
| 島 + | M | 5.128 | 0.0193 | 0.0038 | 0.0600 | 15.941 |
| 島 + | M | 5.030 | 0.0459 | 0.0091 | 0.1980 | 21.697 |
| (上記の列のエントリ) の範囲 +/-を意味します。 | 0.049 ± 5.079 | 0.0133 ± 0.0326 | 0.0027 ± 0.0065 | 0.0690 +/0.1290 | 2.878万 +/18.819 | |
| DT- | M | 5.426 | 0.0322 | 0.0059 | 0.0775 | 13.058 |
| DT- | M | 4.255 | 0.0360 | 0.0085 | 0.0895 | 10.579 |
| DT- | M | 4.818 | 0.0306 | 0.0064 | 0.1460 | 22.989 |
| DT- | M | 5.189 | 0.0197 | 0.0038 | 0.0380 | 10.010 |
| DT- | F | 5.500 | 0.0256 | 0.0047 | 0.0390 | 8.379 |
| (列上のエントリ) の SEM の +/-を意味します。 | 0.229 +/-5.038 | 0.0028 ± 0.0288 | ± 0.0008 0.0059 | 0.0198 ± 0.0780 | 2.3607 +/13.003 | |
| DT + | M | 5.008 | 0.0694 | 0.0139 | 0.0270 | 1.948 |
| DT + | M | 4.750 | 0.0660 | 0.0139 | 0.0070 | 0.504 |
| DT + | M | 5.495 | 0.0587 | 0.0107 | 0.0692 | 6.478 |
| DT + | M | 5.233 | 0.0542 | 0.0104 | 0.0620 | 5.986 |
| (列上のエントリ) の SEM の +/-を意味します。 | 0.159 +/5.121 | 0.0034 ± 0.0621 | 0.0010 ± 0.0122 | 0.0147 ± 0.0413 | 1.478 ± 3.729 |
表 2: 個々 の WT、ネップは KO、ネップ overexpressor マウス、duodenums からサブスタンス P 誘発される血漿漏出します。血漿漏出値 FVBN マウス (事前ドキシサイクリンの有無にかかわらず) から個別に OD620 nm/g 乾燥重量、FVBN WT マウスと表現された (n = 5 と n、ドキシサイクリンを 7 =)、ネップ KO マウス (n = 5 と n = ドキシサイクリンを 2)、ネップoverexpressor 二重トランスジェニック マウス (n = 5 と n、ドキシサイクリンで 4 を =)。マウスは、上記で説明した血漿漏出のためのプロトコルに服従しました。明らか血漿の血管外漏出値に男女差はありませんでした。Duodenums が分離されました。血漿漏出の計算に使用される個々 の値は、表 1のとおりだった。結果血漿の血管外漏出の値は、図 3A ~ Cの構築に使用されました。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
前述したように、血漿漏出に関する研究が最終的の原因に関する新しい知識や抑制または血漿漏出を治療する新しい方法に します。(上記)、血漿の血管外漏出プロトコルの使用の成功は、現在原稿で実証されているエバンス ブルー色素を用いたします。示されているデータもバックアップにネップが血管を保護するかもしれないこと仮説血漿漏出に対してこれは、第二の目的現在、主要目的の平均研究室で容易に使用できる最適化されたプロトコルを提示するが、血漿漏出の今後の研究。ここ報告プロトコル別の目標、動物、臓器、その他の条件と今後の研究への適応性に焦点を当てたこのプロトコルは使いやすく、信頼性の高い、経済的で、特に便利で、考慮一般一般的な材料、試薬、有能な人材の可用性。それは、ただし、このプロトコルが動物 (8-12 繰り返し提案) のグループあたりの繰り返しのかなりの量を要求する統計的に有効な結果を取得します。
多数の研究と血管透過性、血漿漏出を測定する試みを詳述した報告書がありました。はるかに、これらのレポートのほとんどの詳細を血漿漏出と血管透過性2,3,6,11,を調査するエバンス ブルー色素法の併用の方法の組み合わせ12,13。エバンス全3,13,15,24; 青を内蔵していないメソッドは血管透過性の少ないレポートがずっとあります。これらのメソッドは一般的な平均の所のアクセスしにくい複雑な方法、専用の装置と人員を必要とするのには、一般的に高価。
上記のエバンス ブルーのプロトコルの開発は、多くの異なった順列と修正のテスト関与しています。初期の実験は、エバンス ブルー マウス尾静脈を注入する試みに集中しました。ただし、尾静脈注射証明した技術的に挑戦し、一貫性のない結果、頚静脈注射の包含を施行した結果および上記ターミナル手技。多くの予備実験が完了を青と物質 p. エヴァンスの適切な濃度を見つけようとしてもエバンス ブルーの正確な量が約 200 mg/kg (50 mg/kg 現在使用と比較して)、以下だったが、これらの実験で使用されるサブスタンス P 量は重要な限り、強制する見つかりませんでした。多くの実験の後 1 nmole/kg の 1.5 倍増強の結果 (およびこうしてより容易に測定可能な) 追加外因物質 P の理想的な濃度に発見された血漿の血管外漏出時の値。また、平衡にエバンス ブルーの十分な時間を許可する必要があることが分かった (> 10 分)。この灌流ステップ4を含まないその他のプロトコルではなく、現在のプロトコルの重要なコンポーネントであるとマウスが臓器隔離前の犠牲の後余分なエバンス ブルーを削除する血管の灌流が見つかりました。(優しい重力勾配で配信) 出納が (これはエバンス ブルーとアルブミンの結合を励ます) pH 3.5 溶液; 50 mLパラホルムアルデヒド、多く他エバンス ブルー プロトコル6,10,25で普及している、この議定書で省略されます。このプロトコルでは、解決されたもう一つの要因は、ドキシサイクリンの食事に使われる染料が体内で消化トラックからエバンス ブルーの OD620 nm の測定と干渉することです。したがって、上記の実験で亜麻ドキシサイクリン チョウを使用する必要があります。また、重要かつ有用な見つけることはマウスのほぼすべての臓器が十分に分離され現在のプロトコル経由で検査します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者貴重な支援とこの原稿を編集アンディ Poczobutt、博士 Jori Leszczynski を感謝したいです。 国立心臓、肺および血の協会 (NHLBI RO1 HL078929、PPG HL014985 と RO3 HL095439) 退役軍人省問題 (メリット レビュー) から受け取った補助金によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| isoflurane | Vet One | 200-070 | inhaled anesthetic |
| ketamine | Vet One | 200-055 | injectable anesthetic |
| xylazine | Lloyd Laboratories | 139-236 | injectable anesthetic |
| syringes (10,3 & 1 cc) | Becton Dickinson | 309604, 309657, 309659 | |
| needles (20G1,23G1 & 26G1/2) | Becton Dickinson | 305178, 305193, 305111 | |
