Summary
이 문서에는 다른 긴장, 종, 그리고 다른 장기 나 조직에 사용 하기 위해 적용할 수 있는 FVBN 쥐의 장기에서 플라즈마 넘쳐 흐름을 평가 하기 위한 에반스 블루 염료 메서드를 사용 하 여, 최적화 된, 경제적이 고 간단한 프로토콜 설명 합니다.
Abstract
혈관 누출 또는 플라즈마 넘쳐 흐름, 원인, 수 있으며 심각한 결과 또는 염증 반응의 증상이 있을 수 있습니다. 이 연구의 원인에 관한 새로운 지식 또는 억제 또는 플라즈마 넘쳐 흐름을 치료 하는 새로운 방법을 궁극적으로 발생할 수 있습니다. 연구원은 가장 좋은 방법 플라즈마 넘쳐 흐름을 공부에 대 한 사용할 수를 포함 하 여 적절 한 도구는 중요 하다. 이 문서에서 우리는 FVBN 쥐의 장기에서 플라즈마 넘쳐 흐름을 평가 하기 위한 에반스 블루 염색 방법을 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 의도적으로 간단를 훌륭한 가능한 정도 하지만 제공 한다 고품질 데이터. 주로 하기 때문에 그것은 쉽게 사용 하 여 평균 실험실 에반스 블루 염료 선정 되었습니다. 우리 효소 neprilysin 플라즈마 넘쳐 흐름에 대 한 맥 관 구조를 보호 수 있습니다 가설에 대 한 증거와 지원을 제공 하기 위해이 프로토콜을 이용 했다. 그러나이 프로토콜을 실험적으로 사용 하 고 쉽게 이해, 예방, 또는 치료에서 중요 한 다른 요소를 포함할 수 있습니다 연구에 대 한 쥐의 다른 긴장에 또는 다른 종에서 많은 다른 장기 또는 조직에서 사용 하기 위해 적응 수 있습니다, 플라즈마 넘쳐 흐름입니다. 이 프로토콜은 광범위 하 게 최적화 및 사용, 경제, 및 재료와 장비,이 프로토콜에 사용 하 여 평균 실험실에 대 한 우수한 만들기의 일반적인 가용성의 용이성 기존 프로토콜과 결합 안정성에서 수정 장기에서 플라즈마 넘쳐 흐름 측정
Introduction
장기에 혈관 누출 넘쳐 흐름, 참조 또는 누설의 피에서 생산 하는 격차를 통해 혈장의 장기에 모 세관 venules 게시. 이 플라즈마 넘쳐 흐름 또는 증가 혈관 침투성, 선 동적인 응답의 어떤 종류에서 발생할 수 있는 중대 한 결과 있을 수 있습니다. 따라서, 그것은이 현상, 그, 변조기, 원인과 결과, 공부 하 고, 이해는 하 고 마찬가지로, 그 수 사관 좋은 도구 고 프로토콜 들을 공부 하는. 내 피 간격 다양 한 자극을 통해 생성 될 수 있습니다 하지만 일반적으로 endothelia에 tachykinins 펩 티 드 신경 전달 물질의 작용에 의해 생산 됩니다. Undecapeptide tachykinin neuropeptide, 물질 P1증가 플라즈마 넘쳐 흐름에서 결과,이 과정의 주요 자연적 중재자 중 하나입니다.
에반스 블루 염료의 알 부 민-바인딩 속성을 사용 하 여 조사 하 고 혈관 침투성 또는 플라즈마 넘쳐 흐름, 측정 방법 개발 되었습니다, 그리고 일반적으로 그들의 정확도, 단순, 경제, 안전, 그리고 허용 하는 기능에 대 한 알려져 있다는 플라즈마 넘쳐 흐름 여러 조직에서 한 번에 결정 그렇다면 원하는2,3,,45,6,,78,9 . FVBN 쥐의 장기에서 플라즈마 넘쳐 흐름을 평가 하기 위한이 에반스 블루 프로토콜, 사용 하지만 일반적으로 유용 하 고 적응력이 미래 연구를 실시 하 고 또는 평균 실험실을 포함 하는 몇 가지 중요 한 수정 추가 플라즈마 넘쳐 흐름 또는 혈관 침투성와 관련 된 요인의 중요 한 연구를 실시 합니다. 이 프로토콜에서 물질 P 1 nmol/kg, 1.5-fold에 의해 플라즈마의 넘쳐 흐름을 증대는에 쥐에 소개 된다. 이 프로토콜, 더 쉽게 관찰 하 고 얻을 수 있는 결과에 결과의 감도 증가 합니다. 침투성, 다양 한 다른 펩 티 드, 화학, 등 어떤 형태의 독성 부상에 영향을 주는 다른 요인 또는 사용 수 있습니다 원하는 대로 다른 실험실에 의해 공부. 경 정 맥 주사는 터미널 수술을 요하는 에반스 블루와 물질 P를 체계적으로, 소개 하는 것이 프로토콜에 사용 됩니다. 그러나, 경 정 맥 주사5,7,10을 필요한 터미널 수술 기법의 고려 사항 후에는 쉽게 마스터 하 고 다른 사람 보다 더 일관 된 결과의 생산으로 이어질 꼬리를 포함 하 여 정 맥 주사, 주사4,9정 맥. 복고풍 궤도 정 맥 공동 주사에 의해 배달 될 블루 에반스에 대 한 수 있습니다, 비록 문학에서 참조가 없습니다 발견 되었습니다 에반스 블루의 납품의이 메서드를 사용 하는. 그러나, 꼬리 정 맥 주사에 대해서 높은 수준의 전문성과 reproducibly 크게이 기술을 마스터 하는 것 성공적인 에반스 블루 주사에 대 한 그것의 사용을 제한 합니다. 반면, 대체 경 정 맥 주입 방법 우리의 프로토콜에 설명 된 대로 기술적으로 얻을 수 있는 솔루션을 제공 합니다. 마우스의 혈관의 관류에 대 한 중요 한 절차 수행 직후 에반스 블루 끼얹는다 마우스의 희생 초과 에반스 파란색 염료를 제거 하 고이 프로토콜 표준화 되었습니다. 관류의 앞에서 설명한 방법은 신중 하 게 검사 하 고 되었습니다 현재 절차를 수정. 여기에 설명 된 다른 수정 모두 최적화 하 고, 간단 하 고 저렴 한 있습니다.
