Summary
I den här artikeln beskrivs ett ekonomiskt, optimerad och enkel protokoll som använder metoden Evans blått färgämne för att bedöma plasma extravasering i organ av FVBN möss som kan anpassas för användning i andra stammar, arter, och andra organ eller vävnader.
Abstract
Vaskulär läckage eller plasma extravasering, har ett antal orsaker, och kan vara en allvarlig konsekvens eller symptom på ett inflammatoriskt svar. Denna studie kan i slutändan leda till ny kunskap om orsakerna till eller nya sätt att hämma eller behandla plasma extravasering. Det är viktigt att forskare har rätt verktyg, inklusive de bästa metoderna som finns, för att studera plasma extravasering. I den här artikeln beskriver vi ett protokoll, metoden Evans blått färgämne, för att bedöma plasma extravasering i organ av FVBN möss. Detta protokoll är avsiktligt enkelt, till lika stor en grad som möjligt, innehåller men data av hög kvalitet. Evans blå färg har valts främst eftersom det är lätt för genomsnittliga laboratoriet att använda. Vi har använt detta protokoll för att tillhandahålla bevis och stöd för hypotesen att de enzym neprilysin kan skydda vaskulatur mot plasma extravasering. Emellertid kan detta protokoll försöksvis användas och anpassas för användning i andra stammar av möss eller andra arter, i många olika organ eller vävnader, för studier som kan innefatta andra faktorer som är viktiga i förståelse, förebygga eller behandla plasma extravasering. Detta protokoll har optimerats på ett utförligt och modifierad från befintliga protokoll och kombinerar tillförlitlighet, enkel användning, ekonomi och allmän tillgänglighet av material och utrustning, att göra detta protokoll överlägsen för genomsnittliga laboratoriet att använda i kvantifiera plasma extravasering från organ.
Introduction
Vaskulär läckage i organ avser extravasering, eller läckage av blod plasma genom luckor tillverkas i endotel bokför kapillär venoler i organen. Denna plasma extravasering eller ökad vaskulär permeabilitet, som kan uppstå från någon typ av en inflammatorisk reaktion, kan få allvarliga konsekvenser. Det är därför viktigt att detta fenomen, dess orsaker, modulatorer och konsekvenser, studeras och förstås, och likaså att utredarna har bra verktyg och protokoll att studera dem. Endothelial luckorna kan produceras via ett antal stimuli, men vanligtvis produceras av peptid signalsubstanser eller tachykininer på endothelia. En av de större naturligt förekommande mediatorer av denna process, vilket resulterar i ökad plasma extravasering, är den undecapeptide tachykinin neuropeptid, substans P1.
Metoder att undersöka och mäta vaskulär permeabilitet eller plasma extravasering, som använder egenskapen albuminbindning Evans blå färg, har utvecklats och är oftast kända för deras precision, enkelhet, ekonomi, säkerhet och möjligheten att tillåta det bestämning av plasma extravasering från flera vävnader på en gång, önskas om så2,3,4,5,6,7,8,9 . Detta Evans blå protokoll för att bedöma plasma extravasering i organ av FVBN möss använder alla dessa, men lägger till några viktiga ändringar som gör det generellt användbara och anpassningsbar för framtida studier, med den genomsnittliga laboratorium som utför eller kommer att genomföra viktiga studier av faktorer som förknippas med plasma extravasering eller vaskulär permeabilitet. I detta protokoll införs substans P till möss på 1 nmol per kg, vilket förstärker extravaseringen av plasma av 1.5-fold. Detta ökar känsligheten i protokollet, vilket resulterar i mer lätt observerbara och erhållas resultat. Andra faktorer som påverkar permeabilitet, såsom olika andra peptider, kemikalier eller vissa former av giftiga skada, får användas eller studerats av andra laboratorier, som önskat. Halsvenen injektioner används i detta protokoll att införa Evans blue och substans P systemiskt, som kräver terminal kirurgi. Emellertid, halsvenen injektioner5,7,10, även efter övervägande av de nödvändiga terminal kirurgiska teknikerna, är lättare att behärska och leda till produktion av mer enhetliga resultat än andra venös injektioner, inklusive svans ven injektioner4,9. Även om det kan vara möjligt för Evans blå levereras av retro-orbital vensinustrombos injektioner, har inga referenser i litteraturen hittats som använder denna metod för leverans av Evans blue. Men när det gäller svans ven injektioner begränsar den höga graden av expertis och övning att behärska reproducibly denna teknik kraftigt dess användning för framgångsrika Evans blå injektioner. Däremot erbjuder den alternativa halsvenen injektion metoden som beskrivs i våra protokoll, en tekniskt erhållas lösning. En avgörande förfarande för perfusion av musens vener, utförs precis efter offrandet av Evans blue-perfusion musen, tar bort överflödig Evans blå färgämnet och har standardiserats i detta protokoll. Tidigare beskrivna metoder för perfusion har noggrant granskats och modifierad för att erhålla förevarande förfarande. Andra ändringar som beskrivs här är alla optimerade, enkel och billig.
Det finns några viktiga begränsningar av metoden Evans blått färgämne. Till exempel låg känslighet ibland associerade med den här metoden kan förhindra att vissa ytterligare brutto patologiska och Histologisk undersökning av vävnader från Evans blue-injiceras djur. Dessa och andra begränsningar har dock lett till utvecklingen av alternativa metoder och modeller som, dock fortfarande använder Evans blå. Mätning av Evans blue av fluorescens (snarare än av visual-range) spektroskopi kan öka känsligheten för metoden. Dessutom utvecklades fluorescensmikroskopi av Evans blå-färgade vävnader för att möjliggöra observation av vaskulär läckage i mer distinkta platser11. Dessutom hela kroppen imaging och skanning av ett levande djur tidigare injiceras med Evans blå12 möjliggör undersökning av Evans blå koncentrationer på ett kontinuerligt sätt, snarare än på en specifik valt tid pekar av experimentet. Men den här metoden kräver tillgång till lämpliga faciliteter för imaging och kan bli mycket dyrt. Ändringar som rör Evans blue och utförs i en in vitro- typ av modell, har som i en cell kultur eller chick chorioallantoic modell13 (CAM) också beskrivits. Dessa modeller övervakas av fluorescens och intravital14 mikroskopi, och tillåter kvantifiering av vaskulär permeabilitet förändringar över tid, men kan ta upp frågor om korrekt modellering i vivo villkor och kan även dyra.
Det har förekommit andra metoder utvecklats för att bestämma och kvantifiera vaskulär läckage eller permeabilitet, som inte inbegriper förvaltning av Evans blå. Dessa metoder får anställa en lämplig fluorescerande molekyl (exempelvis albumin eller fluorescein), eller en isotopically märkta eller på annat sätt märkta molekyl, att levande djur (eller till cell kultur eller chorioallantoic (CAM) modeller13, följt av icke-invasiva Imaging (PET-kamerateknik, MRI, intravital mikroskopi, hela kroppen skanning) eller invasiva imaging (fluorescerande mikroskopi)3,12,15. Även om dessa tekniker kan erbjuda ett antal fördelar jämfört med andra Evans blå metoder, har de också nackdelar, vilket kan omfatta deras stora komplexitet, erforderlig expertis, resurser och höga monetära kostnader.
Neprilysin16 (peptidase enzymet NEP, även känd som CD10, MME eller enkefalinas) har föreslagits vara inblandade i att hämma plasma extravasering, åtminstone delvis, genom enzymatisk metabolism och inaktivering av endogen substans P. I vävnader som i cell surface-hämmare NEP uppstår, kan det således vara en försvagning av effekten av substans P, förmodligen av peptidase aktiviteten av NEP.
Inledningsvis testade vi för substans P-inducerad plasma extravasering utnyttja detta modifierade Evans blå protokoll, med FVBN vildtyp (WT) och NEP-knockoutmöss (KO). NEP inblandning i substans P-augmented plasma extravasering misstänktes från dessa inledande studier, och vi beskriva dessa och ytterligare experiment med NEPS roll i plasma extravasering. Fokus för detta manuskript är inte NEP eller dess roll i plasma extravasering, men snarare i plasma extravasering experimenterar själva. NEP resultaten är representativa för typ av resultat som kan erhållas genom användning av detta modifierade protokoll. Evans blå metoden att mäta plasma extravasering har optimerat och ändras, som beskrivs i detalj nedan för FVBN möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla tillämpliga internationella, nationella och/eller institutionella riktlinjer för skötsel och användning av djur (möss) följdes i de experiment som beskrivs i detta manuskript.
Denna metod använder FVBN vuxna möss, i åldern 16-20 veckor, befunnits vara optimala för denna studie. Dag 1 omfattar steg 1-5 och dag 2 omfattar steg 6-7 (figur 1).
1. utrustning förberedelse
- Säkra en tillräcklig försörjning av sterila, disponibel sprutor och nålar, om ketamin/xylazin används som bedövningsmedlet (som rekommenderas). Om isofluran används som bedövningsmedlet, kontrollera syre tanken och vätskenivån av isofluran att se till att det finns tillräckliga leveranser för experimentet innan du börjar. Också, montera den noskon andas kretsar och bifoga dem till rutan induktion. Fäst nya träkol kanistrar andning kretsar. Förbereda rutan induktion genom att vrida på syre och konstatera att det andra steget läser cirka 50 psi.
- Slå på värmedyna till 37 ° C.
- Förbereda rektaltemperatur sonden för operationen.
2. mus förberedelse
Detta steg innefattar anestesi, hårborttagning och positionering (vuxen FVBN möss-ålder 16-20 veckor).
- Väga möss och spela in vikterna.
- Söva möss.
- Administrera ketamin och xylazin IP (80-100 mg/kg och 7,5-16 mg/kg, respektive). Emellertid, det rekommenderas att börja med lägre doser av ketamin och xylazin (om 30 mg/kg och 6 mg/kg, respektive).
- Underhåll av anestesi med ca 0,1 - 0,25 gånger initiala doser av ketamin/xylazin under hela operationen. Ketamin och xylazin var den anestetiska medel av val i denna särskilda undersökning, som observerades mer reproducerbarhet och överlevnadsförmåga. Den anestetiska medel av val i andra studier kan hittas vara annorlunda. Om isofluran används, Placera musen i en induktion kammare och aktivera isofluran 5% tills musen förlorar fullt medvetande. Använd sedan en nasal noskon på 1,5-2,5% isofluran under återstoden av förfarandet.
- Övervaka möss varje 2-3 min tå nypa till check för lämpligt djup anestesi.
- Raka ventrala nacken av musen.
- Placera musen i ryggläge på förvärmd pad. Trygga tassar och fötter av musen till kirurgiska ytan med tejp.
- Placera konstgjorda tår salva till ögonen för att förhindra uttorkning under operation.
3. kirurgiska Detaljer
- Gör en 1 cm snitt i just ventrala nacken över halsvenen.
- Applicera en eller två droppar av lidokain (1-2%) i området snitt för smärtlindring och för att främja vasodilatation. Vänta 2 min. för det lidokain ska gälla.
- Exponera och isolera rätt inre halsvenen via trubbig dissektion. Binda venen med 4-0 sutur och dra försiktigt in i rostralt slutet av fartyget med en hemostat. Skär ett hål, med fina sax, ca 3 mm nedan eller stjärtfenan till slipsen, ungefär halva diametern av venen.
- Markera en PV-1 polyvinyl kateter 1,5 cm från slutet och infoga det i halsvenen genom hålet med ett fartyg dilatator tråd katetern i kaudala slutet av fartyget, ca 1,5 cm.
- Knyta katetern säkert inom den kaudala delen av fartyget (nedanför snittet), med 4-0 silke. Knyt den rostralt delen av fartyget på utsidan av katetern med de lösa ändarna av suturen som användes för att binda den rostralt halsvenen, i steg 3.3.
- Tack huden tillbaka löst tillsammans runt katetern med 4-0 silke för att förhindra förlusten av kroppsvärme och uttorkning av vävnader.
- Koppla katetern till en spruta innehållande hepariniserad saltlösning (10 U/mL) och Spola katetern.
4. injektioner
- Injicera lösningen Evans blå (50 μL av en 30 mg/mL lösning i 0,9% koksaltlösning för normal, unheparinized, eller ungefär 50 mg/kg) i halsvenen katetern, följt av en liten volym av hepariniserad koksaltlösning att spola linjen.
- 2 min senare, injicera substans P (100 μL av en 0,3 μM lösning i 0,9% normal, unheparinized koksaltlösning eller 1 nmol/kg), följt av en liten volym av hepariniserad koksaltlösning att spola linjen. Substans P förstärker extravaseringen av plasmaproteiner genom endothelial lagret; i detta protokoll inducerar det rutinmässigt en förstärkning av plasma extravasering värden för cirka 1,5, att göra plasma extravasering värden lättare att mäta.
- Vänta 18 min efter substans P injiceras. Under denna tid kommer Evans blå färgen temperera och cirkulera.
- Avsluta experimentet 18 min efter injektion av substans P (20 min efter Evans blå injektion) genom att offra musen med cervikal dislokation. Det är troligt att musen kan vara direkt cervically vrickat, utan att först ha gett en överdos av bedövningsmedel, som musen är förmodligen fortfarande väl sövda från operation. Dock om det är nödvändigt, kan en överdos av narkosmedel ketamin/xylazin, isofluran eller pentobarbital ges, följt av cervikal dislokation.
5. isolering av organ
- Uppskuren brösthålan av musen och gravitation-BEGJUTA (från en höjd av ca 51 cm eller 20 ”) hjärta och blodkärl med 50 mL 50 mM natriumcitrat, pH 3,5. pH 3,5 bevarar förmodligen Evans blå bindningen till albumin.
- Punktskatter 1-5 relevanta organ (vävnader) med en dissekera skalpell (e.g. urinblåsan, njure, mage, lever, bukspottkörteln, proximala eller distala kolon, ileum, tolvfingertarmen, flanken hud, öron, svans, hjärtat eller lungorna) och ta bort eventuella kvarvarande innehåll, om närvarande.
- Skölj orglarna i rumstemperatur (RT) fosfatbuffrad saltlösning (PBS; 1,44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, 8,0 g NaCl och 0.20 g KCl i 1 L, pH 7,4).
- Blot organ med vävnad, halvera varje orgel, och väga varje halva (våt vikter, i g).
- Torka en halvan av vävnaden i torkugn vid 150 ° C, på folie, för 48 h.
- Placera den andra vävnaden hälften i en konsekvent volym (upp till 200 µL) av formamid i en microfuge tub för 48 h (och upp till 72 h) att extrahera Evans blå.
6. mätning av vävnad OD
- Ta bort 50 µL av Evans blue-infunderas formamid (efter 48-72 h RT inkubation) från mikrofugrör och plats i en brunn av en 96 brunnar polystyren plattan. Var noga med att inte överföra vävnad bitar tillsammans med formamid.
- Plats 50 µL av nya, rena formamid i var och en av två tomma brunnar av 96 brunnar plattan för tomrummen.
- Mäta och registrera OD620 av varje brunn plattan med 96 brunnar på en absorbans Plattläsare. 620 nm är absorbansen max Evans blå.
7. beräkning av Plasma extravasering
- Väger den torr pappersnäsduk hälften som har varit i ugnen i 48 h.
- Beräkna förhållandet våt vikt/torr vikt för specifika organ av intresse från varje individuell mus, börjar med den våta vikten av denna vävnad halv (införskaffad i steg 5,4), dividerat med den torra vikten av denna samma vävnad halv (införskaffad i steg 7.1).
- Beräkna på torr vikt (i g) vävnaden hälften i formamid dividerar vävnaden hälften innan det placerades i formamid (erhålls i steg 5,4) av våta våta vikt: torrvikt baserat på specifika orgel av intresse (beräknat i steg 7,2).
- Beräkna de korrigerade OD620 -värdena. Värde från varje experimentella väl av den plattan med 96 brunnar (innehållande Evans blue-infunderas formamid från varje vävnad, erhölls i steg 6.3), börjar med OD620 och subtrahera det tomma väl OD620 värdet (OD620 medelvärdet av två brunnarna som innehåller ren formamid, bereddes i steg 6,2, OD620 värden som erhålls i steg 6.3) från varje experimental värde.
- Beräkna plasma extravasering av korrigerade OD620 (beräknade i steg 7,4) divideras med det torra väger av vävnad hälften i formamid (beräknade i steg 7,3). Enheterna av plasma extravasering blir OD620/g torrvikt.
- Analysera data och express som medelvärdet ± SEM. statistiskt Jämför grupper av t-test eller envägs variansanalys och Scheffés multipel-jämförelse test (lycofs01.lycoming.edu), som är lämpligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 1visas en schematisk av förfarandet, vilket har visat sig resultera i de mest pålitliga och konsekventa substans P-inducerad plasma extravasering värdena från organ av FVBN möss. Proceduren tar oftast två dagar av arbete, åtskilda med minst 48 h av väntetid. Det är möjligt att sprida ut ännu mer, om detta görs konsekvent för alla experiment som ska jämföras. Exempelvis efter organ är isolerad på dag 1, kan organ vara flash fryst i flytande kväve och lagras vid-80 ° C; vid noggrant upptining organ (inom ett par dagar till 1 vecka), kan de tvättas i PBS och utplånas innan resten av protokollet. Också, även om torkning av vävnader bör göras enligt (vid 150 ° C för 48 h), utvinning av Evans blå av vävnad hälften i formamid förlängas från 48-72 h, så länge som tiden i formamid är konsekvent för alla experiment.
Visas i figur 2 och tabell 1 data visar substans P-inducerad plasma extravasering från urin blåsorna FVBN vildtyp (WT) och NEP knockout (KO) möss17, som var tillgänglig primärt på grund av detta laboratoriets långvariga intressen i NEP och förordning och åtgärder av valda neuropeptider18,19. NEP KO möss uttrycker inte NEP i någon vävnad. Men uttrycks NEP inom urinblåsan WT möss, om än vid låga nivåer20,21,22. Figur 2 och tabell 1 tyder det finns en skillnad i substans P-inducerad plasma extravasering från urin blåsorna från dessa två grupper av möss. Detta antyder en roll för NEP i substans P-inducerad plasma extravasering från urinblåsan, eftersom uttrycket av NEP är potentiellt största skillnaden i urin blåsorna WT och NEP KO möss.
Eftersom den ursprungliga datan föreslog en möjlig roll för NEP i substans P-inducerad plasma extravasering i urinblåsan (figur 2 och tabell 1), beslutade vi att mer fullständigt undersöka medverkan av NEP i plasma extravasering i en annan orgel. Först, vi skapade en dubbelt transgen mus till overexpress NEP nästan universellt23. Denna konstruerade mus får en jämförelse av data från tre typer av FVBN möss: WT möss16, som naturligtvis uttrycka en begränsad mängd NEP i många vävnader; NEP KO möss17, som uttrycker ingen NEP i någon vävnad; och vår dubbelt transgena NEP overexpressor möss23, som overexpress NEP i nästan alla vävnader vid administrering av doxycyklin. Möss får fri tillgång till doxycyklin-innehållande chow i 1 vecka före kirurgi (figur 1). doxycyklin dosen är 1 mg/kg av chow, ofärgade. Byggandet av dessa dubbelt transgena möss som överuttrycka NEP har varit detaljerad, med beskrivning av NEP analyser, västernfilmer och NEP mRNA qPCR23.
Med dessa 3 typer av möss visar detta protokoll en roll för NEP i plasma extravasering i vävnader inklusive tolvfingertarmen23 (diagram 3 och tabell 2). I dessa experiment, den NEP överuttryck i dubbelt transgena NEP overexpressor mössen var påslagen vid utfodringen, för 1 vecka före dag 1, chow som innehåller doxycyklin (ofärgade; 1 mg doxycyklin/mg chow, figur 3en). Som en kontroll matades några WT och NEP KO möss också den ofärgade doxycyklin chow under den vecka som föregår dag 1 (figur 3b och 3 c).
För att bekräfta NEP roll i plasma extravasering till i tolvfingertarmen av FVBN möss, ett uttryck för NEP i tolvfingertarmen av FVBN WT och NEP (dubbelt transgena) overexpressor möss matas doxycyklin chow bekräftades av västra analys med en polyklonala antikroppar mot mänskliga NEP (som cross-reacts med mus NEP)23. Denna analys bekräftas att WT duodenums express måttliga mängder proteinet NEP, men de NEP overexpressor duodenums express 2-3 x beloppen för NEP uttryckt av de WT duodenums. NEP KO möss, uttrycker per definition, inte någon NEP i tolvfingertarmen.
Figur 1: allmänna schemat för protokollet för mätning av substans P-inducerad plasma extravasering. Schematisk bild av protokollet för mätning av substans P-inducerad plasma extravasering från organ av FVBN möss (ålder 16-20 veckor). Detta protokoll innebär mätning av vävnad plasma extravasering av metoden Evans blått färgämne genom injektion i halsvenen och införlivar exogent tillförda substans P, för att få förstärkt och enkelt uppmätta plasma extravasering värden, i enheter av OD620/g torrvikt. Protokollet beskrivs har visat sig resultera i konsekvent substans P-inducerad plasma extravasering värden från olika organ i FVBN möss och tar minst två dagars arbete. Dag 1 och dag 2 avgränsas med minst 48 h tid väntar vävnader att torka och extrahera. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Substans P-inducerad plasma extravasering från urinblåsan WT och NEP KO möss. Urinblåsan plasma extravasering från FVBN möss (utan föregående doxycyklin) förstärkt av substans P administration och uttryckt som OD620 nm/g torrvikt. Urin urinblåsor isolerades från FVBN vildtyp (WT; vit stapel, n = 12) eller FVBN NEP knockout (KO; svart bar, n = 7) möss och utsätts för protokollet för plasma extravasering som beskrivs ovan. Enskilda värden anges i tabell 1. Linjerna ovanför staplarna representerar standardavvikelsen för medelvärdet (SEM). Värdena WT och NEP KO trended mot en signifikant skillnad p = 0,051 av t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Substans P-inducerad plasma extravasering från tolvfingertarmen WT, NEP KO och NEP overexpressor möss. (A-C) Duodenal plasma extravasering utökas av substans P administration och uttryckt som OD620/g torrvikt. (A) Duodenums isolerades från FVBN WT möss utan föregående doxycyklin (-; vit bar, n = 5), NEP KO möss utan föregående doxycyklin (-; ljus grå bar, n = 5), NEP ovexpressor dubbelt transgena möss utan föregående doxycyklin (DT-; mörk grå bar, n = 5) eller NEP ovexpressor dubbelt transgena möss med föregående doxycyklin (DT +; svart bar, n = 4) och utsätts för protokollet för plasma extravasering som beskrivs ovan. Linjerna ovanför staplarna representerar SEM. Även om NEP KO (-) värdena trended högre än WT (-) eller DT (-) värden, var denna skillnad inte statistiskt signifikant. Duodenal plasma extravasering minskade signifikant endast med gruppen av doxycyklin matas, NEP ovexpressor dubbelt transgena möss (DT +), jämfört med alla andra (* p < 0,05, variansanalys). (B, C) Duodenal plasma extravasering värden från WT och NEP KO möss påverkades inte signifikant av doxycyklin administration (p < 0,05). (B), WT möss utan doxycyklin (WT-; vit stapel, n = 5) och WT möss med doxycyklin (WT +; medium grå bar, n = 7). (C), NEP KO möss utan doxycyklin (KO-, ljusgrått fält, n = 5) och NEP KO med doxycyklin (KO +; medium grå bar, n = 2). Enskilda värden som visas som en sammansatt i A, B och C, ges i tabell 2. Återges med mindre modifiering från Springer journal artikel23 med tillstånd av Springer Science + Business Media. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Genotyp | Sex | torr/viktförhållande av urinblåsan | våt vikt av urinblåsan halv (g; i 85 μL formamid) | Beräknad torrvikt av urinblåsan halv (g) | OD 620 nm - tomt | OD 620 nm/g torrvikt (urinblåsan) |
| WT | F | 4.737 | 0.0038 | 0,0008 | 0.0150 | 18.750 |
| WT | M | 4.632 | 0.0045 | 0.0010 | 0.0100 | 10.000 |
| WT | F | 4.700 | 0.0048 | 0.0010 | 0.0280 | 28.000 |
| WT | F | 4.625 | 0,0068 | 0,0015 | 0.0230 | 15.333 |
| WT | F | 4.546 | 0.0077 | 0.0017 | 0.0400 | 23.529 |
| WT | M | 4.800 | 0.0094 | 0.0020 | 0.0570 | 28.500 |
| WT | M | 5.500 | 0.0095 | 0.0017 | 0.0240 | 14.118 |
| WT | F | 4.316 | 0.0098 | 0.0023 | 0.0660 | 28.696 |
| WT | M | 5.061 | 0,0121 | 0,0024 | 0.0400 | 16.667 |
| WT | M | 5.061 | 0.0192 | 0.0038 | 0.0330 | 8.684 |
| Menar +/-SEM (av posterna i kolumnen ovan) | 4.798 +/-0.105 | 0.0088 +/-0,0014 | 0,0018 +/-0.0003 | 0,0336 +/-0,0056 | 19.228 +/-2.393 | |
| KO | M | 4.316 | 0.0196 | 0.0045 | 0.1610 | 35.778 |
| KO | M | 4.600 | 0.0134 | 0.0029 | 0.1020 | 35.172 |
| KO | M | 4,377 | 0.0104 | 0,0024 | 0.0410 | 17.083 |
| KO | M | 4.727 | 0.0258 | 0.0055 | 0.1410 | 25.636 |
| KO | F | 4.539 | 0,0025 | 0,0006 | 0.0250 | 41.667 |
| KO | M | 4.457 | 0,0149 | 0.0033 | 0.1420 | 43.030 |
| Menar +/-SEM (av posterna i kolumnen ovan) | 4.503 +/-0.062 | 0,0144 +/-0.0032 | 0.0032 +/-0.0007 | 0.1020 +/-0.0233 | 33.061 +/-4.065 |
Tabell 1: substans P-inducerad plasma extravasering från urinblåsan av enskilda WT och NEP KO möss. Värdena i plasma extravasering från FVBN möss (utan föregående doxycyklin) var individuellt uttryckt som OD620 nm/g torrvikt, från FVBN WT (n = 12) eller NEP KO (n = 7) möss och utsätts för protokollet för plasma extravasering som beskrivs ovan. Inga könsskillnader var tydligt i plasma extravasering värdena. Urin urinblåsor isolerades; enskilda värden ges för den beräkna torr/viktförhållandet av urinblåsan, urinblåsan våt vikt hälften i formamid, den beräknade torr vikt i urinblåsan hälften i formamid (i g), den korrigerade OD620 nm (prov OD620 nm minus den meanOD620 nmof torrvikt av blanks (ren formamid) och beräknade plasma extravasering värdet i OD620 nm/g (den korrigerade OD620 nm, dividerat med de beräknade torr vikten). De resulterande plasma extravasering värdena användes för att konstruera figur 2.
| Genotyp och doxycyklin chow, utan (-) eller med (+) | Sex | torr/viktförhållande av tolvfingertarmen | våt vikt av tolvfingertarmen halv (g; i 85 μL formamid) | Beräknad torrvikt av tolvfingertarmen halv (g) | OD 620 nm - tomt | OD620 nm/g torrvikt (tolvfingertarmen) |
| WT- | M | 4.927 | 0.0307 | 0.0062 | 0.0640 | 10.272 |
| WT- | F | 4.912 | 0.0172 | 0.0035 | 0.0460 | 13.138 |
| WT- | M | 5.333 | 0.0281 | 0,0053 | 0.0960 | 18.221 |
| WT- | F | 5.433 | 0,0375 | 0.0069 | 0.1010 | 14.634 |
| WT- | M | 5.179 | 0.0287 | 0.0055 | 0.0430 | 7.759 |
| Menar +/-SEM (av posterna i kolumnen ovan) | 5.157 +/-0.105 | 0.0284 +/-0.0033 | 0.0055 +/-0,0006 | 0.0700 +/-0,0122 | 12.805 +/-1.798 | |
| WT + | M | 5.342 | 0.0542 | 0.0101 | 0.1520 | 14.981 |
| WT + | M | 5.653 | 0.0477 | 0.0084 | 0.1120 | 13.272 |
| WT + | M | 5.700 | 0.0564 | 0.0099 | 0.1110 | 11.218 |
| WT + | F | 5.542 | 0.0498 | 0.0090 | 0.1430 | 15.914 |
| WT + | F | 5.723 | 0.0266 | 0.0046 | 0.0470 | 10.112 |
| WT + | F | 5.186 | 0.0262 | 0.0051 | 0.0470 | 9.304 |
| WT + | M | 5.543 | 0.0342 | 0.0062 | 0.0480 | 7.779 |
| Menar +/-SEM (av posterna i kolumnen ovan) | 5.527 +/-0,075 | 0.0422 +/-0,0049 | 0.0076 +/-0.0009 | 0.0943 +/-0,0175 | 11.797 +/-1,142 | |
| KO- | F | 5.763 | 0,0209 | 0,0036 | 0.0690 | 19.025 |
| KO- | M | 4.232 | 0.0164 | 0.0039 | 0.1010 | 26.061 |
| KO- | M | 4.810 | 0.0227 | 0.0047 | 0.0880 | 18.647 |
| KO- | F | 5.650 | 0.0363 | 0.0064 | 0.0600 | 9.339 |
| KO- | M | 5.212 | 0.0178 | 0.0034 | 0.0640 | 18.739 |
| Menar +/-SEM (av posterna i kolumnen ovan) | 5.133 +/-0.282 | 0.0228 +/-0.0035 | 0.0044 +/-0,0005 | 0.0764 +/-0,0078 | 18.362 +/-2.659 | |
| KO + | M | 5.128 | 0,0193 | 0.0038 | 0.0600 | 15.941 |
| KO + | M | 5.030 | 0.0459 | 0.0091 | 0.1980 | 21.697 |
| Menar +/-(rad poster i kolumnen ovan) | 5.079 +/-0,049 | 0,0326 +/-0,0133 | 0.0065 +/-0,0027 | 0.1290 +/-0.0690 | 18.819 +/-2.878 | |
| DT- | M | 5.426 | 0.0322 | 0.0059 | 0.0775 | 13.058 |
| DT- | M | 4.255 | 0.0360 | 0.0085 | 0,0895 | 10.579 |
| DT- | M | 4.818 | 0.0306 | 0.0064 | 0.1460 | 22.989 |
| DT- | M | 5.189 | 0.0197 | 0.0038 | 0.0380 | 10.010 |
| DT- | F | 5.500 | 0.0256 | 0.0047 | 0.0390 | 8.379 |
| Menar +/-SEM (av posterna i kolumnen ovan) | 5.038 +/-0.229 | 0.0288 +/-0,0028 | 0.0059 +/-0,0008 | 0.0780 +/-0.0198 | 13.003 +/-2.3607 | |
| DT + | M | 5.008 | 0.0694 | 0.0139 | 0.0270 | 1.948 |
| DT + | M | 4.750 | 0.0660 | 0.0139 | 0.0070 | 0.504 |
| DT + | M | 5.495 | 0.0587 | 0.0107 | 0.0692 | 6.478 |
| DT + | M | 5.233 | 0.0542 | 0.0104 | 0.0620 | 5.986 |
| Menar +/-SEM (av posterna i kolumnen ovan) | 5.121 +/-0.159 | 0.0621 +/-0.0034 | 0,0122 +/-0.0010 | 0.0413 +/-0.0147 | 3.729 +/-1,478 |
Tabell 2: substans P-inducerad plasma extravasering från duodenums av enskilda WT, NEP KO och NEP overexpressor möss. Värdena i plasma extravasering från FVBN möss (med eller utan föregående doxycyklin) var individuellt uttryckt som OD620 nm/g torrvikt, från FVBN WT möss (n = 5 utan, och n = 7 med, doxycyklin), NEP KO möss (n = 5 utan, och n = 2 med, doxycyklin), och NEP overexpressor dubbelt transgena möss (n = 5 utan, och n = 4 med, doxycyklin). Möss utsattes för protokollet för plasma extravasering enligt beskrivningen ovan. Inga könsskillnader var tydligt i plasma extravasering värdena. Duodenums isolerades; enskilda värden används vid beräkning av plasma extravasering var enligt tabell 1. De resulterande plasma extravasering värdena användes för att konstruera figur 3A-C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som diskuterats ovan, studiet av plasma extravasering kan i slutändan leda till ny kunskap om orsakerna till eller nya sätt att hämma eller behandla plasma extravasering. Lyckad användning av plasma extravasering protokollet (ovan), har med Evans blått färgämne, påvisats i det nuvarande manuskriptet. Även om data visas tillbaka hypotesen att NEP kan skydda vaskulatur mot plasma extravasering, detta är ett sekundärt mål för närvarande, med det primära målet är att presentera en optimerad protokollet som lätt kan användas i genomsnitt laboratorium för den framtida studie av plasma extravasering. Protokollet rapporteras häri är inriktad på anpassningsförmåga till framtida studier med olika mål, djur, organ och andra villkor, och är särskilt användbart eftersom detta protokoll är enkel att använda, pålitlig, ekonomisk och tar hänsyn till allmänna tillgänglighet av vanliga material, reagens och kompetent personal. Det är dock att detta protokoll kommer att kräva en hel del upprepningar per grupp djur (8-12 repetitioner föreslog) att få statistiskt giltiga resultat.
Det har varit många studier och rapporter som beskriver försök att mäta vaskulär permeabilitet och plasma extravasering. Särklass, de flesta av dessa rapporter detalj permutationer av metoder som används tillsammans med Evans blått färgämne metoden för att undersöka plasma extravasering och vaskulär permeabilitet2,3,6,11, 12,13. Har färre rapporter av vaskulär permeabilitet metoder som inte inkorporerar Evans blå alla3,13,15,24; dessa andra metoder är i allmänhet mindre tillgängliga för genomsnittliga laboratoriet, som kräver komplicerade metoder, specialiserad utrustning och personal, och är oftast dyrare.
Utvecklingen av protokollet Evans blå ovan involverade test av många olika varianter och ändringar. Tidiga experiment var fokuserade på försök att injicera Evans blå genom mus svans. Dock svans ven injektioner visat sig vara tekniskt utmanande och resulterade i inkonsekventa resultat, vilket kräver ett införande av halsvenen injektionerna och terminal kirurgiska tekniker som beskrivs ovan. Många preliminära experiment var också klar försöker hitta lämpliga koncentrationer av Evans blue och substans P. Den exakta mängden Evans blue befanns inte vara tvingande, så länge det var under ca 200 mg/kg (jämfört med 50 mg/kg används för närvarande), men mängden substans P används i dessa experiment var viktigt. Efter mycket experimenterande, 1 nmole/kg befanns vara idealisk koncentrationen av exogent extra substans P, resulterande i en 1,5 förstärkning av (och därmed mer enkelt mätbara) plasma extravasering värden. Dessutom konstaterades det att tillräcklig tid får för Evans blå temperera (> 10 min). Perfusion av blodkärlen att ta bort överflödig Evans blå, efter offer av musen men före orgel isolering, befanns vara en viktig komponent i detta protokoll, i motsats till andra protokoll som inte inkluderar detta perfusion steg4. Den perfusatet (levereras med en mild gravitation gradient) är 50 mL av en lösning med pH 3,5 (som uppmuntrar bindningen av Evans blue och albumin); paraformaldehyd, utbredd i många andra Evans blå protokoll6,10,25, utelämnas i detta protokoll. En annan faktor som har lösts i detta protokoll är att färgämnet används i doxycyklin chow stör OD620 nm mätning av Evans blue i vävnader från mag-tarmkanalen spåret. Således, var det nödvändigt att använda ofärgade doxycyklin chow i ovanstående experiment. En viktig och användbar slutsats är också att nästan alla organ av musen på ett tillfredsställande sätt isoleras och undersökte via detta protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Andy Poczobutt och Dr Jori Leszczynski för deras värdefulla hjälp och ändringar till detta manuskript. Stöds av bidrag från nationella hjärta, lunga och Blood Institute (NHLBI RO1 HL078929, PPG HL014985 och RO3 HL095439) och den institutionen av Veterans' Affairs (Merit Review).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| isoflurane | Vet One | 200-070 | inhaled anesthetic |
| ketamine | Vet One | 200-055 | injectable anesthetic |
| xylazine | Lloyd Laboratories | 139-236 | injectable anesthetic |
| syringes (10,3 & 1 cc) | Becton Dickinson | 309604, 309657, 309659 | |
| needles (20G1,23G1 & 26G1/2) | Becton Dickinson | 305178, 305193, 305111 | |
| isoflurane induction chamber | VetEquip | 941443 | 1 Liter |
| nosecone breathing circuits | VetEquip | RC2 | Rodent Circuit Controller 2 |
| oxygen tank | Airgas | UN 1072 | 100% medical |
| heating pad | CWE Inc. | TC-1000 | temperature controller |
| rectal temperature probe | CWE Inc. | 10-09012 | mouse |
| balance (for rodents) | Ohaus | CS 2000 | |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 15000-00 | Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11151-10 | Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13009-12 | Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools -suture drivers | Fine Science tools | 12502-12 | Olsen-Hegar suture drivers (suturing) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11627-12 | Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14110-15 | Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 18025-10 | suture tying forceps (used for Millar cath) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14078-10 | Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14082-09 | Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11051-10 | 10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11251-35 | Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels) |
| surgical tools-retractors | Fine Science tools | 17012-11 | Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11294-00 | Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11297-00 | Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14058-11 | tough cut iris scissors (mouse dissection, bones) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11009-13 | serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13003-10 | Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11006-12 | Adson serrated forceps (tissue grasping) |
| clippers | Oster | A5 | |
| tape | Fisherbrand | 159015G | |
| artificial tear ointment | Akorn Inc | 13985-600-03 | |
| lidocaine | Hospira | 0409-4277-01 | 2% injectable |
| polyvinyl catheters | Tygon | PV-1 | |
| Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Substance P | Bachem | H-1890 | |
| heparin | Sagent Pharmaceuticals | 25201-400-10 | 1000 U/ml |
| saline solution | Hospira | 0409-7138-09 | 0.9% sodium chloride |
| phenobarbital | Vortech | 0298-9373-68 | |
| sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417-50TAB | |
| Kimwipes for blotting | Fisher Scientific | 06-666A | |
| formamide | Sigma Aldrich | 47670 | |
| microbalance | Denver Instrument | APX-60 | |
| microfuge tubes | Fisher Scientific | 07-200-534 | |
| polystyrene 96 well plate | Becton Dickenson | 351172 | |
| absorbance plate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| polyacrylamide gels | Bio-Rad | 3450014 | |
| protein molecular weight standard | Bio-Rad | 1610374 | |
| Protran supported nitrocellulose | Amersham (GE) | 10600015 | |
| gel box | Bio-Rad | 1658005 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P-1379 | |
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| primary NEP polyclonal antibody | R & D Systems | AF1182 | |
| doxycycline chow | Teklad (HARLAN) | TD.130750 | |
| FVB/NJ wild type mice | Jackson | 001800 | |
| secondary antibody (goat anti-rabbit) | ZyMed | 81-6120 | |
| ECL solution-Western Lightening Plus | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| film | Pierce | 34091 |
References
- Snijdelaar, D. G., Dirksen, R., Slappendel, R., Crul, B. J.
- Rubinstein, I., Iwamoto, I., Ueki, I. F., Borson, D. B., Nadel, J. A. Recombinant neutral endopeptidase attenuates substance P-induced plasma extravasation in the guinea pig skin. Int Arch Allergy Appl Immunol. 91 (3), 232-238 (1990).
- Szabo, A., Menger, M. D., Boros, M. Microvascular and epithelial permeability measurements in laboratory animals. Microsurgery. 26 (1), 50-53 (2006).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. J Vis Exp. (73), e50062 (2013).
- Moitra, J., Sammani, S., Garcia, J. G. Re-evaluation of Evans Blue dye as a marker of albumin clearance in murine models of acute lung injury. Transl Res. 150 (4), 253-265 (2007).
- Figini, M., et al. Substance P and bradykinin stimulate plasma extravasation in the mouse gastrointestinal tract and pancreas. Am J Physiol. 272 (4), Pt 1 785-793 (1997).
- Awad, A. S., et al. Selective sphingosine 1-phosphate 1 receptor activation reduces ischemia-reperfusion injury in mouse kidney. Am J Physiol Renal Physiol. 290 (6), 1516-1524 (2006).
- Lu, B., et al. The control of microvascular permeability and blood pressure by neutral endopeptidase. Nat Med. 3 (8), 904-907 (1997).
- Gendron, G., Simard, B., Gobeil, F., Sirois, P., D'Orleans-Juste, P., Regoli, D. Human urotensin-II enhances plasma extravasation in specific vascular districts in Wistar rats. Can J Physiol Pharmacol. 82 (1), 16-21 (2004).
- Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
- Saria, A., Lundberg, J. M. Evans blue fluorescence: quantitative and morphological evaluation of vascular permeability in animal tissues. J Neurosci Methods. 8 (1), 41-49 (1983).
- Fricke, I. B., et al. In vivo bioluminescence imaging of neurogenesis - the role of the blood brain barrier in an experimental model of Parkinson's disease. Eur J Neurosci. 45 (7), 975-986 (2017).
- Pink, D. B., Schulte, W., Parseghian, M. H., Zijlstra, A., Lewis, J. D. Real-time visualization and quantitation of vascular permeability in vivo: implications for drug delivery. PLoS One. 7 (3), 33760 (2012).
- Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat Rev Cancer. 2 (4), 266-276 (2002).
- Vandoorne, K., Addadi, Y., Neeman, M. Visualizing vascular permeability and lymphatic drainage using labeled serum albumin. Angiogenesis. 13 (2), 75-85 (2010).
- Turner, A. J., Nalivaeva, N. N. Proteinase dysbalance in pathology: the neprilysin (NEP) and angiotensin-converting enzyme (ACE) families. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 52 (4), 40-48 (2006).
- Lu, B., Gerard, N. P., Kolakowski, L. F., Finco, O., Carroll, M. C., Gerard, C. Neutral endopeptidase modulates septic shock. Ann N Y Acad Sci. 780, Mar 22 156-163 (1996).
- Dempsey, E. C., et al. Neprilysin null mice develop exaggerated pulmonary vascular remodeling in response to chronic hypoxia. Am J Pathol. 174 (3), 782-796 (2009).
- Karoor, V., Oka, M., Walchak, S. J., Hersh, L. B., Miller, Y. E., Dempsey, E. C. Neprilysin regulates pulmonary artery smooth muscle cell phenotype through a platelet-derived growth factor receptor-dependent mechanism. Hypertension. 61 (4), 921-930 (2013).
- Chu, P., Arber, D. A. Paraffin-section detection of CD10 in 505 nonhematopoietic neoplasms. Frequent expression in renal cell carcinoma and endometrial stromal sarcoma. Am J Clin Pathol. 113 (3), 374-382 (2000).
- Bircan, S., Candir, O., Kapucuoglu, N., Serel, T. A., Ciris, M., Karahan, N. CD10 expression in urothelial bladder carcinomas: a pilot study. Urol Int. 77 (2), 107-113 (2006).
- Koiso, K., Akaza, H., Ohtani, M., Miyanaga, N., Aoyagi, K. A new tumor marker for bladder cancer. Int J Urol. 1 (1), 33-36 (1994).
- Wick, M. J., et al. Protection against vascular leak in neprilysin transgenic mice with complex overexpression pattern. Transgenic Res. 25 (6), 773-784 (2016).
- Natah, S. S., Srinivasan, S., Pittman, Q., Zhao, Z., Dunn, J. F. Effects of acute hypoxia and hyperthermia on the permeability of the blood-brain barrier in adult rats. J Appl Physiol. 107 (4), (1985) 1348-1356 (2009).
- Scholzen, T. E., et al. Neutral endopeptidase terminates substance P-induced inflammation in allergic contact dermatitis. J Immunol. 166 (2), 1285-1291 (2001).