| isoflurane induction chamber | VetEquip | 941443 | 1 Liter |
| nosecone breathing circuits | VetEquip | RC2 | Rodent Circuit Controller 2 |
| oxygen tank | Airgas | UN 1072 | 100% medical |
| heating pad | CWE Inc. | TC-1000 | temperature controller |
| rectal temperature probe | CWE Inc. | 10-09012 | mouse |
| balance (for rodents) | Ohaus | CS 2000 | |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 15000-00 | Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11151-10 | Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13009-12 | Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools -suture drivers | Fine Science tools | 12502-12 | Olsen-Hegar suture drivers (suturing) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11627-12 | Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14110-15 | Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 18025-10 | suture tying forceps (used for Millar cath) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14078-10 | Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14082-09 | Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11051-10 | 10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11251-35 | Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels) |
| surgical tools-retractors | Fine Science tools | 17012-11 | Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11294-00 | Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11297-00 | Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14058-11 | tough cut iris scissors (mouse dissection, bones) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11009-13 | serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13003-10 | Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11006-12 | Adson serrated forceps (tissue grasping) |
| clippers | Oster | A5 | |
| tape | Fisherbrand | 159015G | |
| artificial tear ointment | Akorn Inc | 13985-600-03 | |
| lidocaine | Hospira | 0409-4277-01 | 2% injectable |
| polyvinyl catheters | Tygon | PV-1 | |
| Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Substance P | Bachem | H-1890 | |
| heparin | Sagent Pharmaceuticals | 25201-400-10 | 1000 U/ml |
| saline solution | Hospira | 0409-7138-09 | 0.9% sodium chloride |
| phenobarbital | Vortech | 0298-9373-68 | |
| sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417-50TAB | |
| Kimwipes for blotting | Fisher Scientific | 06-666A | |
| formamide | Sigma Aldrich | 47670 | |
| microbalance | Denver Instrument | APX-60 | |
| microfuge tubes | Fisher Scientific | 07-200-534 | |
| polystyrene 96 well plate | Becton Dickenson | 351172 | |
| absorbance plate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| polyacrylamide gels | Bio-Rad | 3450014 | |
| protein molecular weight standard | Bio-Rad | 1610374 | |
| Protran supported nitrocellulose | Amersham (GE) | 10600015 | |
| gel box | Bio-Rad | 1658005 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P-1379 | |
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| primary NEP polyclonal antibody | R & D Systems | AF1182 | |
| doxycycline chow | Teklad (HARLAN) | TD.130750 | |
| FVB/NJ wild type mice | Jackson | 001800 | |
| secondary antibody (goat anti-rabbit) | ZyMed | 81-6120 | |
| ECL solution-Western Lightening Plus | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| film | Pierce | 34091 |
References
- Snijdelaar, D. G., Dirksen, R., Slappendel, R., Crul, B. J.
- Rubinstein, I., Iwamoto, I., Ueki, I. F., Borson, D. B., Nadel, J. A. Recombinant neutral endopeptidase attenuates substance P-induced plasma extravasation in the guinea pig skin. Int Arch Allergy Appl Immunol. 91 (3), 232-238 (1990).
- Szabo, A., Menger, M. D., Boros, M. Microvascular and epithelial permeability measurements in laboratory animals. Microsurgery. 26 (1), 50-53 (2006).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. J Vis Exp. (73), e50062 (2013).
- Moitra, J., Sammani, S., Garcia, J. G. Re-evaluation of Evans Blue dye as a marker of albumin clearance in murine models of acute lung injury. Transl Res. 150 (4), 253-265 (2007).
- Figini, M., et al. Substance P and bradykinin stimulate plasma extravasation in the mouse gastrointestinal tract and pancreas. Am J Physiol. 272 (4), Pt 1 785-793 (1997).
- Awad, A. S., et al. Selective sphingosine 1-phosphate 1 receptor activation reduces ischemia-reperfusion injury in mouse kidney. Am J Physiol Renal Physiol. 290 (6), 1516-1524 (2006).
- Lu, B., et al. The control of microvascular permeability and blood pressure by neutral endopeptidase. Nat Med. 3 (8), 904-907 (1997).
- Gendron, G., Simard, B., Gobeil, F., Sirois, P., D'Orleans-Juste, P., Regoli, D. Human urotensin-II enhances plasma extravasation in specific vascular districts in Wistar rats. Can J Physiol Pharmacol. 82 (1), 16-21 (2004).
- Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
- Saria, A., Lundberg, J. M. Evans blue fluorescence: quantitative and morphological evaluation of vascular permeability in animal tissues. J Neurosci Methods. 8 (1), 41-49 (1983).
- Fricke, I. B., et al. In vivo bioluminescence imaging of neurogenesis - the role of the blood brain barrier in an experimental model of Parkinson's disease. Eur J Neurosci. 45 (7), 975-986 (2017).
- Pink, D. B., Schulte, W., Parseghian, M. H., Zijlstra, A., Lewis, J. D. Real-time visualization and quantitation of vascular permeability in vivo: implications for drug delivery. PLoS One. 7 (3), 33760 (2012).
- Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat Rev Cancer. 2 (4), 266-276 (2002).
- Vandoorne, K., Addadi, Y., Neeman, M. Visualizing vascular permeability and lymphatic drainage using labeled serum albumin. Angiogenesis. 13 (2), 75-85 (2010).
- Turner, A. J., Nalivaeva, N. N. Proteinase dysbalance in pathology: the neprilysin (NEP) and angiotensin-converting enzyme (ACE) families. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 52 (4), 40-48 (2006).
- Lu, B., Gerard, N. P., Kolakowski, L. F., Finco, O., Carroll, M. C., Gerard, C. Neutral endopeptidase modulates septic shock. Ann N Y Acad Sci. 780, Mar 22 156-163 (1996).
- Dempsey, E. C., et al. Neprilysin null mice develop exaggerated pulmonary vascular remodeling in response to chronic hypoxia. Am J Pathol. 174 (3), 782-796 (2009).
- Karoor, V., Oka, M., Walchak, S. J., Hersh, L. B., Miller, Y. E., Dempsey, E. C. Neprilysin regulates pulmonary artery smooth muscle cell phenotype through a platelet-derived growth factor receptor-dependent mechanism. Hypertension. 61 (4), 921-930 (2013).
- Chu, P., Arber, D. A. Paraffin-section detection of CD10 in 505 nonhematopoietic neoplasms. Frequent expression in renal cell carcinoma and endometrial stromal sarcoma. Am J Clin Pathol. 113 (3), 374-382 (2000).
- Bircan, S., Candir, O., Kapucuoglu, N., Serel, T. A., Ciris, M., Karahan, N. CD10 expression in urothelial bladder carcinomas: a pilot study. Urol Int. 77 (2), 107-113 (2006).
- Koiso, K., Akaza, H., Ohtani, M., Miyanaga, N., Aoyagi, K. A new tumor marker for bladder cancer. Int J Urol. 1 (1), 33-36 (1994).
- Wick, M. J., et al. Protection against vascular leak in neprilysin transgenic mice with complex overexpression pattern. Transgenic Res. 25 (6), 773-784 (2016).
- Natah, S. S., Srinivasan, S., Pittman, Q., Zhao, Z., Dunn, J. F. Effects of acute hypoxia and hyperthermia on the permeability of the blood-brain barrier in adult rats. J Appl Physiol. 107 (4), (1985) 1348-1356 (2009).
- Scholzen, T. E., et al. Neutral endopeptidase terminates substance P-induced inflammation in allergic contact dermatitis. J Immunol. 166 (2), 1285-1291 (2001).