에반스 블루 염색 방법의 몇 가지 중요 한 제한이 있습니다. 예를 들어 낮은 감도 가끔이 방법으로 관련 된 몇 가지 추가 총 병 리 학적 및 조직학 검사 조직의 에반스 블루 주입 동물에서 방지할 수 있습니다. 그러나,이 및 다른 제한은 그럼에도 불구 하 고, 여전히 에반스 블루를 사용 하는 모델과 다른 방법의 개발에 이르렀다. 에반스 블루의 측정 형광 (여 보다 시각 범위) 분광학 방법의 감도 증가 시킬 수 있습니다. 또한, 형광 현미경 검사 법 에반스 블루 스테인드 직물의 더 뚜렷한 위치11혈관 누출의 관찰에 대 한 허용 하도록 개발 되었다. 또한, 전체-바디 이미징 및 살아있는 동물의 스캔 이전 에반스 블루12 연속 방식에서 에반스 블루 농도의 조사에 대 한 수와 함께 주입 보다는 실험의 시간을 선택 하는 한 특정 시점. 그러나,이 메서드는 적절 한 영상 시설의 가용성을 필요로 하며 매우 비쌀 수 있습니다. 수정 에반스 블루와 수행 모델의 생체 외에서 종류에 관련 된와 같은 셀에 문화 또는 병아리 chorioallantoic 모델13 (CAM)는 또한 설명. 이러한 모델14 intravital 현미경 검사 법, 형광에 의해 모니터링 됩니다 시간이 지남에, 혈관 침투성 변화의 정량화를 허용 하지만 비보에 조건의 정확한 모델링에 관한 질문을 올릴 수 있고 수도 있습니다. 비싼.
에반스 블루의 관리를 포함 하지 않는 다른 방법을 결정 하 고 계량 혈관 누출 또는 침투성, 개발 되었습니다. 이러한 메서드 (예: 알 부 민 또는 fluorescein), 적절 한 형광 분자 또는 isotopically 레이블 또는 기타 태그 분자, 동물을 살 수를 고용할 수 있습니다 (또는 세포 문화 또는 chorioallantoic (캠)을 모델13, 비-침략 적 이어서 (애완 동물 스캐닝, MRI, intravital 현미경 검사 법, 전신 스캔) 이미징 또는 침략 이미징 (형광 현미경 검사 법)3,,1215. 이러한 기술을 다양 한 장점이 다른 에반스 블루 방법을 제공할 수 있습니다, 하지만 그들은 또한 그들의 상당한 복잡성, 필요한 전문 지식, 자원, 및 높은 금융 비용 포함 될 수 있습니다 있는 불리 있다.
Neprilysin16 (peptidase 효소 NEP, 또한 CD10, MME, 또는 Enkephalinase) 효소 대사와 내 인 성 물질 피의 비활성화를 통해 부분에서 플라즈마 넘쳐 흐름, 적어도 억제에 참여 제안 되었습니다. 따라서, 조직 세포 표면 peptidase NEP 발생 하는, 있을 수 있습니다 아마도 묻힐 peptidase 활동으로 물질 p, 효과의 감쇠
처음에, 우리는 FVBN 야생 타입 (WT)와 NEP 녹아웃 (KO) 마우스 수정된이 에반스 블루 프로토콜을 이용 하 여 물질 P 유도 플라즈마 넘쳐 흐름에 대 한 테스트. 물질 P 증강 플라즈마 넘쳐 흐름에 NEP 참여 이러한 초기 연구에서 의심 되었다 우리는 이것을 설명 하 고 추가 플라즈마 넘쳐 흐름에 관련 된 NEP의 역할 실험. 그러나,이 원고는 하지 NEP 또는 그것의 역할에서 플라즈마 넘쳐 흐름, 오히려 플라즈마 넘쳐 흐름 스스로 실험. NEP 결과이 수정된 프로토콜의 사용을 통해 얻을 수 있는 결과의 종류를 대표 합니다. 플라즈마 넘쳐 흐름을 측정 하는 에반스 블루 메서드 최적화 되었고 수정, FVBN 마우스 아래 자세히 설명 된 대로.
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Protocol
관심과 동물 (쥐)의 사용에 대 한 모든 해당 국제, 국가, 또는 기관 지침이이 원고에 설명 된 실험에 따라 했다.
이 방법은 사용 FVBN 성인 쥐, 세 16-20 주,이 연구의 목적에 대 한 수를 발견. 1 일 1-5 단계를 포함 하 고 하루 2 단계 6-7 (그림 1)을 포함.
1. 장비 준비
- (권장)으로 케 타 민/xylazine는 마 취약으로 사용 하는 경우 멸 균, 일회용 주사기와 바늘의 충분 한 공급을 보호 합니다. Isoflurane 마 취로 사용 하는 경우 산소 탱크와는 시작 하기 전에 실험에 대 한 적절 한 공급 되도록 isoflurane의 유체 레벨을 확인 하십시오. 또한, 호흡 회로 nosecone 모이고 유도 상자; 연결 호흡 회로에 새로운 목탄 용기를 연결. 산소 설정 하 고 2 단계 약 50 psi를 읽고 확인 하 여 유도 상자를 준비 합니다.
- 37 ° c가 열 패드 설정
- 수술에 대 한 직장 온도 프로브를 준비 합니다.
2. 마우스 준비
이 단계는 마 취, 탈모, 및 위치 (성인 FVBN 쥐 나이 16-20 주)를 포함 합니다.
- 쥐의 무게 고 무게를 기록 합니다.
- 쥐 anesthetize
- 마 취 제와 xylazine IP 관리 (80-100 mg/kg 및 7.5-16 mg/kg, 각각). 그러나, 그것 마 취 제와 xylazine의 더 낮은 복용량으로 시작 하는 것이 좋습니다 (30mg/kg 및 6 mg/kg에 대 한 각각).
- 약 0.1와 마 취 유지-0.25 시간 초기 수술 내내 마 취 제/xylazine의 복용량. 마 취 제와 xylazine 더 재현성 및 생존 관찰 했다이 특별 한 연구에 있는 선택의 마 취 에이전트 했다. 다른 연구에서 선택의 마 취 에이전트 다를 수 있습니다. Isoflurane 사용 하는 경우 마우스 유도 챔버에 넣고 5 %isoflurane 마우스 지 면 완전 한 의식 때까지 설정. 다음 절차의 나머지 부분에 걸쳐 1.5-2.5 %isoflurane 설정 비 nosecone를 사용 합니다.
- 모든 2-3 분 발가락 핀치 마 취의 적절 한 깊이를 확인 하 여 쥐를 모니터링 합니다.
- 마우스의 복 부 목 부분을 면도.
- 따뜻한 패드에 부정사 위치에 마우스를 놓습니다. 발 및 테이프로 수술 표면에 마우스의 발을 보호 합니다.
- 수술 하는 동안 밖으로 건조를 방지 하기 위해 눈에 인공 눈물 연 고를 배치 합니다.
3. 수술 정보
- 경 정 맥 이상 오른쪽 복 부 목에 1 cm 절 개를 하 게.
- 혈관 확장을 촉진 하 고 통증 관리에 대 한 절 개 면에 하나 또는 두 방울 lidocaine (1-2%)를 적용 합니다. 적용 lidocaine에 대 일 분 기다립니다.
- 노출 하 고 무딘 절 개를 통해 바로 내부 경 정 맥 혈관을 분리. 정 맥에서 4-0 봉합과 고 부드럽게 한 hemostat로 선박의 rostral 끝을 철회. 좋은 위, 아래 또는 넥타이, 꼬리 약 3 m m를 사용 하 여 정 맥의 직경을 통해 약 절반, 구멍을 잘라.
- 태양광 발전-1 폴 리 비닐 카 테 터 끝에서 1.5 c m을 mark 선박 확장기를 사용 하 여 구멍을 통해 경 정 맥에 삽입 하 고 선박, 약 1.5 cm의 꼬리 끝 쪽으로 카 테 터를 스레드.
- 4-0 실크 (컷), 아래 그릇의 꼬리 부분 내에서 안전 하 게 카 테 터를 묶어. Rostral 부분의 봉합 단계 3.3에서에서 rostral 경 정 맥을 연결 하는 데 사용 했다의 느슨한 끝을 가진 카 테 터의 외부에 선박을 묶어.
- 느슨하게 압정 피부 체온의 손실과 조직의 건조를 방지 하는 4-0 실크로 테 주위 함께 다시.
- 테 heparinized 염 (10 U/mL)를 포함 하는 주사기를 연결 하 고 카 테 터를 플러시.
4입니다. 주사
- 경 정 맥 카 테 터, 다음 라인을 플러시 heparinized 염 분의 작은 볼륨으로 에반스 블루 솔루션 (0.9% 정상, unheparinized 염 분, 또는 약 50 mg/kg에 30 mg/mL 해결책의 50 μ)을 주사.
- 2 분 후, 물질 P (0.9% 정상, unheparinized 염 분, 또는 1 nmol/kg에서 0.3 μ M 솔루션의 100 μ), 뒤에 라인을 플러시 heparinized 염 분의 작은 볼륨을 주입. 물질 P는 내 피 레이어; 통해 플라스마 단백질의 넘쳐 흐름을 증대 시킵니다. 이 프로토콜에서 그것은 일상적으로 쉽게 플라즈마 넘쳐 흐름 값을 측정 하는 약 1.5-fold의 플라즈마 넘쳐 흐름 값의 확대를 유도 합니다.
- 물질 P 주입 후 18 분을 기다립니다. 이 기간 동안, 에반스 블루 염료 equilibrate 하 고 순환.
- 자 궁 경부 전위와 마우스를 희생 하 여 물질 P (에반스 블루 주사 후 20 분)의 주사 후 18 분 실험을 종료 합니다. 그것은 가능성이 그 마우스 수 직접 cervically 탈 구, 첫 주는 취의 과다 복용 하지 않고 마우스는 아마 아직도 잘 마 취 수술에서. 그러나, 그것은 필요한 경우, 마 취약 케 타 민/xylazine, isoflurane, 또는 pentobarbital 과다 주어진 수 있습니다, 뒤에 자 궁 경관 탈 구.
5입니다. 장기 절연
- 오픈 마우스의 흉 고 중력-perfuse (약 51 ㎝ 또는 20"의 높이)에서 심장 및 혈관 50mm 나트륨 시트르산, 산도 3.5의 50 mL와 함께. pH 3.5 아마도 에반스 블루 바인딩 알 부 민을 유지합니다.
- 1-5 관련 기관 (조직) (예: 방광, 신장, 위, 간, 췌 장, 근 위 또는 원심 결 장, 회장, 십이지 장, 측면 피부, 귀, 꼬리, 심장, 또는 폐) 해 메스와 excise 고 경우 잔여 내용이 제거 현재.
- 실 온 (RT) 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS; 나2HPO4, KH2PO4, 8.0 g의 0.24 g의 NaCl, 1.44 g와 0.20 g 1 L, pH 7.4에에서 KCl의)에서 장기를 씻어.
- 오 점 조직으로 장기, 각 기관 반으로 자르고 각 절반 무게 (젖은 중량 g에서).
- 1 개를 말리십시오 호, 48 h에 150 ° C에서 건조 오븐에서 조직의 절반.
- 장소는 microfuge에 formamide의 일관 된 볼륨 (최대 200 µ L)에서 절반 관 48 h에 대 한 (그리고 72 h까지) 다른 조직 에반스 블루를 추출.
6입니다. 조직 OD의 측정
- 폴리스 티 렌 96 잘 접시의 한 잘에 microfuge 관 및 장소에서 에반스 블루 생긴 formamide (후 48-72 h RT 외피)의 50 µ L을 제거 합니다. 수는 formamide 함께 조직 조각을 전송 하지 않도록 주의 하십시오.
- 공백에 대 한 96 잘 접시의 두 빈 우물의 각 새로운, 순수한 formamide의 장소 50 µ L.
- 측정 하 고 흡 광도 플레이트 리더에 96 잘 접시의 각의 OD620 기록. 620 nm에서 흡 광도 에반스 블루의 최대.
7입니다. 플라즈마 넘쳐 흐름의 계산
- 건조 조직 무게 절반 48 h에 대 한 오븐에 왔다.
- 특정 기관에서 각 개별 마우스,이 직물의 젖은 무게 반 시작 (5.4에서 얻은 단계), 관심의 절반이 같은 조직의 건조 중량으로 나눈 값 (7.1에서 얻은 단계)에 대 한 젖은 무게/건조 중량 비율을 계산 합니다.
- 그것 전에 절반 젖은 여 formamide (단계 5.4에서에서 얻은)에 배치 했다 조직의 젖은 무게를 나누어 절반 formamide는 건조 중량 (g) 조직의 계산: 건조 중량 비율 (단계 7.2에서에서 계산)의 특정 기관에 대 한.
- OD620 수정 값을 계산 합니다. OD620 부터 (에반스 블루 주입 formamide 단계 6.3에서에서 얻은 각 조직에서를 포함 하는) 96 잘 접시의 각 실험 우물에서 값 빼기 빈 잘 OD620 값 (평균 OD620 의 가치 준비 단계 6.2에서 순수한 formamide를 포함 하는 두 개의 우물620 값 단계 6.3에서에서 얻은 세) 각 실험 값에서.
- 계산 플라즈마 넘쳐 흐름 값 수정된 OD620 (에서 계산된 단계 7.4) 조직의 건조 중량으로 나누어 절반 formamide (에서 계산된 단계 7.3). 플라즈마 넘쳐 흐름의 단위 OD620/g 건조 중량을 될 것입니다.
- 데이터를 분석 하 고 평균 ± SEM. 통계 t 시험 또는 단방향 분산 분석 고 있어의 다중 비교 테스트 (lycofs01.lycoming.edu), 적절 한 그룹을 비교 하는 표현.
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Representative Results
그림 1, 절차의 회로도 표시는 가장 안정적이 고 일관성 있는 물질 P 유도 플라즈마 넘쳐 흐름 값 FVBN 쥐의 장기에서 발견 되었습니다. 이 절차는 일반적으로 작업, 대기 시간의 적어도 48 h 구분의 2 일 걸립니다. 비교할 모든 실험에 일관 되 게 이렇게 훨씬 더, 밖으로 확산 가능 하다. 예를 들어 장기 주 1 격리 후 장기 수 플래시 액체 질소에서 냉동 고-80 ° C에 저장 (1 주에 몇 일) 이내 장기를 신중 하 게 녹고, 따라 그들은 PBS로 세척 고 프로토콜의 나머지 전에 얼룩이. 또한, 비록 조직의 건조 할 수 명시 (150 ° C에서 48 h에 대 한), 조직의 블루 에반스의 추출 절반 formamide 확장할 수 있습니다에서 48-72, formamide에서 시간은 모든 실험에 대 한 일관 된.
그림 2 및 표 1 에 데이터 설명 FVBN 야생 타입 (WT)와 NEP 녹아웃 (KO) 마우스17, 오 줌 방광에서 물질 P 유도 플라즈마 넘쳐 흐름 표시는이 연구소의 주로 사용할 수 없습니다 했다 NEP 및 레 귤 레이 션과 행동에 선택한 neuropeptides18,19의 오랜 관심사. NEP 코 마우스는 어떤 조직에 NEP를 표현 하지 않습니다. 그러나, NEP WT 쥐의 방광 내 이기는 하지만 낮은 레벨20,,2122에서 표현 된다. 그림 2 및 표 1 에이 두 그룹의 쥐에서 오 줌 방광에서 물질 P 유도 플라즈마 넘쳐 흐름에 차이가 있다 하는 것이 좋습니다. 이 의미는 역할 NEP에 대 한 오 줌 방광에서 물질 P 유도 플라즈마 넘쳐 흐름에 NEP의 표현 WT 및 NEP 코 쥐의 오 줌 방광의 주요 차이 잠재적으로 이후 합니다.
원래 데이터 (그림 2 및 표 1) 방광에 물질 P 유도 플라즈마 넘쳐 흐름에 NEP에 대 한 가능한 역할을 제안, 때문에 우리는 더욱 완벽 하 게 다른에서 플라즈마 넘쳐 흐름에 NEP의 관련을 조사 하기로 오르간입니다. 첫째, 우리가 만든 이중 유전자 변형 마우스 overexpress NEP 거의 보편적으로23. 세 가지 유형의 FVBN 마우스에서 데이터의 비교를 허용 하는이 조작된 마우스: WT 쥐16, 자연스럽 게 많은 조직;에 NEP의 제한 금액을 표현 하는 NEP 코 쥐17, 어떤 조직; 아무 NEP를 표현 하는 그리고 우리의 이중 유전자 변형 NEP overexpressor 마우스23, doxycycline의 관리에 따라 거의 모든 조직에는 overexpress NEP. 마우스 doxycycline 포함에 무료로 액세스할 수 있습니다 (그림 1); 수술 전 1 주 차 doxycycline 복용량은 차 우, 미색의 1 mg/kg 이다. NEP를 overexpress 이러한 이중 유전자 변형 마우스의 건설, NEP 분석 실험, westerns, 및 NEP mRNA 정량23설명 자세한 되었습니다 있다.
쥐의 이러한 3 종류,이 프로토콜 십이지23 (그림 3 및 표 2)를 포함 하 여 조직에서 플라즈마 넘쳐 흐름에 NEP에 대 한 역할을 보여줍니다. 이 실험에서 이중 유전자 변형 NEP overexpressor 마우스에 NEP overexpression 바뀌었고 먹이 의해, 1 주 1, 일 전에 doxycycline 포함 된 차 우에 대 한 (미색; 1 mg doxycycline/mg 차 우, 그림 3을). 컨트롤, 일부 WT 및 NEP 코 마우스 또한 하루 1 (그림 3b 와 3 c) 앞 주 동안 undyed doxycycline 차를 먹이 했다.
플라즈마 넘쳐 흐름에는 십이지에 FVBN 마우스, FVBN WT 및 NEP (이중 유전자 변형)의 십이지에 NEP의 식의 NEP의 역할을 확인 하려면 overexpressor 마우스 doxycycline 차 우를 먹이 polyclonal 항 체에 대 한 서 부 분석에 의해 확인 되었다 인간의 NEP (어떤 마우스 NEP와 cross-reacts)23. 이 분석 확인 WT duodenums 익스프레스 NEP 단백질의 적당 한 양의 하지만 NEP overexpressor duodenums 익스프레스 2-3 배 NEP 양의 WT duodenums에 의해 표현. NEP 코 쥐 정의 십이지 장에서 어떤 NEP를 표현 하지 않습니다.
그림 1: 물질 P 유도 플라즈마 넘쳐 흐름을 측정 하기 위한 프로토콜의 일반적인 스키마. FVBN 쥐 (나이 16-20 주)의 장기에서 물질 P 유도 플라즈마 넘쳐 흐름을 측정 하기 위한 프로토콜의 회로도 이 프로토콜 경 정 맥에 주사를 통해 에반스 블루 염색 방법으로 조직의 플라즈마 넘쳐 흐름의 측정을 포함 하 고 증강 하 고 쉽게 측정 플라즈마 넘쳐 흐름을 깨는 것 관리 물질 P 값, OD620/g 건조 중량의 단위로. 설명된 프로토콜 FVBN 마우스의 다양 한 기관에서 일관 된 물질 P 유도 플라즈마 넘쳐 흐름 값이 발견 되었습니다 그리고 일의 2 일 최소를 걸립니다. 1 일 및 2 일 이상 48 h 건조 하 고 추출 하는 조직에 대 한 대기 시간으로 구분 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : WT 및 NEP 코 쥐의 오 줌 방광에서 물질 P 유도 플라즈마 넘쳐 흐름. (사전 doxycycline) 없이 FVBN 쥐에서 방광 플라즈마 넘쳐 흐름 물질 P 관리에 의해 증강 하 고 OD620 nm/g 건조 중량으로 표현. 오 줌 방광 FVBN 야생 타입에서 고립 되었다 (WT; 백색 바, n = 12) 또는 FVBN NEP 녹아웃 (KO; 검은 바, n = 7) 마우스 위의 자세한 플라즈마 넘쳐 흐름에 대 한 프로토콜을 대상. 개별 값은 표 1에 주어진 다. 막대 위에 줄 평균 (SEM)의 표준 오차를 나타냅니다. WT 및 NEP 코 값으로 상당한 차이 p 줍니다 = 0.051 t 시험. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : WT, NEP 코 및 NEP overexpressor 쥐의 십이지 장에서 물질 P 유도 플라즈마 넘쳐 흐름. (A-C) 십이지 장 플라즈마 넘쳐 흐름 물질 P 관리에 의해 증강 하 고 OD620/g 건조 중량으로 표현. (A) Duodenums 이전 doxycycline 없이 FVBN WT 쥐에서 고립 되었다 (-; 백색 바, n = 5), 사전 doxycycline 없이 NEP 코 쥐 (-; 빛 회색 바, n = 5), 사전 doxycycline 없이 NEP ovexpressor 이중 유전자 변형 마우스 (DT-; 어두운 회색 바, n = 5) 또는 NEP 이전 doxycycline와 ovexpressor 이중 유전자 변형 쥐 (DT +; 바 블랙, n = 4)과 위의 자세한 플라즈마 넘쳐 흐름에 대 한 프로토콜을 대상. 막대 위의 라인 대표는 SEM. NEP 코 (-) 값 동향 WT (-) 또는 DT (-) 값을 보다 높은 있지만이 차이가 통계적으로 중요 한 되지 않았습니다. 십이지 장 플라즈마 넘쳐 흐름 값 doxycycline 먹이, NEP ovexpressor 이중 유전자 변형 마우스 (DT +), 모든 다른 사람에 비해 그룹과 크게 감소 했다 (* p < 0.05, 분산 분석). (B, C) WT 및 NEP 코 쥐에서 십이지 장 플라즈마 넘쳐 흐름 값은 크게 영향을 받지 않습니다 doxycycline 관리 (p < 0.05). (B) WT 쥐 doxycycline 없이 (WT-; 백색 바, n = 5)와 아목시실린과와 WT 쥐 (WT +; 중간 회색 바, n = 7). Doxycycline 없이 (C) NEP 코 쥐 (코-; 빛 회색 바, n = 5) 및 NEP doxycycline와 코 (코 +; 중간 회색 바, n = 2). 개별 값을 B, C, 표 2에 주어진 a에서 합성으로 표시 합니다. 스프링 거 과학 + 비즈니스 미디어 허가 스프링 거 저널 제23 에서 사소한 수정 재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 유전자 형 | 섹스 | 습식/건식 방광의 무게 비율 | 방광의 무게를 절반 젖은 (g; 85 μ formamide) | 반 오 줌 방광의 건조 중량을 계산 (g) | OD 620 nm-빈 | OD 620 nm/g 건조 중량 (오 줌 방광) |
| WT | F | 4.737 | 0.0038 | 0.0008 | 0.0150 | 18.750 |
| WT | M | 4.632 | 0.0045 | 0.0010 | 0.0100 | 10.000 |
| WT | F | 4.700 | 0.0048 | 0.0010 | 0.0280 | 28.000 |
| WT | F | 4.625 | 0.0068 | 0.0015 | 0.0230 | 15.333 |
| WT | F | 4.546 | 0.0077 | 0.0017 | 0.0400 | 23.529 |
| WT | M | 4.800 | 0.0094 | 0.0020 | 0.0570 | 28.500 |
| WT | M | 5.500 | 0.0095 | 0.0017 | 0.0240 | 14.118 |
| WT | F | 4.316 | 0.0098 | 0.0023 | 0.0660 | 28.696 |
| WT | M | 5.061 | 0.0121 | 0.0024 | 0.0400 | 16.667 |
| WT | M | 5.061 | 0.0192 | 0.0038 | 0.0330 | 8.684 |
| SEM을 (위의 열에서 항목) + 의미 | 0.105 + 4.798 | 0.0014 + 0.0088 | 0.0003 + 0.0018 | 0.0056 + 0.0336 | 2.393 + 19.228 | |
| 코 | M | 4.316 | 0.0196 | 0.0045 | 0.1610 | 35.778 |
| 코 | M | 4.600 | 0.0134 | 0.0029 | 0.1020 | 35.172 |
| 코 | M | 4.377 | 0.0104 | 0.0024 | 0.0410 | 17.083 |
| 코 | M | 4.727 | 0.0258 | 0.0055 | 0.1410 | 25.636 |
| 코 | F | 4.539 | 0.0025 | 0.0006 | 0.0250 | 41.667 |
| 코 | M | 4.457 | 0.0149 | 0.0033 | 0.1420 | 43.030 |
| SEM을 (위의 열에서 항목) + 의미 | 0.062 + 4.503 | 0.0032 + 0.0144 | 0.0032 0.0007 + | 0.0233 + 0.1020 | 4.065 + 33.061 |
표 1: 개별 WT 및 NEP 코 쥐의 오 줌 방광에서 물질 P 유도 플라즈마 넘쳐 흐름. FVBN 쥐 (없이 사전 doxycycline)에서 플라즈마 넘쳐 흐름 값 FVBN WT에서 OD620 nm/g 건조 중량으로 개별적으로 표현 되었다 (n = 12) 또는 NEP 코 (n = 7) 마우스 위의 자세한 플라즈마 넘쳐 흐름에 대 한 프로토콜을 대상. 성별 차이가 플라즈마 넘쳐 흐름 값에서 분명 했다. 오 줌 방광 했다 격리; 개별 값은 방광, 방광의 젖은 무게의 계산된 습식/건식 무게 비율에 대 한 formamide에 절반, 계산 자체 무게는 방광의 formamide (에 주어진된 g), 수정 된 OD620 nm (샘플 OD620 nm에 절반 meanOD620 nmof 마이너스 공백 (순수 formamide), 및 OD620 nm/g에서 계산 된 플라즈마 넘쳐 흐름 값 건조 무게 (는 수정된 OD620 nm, 계산 된 건조 중량으로 나눈 값). 결과 플라즈마 넘쳐 흐름 값은 그림 2를 만드는 데 사용 되었다.
| 유전자 형 및 doxycycline 차 우, (-) 없이 또는 (+) | 섹스 | 습식/건식 십이지의 무게 비율 | 십이지의 무게를 절반 젖은 (g; 85 μ formamide) | 십이지의 건조 중량을 절반 계산 (g) | OD 620 nm-빈 | OD620 nm/g 건조 중량 (십이지 장) |
| WT- | M | 4.927 | 0.0307 | 0.0062 | 0.0640 | 10.272 |
| WT- | F | 4.912 | 0.0172 | 0.0035 | 0.0460 | 13.138 |
| WT- | M | 5.333 | 0.0281 | 0.0053 | 0.0960 | 18.221 |
| WT- | F | 5.433 | 0.0375 | 0.0069 | 0.1010 | 14.634 |
| WT- | M | 5.179 | 0.0287 | 0.0055 | 0.0430 | 7.759 |
| SEM을 (위의 열에서 항목) + 의미 | 5.157 0.105 + | 0.0033 + 0.0284 | 0.0055 0.0006 + | 0.0122 + 0.0700 | 1.798 + 12.805 | |
| WT + | M | 5.342 | 0.0542 | 0.0101 | 0.1520 | 14.981 |
| WT + | M | 5.653 | 0.0477 | 0.0084 | 0.1120 | 13.272 |
| WT + | M | 5.700 | 0.0564 | 0.0099 | 0.1110 | 11.218 |
| WT + | F | 5.542 | 0.0498 | 0.0090 | 0.1430 | 15.914 |
| WT + | F | 5.723 | 0.0266 | 0.0046 | 0.0470 | 10.112 |
| WT + | F | 5.186 | 0.0262 | 0.0051 | 0.0470 | 9.304 |
| WT + | M | 5.543 | 0.0342 | 0.0062 | 0.0480 | 7.779 |
| SEM을 (위의 열에서 항목) + 의미 | 0.075 + 5.527 | 0.0049 + 0.0422 | 0.0076 0.0009 + | 0.0175 + 0.0943 | 1.142 + 11.797 | |
| KO- | F | 5.763 | 0.0209 | 0.0036 | 0.0690 | 19.025 |
| KO- | M | 4.232 | 0.0164 | 0.0039 | 0.1010 | 26.061 |
| KO- | M | 4.810 | 0.0227 | 0.0047 | 0.0880 | 18.647 |
| KO- | F | 5.650 | 0.0363 | 0.0064 | 0.0600 | 9.339 |
| KO- | M | 5.212 | 0.0178 | 0.0034 | 0.0640 | 18.739 |
| SEM을 (위의 열에서 항목) + 의미 | 0.282 + 5.133 | 0.0035 + 0.0228 | 0.0005 + 0.0044 | 0.0764 0.0078 + | 2.659 + 18.362 | |
| 코 + | M | 5.128 | 0.0193 | 0.0038 | 0.0600 | 15.941 |
| 코 + | M | 5.030 | 0.0459 | 0.0091 | 0.1980 | 21.697 |
| (위의 열에서 항목)의 범위 + 의미 | 0.049 + 5.079 | 0.0133 + 0.0326 | 0.0027 ± 0.0065 | 0.0690 + 0.1290 | 2.878 + 18.819 | |
| DT- | M | 5.426 | 0.0322 | 0.0059 | 0.0775 | 13.058 |
| DT- | M | 4.255 | 0.0360 | 0.0085 | 0.0895 | 10.579 |
| DT- | M | 4.818 | 0.0306 | 0.0064 | 0.1460 | 22.989 |
| DT- | M | 5.189 | 0.0197 | 0.0038 | 0.0380 | 10.010 |
| DT- | F | 5.500 | 0.0256 | 0.0047 | 0.0390 | 8.379 |
| SEM을 (위의 열에서 항목) + 의미 | 0.229 + 5.038 | 0.0028 + 0.0288 | 0.0008 + 0.0059 | 0.0780 0.0198 + | 2.3607 + 13.003 | |
| DT + | M | 5.008 | 0.0694 | 0.0139 | 0.0270 | 1.948 |
| DT + | M | 4.750 | 0.0660 | 0.0139 | 0.0070 | 0.504 |
| DT + | M | 5.495 | 0.0587 | 0.0107 | 0.0692 | 6.478 |
| DT + | M | 5.233 | 0.0542 | 0.0104 | 0.0620 | 5.986 |
| SEM을 (위의 열에서 항목) + 의미 | 0.159 + 5.121 | 0.0034 + 0.0621 | 0.0010 + 0.0122 | 0.0147 + 0.0413 | 1.478 + 3.729 |
표 2: 개별 WT, NEP 코 및 NEP overexpressor 쥐의는 duodenums에서 물질 P 유도 플라즈마 넘쳐 흐름. FVBN 마우스 (또는 사전 doxycycline 없이)에서 플라즈마 넘쳐 흐름 값 FVBN WT 쥐에서 OD620 nm/g 건조 중량으로 개별적으로 표현 되었다 (n 5, 그리고 n = = 7, doxycycline), NEP 코 쥐 (n = 5, 그리고 n = 2, doxycycline), 및 NEP overexpressor 이중 유전자 변형 마우스 (n = 5, 그리고 n = 4, doxycycline). 마우스 위에 설명된대로 플라즈마 넘쳐 흐름에 대 한 프로토콜을 받게 했다. 성별 차이가 플라즈마 넘쳐 흐름 값에서 분명 했다. Duodenums은 격리; 플라즈마 넘쳐 흐름을 계산에 사용 하는 개별 값은 표 1에 설명 된 대로. 결과 플라즈마 넘쳐 흐름 값은 그림 3A-C를 만드는 데 사용 되었다.
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Discussion
위에서 설명 했 듯이, 플라즈마 넘쳐 흐름의 연구의 원인에 관한 새로운 지식 또는 억제 또는 플라즈마 넘쳐 흐름을 치료 하는 새로운 방법에 궁극적으로 이어질 수 있습니다. 현재 원고에서 플라즈마 넘쳐 흐름 프로토콜 (위)의 성공적인 사용 입증 되었습니다 에반스 파란색 염료를 사용 하 여. 표시 된 데이터를 다시 있지만 NEP는 맥 관 구조를 보호 수 있습니다 가설 플라즈마 넘쳐 흐름에 대 한 이것은 보조 목표 현재,와 함께 기본 목표에 대 한 평균 실험실에서 쉽게 사용할 수 있는 최적화 된 프로토콜을 제시 되는 플라즈마 넘쳐 흐름의 미래 연구입니다. 여기 보고 프로토콜 다른 목표, 동물, 기관, 및 다른 조건, 미래 연구에 적응성에 초점을 맞추고 특히 유용 하기 때문에이 프로토콜은 사용 하 여 단순, 신뢰성, 경제적, 그리고 고려는 일반 일반적인 재료, 시 약, 및 유능한 직원의 가용성. 그러나 그것은 지적 이다,,이 프로토콜 그룹 동물 (8-12 반복 제안)의 당 반복의 공정한 금액을 요구할 것 이다 통계적으로 유효한 결과를 얻을.
수많은 연구와 혈관 침투성 및 플라즈마 넘쳐 흐름을 측정 하는 시도 자세히 보고 되었습니다. 지금까지, 대부분의 이러한 보고서의 세부 조사 플라즈마 넘쳐 흐름, 혈관 침투성2,3,6,11, 를 에반스 블루 염료 메서드와 함께 사용 되는 방법의 순열 12,13. 모든3,13,15,의24; 블루 에반스를 통합 하지 혈관 침투성 방법 적은 보고 왔다 이러한 다른 방법은 일반 평균 실험실에 대 한 액세스 요구 하는 복잡 한 방법, 전문된 장비 및 인력에 있고 일반적으로 비싸다.
위의 블루 에반스 프로토콜의 개발 참여의 많은 다른 순열을 수정 테스트. 초기 실험은 에반스 블루 마우스 꼬리 정 맥을 통해 주입 하는 시도에 집중 되었다. 그러나, 정 맥 주사 증명 기술적으로 도전적이 고 일관성 없는 결과, 경 정 맥 주사의 포함을 필요로 결과 및 위에서 설명한 터미널 수술 기법 꼬리. 많은 예비 실험 했다 또한 완료 하려고 블루와 물질 P. 에반스의 적절 한 농도 찾을 에반스 블루의 정확한 금액으로 약 200 mg/kg (50 mg/kg 현재 사용에 비해), 아래만이 실험에 사용 되는 물질 P 양의 중요 한 긴급, 수를 찾을 수 없습니다. 많은 실험 후에 1 nmole/kg 것 추가 물질 P, 1.5-fold 확대의 (그리고 따라서 더 쉽게 측정)의 이상적인 농도 이기 위하여 찾아냈다 플라즈마 넘쳐 흐름 값. 또한, 그것은 에반스 블루 equilibrate에 대 한 충분 한 시간을 허용 되어야 한다 발견 (> 10 분). 마우스의 하지만 기관 격리, 이전 희생 후 초과 에반스 블루를 제거 하는 혈관의 관류가 관류 단계4를 포함 하지 않는 다른 프로토콜 반대 현재 프로토콜의 필수 요소가 될 발견 됐다. Perfusate (부드러운 중력 기온 변화도 의해 전달)은 산도 3.5 솔루션 (에반스 블루 및 알 부 민 바인딩을 장려);의 50 mL paraformaldehyde, 많은 다른 에반스 블루 프로토콜6,10,25일에 현재 프로토콜에서 생략 됩니다. 이 프로토콜에서 해결 되었습니다 다른 요인은 doxycycline 차에 사용 되는 염료 영양 트랙에서 조직에 에반스 블루의 OD620 nm 측정 방해입니다. 따라서, 위의 실험에 undyed doxycycline 차를 사용 해야 했다. 또한, 중요 하 고 유용한 찾기 마우스의 거의 모든 장기는 만족 스럽게 격리 하 고 현재 프로토콜을 통해 검사 이다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 그들의 귀중 한 도움과 편집이이 원고에 대 한 앤디 Poczobutt와 박사 파주시 조리 Leszczynski 감사 하고자 합니다. 국가 심 혼, 폐 및 혈액 연구소 (NHLBI RO1 HL078929, PPG HL014985 RO3 HL095439) 및 학과의 재향 군인의 업무 (가치 평가)에서 받은 보조금으로 지원.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| isoflurane | Vet One | 200-070 | inhaled anesthetic |
| ketamine | Vet One | 200-055 | injectable anesthetic |
| xylazine | Lloyd Laboratories | 139-236 | injectable anesthetic |
| syringes (10,3 & 1 cc) | Becton Dickinson | 309604, 309657, 309659 | |
| needles (20G1,23G1 & 26G1/2) | Becton Dickinson | 305178, 305193, 305111 | |
| isoflurane induction chamber | VetEquip | 941443 | 1 Liter |
| nosecone breathing circuits | VetEquip | RC2 | Rodent Circuit Controller 2 |
| oxygen tank | Airgas | UN 1072 | 100% medical |
| heating pad | CWE Inc. | TC-1000 | temperature controller |
| rectal temperature probe | CWE Inc. | 10-09012 | mouse |
| balance (for rodents) | Ohaus | CS 2000 | |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 15000-00 | Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11151-10 | Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13009-12 | Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools -suture drivers | Fine Science tools | 12502-12 | Olsen-Hegar suture drivers (suturing) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11627-12 | Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14110-15 | Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 18025-10 | suture tying forceps (used for Millar cath) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14078-10 | Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14082-09 | Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11051-10 | 10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11251-35 | Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels) |
| surgical tools-retractors | Fine Science tools | 17012-11 | Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11294-00 | Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11297-00 | Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14058-11 | tough cut iris scissors (mouse dissection, bones) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11009-13 | serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13003-10 | Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11006-12 | Adson serrated forceps (tissue grasping) |
| clippers | Oster | A5 | |
| tape | Fisherbrand | 159015G | |
| artificial tear ointment | Akorn Inc | 13985-600-03 | |
| lidocaine | Hospira | 0409-4277-01 | 2% injectable |
| polyvinyl catheters | Tygon | PV-1 | |
| Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Substance P | Bachem | H-1890 | |
| heparin | Sagent Pharmaceuticals | 25201-400-10 | 1000 U/ml |
| saline solution | Hospira | 0409-7138-09 | 0.9% sodium chloride |
| phenobarbital | Vortech | 0298-9373-68 | |
| sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417-50TAB | |
| Kimwipes for blotting | Fisher Scientific | 06-666A | |
| formamide | Sigma Aldrich | 47670 | |
| microbalance | Denver Instrument | APX-60 | |
| microfuge tubes | Fisher Scientific | 07-200-534 | |
| polystyrene 96 well plate | Becton Dickenson | 351172 | |
| absorbance plate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| polyacrylamide gels | Bio-Rad | 3450014 | |
| protein molecular weight standard | Bio-Rad | 1610374 | |
| Protran supported nitrocellulose | Amersham (GE) | 10600015 | |
| gel box | Bio-Rad | 1658005 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P-1379 | |
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| primary NEP polyclonal antibody | R & D Systems | AF1182 | |
| doxycycline chow | Teklad (HARLAN) | TD.130750 | |
| FVB/NJ wild type mice | Jackson | 001800 | |
| secondary antibody (goat anti-rabbit) | ZyMed | 81-6120 | |
| ECL solution-Western Lightening Plus | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| film | Pierce | 34091 |
References
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