Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

En iyi duruma getirilmiş bir Evans mavi Mouse vasküler sızıntı değerlendirmek için iletişim kuralı

Published: September 12, 2018 doi: 10.3791/57037
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3
1Cardiovascular Pulmonary Research Laboratory, University of Colorado Denver, 2Division of Pulmonary Sciences and Critical Care Medicine, University of Colorado Denver, 3Denver VA Medical Center

Summary

Bu makalede, ekonomik, en iyi duruma getirilmiş ve basit bir protokol bu Evans mavi boya yöntemi diğer suşları, türler ve diğer organ veya doku kullanmak için adapte edilebilir FVBN farelerin organlarda plazma ekstravazasyonu değerlendirmek için kullandığı açıklanmıştır.

Abstract

Vasküler sızıntı veya plazma ekstravazasyonu, bir nedeni vardır ve ciddi sonucu veya bir enflamatuar yanıt belirtisi olabilir. Bu çalışmada sonuçta nedenleri ile ilgili yeni bilgi ya da inhibe veya plazma ekstravazasyonu tedavi etmek için yeni yollar açabilir. Araştırmacılar plazma ekstravazasyonu çalışmak için en iyi yöntemler kullanılabilir, dahil olmak üzere uygun araçlara sahip önemlidir. Bu makalede, biz FVBN farelerin organlarda plazma ekstravazasyonu değerlendirmek için Evans mavi boya yöntemini kullanarak bir protokol tanımlamak. Bu iletişim kuralı kasten basittir, için iyi bir derece, mümkün olduğunca ama sağlar yüksek kalitede veri. Evans mavi boya öncelikle çünkü kullanmak ortalama laboratuvar için kolay seçildi. Enzim neprilysin plazma ekstravazasyonu karşı damarlara korusun hipotez için kanıt ve destek sağlamak için bu protokolü kullanmış. Ancak, bu iletişim kuralını deneysel olarak kullanılan olabilir ve kolayca anlama, önlenmesi ve tedavisinde önemli diğer faktörler içerebilir çalışmaları için diğer suşların fareler veya diğer türler, birçok farklı organ veya doku, kullanılacak adapte plazma ekstravazasyonu. Bu iletişim kuralı kapsamlı bir şekilde optimize edilmiş ve kullanımı, ekonomi ve genel availability-in malzeme ve ekipman, bu iletişim kuralını kullanmak ortalama laboratuvar için üstün yapım kolaylığı varolan iletişim kuralları ve birleştiren güvenilirlik modifiye, plazma ekstravazasyonu düşük organlarını miktarının.

Introduction

Organlarda vasküler sızıntı ekstravazasyonu için başvurur veya kan plazma arasındaki endotel üretilen geçitlerden kaçağı sonrası kapiller venüller organlarda. Bu plazma ekstravazasyonu veya bazı tip bir enflamatuar yanıt ortaya çıkabilecek, artmış vasküler geçirgenliği ciddi sonuçlara yol açabilir. Bu nedenle, bu fenomen, nedenleri, modülatörler ve sonuçları, okudu ve anlaşılır, aynı şekilde, müfettişler kadrini ve araçları protokol önemli ve onları çalışma kullanılacak. Endotel boşluklar uyaran bir dizi üretilen ama genellikle peptid nörotransmitter ve/veya tachykinins endothelia üzerinde eylem tarafından üretilmektedir. Artmış plazma ekstravazasyonu oluşur, bu sürecin önemli doğal olarak meydana gelen arabulucular biridir undecapeptide tachykinin peptit, madde P1.

Evans mavi boya albümin-bağlama özelliği kullanmak, araştırmak ve vasküler geçirgenliği veya plazma ekstravazasyonu, ölçmek için yöntemler geliştirilmiştir ve genellikle onların doğruluğu, basitlik, ekonomi, güvenlik ve izin yeteneği için bilinen Hemen, plazma ekstravazasyonu birkaç doku üzerinden belirlenmesi Eğer öyleyse istenen2,3,4,5,6,7,8,9 . Plazma ekstravazasyonu organlarda FVBN farelerin değerlendirmek için bu Evans mavi iletişim kuralı tüm bunlar kullanır, ancak genellikle yararlı ve gelecekteki araştırmalar yapar veya olacak ortalama laboratuvar içeren, uyarlanabilir olsun bazı önemli değişiklikler ekler plazma ekstravazasyonu veya vasküler geçirgenliği ile ilişkili faktörler önemli çalışmalar yapmak. Bu protokol için madde P 1 nmol/kg, hangi 1.5-fold tarafından plazma ekstravazasyonu zenginleştirerek fareler için verilir. Bu daha kolay gözlemlenebilir ve elde edilebilecek sonuçlarında ortaya çıkan protokolü, hassasiyeti artırır. Geçirgenliği gibi çeşitli diğer peptidler, kimyasal madde veya toksik yaralanma, bazı türlerinin etkileyen diğer faktörler kullanılan ya da istediğiniz gibi diğer laboratuvarlar tarafından okudu. Juguler ven enjeksiyonları terminal ameliyat gerektiren Evans mavi ve madde P sistemik, tanıtmak için bu protokol için kullanılır. Ancak, juguler ven enjeksiyonları5,7,10, hatta gerekli terminal cerrahi teknikleri, dikkate sonra daha kolay usta ve diğerinden daha tutarlı sonuçlar üretim yol venöz enjeksiyonu, kuyruk dahil olmak üzere enjeksiyonları4,9damar. Retro-orbital venöz sinüs enjeksiyonları tarafından teslim edilmek üzere mavi Evans için mümkün olabilir, ancak hiçbir başvuru literatürde teslimat Evans mavi bu yöntemi kullanan tespit edilmiştir. Ancak, kuyruk ven enjeksiyon gelince, yüksek seviyede uzmanlık ve büyük ölçüde bu tekniği tekrarlanarak master için pratik kullanımı başarılı Evans mavi enjeksiyonlar için sınırlar. Buna ek olarak, alternatif juguler ven enjeksiyon yöntemi bizim iletişim kuralında, açıklandığı gibi teknik olarak elde edilebilecek bir çözüm sunar. Bir çok önemli fare damar, perfüzyon için müdahalede sonra sadece mavi periosteum Evans fare kurban aşırı Evans mavi boya kaldırır ve bu protokol için standart. Perfüzyon, önceden açıklanan yöntemleri dikkatle inceledi ve mevcut prosedür elde etmek için değiştirilebilir. Burada açıklanan diğer değişiklikler tüm en iyi duruma getirilmiş, basit ve ucuz.

Evans mavi boya yönteminin önemli bazı sınırlamalar vardır. Örneğin, bazen bu yöntemle ilişkili düşük duyarlılık Evans mavi enjekte hayvanlardan dokuların bazı ek brüt patolojik ve histolojik muayene engelleyebilir. Ancak, bu ve diğer sınırlamalar alternatif yöntemler ve yine de, hala Evans mavi kullanan modelleri gelişmesine yol açmıştır. Evans mavi ölçümü Floresan (yerine göre görsel menzilli) spektroskopisi yönteminin duyarlılığını artabilir. Ayrıca, floresans mikroskobu Evans mavi lekeli dokuların daha farklı yerlerde11vasküler sızıntı gözlenmesi için izin vermek için geliştirilmiştir. Ayrıca, tüm vücut görüntüleme ve yaşayan bir hayvan tarama daha önce mavi12 Evans mavi konsantrasyonları incelenmesi için sürekli bir şekilde sağlar Evans ile enjekte yerine bir belirli zaman seçilmiş deneme üzerine gelin. Ancak, bu yöntem uygun görüntüleme özellikleri gerektirir ve çok pahalı olabilir. Değişiklikler, Evans mavi ve gerçekleştirilen bir vitro tür modeli içeren gibi bir hücreye kültür ya da piliç chorioallantoic modeli13 (CAM) Ayrıca tarif edilmiştir. Bu modeller floresans ve intravital14 mikroskobu, tarafından izlenir ve vasküler permeabilite değişiklikleri miktar, zaman içinde izin ama doğru modelleme ile ilgili sorular vivo durumlardan artırabilir ve de kullanabilirsiniz pahalı.

Evans mavi yönetim içermeyen diğer yöntemleri belirlemek ve vasküler sızıntı veya geçirgenliği, ölçmek için geliştirilmiş oldu. Bu Yöntemler (örneğin, albümin veya fluoresein) uygun bir floresan molekül veya canlı hayvanlar için bir isotopically etiketli veya başka bir şekilde etiketlenmiş molekül istihdam (veya modelleri13non-invaziv tarafından takip, kültür veya chorioallantoic (CAM) hücre için görüntüleme (PET tarama, MRI, intravital mikroskobu, tüm vücut tarama) veya invaziv görüntüleme (Floresan Mikroskobu)3,12,15. Her ne kadar bu teknikler mavi yöntemleri bir dizi diğer Evans avantajlar sunabilir, aynı zamanda onların önemli karmaşıklığı, gerekli uzmanlık, kaynak ve yüksek parasal maliyeti içerebilir dezavantajları var.

Neprilysin16 (peptidaz enzim NEP, olarak da bilinen CD10, MME veya Enkephalinase) plazma ekstravazasyonu, en azından bölümünde, enzimatik metabolizma ve endojen madde p. inactivation inhibe içinde dahil olmak için önerilen Böylece, hücre yüzey peptidaz NEP oluşmasına neden olan dokularda olabilir bir zayıflama etkisinin bir madde P, muhtemelen NEP. peptidaz etkinliği tarafından

Başlangıçta, madde P kaynaklı plazma ekstravazasyonu bu değiştirilmiş Evans mavi iletişim kuralı, FVBN vahşi türü (WT) ve NEP nakavt (KO) fare ile kullanmak için test ettik. Madde P artar plazma ekstravazasyonu NEP katılımı bu ilk çalışmalardan şüphelenildi ve bunlar tarif ve daha fazla plazma ekstravazasyonu içeren NEP'ın rolü deneyler. Ancak, bu yazının odak NEP veya plazma ekstravazasyonu rolü değil, ama oldukça plazma ekstravazasyonu kendilerini deneyler. Değiştirilmiş bu iletişim kuralı kullanımı ile elde edilen sonuçlar tür temsilcisi NEP sonuçlarıdır. Evans mavi yöntem plazma ekstravazasyonu ölçmek için en iyi duruma getirilmiş ve FVBN fareler için ayrıntılı olarak açıklandığı gibi değiştirilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm ilgili uluslararası, ulusal ve/veya kurumsal yönergeleri bakım ve hayvanlar (fare) kullanımı için bu el yazması açıklanan deneylerde takip edildi.

Bu yöntem FVBN yetişkin fareler, 16-20 hafta, bu çalışmanın amaçları için en uygun olduğu tespit yaşlı kullanır. 2 gün 6 ile 7 (Şekil 1) içerir ve adım 1-5 gün 1 içerir.

1. ekipman hazırlık

  1. Ketamin/xylazine anestezik olarak (önerilen) kullanılıyorsa, steril, tek kullanımlık şırınga ve iğne, yeterli kaynağımız tutun. İsoflurane anestezik kullanılırsa, oksijen tüpü ve isoflurane başlamadan önce deney için yeterli malzeme olduğundan emin olmak için sıvı seviyesi kontrol edin. De, devreler nefes nosecone montajı ve indüksiyon kutusuna ekleyebilirsiniz; Yeni kömür kutu nefes devreler ekleyin. İndüksiyon kutusu üzerinde oksijen dönüm ve ikinci aşamada yaklaşık 50 psi okur ascertaining hazırlayın.
  2. 37 ° c ısıtma yastığını açmak
  3. Rektal sıcaklık probu ameliyat için hazırlayın.

2. fare hazırlık

Bu adım, anestezi, epilasyon ve konumlandırma (yetişkin FVBN fareler-yaş 16-20 hafta) içerir.

  1. Fareler tartmak ve ağırlıkları kaydedin.
  2. Fareler anestezi.
    1. Ketamin ve xylazine IP yönetmek (80-100 mg/kg ve 7,5-16 mg/kg, sırasıyla). Ancak, ketamin ve xylazine daha düşük doz ile başlamak tavsiye edilir (30 mg/kg ve 6 mg/kg, sırasıyla).
    2. Anestezi ile yaklaşık 0.1 korumak - ketamin/xylazine ameliyat boyunca doz 0.25 kez ilk. Ketamin ve xylazine daha fazla tekrarlanabilirlik ve Beka gözlendi olarak anestezik temsilcisi belirli bu çalışmada tercih edildi. Anestezik temsilcisi seçim diğer çalışmalarda farklı olduğu tespit.  İsoflurane kullandıysanız, fare bir indüksiyon odasında koymak ve isoflurane %5 için fareyi tam bilincini kaybeder kadar açmak. Daha sonra 1,5-%2,5 isoflurane yordamı kalanı boyunca ayarlamak bir burun nosecone kullanın.
  3. Fareler her 2-3 dk uygun anestezi derinliği için kontrol etmek için ayak çimdik tarafından izlemek.
  4. Fare ventral boyun bölgesi tıraş.
  5. Önceden ısıtılmış panelindeki sırtüstü pozisyonda fareyi getirin. Pençeleri ve ayak bandı ile cerrahi yüzeye fare güvenli.
  6. Suni gözyaşı merhem ameliyat sırasında kurumasını önlemek için gözlerinin üzerine yerleştirin.

3. cerrahi ayrıntıları

  1. 1 cm kesi şu ventral boynundan juguler ven içinde olun.
  2. Lidocaine (% 1-2) bir veya iki damla ağrı yönetimi için ve vazodilatasyon tanıtmak için kesi bölgeye uygulanır. Lidokain etkili olması için 2 dk. bekleyin.
  3. Ortaya çıkarmak ve künt diseksiyon ile Şu iç juguler ven yalıtır. Ven 4-0 sütür ile bağlayın ve yavaşça bir hemostat ile gemi rostral sonu geri çek. Bir delik, ince makas, yaklaşık 3 mm aşağıda veya kaudal bağlamak için damar çapı yaklaşık olarak yarısına kullanarak.
  4. Bir PV-1 Polivinil kateter sonundan itibaren 1.5 cm işaretlemek ve juguler ven bir gemi dilatör kullanarak delikten takın ve kateter gemi, yaklaşık olarak 1.5 cm kaudal sonuna doğru iplik.
  5. Kaudal bölümü (aşağıda kesim), geminin içinde güvenli bir şekilde kateter ile 4-0 ipek. Kateter dışarıya adım 3.3 rostral juguler ven bağlamaya kullanılan dikiş gevşek uçları ile gemi rostral parçası bağla.
  6. Tack cilt gevşek geri birlikte vücut ısı kaybı ve kurutulma dokuların önlemeye yardımcı olmak için 4-0 ipek sondayla çevresinde.
  7. Kateter heparinized serum fizyolojik (10 U/mL) içeren bir şırınga bağlanmak ve kateter floş.

4. enjeksiyonları

  1. Evans mavi çözüm (% 0,9 normal, unheparinized serum fizyolojik veya yaklaşık 50 mg/kg 30 mg/mL solüsyon 50 μL) çizgi temizlemek için heparinized serum küçük bir birim tarafından takip juguler ven kateteri içine enjekte.
  2. 2 dk sonra madde satırı temizlemek için heparinized serum küçük bir birim tarafından takip P (0.3 mikron çözüm % 0,9 normal, unheparinized serum fizyolojik veya 1 nmol/kg 100 μL), enjekte et. Madde P endotel katmanı üzerinden proteinler plazma ekstravazasyonu zenginleştirerek; Bu protokol için rutin olarak plazma ekstravazasyonu değerleri ölçmek daha kolay hale bir büyütme plazma ekstravazasyonu değerleri arasında yaklaşık 1.5-fold neden olmaktadır.
  3. Madde P enjekte sonra 18 dk bekleyin. Bu süre boyunca, Evans mavi boya equilibrate ve dolaşımda.
  4. Deney 18 dk madde P (20 dk sonra Evans mavi enjeksiyon) enjeksiyon sonra fare ile servikal çıkığı feda ederek sona erdirmek. Fareyi doğrudan cervically olabilir muhtemelen çıkık, anestezi, aşırı dozda vermeden faredir muhtemelen hala iyi imzalat ameliyattan. Eğer gerekirse, ancak, aşırı doz anestezikler ketamin/xylazine, isoflurane veya Fentobarbital, servikal çıkığı tarafından takip verilebilir.

5. yalıtım organları

  1. Göğüs boşluğu fare derini yüzüp, kalp ve kan damarlarının 50 mL 50 mM sodyum sitrat, pH 3.5 ile (bir yükseklikten 51 cm veya 20") yerçekimi sıvı. pH 3.5 muhtemelen Evans mavi bağlayıcı albumin için korur.
  2. 1-5 ilgili organları (mendil) (Örneğin idrar kesesi, böbrek, mide, karaciğer, pankreas, distal veya proksimal kolon, ileum, oniki parmak bağırsağı, gögüs deri, kulaklar, kuyruk, kalp, ve/veya akciğer) parçalanmış bir neşter ile tüketim ve eğer herhangi bir kalıntı içeriği kaldırmak mevcut.
  3. Oda sıcaklığında (RT) fosfat tamponlu tuz (PBS; Na2HPO4, KH2PO4, 8.0 g 0,24 g NaCl 1.44 g ve 1 L, pH 7.4 KCl 0.20 g) organları durulayın.
  4. Doku organlarla leke, her organ yarıya ve her yarı ağırlığında (ıslak ağırlıkları, g).
  5. Bir kuru bir kurutma fırın 48 h için folyo üzerinde 150 ° C'de dokusunda yarısı.
  6. Formamide bir microfuge içinde tutarlı hacmi (en fazla 200 µL) ikiye tüp 48 h için (ve en fazla 72 s) diğer doku yerleştirmek mavi Evans ayıklamak için.

6. ölçüm doku OD

  1. Evans mavi-infüzyon formamide (48-72 h RT kuluçka sonra) 50 µL microfuge tüp ve yer 96-şey polistiren tabakta bir kuyunun içine çıkarın. Doku parçaları ile birlikte formamide aktarmak için dikkatli olun.
  2. Yeni, saf formamide her iki boş Wells 96-şey plaka boşlukları için yer 50 µL.
  3. Ölçü ve kaydı 96-şey plaka üzerinde bir absorbans plaka okuyucu her şey OD620 . 620 nm olduğunu absorbans max Evans mavi.

7. plazma ekstravazasyonu hesaplanması

  1. Kuru doku tartmak yarısı 48 h fırında olmuştur.
  2. Bu aynı doku kuru ağırlığının tarafından yarı bölünmüş belirli organ dan bireysel her fare (içinde elde edilen adım 5,4), yarı başlayan bu doku ıslak ağırlık ile ilgi (içinde elde edilen adım 7.1) ıslak ağırlık/Kuru ağırlık oranını hesaplamak.
  3. Kuru ağırlık (g) dokusunun formamide ikiye yarısı daha önce yerleştirilir (5.4. adımda elde) formamide tarafından ıslak mendil ıslak ağırlığına bölünerek hesaplamak: Kuru ağırlık oranı (7,2 adımda hesaplanır) ilgi belirli organ için.
  4. OD620 düzeltilmiş değerleri hesaplar. İle OD620 başlangıç değeri (Evans formamide 6,3. adımda elde her dokusundan mavi-infüzyon içeren) 96-şey plaka deneysel her kuyudan çıkarmak boş iyi OD620 değeri (ortalama OD620 değeri saf formamide, 6.2, adımda hazırlanan içeren iki kuyu 6.3. adımda elde620 değerleri OD) deneysel her değerinden.
  5. Plazma ekstravazasyonu değer doku kuru ağırlığının tarafından düzeltilen OD620 (içinde hesaplanan adım 7,4) bölerek formamide (içinde hesaplanan adım 7.3) ikiye hesaplayın. Plazma ekstravazasyonu birim OD620/g kuru ağırlık olacaktır.
  6. Verileri çözümlemek ve SEM istatistiksel ortalama ± karşılaştırmak gibi gruplar t testi veya tek yönlü varyans analizi ve Scheffé'ın çoklu karşılaştırma testi (lycofs01.lycoming.edu), uygun olarak ifade eder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 1' de, bir şematik yordam, hangi FVBN farelerin organları en güvenilir ve tutarlı madde P kaynaklı plazma ekstravazasyonu değerleri neden tespit edilmiştir gösterilir. Bu yordam genellikle iş, bekleme süresi en az 48 saat tarafından ayrılmış iki gün sürer. Bu karşılaştırılmak üzere tüm deneylerin tutarlı bir şekilde yapılırsa daha, yaymak mümkündür. Organları üzerinde gün 1 izole sonra Örneğin, organları sıvı azot içinde donmuş ve-80 ° C'de depolanan flaş olabilir; dikkatle organları (1 hafta için bir kaç gün içinde) çözdürme üzerine, onlar PBS içinde yıkanmış ve protokol geri kalanı önce deyimiyle. Dokuların kurutma (150 ° C'de 48 h için), Evans doku mavi çıkarma belirtildiği gibi yapılmalıdır rağmen formamide zamanında tüm deneyler için tutarlı olduğu sürece de, formamide ikiye 48-72 h dan uzatılabilir.

Şekil 2 ve Tablo 1 ' de olduğunu veri gösteren FVBN vahşi türü (WT) ve NEP nakavt (KO) fareler17, idrar mesane üzerinden madde P kaynaklı plazma ekstravazasyonu gösterilen hangi öncelikle bu laboratuvarı nedeniyle kullanıma hazır hale getirildi uzun süredir ilgi NEP ve yönetmelik ve eylemleri seçilen nöropeptitler18,19. NEP KO fareler NEP herhangi bir doku ifade değil. Ancak, NEP WT fareler, mesane içinde düşük seviyelerde20,21,22de olsa ifade edilir. Şekil 2 ve Tablo 1 fareler iki bu gruplardan madde P kaynaklı plazma ekstravazasyonu idrar mesane üzerinden bir fark olduğunu gösteriyor. NEP ifade potansiyel olarak idrar mesane WT ve NEP KO farelerin ana fark olduğuna göre bu bir rol NEP için madde P kaynaklı plazma ekstravazasyonu gelen idrar kesesi içinde anlamına gelir.

Özgün veri olası bir rol içinde idrar kesesi (Şekil 2 ve Tablo 1) madde P kaynaklı plazma ekstravazasyonu NEP için önerdi çünkü daha tam olarak başka bir plazma ekstravazasyonu NEP katılımı araştırmak karar verdik organ. İlk olarak, neredeyse evrensel olarak iki kat transgenik bir fare overexpress NEP için oluşturulan23. Bu mühendislik fare izin veri karşılaştırma FVBN fareler üç tür: doğal olarak NEP sınırlı bir miktarda birçok dokularda; hızlı WT fareler16, Hangi herhangi bir doku yok NEP hızlı NEP KO fareler17, ve bizim iki kat transgenik NEP overexpressor fareler23, hangi overexpress NEP doksisiklin İdaresi üzerine neredeyse tüm dokularda. Fareler doksisiklin içeren ücretsiz erişim verilir chow 1 hafta önce ameliyat (Şekil 1); doksisiklin doz 1 mg/kg boyanmamış chow, var. NEP overexpress bu iki kat transgenik farelerde inşaatı, NEP deneyleri, kovboy ve NEP mRNA qPCR23ile ayrıntılı açıklama.

Fareler 3 Bu tür ile NEP için plazma ekstravazasyonu oniki parmak bağırsağı23 (Şekil 3 ve Tablo 2) de dahil olmak üzere dokularda bu iletişim kuralı bir rolü gösterir. 1 hafta 1 gün önce yemek için doksisiklin içeren bu deneylerde NEP overexpression iki kat transgenik NEP overexpressor farelerde besleyerek, açıldı (boyanmamış; 1 mg doksisiklin/mg chow, Şekil 3bir). Bir denetimi gibi bazı WT ve NEP KO fareler de gün 1 (Şekil 3b ve 3 c) önceki hafta içi boyanmamış doksisiklin chow beslenen edildi.

NEP rolde duodenum olarak plazma ekstravazasyonu FVBN farelerin NEP ifadede onikiparmak FVBN WT ve NEP (iki kat transgenik)-için onaylamak için doksisiklin chow beslenen overexpressor fareler olduğunu doğruladı tarafından karşı poliklonal antikor ile Batı Analizi (hangi fare ile NEP cross-reacts) insan NEP23. Bu analiz WT duodenums NEP protein makul miktarlarda hızlı ama NEP overexpressor duodenums 2-3 x NEP miktarda WT duodenums tarafından ifade ifade doğruladı. NEP KO fareler, tanım olarak, herhangi bir NEP duodenum içinde ifade değil.

Figure 1
Resim 1: Madde P kaynaklı plazma ekstravazasyonu ölçmek için iletişim kuralının genel şema. Şematik protokolünün (Yaş 16-20 hafta) FVBN farelerin organları üzerinden madde P kaynaklı plazma ekstravazasyonu ölçmek için. Bu iletişim kuralı tarafından Evans mavi boya yöntemi juguler ven içine enjeksiyon yoluyla doku plazma ekstravazasyonu ölçümü içerir ve exogenously yönetilen madde P artar ve kolayca ölçülen plazma ekstravazasyonu elde etmek için birleştirmek değerleri, OD620/g kuru ağırlık birimi. Açıklanan protokol FVBN fareler çeşitli organlarının tutarlı madde P kaynaklı plazma ekstravazasyonu değerleri neden tespit edilmiştir ve en az iki gün iş alır. Gün 1 ve 2 gün en az 48 saat kuru ve ayıklamak dokular için bekleyen zaman ayrılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : WT ve NEP KO fareler mesane üzerinden madde P kaynaklı plazma ekstravazasyonu. İdrar kesesi plazma ekstravazasyonu FVBN fareler (olmadan önceki doksisiklin) üzerinden madde P yönetim tarafından artar ve OD620 nm/g kuru ağırlık dile getirdi. İdrar mesane FVBN vahşi türünden izole (WT; beyaz çubuğu, n = 12) veya FVBN NEP nakavt (KO; siyah çubuğu, n = 7) fareler ve iletişim kuralı için için plazma ekstravazasyonu detaylı olarak yukarıdaki tabi. Tek tek değerleri Tablo 1' de verilmiştir. Barlar yukarıdaki satır ortalama (SEM) standart hatasını temsil eder. WT ve NEP KO değerleri bir önemli fark p doğru trended t testi ile 0.051 =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : WT, NEP KO ve NEP overexpressor farelerin duodenum üzerinden madde P kaynaklı plazma ekstravazasyonu. (A-C) Duodenal plazma ekstravazasyonu madde P yönetim tarafından artar ve OD620/g kuru ağırlık dile getirdi. (A)Duodenums FVBN WT fare olmadan önceki doksisiklin yalıtılmış (-; beyaz bar, n = 5), NEP KO fareler önceki doksisiklin olmadan (-; ışık gri bar, n = 5), NEP ovexpressor iki kat transgenik fareler önceki doksisiklin olmadan (DT-; koyu gri çubuğu, n = 5) veya NEP önceki Doksisiklin ile ovexpressor iki kat transgenik fareler (DT +; siyah bar, n = 4) ve iletişim kuralı için için plazma ekstravazasyonu detaylı olarak yukarıdaki tabi. Sem barlar yukarıdaki satır temsil NEP KO (-) değerleri WT (-) veya DT (-) değerleri, daha yüksek langıç rağmen bu fark istatistiksel olarak anlamlı değildi. Duodenal plazma ekstravazasyonu değerleri azalmış önemli ölçüde sadece doksisiklin beslenen, NEP ovexpressor iki kat transgenik fareler (DT +), tüm diğerlerine göre grupla (* p < 0,05, varyans analizi). (B, C) Duodenal plazma ekstravazasyonu değerleri WT ve NEP KO fareler değil önemli ölçüde etkilendi doksisiklin yönetim tarafından (p < 0,05). (B) WT fareler doksisiklin olmadan (WT-; beyaz çubuğu, n = 5) ve Doksisiklin ile WT fareler (WT +; orta gri bar, n = 7). (C) NEP KO fareler doksisiklin olmadan (KO-; ışık gri çubuğu, n = 5) ve NEP KO Doksisiklin ile (KO +; orta gri bar, n = 2). Tek tek değerleri gösterilen a, bileşik olarak B ve C, Tablo 2' de verilmiştir. Springer bilim + iş medya izniyle Springer günlüğü Makale23 küçük değişiklik ile çoğaltılamaz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Genotip seks idrar torbası Islak/Kuru ağırlık oranı idrar kesesi ağırlığını yarı ıslak (g; 85 μL formamide) mesane kuru ağırlığının yarısı hesaplanan (g) OD 620 nm - boş OD 620 nm/g kuru ağırlığı (idrar kesesi)
WT F 4.737 0.0038 0.0008 0.0150 18.750
WT M 4.632 0.0045 0.0010 0.0100 10.000
WT F 4.700 0.0048 0.0010 0.0280 28.000
WT F 4.625 0.0068 0.0015 0.0230 15.333
WT F 4.546 0.0077 0.0017 0.0400 23.529
WT M 4.800 0.0094 0.0020 0.0570 28.500
WT M 5.500 0,0095 0.0017 0.0240 14.118
WT F 4.316 0.0098 0.0023 0.0660 28.696
WT M 5.061 0.0121 0.0024 0.0400 16.667
WT M 5.061 0.0192 0.0038 0.0330 8.684
(Yukarıdaki sütundaki girdiler) SEM +/-demek 4.798 0.105 +/- 0.0088 + / 0.0014 0.0018 0,0003 +/- 0.0336 + / 0.0056 19.228 2.393 +/-
KO M 4.316 0.0196 0.0045 0.1610 35.778
KO M 4.600 0.0134 0.0029 0.1020 35.172
KO M 4.377 0.0104 0.0024 0.0410 17.083
KO M 4.727 0.0258 0.0055 0.1410 25.636
KO F 4.539 0.0025 0,0006 0.0250 41.667
KO M 4.457 0.0149 0.0033 0.1420 43.030
(Yukarıdaki sütundaki girdiler) SEM +/-demek 4.503 0.062 +/- 0.0144 + / 0.0032 0.0032 0,0007 +/- 0.1020 + / 0.0233 33.061 4,065 +/-

Tablo 1: bireysel WT ve NEP KO fareler mesane üzerinden madde P kaynaklı plazma ekstravazasyonu. FVBN fareler (olmadan önceki doksisiklin) plazma ekstravazasyonu değerleri tek tek OD620 nm/g kuru ağırlığı, FVBN WT üzerinden ifade (n = 12) veya NEP KO (n = 7) fareler ve iletişim kuralı için için plazma ekstravazasyonu detaylı olarak yukarıdaki tabi. Hiçbir cinsiyet farklılıkları plazma ekstravazasyonu değerlerde belirgin idi. İdrar mesane izole edildi; tek tek değerleri mesane, idrar kesesi, ıslak ağırlığına oranı hesaplanan Islak/Kuru ağırlık için formamide ikiye verilir, idrar kesesi ağırlığını formamide (verilen g), düzeltilmiş OD620 nm (örnek OD620 nm ikiye hesaplanan Kuru meanOD620 nmof boşluklar (saf formamide) ve hesaplanan plazma ekstravazasyonu değeri OD620 nm/g Ağırlık (hesaplanan Kuru ağırlık tarafından bölünmüş düzeltilmiş OD620 nm,) kuru. Sonuç plazma ekstravazasyonu değerleri Şekil 2oluşturmak için kullanılmıştır.

Genotip ve doksisiklin chow, olmadan (-) veya (+) ile seks oniki parmak bağırsağı Islak/Kuru ağırlık oranı oniki parmak bağırsağı ağırlığını yarı ıslak (g; 85 μL formamide) oniki parmak bağırsağı kuru ağırlığının yarısı hesaplanan (g) OD 620 nm - boş OD620 nm/g kuru ağırlığı (oniki parmak bağırsağı)
WT- M 4.927 0.0307 0.0062 0.0640 10.272
WT- F 4.912 0.0172 0.0035 0.0460 13.138
WT- M 5.333 0.0281 0.0053 0.0960 18.221
WT- F 5.433 0.0375 0.0069 0.1010 14.634
WT- M 5.179 0.0287 0.0055 0.0430 7.759
(Yukarıdaki sütundaki girdiler) SEM +/-demek 5.157 0.105 +/- 0.0284 + / 0.0033 0.0055 0,0006 +/- 0.0700 0.0122 +/- 12.805 + /-1.798
WT + M 5.342 0.0542 0.0101 0.1520 14.981
WT + M 5.653 0.0477 0.0084 0.1120 13.272
WT + M 5.700 0.0564 0.0099 0.1110 11.218
WT + F 5.542 0.0498 0.0090 0.1430 15.914
WT + F 5.723 0.0266 0.0046 0.0470 10.112
WT + F 5.186 0.0262 0.0051 0.0470 9.304
WT + M 5.543 0.0342 0.0062 0.0480 7.779
(Yukarıdaki sütundaki girdiler) SEM +/-demek 5.527 0.075 +/- 0.0422 + / 0.0049 0.0076 + / 0.0009 0.0943 + / 0.0175 11.797 1.142 +/-
KO- F 5.763 0.0209 0.0036 0.0690 19.025
KO- M 4.232 0.0164 0.0039 0.1010 26.061
KO- M 4.810 0.0227 0.0047 0.0880 18.647
KO- F 5.650 0.0363 0.0064 0.0600 9.339
KO- M 5.212 0.0178 0.0034 0.0640 18.739
(Yukarıdaki sütundaki girdiler) SEM +/-demek 5.133 0,282 +/- 0.0228 + / 0.0035 0.0044 0.0005 +/- 0.0764 + / 0.0078 18.362 + / 2.659
KO + M 5.128 0.0193 0.0038 0.0600 15.941
KO + M 5.030 0.0459 0.0091 0.1980 21.697
(Yukarıdaki sütunundaki girdi) aralığı +/-demek 5.079 0.049 +/- 0.0326 + / 0.0133 0.0065 0.0027 +/- 0.1290 + / 0.0690 18.819 + / 2.878
DT- M 5.426 0.0322 0.0059 0.0775 13.058
DT- M 4.255 0.0360 0.0085 0,0895 10.579
DT- M 4.818 0.0306 0.0064 0.1460 22.989
DT- M 5.189 0.0197 0.0038 0.0380 10.010
DT- F 5.500 0.0256 0.0047 0.0390 8.379
(Yukarıdaki sütundaki girdiler) SEM +/-demek 5.038 0,229 +/- 0.0288 + / 0.0028 0.0059 + / 0.0008 0.0780 + / 0.0198 13.003 + / 2.3607
DT + M 5.008 0.0694 0.0139 0.0270 1.948
DT + M 4.750 0.0660 0.0139 0.0070 0.504
DT + M 5.495 0.0587 0.0107 0.0692 6.478
DT + M 5.233 0.0542 0.0104 0.0620 5.986
(Yukarıdaki sütundaki girdiler) SEM +/-demek 5.121 0.159 +/- 0.0621 + / 0.0034 0.0122 + / 0.0010 0.0413 + / 0.0147 3.729 1.478 +/-

Tablo 2: bireysel WT, NEP KO ve NEP overexpressor fareler duodenums üzerinden madde P kaynaklı plazma ekstravazasyonu. Plazma ekstravazasyonu değerleri FVBN fareler (ile ya da ezelî önceki doksisiklin) ayrı ayrı OD620 nm/g kuru ağırlığı, FVBN WT fareler üzerinden ifade (n = 5 olmadan ve n = 7 ile doksisiklin), NEP KO fareler (n = 5 olmadan ve n = 2 ile doksisiklin) ve NEP overexpressor iki kat transgenik fareler (n = 5 olmadan ve n = 4 ile doksisiklin). Fareler için plazma ekstravazasyonu yukarıda ayrıntılı olarak protokolü için tabi tutuldu. Hiçbir cinsiyet farklılıkları plazma ekstravazasyonu değerlerde belirgin idi. Duodenums izole edildi; plazma ekstravazasyonu hesaplamak için kullanılan tek tek değerleri Tablo 1için açıklandığı gibi idi. Sonuç plazma ekstravazasyonu değerleri Şekil 3A-Coluşturmak için kullanılmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Yukarıda da açıklandığı gibi plazma ekstravazasyonu çalışmanın sonuçta nedenleri ile ilgili yeni bilgi ya da inhibe veya plazma ekstravazasyonu tedavi etmek için yeni yollar açabilir. Başarılı kullanımı, plazma ekstravazasyonu Protokolü (üstte), Evans mavi boya, kullanarak geçerli el yazması kanıtlanmıştır. Her ne kadar gösterilen verileri NEP damarlara korusun hipotez plazma ekstravazasyonu karşı bu bir ikincil halen, kolayca ortalama laboratuvar için kullanılabilir en iyi duruma getirilmiş bir iletişim kuralı sunmak için birincil amaç ile hedeftir plazma ekstravazasyonu gelecekteki çalışma. Burada rapor protokol farklı hedefleri, hayvanlar, organ ve diğer koşulları ile gelecekteki çalışmaları için uyum odaklanmıştır ve bu iletişim kuralı için kullanımı kolay, güvenilir, ekonomik, özellikle yararlı olur ve dikkate alır general ortak malzemeler, reaktifler ve yetkili personel durumu. Bu, ancak, bu iletişim kuralını tekrarlar grup hayvan (8-12 tekrar önerilen) başına adil bir miktar gerektirecektir belirtilmektedir istatistiksel geçerli sonuçlar elde etmek için.

Çok sayıda çalışmalar ve vasküler geçirgenliği ve plazma ekstravazasyonu ölçmek için girişimleri ayrıntılı raporlar olmuştur. By far, bu raporlar çoğunu Evans mavi boya yöntemi ile birlikte plazma ekstravazasyonu ve vasküler geçirgenliği2,3,6,11, araştırmak için kullanılan bir yöntem permütasyon detay 12,13. Hangi Evans tüm3,13,15,24, mavi birleştirmek değil damar geçirgenliği yöntemlerden daha az rapor edilmiştir; Bu diğer yöntemleri karmaşık Yöntemler, özel ekipman ve personel gerektiren genel ortalama laboratuvar için daha az erişilebilir ve genellikle pahalıdır.

Yukarıdaki Evans mavi Protokolü gelişimi birçok farklı permütasyon ve değişiklikleri test dahil. Erken deneyler Evans fare kuyruğu ven mavi enjekte girişimlerini üzerinde durulmuştur. Ancak, teknik olarak zor ve juguler ven enjeksiyonları eklenmesi gerektirecek tutarsız sonuçlar içinde sonuçlandı oldu damar enjeksiyonları ve yukarıda açıklanan terminal cerrahi teknik takip et. Ayrıca yapılan mavi ve madde s. Evans uygun konsantrasyonlarda bulmaya çalışıyorum birçok ön deney vardı Evans mavi miktarı yaklaşık 200 mg/kg (50 mg/kg için şu anda kullanılan göre) aşağıda öyleydi ama madde bu deneylerde kullanılan P miktarı önemli olarak zorunlu olmak bulunamadı. Çok deneme sonra 1 nmole/kg exogenously eklenen madde P, 1.5-fold bir büyütme ile sonuçlanan (ve böylece daha kolay ölçülebilir) ideal konsantrasyonu bulundu plazma ekstravazasyonu değerleri. Ayrıca, bu yeterli zaman Evans mavi equilibrate izin gerekir bulundu (> 10 dk). Perfüzyon aşırı Evans mavi, kurban fare ama organ yalıtım önce sonra kaldırmak için kan damarlarının bir unsuru bu perfüzyon adım4içermez diğer protokolleri karşı mevcut Protokolü bulundu. (Yumuşak yerçekimi degrade tarafından teslim) perfusate 50 mL (hangi bağlama Evans mavi ve albümin teşvik) bir pH 3.5 çözüm olduğunu; paraformaldehyde, birçok diğer Evans mavi protokolleri6,10,25, yaygın olarak karşılaşılan bazı mevcut protokolünde atlandı. Bu protokol için çözümlenmiş diğer faktör doksisiklin chow içinde kullanılan boya ile OD620 nm ölçüm Evans mavi dokularda Sindirimsel evden gelen engelleyen olmasıdır. Böylece, boyanmamış doksisiklin chow yukarıda deneylerde kullanmak için gerekli idi. Ayrıca, bir önemli ve yararlı neredeyse herhangi bir organ fare tatmin edici izole ve mevcut protokolü üzerinden incelendiğinde bulgudur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Yazarlar Andy Poczobutt ve Dr. Jori Leszczynski onların değerli yardım ve düzenlemeleri için bu el yazması için teşekkür etmek istiyorum.  Ulusal Kalp, akciğer ve kan Enstitüsü (NHLBI RO1 HL078929, PPG HL014985 ve RO3 HL095439) ve gazileri departmanı işleri (Merit Review) alınan hibe tarafından desteklenen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
isoflurane Vet One 200-070 inhaled anesthetic
ketamine Vet One 200-055 injectable anesthetic
xylazine Lloyd Laboratories 139-236 injectable anesthetic
syringes (10,3 & 1 cc) Becton Dickinson 309604, 309657, 309659
needles (20G1,23G1 & 26G1/2) Becton Dickinson 305178, 305193, 305111
isoflurane induction chamber VetEquip 941443 1 Liter
nosecone breathing circuits  VetEquip RC2 Rodent Circuit Controller 2
oxygen tank Airgas UN 1072 100% medical
heating pad CWE Inc. TC-1000 temperature controller
rectal temperature probe CWE Inc. 10-09012 mouse
balance (for rodents) Ohaus CS 2000
surgical tools-scissors Fine Science tools 15000-00 Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels)  
surgical tools-forceps Fine Science tools 11151-10 Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels)
surgical tools-hemostats Fine Science tools 13009-12 Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue)
surgical tools -suture drivers Fine Science tools 12502-12 Olsen-Hegar suture drivers (suturing)
surgical tools-forceps Fine Science tools 11627-12 Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat)
surgical tools-scissors Fine Science tools 14110-15 Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat)
surgical tools-forceps Fine Science tools 18025-10 suture tying forceps (used for Millar cath)
surgical tools-scissors Fine Science tools 14078-10 Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse)
surgical tools-forceps Fine Science tools 11254-20 Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection)
surgical tools-scissors Fine Science tools 14082-09 Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse)
surgical tools-forceps Fine Science tools 11051-10 10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse)
surgical tools-forceps Fine Science tools 11251-35 Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels)
surgical tools-retractors Fine Science tools 17012-11 Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical)
surgical tools-forceps Fine Science tools 11294-00 Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice)
surgical tools-forceps Fine Science tools 11297-00 Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection)
surgical tools-scissors Fine Science tools 14058-11 tough cut iris scissors (mouse dissection, bones)
surgical tools-forceps Fine Science tools 11009-13 serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat)
surgical tools-hemostats Fine Science tools 13003-10 Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue)
surgical tools-forceps Fine Science tools 11006-12 Adson serrated forceps (tissue grasping)
clippers Oster A5
tape Fisherbrand 159015G
artificial tear ointment Akorn Inc 13985-600-03
lidocaine Hospira 0409-4277-01 2% injectable
polyvinyl catheters Tygon PV-1
Evans blue Sigma Aldrich E2129
Substance P Bachem  H-1890
heparin Sagent Pharmaceuticals 25201-400-10 1000 U/ml
saline solution Hospira 0409-7138-09 0.9% sodium chloride
phenobarbital  Vortech 0298-9373-68
sodium citrate Fisher Scientific BP327-1
PBS Sigma Aldrich P4417-50TAB 
Kimwipes for blotting Fisher Scientific 06-666A
formamide Sigma Aldrich 47670
microbalance Denver Instrument APX-60
microfuge tubes Fisher Scientific 07-200-534
polystyrene 96 well plate Becton Dickenson 351172
absorbance plate reader BioTek Synergy 2
polyacrylamide gels Bio-Rad 3450014 
protein molecular weight standard Bio-Rad 1610374
Protran supported nitrocellulose Amersham (GE) 10600015
gel box Bio-Rad 1658005
Tris Fisher Scientific BP152-1
Tween20 Sigma Aldrich P-1379
sodium chloride Fisher Scientific S271-1
primary NEP polyclonal antibody  R & D Systems AF1182
doxycycline chow Teklad (HARLAN) TD.130750 
FVB/NJ wild type mice Jackson 001800
secondary antibody (goat anti-rabbit) ZyMed 81-6120
ECL solution-Western Lightening Plus PerkinElmer NEL104001EA
film Pierce 34091

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Snijdelaar, D. G., Dirksen, R., Slappendel, R., Crul, B. J. Substance P. Eur J Pain. 4 (2), 121-135 (2000).
  2. Rubinstein, I., Iwamoto, I., Ueki, I. F., Borson, D. B., Nadel, J. A. Recombinant neutral endopeptidase attenuates substance P-induced plasma extravasation in the guinea pig skin. Int Arch Allergy Appl Immunol. 91 (3), 232-238 (1990).
  3. Szabo, A., Menger, M. D., Boros, M. Microvascular and epithelial permeability measurements in laboratory animals. Microsurgery. 26 (1), 50-53 (2006).
  4. Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. J Vis Exp. (73), e50062 (2013).
  5. Moitra, J., Sammani, S., Garcia, J. G. Re-evaluation of Evans Blue dye as a marker of albumin clearance in murine models of acute lung injury. Transl Res. 150 (4), 253-265 (2007).
  6. Figini, M., et al. Substance P and bradykinin stimulate plasma extravasation in the mouse gastrointestinal tract and pancreas. Am J Physiol. 272 (4), Pt 1 785-793 (1997).
  7. Awad, A. S., et al. Selective sphingosine 1-phosphate 1 receptor activation reduces ischemia-reperfusion injury in mouse kidney. Am J Physiol Renal Physiol. 290 (6), 1516-1524 (2006).
  8. Lu, B., et al. The control of microvascular permeability and blood pressure by neutral endopeptidase. Nat Med. 3 (8), 904-907 (1997).
  9. Gendron, G., Simard, B., Gobeil, F., Sirois, P., D'Orleans-Juste, P., Regoli, D. Human urotensin-II enhances plasma extravasation in specific vascular districts in Wistar rats. Can J Physiol Pharmacol. 82 (1), 16-21 (2004).
  10. Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
  11. Saria, A., Lundberg, J. M. Evans blue fluorescence: quantitative and morphological evaluation of vascular permeability in animal tissues. J Neurosci Methods. 8 (1), 41-49 (1983).
  12. Fricke, I. B., et al. In vivo bioluminescence imaging of neurogenesis - the role of the blood brain barrier in an experimental model of Parkinson's disease. Eur J Neurosci. 45 (7), 975-986 (2017).
  13. Pink, D. B., Schulte, W., Parseghian, M. H., Zijlstra, A., Lewis, J. D. Real-time visualization and quantitation of vascular permeability in vivo: implications for drug delivery. PLoS One. 7 (3), 33760 (2012).
  14. Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat Rev Cancer. 2 (4), 266-276 (2002).
  15. Vandoorne, K., Addadi, Y., Neeman, M. Visualizing vascular permeability and lymphatic drainage using labeled serum albumin. Angiogenesis. 13 (2), 75-85 (2010).
  16. Turner, A. J., Nalivaeva, N. N. Proteinase dysbalance in pathology: the neprilysin (NEP) and angiotensin-converting enzyme (ACE) families. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 52 (4), 40-48 (2006).
  17. Lu, B., Gerard, N. P., Kolakowski, L. F., Finco, O., Carroll, M. C., Gerard, C. Neutral endopeptidase modulates septic shock. Ann N Y Acad Sci. 780, Mar 22 156-163 (1996).
  18. Dempsey, E. C., et al. Neprilysin null mice develop exaggerated pulmonary vascular remodeling in response to chronic hypoxia. Am J Pathol. 174 (3), 782-796 (2009).
  19. Karoor, V., Oka, M., Walchak, S. J., Hersh, L. B., Miller, Y. E., Dempsey, E. C. Neprilysin regulates pulmonary artery smooth muscle cell phenotype through a platelet-derived growth factor receptor-dependent mechanism. Hypertension. 61 (4), 921-930 (2013).
  20. Chu, P., Arber, D. A. Paraffin-section detection of CD10 in 505 nonhematopoietic neoplasms. Frequent expression in renal cell carcinoma and endometrial stromal sarcoma. Am J Clin Pathol. 113 (3), 374-382 (2000).
  21. Bircan, S., Candir, O., Kapucuoglu, N., Serel, T. A., Ciris, M., Karahan, N. CD10 expression in urothelial bladder carcinomas: a pilot study. Urol Int. 77 (2), 107-113 (2006).
  22. Koiso, K., Akaza, H., Ohtani, M., Miyanaga, N., Aoyagi, K. A new tumor marker for bladder cancer. Int J Urol. 1 (1), 33-36 (1994).
  23. Wick, M. J., et al. Protection against vascular leak in neprilysin transgenic mice with complex overexpression pattern. Transgenic Res. 25 (6), 773-784 (2016).
  24. Natah, S. S., Srinivasan, S., Pittman, Q., Zhao, Z., Dunn, J. F. Effects of acute hypoxia and hyperthermia on the permeability of the blood-brain barrier in adult rats. J Appl Physiol. 107 (4), (1985) 1348-1356 (2009).
  25. Scholzen, T. E., et al. Neutral endopeptidase terminates substance P-induced inflammation in allergic contact dermatitis. J Immunol. 166 (2), 1285-1291 (2001).

Tags

Tıp sayı: 139 vasküler sızıntı plazma ekstravazasyonu Evans mavi madde P idrar kesesi oniki parmak bağırsağı neprilysin
En iyi duruma getirilmiş bir Evans mavi Mouse vasküler sızıntı değerlendirmek için iletişim kuralı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wick, M. J., Harral, J. W., Loomis,… More

Wick, M. J., Harral, J. W., Loomis, Z. L., Dempsey, E. C. An Optimized Evans Blue Protocol to Assess Vascular Leak in the Mouse. J. Vis. Exp. (139), e57037, doi:10.3791/57037 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter