Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

بروتوكول سهلة لتوليد بروتينات سيتيسبيسيفيكالي أسيتيلاتيد في الإشريكيّة القولونية

Published: December 9, 2017 doi: 10.3791/57061
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 1, 1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Arkansas, 2Cell and Molecular Biology Program, University of Arkansas, 3Department of Biological Sciences, University of Arkansas, 4Fayetteville High School

Summary

التوسع في الشفرة الجينية بمثابة أداة قوية لدراسة طائفة واسعة من العمليات البيولوجية، بما في ذلك أسيتيليشن البروتين. هنا نظهر بروتوكول سهلة لاستغلال هذه التقنية لتوليد البلوتينيوم أسيتيلاتيد البروتينات في مواقع معينة في خلايا الإشريكيّة القولونية .

Abstract

بوستترانسلاشونال التعديلات التي تحدث في مواقع محددة من البروتينات قد ثبت أن تلعب أدواراً هامة في مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية. فيما بينها، أسيتيليشن يسين عكسها واحد لتوزيعها على نطاق واسع في جميع مجالات الحياة. على الرغم من أن تم إجراء العديد من الدراسات أسيتيلومي الجماعي القائم على قياس الطيف الكتلي، كذلك وصف هذه الأهداف acetylation المفترضة كانت محدودة. أحد الأسباب المحتملة هو أن من الصعب لتوليد بروتينات أسيتيلاتيد بحتة في المواقف المطلوبة بمعظم النهج البيوكيميائية الكلاسيكية. للتغلب على هذا التحدي، تم تطبيق تقنية توسيع الشفرة الجينية لاستخدام الزوج من متغير سينثاتيز المهندسة بيروليسيل-الحمض الريبي النووي النقال، والمشابهة لها الحمض الريبي النووي النقال من أنواع ميثانوسارسيناسيي ، وتوجيه إدماج كوترانسلاشونال من أسيتيليسيني في موقع محدد في بروتين الفائدة. بعد التطبيق الأول في الدراسة من acetylation هستون، سهلت هذا النهج acetylation دراسات بشأن مجموعة متنوعة من البروتينات. في هذا العمل، أثبتنا بروتوكول السطحية لإنتاج البروتينات سيتيسبيسيفيكالي أسيتيلاتيد باستخدام نموذج بكتيريا الإشريكيّة القولونية كالمضيف. مالات نازعة كمثال مظاهرة في هذا العمل.

Introduction

تعديلات بوستترانسلاشونال (بتمس) من البروتينات التي تحدث بعد عملية الترجمة، وتنشأ عن إضافة المجموعات الوظيفية التساهمية لمخلفات الأحماض الأمينية، تضطلع بأدوار هامة في تقريبا جميع العمليات البيولوجية، بما في ذلك الجينات النسخ واستجابة الإجهاد والتمايز الخلوي والتمثيل الغذائي1،،من23. وحتى الآن، حوالي 400 مميزة قد بتمس المحددة4. المعضلة من الجينوم والبروتين يتم تضخيمه إلى حد كبير من قبل بتمس البروتين، كما أنها تنظم نشاط البروتين والتعريب، وتؤثر على التفاعل مع جزيئات أخرى مثل البروتينات والأحماض النووية والدهون والعوامل المساعدة5.

وقد أسيتيليشن البروتين في طليعة الدراسات بتمس في آخر عقدين6،،من78،9،10،11،12. أسيتيليشن يسين كان أول من اكتشف في هيستونيس منذ أكثر من 50 عاماً13،14، قد تم التدقيق جيدا، ومن المعروف أن توجد في أكثر من 80 من عوامل النسخ، والمنظمين، ومختلف البروتينات15، ،من 1617. دراسات في أسيتيليشن البروتين قد وفر لنا فهما أعمق لآلياتها التنظيمية، بل يسترشد أيضا علاجات لعدد من الأمراض الناجمة عن اختلال أسيتيليشن18،19، 20 , 21 , 22 , 23-وكان يعتقد أن acetylation يسين يحدث فقط في حقيقيات النوى، ولكن الدراسات التي أجريت مؤخرا أظهرت أن acetylation البروتين كما تلعب أدواراً رئيسية في فسيولوجيا البكتيريا، بما في ذلك إنزيمية ومقاومة الأحماض والتنشيط وتحقيق الاستقرار في جزر الإمراضية وضراوة الأخرى المتعلقة بالبروتينات24،25،،من2627،،من2829.

باستخدام طريقة شائعة المتحلل تميز acetylation يسين الطفرات الموجهة من الموقع. الجلوتامين كتقليد أسيتيليسيني بسبب حجمها وقطبية مماثلة. ويستخدم ارجينين كتقليد يسين غير أسيتيلاتيد، نظراً لأنه يحتفظ تهمة إيجابية في ظل الظروف الفسيولوجية ولكن لا يمكن أن يكون أسيتيلاتيد. ومع ذلك، كلا يقلد ليست إيسوستيريس حقيقية ولا تسفر دائماً عن النتائج المتوقعة30. النهج الأكثر صرامة لتوليد بروتينات أسيتيلاتيد البلوتينيوم في المخلفات يسين محددة، التي من الصعب أو المستحيل على الأساليب الأكثر كلاسيكية بسبب ستويتشيوميتري منخفض من acetylation يسين في الطبيعة7،11. وقد تم متدهور هذا التحدي في استراتيجية التوسع في الشفرة الجينية، التي توظف هندسة بيروليسيل-الحمض الريبي النووي النقال سينثاتيز البديل من الأنواع ميثانوسارسيناسيي لشحن الحمض الريبي النووي النقالبرونتوسوروس مع أسيتيليسيني، يستخدم المضيف الآلات متعدية لقمع الفريق الاستشاري وقف كودون في مرناً، ويوجه إدماج أسيتيليسيني في موقف مصممة ل البروتين المستهدف31. في الآونة الأخيرة، ونحن الأمثل هذا النظام مع الإنكليزية والفرنسية-تو-ملزمة الحمض الريبي النووي النقال تحسين32 ورفع مستوى أسيتيليسيل-الحمض الريبي النووي النقال سينثاتيز33. وعلاوة على ذلك، نحن طبقت هذا النظام إدماج تعزيز الدراسات acetylation مالات نازعة34 وتيروسيل-الحمض الريبي النووي النقال سينثاتيز35. هنا، علينا أن نظهر البروتوكول من أجل توليد بروتينات أسيتيلاتيد بحتة من الاستنساخ الجزيئي لتحديد الهوية الكيميائية الحيوية باستخدام نازعة مالات (MDH)، الذي درسناه على نطاق واسع كمثال تتضح.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-موقع الموجه الطفرات الجينات المستهدفة

ملاحظة: يتم التعبير عن MDH تحت T7 المروج في ناقل ثنائي بنزوفيوران متعدد الكلور-1 مع مصدر CloDF13 وعدد نسخة من 20 إلى 4034.

  1. إدخال كودون وقف العنبر في موقف 140 في الجينات بالاشعال (الأمام التمهيدي: جتجتتاتجاكعلامةآكااكتجتتكجكج وعكس التمهيدي: جكتتتتتكاجكاكتكاجكاجكاتجك)، بناء على تعليمات الطقم الطفرات الموجهة من الموقع.
  2. تضخيم بلازميد القالب الذي يحتوي على الجين من مالات البرية من نوع ديهيدراتاسي، وإدراج طفرة كودون التوقف عن البلمرة (PCR) سلسلة من ردود الفعل. في خليط رد فعل، تشمل 12.5 ميليلتر من مزيج إنزيم بوليميريز الحمض الخلوي الصبغي X 2، ميليلتر 1.25 10 ميكرون التمهيدي إلى الأمام، ميليلتر 1.25 من 10 ميكرون عكس التمهيدي، 1 ميليلتر من قالب الحمض النووي (20 نانوغرام/ميليلتر) (بلازميدثنائي بنزوفيوران متعدد الكلور-1 التي تحتوي على الجينات البرية من نوع MDH)، و 9 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس.
    1. استخدام معلمات تفاعل PCR كما يلي: الأولى تمسخ عند 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ دورات 25 من 10 s عند 98 درجة مئوية، 30 ثانية على 55 درجة مئوية، و 3 دقيقة في 72 درجة مئوية؛ التمديد النهائي في 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. بعد بكر، إضافة مواد تضخيم مباشرة إلى هذا المزيج إنزيم كيناز-ليجاسى-دبني من الطقم ح 1 لإزالة قالب وعلى درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: الخليط رد يحتوي على 1 ميليلتر المنتج بكر، 5 ميليلتر من 2 × رد فعل المخزن المؤقت، 1 ميليلتر من 10 X كيناز-ليجاسى-دبني إنزيم ميكس وميليلتر 3 من المياه خالية من نوكلاس.
  3. إضافة 5 ميليلتر من مزيج رد فعل للأنبوب من 25 ميليلتر مذاب المختصة كولاي الخلايا DH5α من الطقم. عناية نفض الغبار على أنبوب لمزيج، ووضع الخليط على الجليد ل 30 دقيقة صدمة الحرارة المخلوط في 42 درجة مئوية 30 ثانية، ومكان على الجليد لمدة 5 دقائق إضافية.
    1. "الماصة؛" 600 ميليلتر من درجة حرارة الغرفة مرق "سوبر الأمثل" مع وسائل الإعلام في القمع (شركة نفط الجنوب) كاتابوليتي من المجموعة في المخلوط، واحتضانها في 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة مع الهز 250 لفة في الدقيقة، وانتشر 100 ميليلتر على صفيحة ليسوجيني أجار مرق (رطل) مع المضادات الحيوية المقابلة ، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع الهز 250 لفة في الدقيقة.
  4. اختيار المستعمرات واحدة 4-6 إلى 6 مل الطازجة رطل وسائل الإعلام مع المضادات الحيوية المقابلة، واحتضان عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع الهز 250 لفة في الدقيقة. استخراج البلازميدات من كل ثقافة بين عشية وضحاها بأدوات تنقية بلازميد، عقب دليل الشركة المصنعة، ثم إرسال والبلازميدات لتسلسل الحمض النووي وفقا لبروتوكول مزود الخدمة للتأكد من أن الطفرة كودون التوقف في المواضع الصحيحة.
  5. تخزين السلالة مع التسلسل الصحيح في-80 درجة مئوية عن طريق خلط الثقافة بين عشية وضحاها 1 مل و 300 ميليلتر 100% [دمس].

2-التعبير عن البروتين أسيتيلاتيد

  1. إدخال جينات محسن أسيتيليسيل-الحمض الريبي النووي النقال سينثاتيز33 والأمثل الحمض الريبي النووي النقالبرونتوسوروس 32 إلى بلازميد تك . مكان الجينات الحمض الريبي النووي النقال سينثاتيز تحت المروج التأسيسي الطب الخاص المحدود . مكان الجينات الحمض الريبي النووي النقال تحت المروج التأسيسي proK 34.
    1. شارك تحويل ناقلات التعبير34 تحتوي على الجينات التي تحتوي على العلامة المتحولة من نازعة مالات، وبلازميد إيواء النظام إدراج أسيتيليسيني الأمثل، إلى 25 ميليلتر المختصة المذابة كولاي BL21(DE3) الخلايا التي صدمة الحرارة في 42 درجة مئوية 10 s، ومكان على الجليد لمدة 5 دقائق إضافية.
    2. "الماصة؛" 600 ميليلتر لوسائل الإعلام في شركة نفط الجنوب درجة حرارة الغرفة إلى الخليط واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة مع الهز 275 لفة في الدقيقة، وانتشر 100 ميليلتر على طبق من ذهب مع 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين و 50 ميكروغرام/مل الكلورامفينيكول واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع الهز 275 لفة في الدقيقة.
  2. التقاط مستعمرة واحدة من اللوحة، وتطعيم في 15 مل الطازجة رطل وسائل الإعلام مع 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين والكلورامفينيكول 50 ميكروغرام/مل في أنبوب 50 مل بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع تهتز بسرعة 250 لفة في الدقيقة. نقل الثقافة بين عشية وضحاها 15 مل إلى 300 مل الطازجة رطل وسائل الإعلام مع المضادات الحيوية في قارورة ل 1، واحتضان في 37 درجة مئوية مع الهز 250 لفة في الدقيقة.
  3. حل أسيتيليسيني بالماء لجعل الحل الأسهم 100 مم، تخزين في 4 درجات مئوية. إضافة أسيتيليسيني 5 مم و 20 مم نيكوتيناميد (مثبطات ديسيتيلاسيس) إلى وسائط النمو عندما يصل امتصاص 0.5 في 600 نانومتر.
    1. تنمو خلايا ح 1 إضافية عند 37 درجة مئوية، تهز 250 لفة في الدقيقة، ثم إضافة 0.5 مم إيبتج للتعبير البروتين، وتنمو الخلايا عند 25 درجة مئوية بين عشية وضحاها، مع الهز 180 لفة في الدقيقة.
      ملاحظة: قد تحتاج إلى شروط التعبير الأمثل للبروتينات المختلفة.
  4. جمع الخلايا من سينتريفوجينج في س 3,000 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، وتجاهل المادة طافية، وتغسل الكريات الخلية مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) المخزن المؤقت (10 مم نا2هبو4، 1.8 مم خ2ص4، 137 مم كلوريد الصوديوم، 2.7 مم بوكل). جمع الخلايا غسلها في س 10,000 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية، وتخزين خلايا الكريات في-80 درجة مئوية.

3-تنقية البروتين أسيتيلاتيد

  1. ذوبان الجليد الكريات خلية مجمدة في الجليد، وإعادة تعليق مع 15 مل من تحلل المخزن المؤقت (50 مم تريس (هيدروكسيميثيل) أمينوميثاني (تريس) الأس الهيدروجيني 7.8، 300 مم كلوريد الصوديوم، ايميدازول 20 مم، ونيكوتيناميد 20 مم)، 5 ميليلتر β-ميركابتوثانول ونوكلياسي بينزوناسي ميليلتر 1 (250 وحدة).
  2. كسر الخلايا من سونيكيشن 40 كيلو هرتز في 70% طاقة الإنتاج مع دورات 10 من 10 s رشقات نارية قصيرة، تليها فترات 30 ثانية للتبريد لاستخراج النفط الخام شكل. استخراج النفط الخام من أجهزة الطرد المركزي في 20,000 x ز لمدة 25 دقيقة في 4 درجات مئوية. تصفية المادة طافية مع عامل تصفية غشاء 0.45 ميكرومتر، وتحميل في عمود يحتوي على 1 مل من النيكل-نيتروتراياكتيك الراتنج (ني-جاتا) حمض اكويليبراتيد مع 20 مل من المياه و 20 مل من تحلل المخزن المؤقت.
    ملاحظة: يمكن أيضا كسر الخلايا من المنظفات معتدل، إذا لم يتوفر sonication.
  3. أغسل العمود مع 20 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي (50 مم تريس pH 7.8، 300 مم كلوريد الصوديوم وايميدازول 50 مم 20 مم نيكوتيناميد)، ومن ثم الوت مع 2 مل من المخزن المؤقت شطف (50 مم تريس pH 7.8، 300 مم كلوريد الصوديوم، ايميدازول 150 مم، و 20 مم نيكوتيناميد).
  4. تحلية الكسر شطف مع الملحي العازلة (25 مم تريس pH 7.8 و 10 مم كلوريد الصوديوم) حسب العمود PD-10، عقب الدليل الخاص بالشركة المصنعة. قياس تركيز البروتين التيد باتباع تعليمات الكاشف مقايسة البروتين برادفورد. البروتين ديسالتيد على استعداد لإجراء مزيد من التجارب.
    ملاحظة: جعل الأسهم والغليسيرول 50 في المائة من البروتين، وتبقى في-80 درجة مئوية للتخزين.

4-الكيمياء الحيوية توصيف البروتين أسيتيلاتيد

  1. الحزب الديمقراطي الصربي صفحة وكتلة التحليلات قياس الطيف الكتلي.
    1. تؤذي البروتينات مع الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS) عينة المخزن المؤقت (5 ميليلتر البروتين عينة، مع 2 ميليلتر 4 × العازلة عينة الحزب الديمقراطي الصربي) في أنبوب 2 مل في 105 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، والطرد المركزي المخلوط في 2000 غ س ل 10 ق، التحميل على 4-20% الصوديوم دوديسيل كبريتات جل بولياكريلاميدي اليكتروف هلام أوريسيس (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة)، وتشغيل 200 الخامس لمدة 30 دقيقة.
    2. أغسل الهلام مع الماء المقطر وهزه برفق لمدة 5 دقائق، تكرار العملية 3 مرات. تجاهل الماء، ووصمة عار للهلام مع أخذ الأزرق وصمة عار ح 1 مع الهز لطيف. إزالة وصمة عار للهلام مع الماء المقطر، هزة بلطف و 30 دقيقة، وكرر هذا إزالة وصمة عار 3 مرات.
    3. قص الفرقة في كاتشين 33 في هلام أخذ الحزب الديمقراطي الصربي صفحة ملطخة باللون الأزرق، وإرسالها إلى مرافق الكتلي أو شركات لتأكيد تأسست في أسيتيليسيني في وضع تصميم.
      ملاحظة: بروتوكول تحليل الطيف الكتلي عقب التجربة السابقة34.
  2. النشاف الغربية
    1. تشغيل هلام الحزب الديمقراطي الصربي صفحة مع البروتوكول نفسه في الخطوة 4، 1. بعد الجل تشغيل، نقع الهلام مع نقل المخزن المؤقت (25 مم تريس و 192 مم جليكاين، الأس الهيدروجيني 8.3 و 20% ميثانول) لمدة 15 دقيقة.
    2. تنشيط من 0.2 ميكرومتر، 7 سم × 8.5 سم غشاء ثنائي الفلوريد (PVDF) الفينيليدن مع الميثانول لمدة 1 دقيقة، وشطف مع نقل المخزن المؤقت قبل إعداد ساندويتش نقل.
      ملاحظة: الميثانول الخطرة في حالة تماس الجلد أو العين الاتصال، وابتلاع أو استنشاق. شديدة التعرض المفرط يمكن أن يؤدي إلى الوفاة.
    3. جعل ساندويتش نقل من الكاثود إلى اﻷنود (الأسفنج ورق الترشيح، والحزب الديمقراطي الصربي صفحة هلام، PVDF غشاء، تصفية والورق والإسفنج). وضع المكدس في خزان نقل، تشغيل في التيار المستمر من 350 mA لمدة 45 دقيقة.
      ملاحظة: قد تحتاج إلى نقل الوقت الأمثل.
    4. يغسل الغشاء PVDF 25 مل تريس مخزنة المالحة، 0.1% توين 20 (تبسة) (137 مم كلوريد الصوديوم، 20 مم تريس، 0.1% 20 توين، ودرجة الحموضة 7.6) المخزن المؤقت لمدة 5 دقائق مع الهز لطيف. كتلة الغشاء مع 5% البقري ألبومين المصل (BSA) في المخزن المؤقت تبسة ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
    5. احتضان الغشاء بجسم أسيتيليسيني HRP مترافق مع تركيز نهائي 1 ميكروغرام/مل المخفف مع جيش صرب البوسنة 5% في تبسة في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها مع الهز لطيف.
      ملاحظة: للحصول على نتائج أسرع، ويمكن تنفيذ هذه الخطوة في درجة حرارة الغرفة ح 1. التخفيف من الأجسام المضادة قد تحتاج إلى التحسين.
    6. يغسل الغشاء مع 20 مل تبست المخزن المؤقت لمدة 5 دقائق مع الهز لطيف، تكرار الخطوة 4 مرات. تطبيق الركيزة تشيميلومينيسسينسي للغشاء باتباع إرشادات الشركة المصنعة. التقاط الإشارات مع جهاز اقتران (CCD) المستندة إلى كاميرا التصوير الصوتي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

عائد البروتين MDH أسيتيلاتيد كان 15 ملغ في الثقافة 1 لتر، بينما من البرية من نوع MDH 31 ملغ في الثقافة 1 لتر. تم تحليل البروتينات المنقاة من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة كما هو مبين في الشكل 1. MDH البرية من نوع كمراقبة إيجابية34. البروتين تنقيته من الخلايا إيواء النظام دمج أسيتيليسيني (AcK) والجين متحولة mdh ، ولكن دون AcK في وسائط النمو، كعنصر سلبي. تم الكشف عن acetylation يسين من البروتينات المنقاة بغربي النشاف استخدام أسيتيليسيني الجسم كما هو مبين في الشكل 2. وأكد أسيتيليشن بقايا يسين 140 في نازعة مالات تحليل الطيف الكتلي جنبا إلى جنب كما هو مبين في الشكل 3.

تسلسل البروتين البروتين MDH (والجزء لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد جنبا إلى جنب بخط غامق):

مكفافلجاجيجقالاللكتقلبسجسيلسليديابفتبجفافدلشيبتافكيكجفسجيدات
باليجادففليساجفاركبجمدرسدلفنفناجيفكنلفققفاكتكبكاسيجييتنبفنتفيا
افلكأجفيدكنكلفجفتلدييرسنتففايلكجكقبجيفيفبفيجغسجفتيلبلسقفبجف
سفتيقيفادلتكريقناجتيففيكاججساتلسمجقاارفجلسلفرالقجيقجففيكاي
فيجدجقيارفسقبللجكنجفيركسيجتلسافيقناليجملدتلكديالجيففنك

تسلسل البروتين محسن أسيتيليسيل-الحمض الريبي النووي النقال سينثاتيز33:

مدكبلدفليساتجلومسرتجتلهكيخييسرسكيييماكجدهلففنسرسكربارافريهكي
ركتكركرفسديديننفلترستيجكتسفكفكففسيبكفكامبكسفسرابكبلينبفساكاست
دتسرسفبسباكستبنسبفبتساسابالتكسقتدرليفلنبكديسلنسجكبفريليسيلسر
كدلققييايرينيلجكليريترففدرجفليكسبيليبليييرمجيدندتيلسكقيفرفدكن
فكلربمابنلنياركلدرالبدبيكيفيجبسيركيسدجكيهليفتملنفقمجسجكتري
نليسييتدفلنهلجيدفكيفجدسكمفيجدتلدفمهجدليلساففجبيبلدريوجيدكبويجاجف
جليرلكفخدفكنيكرارسيسينجيستنل

التسلسل الجيني للحمض الريبي النووي النقال الأمثلبرونتوسوروس 32:

جااكجتجاتكاتجتاجاتكجاتجاكتكتااتككجتكاجتجججتاجاتكككك
أكجتتككجككا

Figure 1
الشكل 1 : "أخذ" الملون الأزرق جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة MDH كامل طول المنقي والبديل المحتوية على AcK. هلام نفس أحجام شطف الكسور تم تحميلها على الحزب الديمقراطي الصربي-الصفحة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : النشاف الغربية المنقي البرية من نوع MDH والبديل المحتوية على AcK. تم تحميل وحدات التخزين نفس شطف الكسور. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : تحليل LC-MS/MS لمتغير MDH المحتوية على AcK. الطيف الشامل جنبا إلى جنب من أجفيدك الببتيد (بقايا 135-142)ACناغورني كاراباخ من البديل MDH أسيتيلاتيد المنقي. كAC يدل على إدماج AcK. يمكن قراءة التسلسل الجزئي من الببتيد تحتوي على AcK من ب المشروح أو سلسلة أيون y. وكانت قمم المتطابقة باللون الأحمر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويستند إدراج الوراثية للأحماض الأمينية نونكانونيكال (ncAAs) قمع كودون المعينة، معظمهم إيقاف العنبر كودون الفريق الاستشاري36،37،38،39، بالحمض الريبي النووي النقال المشحون نكا تحتوي على أنتيكودون المقابلة. وكما هو معروف، كودون الفريق الاستشاري يعترف بالإفراج عن العامل-1 (RF1) في البكتيريا، وأنه يمكن أيضا يمكن منعها بالقرب ترنس المشابهة من المضيفين اتهم بالأحماض الأمينية الكنسي (الهيئة) مثل يسين وتيروزين40،41. لذلك، تتوقف كفاءة نكا التأسيس في كودون الفريق الاستشاري على المنافسة بين المتهمين نكا ترنس و RF1، بينما نقاء التأسيس نكا يعتمد على المنافسة بين ترنس مشحونة بالرابطة الوطنية لرياضة والجهاز المركزي للمحاسبات مشحونة بالقرب من ترنس المشابهة. قد يكون سبب منخفضة الغلة والنقاء من البروتين المستهدف أسيتيلاتيد كفاءة منخفضة إدراج زوج متعامد أدخلت الخلايا المضيفة. ويمكن حل هذه المشكلة عن طريق زيادة تركيز أسيتيليسيني في وسائل الإعلام، ومؤخرا باستخدام محسن أسيتيليسيني إدماج النظم، الذي ازداد قمع كودون الفريق الاستشاري بأوقات 5832،33، على حد سواء سيتم تحسين كفاءة ونقاء أسيتيليسيني التأسيس. كما هو مبين في الشكل 1 ، والمقارنة بين الغلة البروتين، كفاءة التأسيس أسيتيليسيني حوالي 50%، وهناك لا يمكن كشفها البروتين تنقيته من الخلايا إيواء النظام إدراج AcK والجينات متحولة MDH، ولكن دون AcK في وسائط النمو، مما يدل على نقاء عالية أسيتيليسيني التأسيس. وعلاوة على ذلك، تحليل الطيف الكتلي كما لم تظهر أي الهيئة في موقف 140 MDH، تشير إلى تجانس إدماج أسيتيليسيني.

هناك اثنين من القيود الرئيسية لهذا النهج. أولاً، بسبب المنافسة من تهمة أسيتيليسيني الحمض الريبي النووي النقال مع كلا RF1 والجهاز المركزي للمحاسبات مشحونة بالقرب من ترنس المشابهة المذكورة أعلاه، والحد الأقصى لعدد من بقايا أسيتيليسيني التي يمكن أن تدمج في نفس الوقت بروتين وحيد حاليا ثلاثة 33،42. وثانيا، تحتوي الخلايا على أنواع أخرى من ديسيتيلاسيس، التي تقاوم نيكوتيناميد وقد ديسيتيلاتي بعض البروتينات المستهدفة. لذلك، قد لا تصل إلى تلك البروتينات acetylation 100% في مواقع محددة. في الآونة الأخيرة، أنشأنا نظام إدماج الايثير-أسيتيليسيني التي يمكن أن تستخدم تناظرية غير ديسيتيلابل من أسيتيليسيني43، وبالتالي يمكن أن يكون هذا النظام نهج بديل جيد في هذه الحالة.

كما ذكر من قبل، هو استخدام النهج الكلاسيكي لتوصيف المتحلل acetylation يسين الطفرات الموجهة من الموقع. الجلوتامين هو استخدامها كتقليد أسيتيليسيني، وتستخدم الارجينين كتقليد يسين غير أسيتيلاتيد. بيد أن كلا يقلد ليست إيسوستيريس حقيقية ولا تسفر دائماً عن النتائج المتوقعة30. استراتيجية التوسع في الشفرة الجينية يمكن أن تولد البروتينات البلوتينيوم أسيتيلاتيد في بقايا يسين محددة، وهي الطريقة الأكثر صرامة تميز البروتينات أسيتيلاتيد.

نظام إدراج الوراثية أسيتيليسيني مستمدة من الزوج من بيروليسيل-الحمض الريبي النووي النقال سينثاتيز المتغيرات، وعلى الحمض الريبي النووي النقال المشابهة من الأنواع ميثانوسارسيناسيي ، الذي يعرف أيضا بأن يكون متعامد في حقيقيات النوى44. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن يمكن تطبيق هذا النظام في خلايا الثدييات وبعض الحيوانات للبروتين acetylation الدراسات39، وبذلك يمكن توسيع نطاق هذا البروتوكول لخلايا الثدييات وحتى الحيوانات للتطبيقات الواسعة في الطب البحث والصناعة. وعلاوة على ذلك، هذا البروتوكول هو أيضا أساسا نفس البروتوكول المستخدم لإدراج أنواع مختلفة من ncAAs، مما استلزم إجراء تغيير بسيط على زوج متعامد أدخلت الخلايا المضيفة.

إزالة يسين ديسيتيلاسيس (كدكس) مجموعة أسيتيل من بقايا يسين أسيتيلاتيد في45من البروتينات. سيرتوين-النوع كوب هو ديسيتيلاسي فقط معروفة في كولاي، التي يمكن أن تحول دون نيكوتيناميد27. ولذلك، لمنع ديسيتيليشن البروتين أسيتيلاتيد التي تم إنشاؤها أثناء نمو الخلايا وتنقية البروتين، تضاف نيكوتيناميد 20 إلى 50 مم في كل من وسائط النمو وتنقية من المخازن المؤقتة. مجرد تنقيته، أسيتيليشن بقايا يسين مستقرة نسبيا نظراً لعدم وجود ديسيتيلاسي. وثانيا، إلى أدنى خلفية acetylation غير محدد في المخلفات الأخرى يسين في البروتين، BL21 سلالة (DE3) استخدمت كسلالة التعبير، نظراً لمستوى أقل بكثير من البروتين أسيتيليشن من سلالات K12 المشتقة استخداماً46 . كما هو مبين في الشكل 2، كان MDH البرية من نوع من الخلايا BL21(DE3) وأعرب عن أسيتيليشن لا يمكن كشفها من النشاف الغربية. وهذا عامل مهم آخر لزيادة نقاء acetylation في البروتين الهدف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة (AI119813)، البدء من جامعة اركنساس، والجائزة من معهد العلوم البيولوجية ولاية أركنسو.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bradford protein assay Bio-Rad 5000006 Protein concentration
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747 SDS sample buffer
Coomassie G-250 Stain Bio-Rad 1610786 SDS-PAGE gel staining
4-20% SDS-PAGE ready gel Bio-Rad 4561093 Protein determination
Ac-K-100 (HRP Conjugate) Cell Signaling 6952 Antibody
IPTG CHEM-IMPEX 194 Expression inducer
Nε-Acetyl-L-lysine CHEM-IMPEX 5364 Noncanonical amino acid
PD-10 desalting column GE Healthcare 17085101 Desalting
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit NEB E0554 Introducing the stop codon
BL21 (DE3) cells NEB C2527 Expressing strain
QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN 27106 Extracting plasmids
Ni-NTA resin QIAGEN 30210 Affinity purification resin
nicotinamide Sigma-Aldrich N3376 Deacetylase inhibitor
β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250 Reducing agent
BugBuster Protein Extraction Reagent Sigma-Aldrich 70584 Breaking cells
Benzonase nuclease Sigma-Aldrich E1014 DNase
ECL Western Blotting Substrate ThermoFisher 32106 Chemiluminescence
Premixed LB Broth VWR 97064 Cell growth medium
Bovine serum albumin VWR 97061-416 western blots blocking

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krishna, R. G., Wold, F. Post-translational modification of proteins. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 67, 265-298 (1993).
  2. Lothrop, A. P., Torres, M. P., Fuchs, S. M. Deciphering post-translational modification codes. FEBS Lett. 587 (8), 1247-1257 (2013).
  3. Walsh, C. T. Posttranslational modification of proteins : expanding nature's inventory. , Roberts and Company Publishers. Englewood, Colorado. (2006).
  4. Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Sci Rep. 1, (2011).
  5. Grotenbreg, G., Ploegh, H. Chemical biology: dressed-up proteins. Nature. 446 (7139), 993-995 (2007).
  6. Arif, M., Selvi, B. R., Kundu, T. K. Lysine acetylation: the tale of a modification from transcription regulation to metabolism. Chembiochem. 11 (11), 1501-1504 (2010).
  7. Cohen, T., Yao, T. P. AcK-knowledge reversible acetylation. Science's STKE : signal transduction knowledge environment. (245), pe42 (2004).
  8. Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R., Arnesen, T. The world of protein acetylation. Biochim Biophys Acta. 1864 (10), 1372-1401 (2016).
  9. Escalante-Semerena, J. C. Nε-acetylation control conserved in all three life domains. Microbe. 5, 340-344 (2010).
  10. Kouzarides, T. Acetylation: a regulatory modification to rival phosphorylation? The EMBO journal. 19 (6), 1176-1179 (2000).
  11. Soppa, J. Protein acetylation in archaea, bacteria, and eukaryotes. Archaea. , (2010).
  12. Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (4), 258-264 (2015).
  13. Allfrey, V. G., Faulkner, R., Mirsky, A. E. Acetylation and Methylation of Histones and Their Possible Role in the Regulation of Rna Synthesis. P Natl Acad Sci USA. 51, 786-794 (1964).
  14. Phillips, D. M. The presence of acetyl groups of histones. Biochem j. 87, 258-263 (1963).
  15. Sterner, D. E., Berger, S. L. Acetylation of histones and transcription-related factors. Microbiology and molecular biology reviews: MMBR. 64 (2), 435-459 (2000).
  16. Glozak, M. A., Sengupta, N., Zhang, X., Seto, E. Acetylation and deacetylation of non-histone proteins. Gene. 363, 15-23 (2005).
  17. Close, P., et al. The emerging role of lysine acetylation of non-nuclear proteins. Cell Mol Life Sci. 67 (8), 1255-1264 (2010).
  18. Iyer, A., Fairlie, D. P., Brown, L. Lysine acetylation in obesity, diabetes and metabolic disease. Immunol Cell Biol. 90 (1), 39-46 (2012).
  19. You, L., Nie, J., Sun, W. J., Zheng, Z. Q., Yang, X. J. Lysine acetylation: enzymes, bromodomains and links to different diseases. Essays Biochem. 52, 1-12 (2012).
  20. Bonnaud, E. M., Suberbielle, E., Malnou, C. E. Histone acetylation in neuronal (dys)function. Biomol Concepts. 7 (2), 103-116 (2016).
  21. Fukushima, A., Lopaschuk, G. D. Acetylation control of cardiac fatty acid beta-oxidation and energy metabolism in obesity, diabetes, and heart failure. Biochim Biophys Acta. 1862 (12), 2211-2220 (2016).
  22. Kaypee, S., et al. Aberrant lysine acetylation in tumorigenesis: Implications in the development of therapeutics. Pharmacol Ther. 162, 98-119 (2016).
  23. Tapias, A., Wang, Z. Q. Lysine Acetylation and Deacetylation in Brain Development and Neuropathies. Genomics Proteomics Bioinformatics. 15 (1), 19-36 (2017).
  24. Hu, L. I., Lima, B. P., Wolfe, A. J. Bacterial protein acetylation: the dawning of a new age. Molecular microbiology. 77 (1), 15-21 (2010).
  25. Jones, J. D., O'Connor, C. D. Protein acetylation in prokaryotes. Proteomics. 11 (15), 3012-3022 (2011).
  26. Bernal, V., et al. Regulation of bacterial physiology by lysine acetylation of proteins. New biotechnol. 31 (6), 586-595 (2014).
  27. Hentchel, K. L., Escalante-Semerena, J. C. Acylation of Biomolecules in Prokaryotes: a Widespread Strategy for the Control of Biological Function and Metabolic Stress. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 79 (3), 321-346 (2015).
  28. Ouidir, T., Kentache, T., Hardouin, J. Protein lysine acetylation in bacteria: Current state of the art. Proteomics. 16 (2), 301-309 (2016).
  29. Wolfe, A. J. Bacterial protein acetylation: new discoveries unanswered questions. Curr Genet. 62 (2), 335-341 (2016).
  30. Albaugh, B. N., Arnold, K. M., Lee, S., Denu, J. M. Autoacetylation of the histone acetyltransferase Rtt109. J Biol Chem. 286 (28), 24694-24701 (2011).
  31. Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding Nε-acetyllysine in recombinant proteins. Nat chem biol. 4 (4), 232-234 (2008).
  32. Fan, C., Xiong, H., Reynolds, N. M., Soll, D. Rationally evolving tRNAPyl for efficient incorporation of noncanonical amino acids. Nucleic Acids Res. 43 (22), e156 (2015).
  33. Bryson, D., et al. Continuous directed evolution of aminoacyl-tRNA synthetases to alter amino acid specificity and enhance activity. Nat Chem Biol. , (2017).
  34. Venkat, S., Gregory, C., Sturges, J., Gan, Q., Fan, C. Studying the Lysine Acetylation of Malate Dehydrogenase. J Mol Biol. 429 (9), 1396-1405 (2017).
  35. Venkat, S., Gregory, C., Gan, Q., Fan, C. Biochemical characterization of the lysine acetylation of tyrosyl-tRNA synthetase in Escherichia coli. Chembiochem. 18 (19), 1928-1934 (2017).
  36. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  37. Mukai, T., Lajoie, M. J., Englert, M., Soll, D. Rewriting the Genetic Code. Annu Rev Microbiol. , (2017).
  38. O'Donoghue, P., Ling, J., Wang, Y. S., Soll, D. Upgrading protein synthesis for synthetic biology. Nat Chem Biol. 9 (10), 594-598 (2013).
  39. Chin, J. W. Expanding and reprogramming the genetic code of cells and animals. Annu Rev Biochem. 83, 379-408 (2014).
  40. O'Donoghue, P., et al. Near-cognate suppression of amber, opal and quadruplet codons competes with aminoacyl-tRNAPyl for genetic code expansion. FEBS Lett. 586 (21), 3931-3937 (2012).
  41. Aerni, H. R., Shifman, M. A., Rogulina, S., O'Donoghue, P., Rinehart, J. Revealing the amino acid composition of proteins within an expanded genetic code. Nucleic Acids Res. 43 (2), e8 (2015).
  42. Huang, Y., et al. A convenient method for genetic incorporation of multiple noncanonical amino acids into one protein in Escherichia coli. Mol Biosyst. 6 (4), 683-686 (2010).
  43. Venkat, S., et al. Genetically encoding thioacetyl-lysine as a nondeacetylatable analog of lysine acetylation in Escherichia coli. FEBS Open. , (2017).
  44. Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
  45. Gregoretti, I. V., Lee, Y. M., Goodson, H. V. Molecular evolution of the histone deacetylase family: functional implications of phylogenetic analysis. J Mol Biol. 338 (1), 17-31 (2004).
  46. Weinert, B. T., et al. Acetyl-phosphate is a critical determinant of lysine acetylation in E. coli. Mol cell. 51 (2), 265-272 (2013).

Tags

علم المناعة، 130 قضية، acetylation البروتين، تعديل بوستترانسلاشونال، والتوسع في الشفرة الجينية، والأحماض الأمينية نونكانونيكال، نازعة مالات، والبيولوجيا التركيبية
بروتوكول سهلة لتوليد بروتينات سيتيسبيسيفيكالي أسيتيلاتيد في <em>الإشريكيّة القولونية</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Venkat, S., Gregory, C., Meng, K.,… More

Venkat, S., Gregory, C., Meng, K., Gan, Q., Fan, C. A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli. J. Vis. Exp. (130), e57061, doi:10.3791/57061 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter