Summary
In dit werk beschrijven we protocollen voor het onderzoek naar de rol van extracellulaire blaasjes (EVs) uitgebracht door Plasmodium falciparum geïnfecteerd erytrocyten. In het bijzonder richten we ons op de interacties van EVW met endotheliale cellen.
Abstract
Malaria is een levensbedreigende ziekte veroorzaakt door Plasmodium parasieten, met P. falciparum is de meest voorkomende op het Afrikaanse continent en die verantwoordelijk is voor de meeste malaria sterfgevallen wereldwijd. Verschillende factoren, met inbegrip van vastlegging van de parasiet in de weefsels, vasculaire dysfunctie en inflammatoire reacties beïnvloedt de ontwikkeling van de ziekte malaria-geïnfecteerd mensen. P. falciparum-geïnfecteerde rode bloedcellen (iRBCs) vrij kleine extracellulaire blaasjes (EVs) met verschillende soorten lading moleculen die pathogenese en mobiele communicatie tussen parasieten en host bemiddelen. EVW zijn efficiënt opgepakt door cellen waarin zij hun functie moduleren. Hier bespreken we strategieën om de rol van het EVW in de parasiet-gastheer interacties. Eerst beschrijven we een eenvoudige methode voor het benoemen en tracking EV internalisering door endotheliale cellen, met behulp van een groene cel linker kleurstof. Ten tweede, rapporteren we een eenvoudige manier om te meten permeabiliteit over een enkelgelaagde endothelial cel met behulp van een fluorescently geëtiketteerde dextran. Tot slot laten we zien hoe te onderzoeken van de rol van kleine niet-coderende RNA-moleculen in functie endothelial cel.
Introduction
Volgens de World Health Organization, er waren 212 miljoen nieuwe gevallen van malaria wereldwijd in 2015 en ongeveer 429,000 mensen zijn omgekomen, voornamelijk kinderen jonger dan vijf jaar leeftijd1. De mechanismen die leiden tot een ernstige aandoening, die vaak geassocieerd met vasculaire dysfunctie wordt, blijven vaag2. Plasmodium- iRBCs afscheiden kleine bi-lipide membraan bollen extracellulaire blaasjes (EVs) genoemd. Het is bekend dat deze EVs potentieel relevant zijn aan het proces van de infectie en aan de immuunrespons van de gastheer voor infectie; echter, er is weinig bekend over de exacte functie van deze kleine blaasjes tijdens malaria infectie3. Het is mogelijk dat zij twee belangrijke rollen spelen: aan de ene kant kunnen ze bijdragen aan de pathogenese door activering van macrofagen4,5; en aan de andere kant, ze cellulaire communicatie tussen parasieten en tussen parasieten en host6,7zou kunnen bemiddelen. In feite, kunnen parasieten overbrengen eiwitten of nucleïnezuren tussen elkaar via EVs. Bijvoorbeeld, Trypanosoma brucei rhodesiense EVs virulentiefactor Serum Resistance-Associated (SRA) kunt overbrengen, en zowel andere T. brucei en gastheer erytrocyten8kunt richten. Bovendien, P. falciparum- iRBCs communicatie tussen elkaar door de overdracht van nucleïnezuren binnen EVs. Hierdoor is de parasieten te optimaliseren en haar groei te synchroniseren. EVs kunnen in feite worden de belangrijke regulator van gametocyt conversie en dragen dus bij tot de regulering van de transmissie fase7.
Niet alleen doen EVs regelen de parasieten, ze ook bemiddelen parasiet-gastheer interacties. Onlangs ontdekten we dat EVs van iRBCs host-afgeleide microRNAs (miRNAs; kleine soorten van de RNA in het bereik van 21-25 nucleotiden9) die in beslag door menselijke endotheliale cellen genomen waren bevatten. De miRNAs in de EVs vormen een stabiele complex met Ago2 (een lid van de RNA-geïnduceerde silencing complex), die zodra geleverd aan de ontvangende cellen, in staat is van specifiek monddood maken van de expressie van genen en invloed op de eigenschappen van de barrière van de cellen10. Standaard protocollen zijn ontwikkeld voor het onderzoek naar de functie van het EVW. Hier beschrijven we eerst een protocol waarmee de fluorescerende labeling van het EVW te onderzoeken hun acceptatie door de ontvangende cellen. Bovendien, met behulp van een confocal microscoop, is het mogelijk om bij te houden van de EV lot in de cel. Verschillende fluorescente kleurstoffen kunnen worden gebruikt voor het bijhouden van EVs. De amine-reactieve kleurstof, 5-(and-6)-Carboxyfluorescein-DIACETAAT-Succinimidyl Ester (CFSE) en calceïne-AM geworden TL eenmaal binnen de blaasjes. Wij graag gebruiken het amfifiele label, PKH, want het geeft een helderder en meer uniforme signaal. Deze aanpak geeft belangrijke informatie om te begrijpen van de interacties tussen het EVW en ontvangende cellen. Terwijl in sommige gevallen EVs aan het oppervlak van de cellen binden, worden sommige blaasjes snel opgenomen. Bij opname leveren EVs hun lading aan de cellen, waarin zij hun regelgevende taken uitoefenen.
Hier beschrijven we een protocol voor het meten van de barrièrefunctie van de endotheliale cellen in vitro door het kwantificeren van de overdracht van een fluorescerende dextran via een cellulaire enkelgelaagde. Gevoeliger traceurs kunnen worden gebruikt zoals radiolabeled markeringen. Ze vereisen echter speciale voorzorgsmaatregelen voor gebruik. Andere testen bestaan voor het meten van de barrièrefunctie in vitro zoals signaalcomplexen elektrische weerstand (TEER), die tight junction integriteit meet. Tot slot het visualiseren van ZO-1, een strakke junction eiwit, met immunofluorescentie kunt beoordeling van strakke junction betrouwbaarheid als goed10. Aangezien EVs complexe en heterogene entiteiten met verschillende ladingen met potentiële regelgevende karakteristiek zijn, is het nuttig om te overexpress een specifieke RNA om te bestuderen van de gevolgen daarvan voor de ontvangende cel. Daarom, definiëren we ook een protocol dat gericht is op het genereren van stabiele cellijnen uiten de miRNA van belang10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Menselijke RBC werden verkregen uit het bloed van gezonde donoren, overeenkomstig de richtsnoeren van Swissethics (swissethics.ch).
Opmerking: P. falciparum parasiet culturen (3D 7) en EV productie eerder werden beschreven in Mbagwu, et al.. 11 want P. falciparum een menselijke pathogenen is, Raadpleeg de plaatselijke regelgeving voor behandeling. De culturen moeten steriel de hele tijd.
1. fluorescentie Labeling van EVs
Opmerking: De volgende procedure maakt gebruik van de labeling technologie te stabiel nemen een groen fluorescente kleurstof (PKH67) met grote alifatische staarten in de lipide-regio van de EV-membraan. De reactie wordt uitgevoerd in een 200 µL uiteindelijke kleuring van volume met een 20 µM eindconcentratie van PKH67. Voer alle stappen uit bij kamertemperatuur (20-25 ° C)
- Plaats 100 µg van het EVW in 1 mL PBS in een microcentrifuge buis.
- Centrifugeer het EVW in een microcentrifuge buis op maximale snelheid (20.000 x g) gedurende 7 minuten naar pellet.
Opmerking: Aangezien hemozoin in EVW aanwezig is, moet er een rood-donker bruinachtige pellet worden opgemerkt. Als het supernatant roodachtig, is dan de EVW hebben lysed. - Gecombineerd het supernatans dat na het centrifugeren, zorgvuldig, om te voorkomen dat het verwijderen van eventuele EVs.
Opmerking: Het minimaliseren van de hoeveelheid resterende buffer aanwezig voordat het EVW in verdunningsmiddel C resuspending teneinde de reproduceerbaarheid en de efficiëntie van de kleuring. - Resuspendeer de pellet EV in 100 µL van verdunningsmiddel C (2 X EV schorsing) en pipet zachtjes te verzekeren van volledige spreiding.
- Voorbereiden van een nieuwe microcentrifuge-buis en voeg 4 µL van de PKH67 ethanolbevattend kleurstof oplossing aan 100 µL verdunningsmiddel C. Vortex goed te mengen. Bereid dit 2 x kleurstof oplossing (40 µM) onmiddellijk voorafgaand aan de kleuring.
Opmerking: Om te voorkomen dat heterogene kleuring, Voeg geen de PKH67 ethanolbevattend kleurstof oplossing rechtstreeks naar de EV-pellet. - Snel, de 100 µL van 2 X EV schorsing (stap 1.4) te combineren met de 100 µL van 2 X kleurstof oplossing (stap 1.5). Meng vervolgens het monster door pipetteren op en neer 10 keer.
- Incubeer de opschorting van de EV/kleurstof uit stap 1.6 voor 5 min beschermd tegen licht en meng door vortexing 3 - 4 keer tijdens de incubatie 5 min.
Opmerking: Het broeden van de opschorting van de EV/kleurstof voor langere tijden biedt geen enkel voordeel, omdat de kleuring zo snel is. - Stop de kleuring reactie door toevoeging van een gelijk volume (200 µL) serum en incubeer gedurende 1 minuut aan de binding van overtollige kleurstof toestaan.
Opmerking: Voordat u stopt de kleuring, afbreken het serum van EVs door centrifugeren bij 20.000 x g gedurende 20 min. - 3 keer wassen met PBS en spin down bij 20.000 x g gedurende 5 min. resuspendeer de EVs in 100 µL van PBS te bereiken een eindconcentratie van 1 µg/µL.
2. het visualiseren van opname van het EVW door confocale microscopie
Opmerking: Het volgende protocol beschrijft het volgen van EV internalisering door endotheliale cellen geteeld op glas coverslips. De endotheliale cellen zijn semi-vereeuwigd menselijke beenmerg endotheliale cellen zoals beschreven in12.
- Werken in een steriele omgeving, jas coverslips met een overmaat van 0,01% poly-L-lysine gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Gecombineerd de poly-L-lysine-oplossing en laat de coverslips volledig drogen.
- Het uitvoeren van een telling van de levensvatbare endothelial cel met behulp van Trypan blauwe uitsluiting en een hemocytometer.
- 1 x 105 endotheliale cellen in 1 mL volledige Endothelial cel groeimedium bevattende de Supplement Mix aan de coverslips van poly-L-lysine-coated en laat de cellen groeien tot een enkelgelaagde overbrengen.
Opmerking: Het medium bevat groeifactoren waarmee cellen te vormen een enkelgelaagde en strakke kruispunten. - Zodra de cellen een enkelgelaagde vormen, zorgvuldig gecombineerd van het medium en voeg 1 mL verse medium te wassen van de cellen. Herhaal nogmaals het wassen. Voeg 50 µg PKH67-geëtiketteerden EVs en incubeer gedurende 4 uur.
Opmerking: Om te zoeken naar het optimale tijdstip voor opname, een tijd-cursus kan worden uitgevoerd. - Na 4 uur, gecombineerd het medium, en wassen van de cellen 3 keer met PBS te verwijderen overtollige en niet-afhankelijke EVs. Het herstellen van de cellen met de 3% paraformaldehyde-oplossing in PBS gedurende 15 minuten.
Opmerking: Methanol kan verstoren actine tijdens het proces van de fixatie; Daarom is het beste om te voorkomen dat eventuele methanol met fixatives of andere fixatives op basis van oplosmiddelen. Het is aanbevolen om gebruik van methanol-vrije formaldehyde als een hechtmiddel. - Wassen van de cellen 3 keer met PBS. Voeg zorgvuldig 250 µL van 0,1% Triton X-100 in PBS te permeabilize van de cellen. Incubeer bij RT gedurende 5 min.
- 3 keer wassen met PBS. Voeg 400 µL van blokkeerbuffer (5% BSA in PBS) gedurende 30 minuten op RT te blokkeren van niet-specifieke binding.
- Wassen van de cellen een keer met PBS. Bereid de kleurstofoplossing door verdunnen 5 µL van de stockoplossing van de phalloidin in 200 µL PBS/1% BSA per elke cover slip. Pipetteer 200 µL van de kleurstofoplossing op het dekglaasje aan en incubeer gedurende 20 min op RT.
- 3 keer wassen met PBS. Counterstain van het DNA voor 30 s met Hoechst 33342 op een eindconcentratie van 2 µg/mL in 200 µL van PBS.
- Wassen 2 x het dekglaasje aan door het toevoegen van 400 µL van PBS. Zorgvuldig het dekglaasje aan pak met een tang en omkeren van het op de bovenkant van een daling van antifade montage media op een glasplaatje. Verwijder voorzichtig het overtollige medium met een tissue en verzegelen van iedere kant met nagellak.
- Opslaan van de dia's beschermd tegen het licht bij 4 ° C.
- Visualiseren van de cellen met behulp van een confocal microscoop op laser excitaties 405, 488 en 543 nm en een 63 X, 1.3 nb olie doelstelling met fluorescerende emissies bij 450-470 nm (blauw), 505-530 nm (groen) en 620 nm.
Opmerking: Typische F-actine kleuring resultaten worden weergegeven in Figuur 1.
3. endothelial cel permeabiliteit
Opmerking: Endothelial cel permeabiliteit wordt beoordeeld door het meten van de overdracht van rhodamine B isothiocyanaat-dextran (gemiddelde MW 70.000) over de enkelgelaagde endothelial cel. Dextran biedt een uitstekend hulpmiddel om te bestuderen van vasculaire permeabiliteit.
- Levensvatbare endotheliale cellen tellen met behulp van 0,4% Trypan blauwe uitsluiting en een hemocytometer.
- Plaat de endotheliale cellen bij een dichtheid van 0,6 x 105 cellen tot samenkomst in 24-well weefselkweek insert (poriegrootte 0.4 µm) en verlof ongestoord gedurende ten minste 5 dagen om te vormen van gedifferentieerde monolayers. Vernieuw het medium elke tweede dag.
- Zodra de cellen een enkelgelaagde bereiken, laden de EVs (50 µg in 1 mL) op de bovenste kamer. De rhodamine-dextran toevoegen aan het hoogste goed op een eindconcentratie van 20 mg/mL. Incubeer de cellen bij 37 ° C met 5% CO2.
- Toezicht op de overdracht van de fluorescerende dextran aan de onderkant goed door het meten van de emissie van de fluorescentie van 40 µL middellange aliquots. Instellen van de multilabel microplate-lezer op 544 nm excitatie en 590 nm emissie voor metingen.
Nota: Het bedrag van diffuus dextran kan worden gekwantificeerd aan de hand kalibratiekrommen opgericht met de stockoplossing. Bovendien, kunnen kinetische experimenten worden uitgevoerd door het verwijderen van kleine steekproeven van het buitenste kamer medium tijdens een tijdsverloop (Figuur 2). Zelfs zonder behandeling, zal de dextran verspreiden via de cel enkelgelaagde.
4. bepalen van de gevoeligheid van de Puromycin
Opmerking: Voordat de transducing van de cellijnen met lentivirus, is het belangrijk om te bepalen van de curve van het doden van een geselecteerde drug voor die bepaalde cel-lijn. Om te bepalen van de minimale hoeveelheid drugs concentratie nodig zijn om te doden alle cellen, een dosis-respons experiment met behulp van incrementele doses van de geselecteerde drug uit te voeren. Omdat elke regel zoogdiercellen een andere gevoeligheid, voor experimenten heeft, moet de optimale concentratie van het antibioticum worden bepaald door de ontwikkeling van de titratie curve doden zoals hieronder beschreven.
- Met behulp van de hemocytometer cellen te tellen. Resuspendeer de endotheliale cellen bij een concentratie van 1 x 105 cellen/mL in volledige Endothelial cel groeimedium, met de aanvulling Mix.
- 1 x 10 bord4 cellen in een 96-wells-plaat in een eindvolume van 100 µL van het Endothelial cel groeimedium.
- Voeg 100 µL van medium met de antibiotica om te verkrijgen van een concentratie van 0,1-10 µg/mL (Zie Figuur 3).
- Bestuderen van de levensvatbaarheid van de cellen om de 2 dagen onder een lichte Microscoop met behulp van een 20 X doelstelling. Cultuur van de cellen voor 10-14 dagen en vervangt u het medium met puromycin elke 2-3 dagen afhankelijk van de celgroei.
- Voeg 10 µL per putje MTS reagens in elk putje, mix, en incubeer gedurende 4 uur bij 37 ° C in standaard cultuuromstandigheden.
- Schud de plaat kort op een shaker en meten van de extinctie van behandeld en onbehandeld cellen met behulp van een afleesapparaat op 490 nm (Figuur 3).
5. transductie van endotheliale cellen met lentivirale Vector
- 5 endotheliale cellen van de plaat 1 x 10 in 1 mL volledige voedingsbodem eergisteren transductie. Transductie uitvoeren wanneer de cellen hebben 50-80% confluentie bereikt.
- Ontdooi de lentivirus op ijs, en maken aliquots van de virale voorraden om te voorkomen dat cycli bevriezen-ontdooien. Spin van het materiaal bij 200 x g voor 30 s, in buizen alvorens te openen om te voorkomen lekkage.
- Hexadimethrine bromide (en) toevoegen aan de cellen op een eindconcentratie van 8 µg/mL.
Opmerking: Hexadimethrine bromide (en) helpt de doelmatigheid van de signaaltransductie, maar in sommige gevallen kan het zijn giftig voor de cellen. Daarom is de optimale concentratie moet worden bepaald door het uitvoeren van een curve doden voordat de signaaltransductie. - Swirl de plaat voorzichtig te mengen. Voeg de juiste hoeveelheid van virale deeltjes (tussen 0,5-2 x 106 deeltjes) op een geschikte veelvoud van infectie (MOI) en de plaat gedurende 30 zachtjes swirl s te mengen.
- Centrifugeer de mix van de cel-virale deeltjes in de centrifuge op RT voor 45 min bij 300 x g de signaaltransductie-efficiëntie te verhogen. Incubeer de cel-virale deeltjes mengsel bij 37 ° C's nachts.
- Verwijder zorgvuldig het virale deeltjes-bevattende medium en op de juiste wijze verwijderen. Verse, voorverwarmde kweekmedium volledig te vervangen.
- Begin de selectie met een puromycin op de tweede dag: het medium verwijderen en vervangen door verse medium met de juiste concentratie van puromycin, eerder bepaald in punt 4 (Figuur 3).
- Oogsten van cellen na puromycin selectie en isoleren van RNA met behulp van een RNA isoleren kit na instructies van de fabrikant.
- Uitvoeren van cDNA synthese met de geselecteerde miRNAs met behulp van een omgekeerde transcriptie kit (Zie de Tabel van de materialen).
- De reactie van de qPCR volgens het genoemde protocol13instellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We beschrijven hier protocollen voor het onderzoek naar de interacties van EVW met cellen van de gastheer. De opname van fluorescently geëtiketteerde EVs wordt gecontroleerd door confocale microscopie (Figuur 1). EVs, duren endotheliale cellen efficiënt maar de incubatietijd met EVs kan worden geoptimaliseerd voor het bijhouden van de opname. Voor een betere localisatie van het EVW in de cellen, vlek actine met phalloidin. Vervolgens gebruiken we een membraan van de filter op de top van die een enkelgelaagde endotheliale cellen groeit. Rhodamine B isothiocyanaat-dextran wordt toegepast op de bovenste kamer van het membraan filter en vervolgens de permeabiliteit van het endotheel monolayer wordt gemeten door het toezicht op de omzetting van de fluorescerende dextran in de onderste zaal (figuur 2A). Meestal wordt de doorlaatbaarheid van de endotheliale cellen beïnvloed na incubatie met een toenemende hoeveelheid EVs (figuur 2B). Het is belangrijk om te groeien van de cellen gedurende een aantal dagen om ervoor te zorgen dat vormen ze een enkelgelaagde, anders die de kleurstof zal snel verspreiden via de putten. Het is belangrijk op te merken dat zelfs zonder behandeling, de dextran zal diffuse langzaam via de cel enkelgelaagde.
MicroRNAs zijn belangrijke onderdelen van het EVW en na overdracht aan de ontvangende cellen, zij regelen genexpressie. Om te onderzoeken specifiek de rol van miRNAs, is het zeer nuttig om te overexpress ze in de cellijn van de ontvangende. Hier beschrijven we hoe transduce miRNAs in endotheliale cellen. De eerste stap bestaat uit de bepaling van de concentratie van puromycin dat endotheliale cellen doodt om stabiel getransduceerde cellen (figuur 4A) selecteren. Tot slot, het niveau van expressie van het miRNAs kan worden gecontroleerd en gevalideerd door de qPCR (figuur 4B).
Figuur 1: EVs worden overgenomen door endotheliale cellen. Gezuiverde EVs waren gelabeld in groen met PKH67 en bebroede gedurende 4 uur met een enkelgelaagde endotheliale cellen. Onbehandelde endotheliale cellen worden gebruikt als een negatieve controle. Na het uitgebreide wassen als u wilt verwijderen niet-afhankelijke EVs, werden de cellen gekleurd met phalloidin om vlek actine (rood) en Hoechst 33342 om vlek de kern (blauw). De cellen werden waargenomen door confocale microscopie. Beelden werden genomen met behulp van een laser confocal microscoop en een doelstelling van 63 x 1.3 nb olie. Hoechst 33342 is enthousiast op 405 nm en met uitstoot verzameld op 450-470 nm (blauw); PKH67 is enthousiast op 488 nm, uitstoot verzameld op 505-530 nm (groen); en Phalloidin-594 is enthousiast op 543 nm, uitstoot verzameld op 620 nm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Effect van EV opname op endotheel barrière. (A) Schematische voorstelling van de verspreiding van rhodamine-geëtiketteerden dextran: endotheliale cellen worden gekweekt tot samenkomst op de bovenkant van een membraan filter, de fluorescerende dextran wordt toegepast op de bovenste kamer en diffundeert na verloop van tijd door het membraan. Het effect van het EVW op permeabiliteit is na de toevoeging van het EVW aan de bovenste kamer geëvalueerd door het meten van de snelheid van diffusie van de dextran naar de onderste kamer. (B) een verhoging van de hoeveelheid van het EVW worden geïncubeerd met endotheliale cellen. De overdracht van rhodamine-geëtiketteerden dextran over een trans-well membraan na verloop van tijd voorziet permeabiliteit metingen. Permeabiliteit over de endothelial laag is aanzienlijk verhoogd na 2 uur incubatie met 50 en 100 µg/mL van het EVW. Gegevens zijn gemiddelde (± s.e.m.) van 3 experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: titratie van puromycin. De stockoplossing van puromycin (10 mg/mL) verdund in RPMI 1640 aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd (56 ° C, 30 min) foetaal kalfsserum 2 mM glutamine, 1 mM natrium pyruvaat, 100 U/mL penicilline/streptomycine. Een totaal van 15 µL wordt toegevoegd aan 10 mL medium in buis A. Dan wordt 7,5 mL van de oplossing van buis A gemengd tot 2,5 mL van RPMI aan buis B. Tot slot worden 100 µL van de verdunning toegevoegd aan 100 µL van cellen om een eindconcentratie van 7,5 µL/mL, 5.62 µL/mL, enzovoort. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: generatie endotheliale cellen overexpressing miR451a. (A) bepaling van de curve van de doden van de puromycin op de endotheliale cellen. Endotheliale cellen werden geïncubeerd met puromycin bij toenemende doses. De levensvatbaarheid werd gemeten door MTS assay na 72 uur. De gegevens vormen het gemiddelde (± s.e.m.) van één vertegenwoordiger experiment. (B) RNAs afgeleid van endotheliale cellen overexpressing miR451a of een negatieve controle zijn geoogst en de tekst van de miR451a werd gekwantificeerd door Real-Time PCR. qPCR resultaten zijn genormaliseerd door de 2-Ct-methode met behulp van U6 als een huishoudster gen en uitgedrukt als betekenen (± s.e.m.) (n = 3 experimenten). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verscheidene parasieten, waaronder Toxoplasma, Leishmania, Trypanosoma en Trichomonas leiden tot de release van het EVW door de geïnfecteerde gastheercel. Afhankelijk van de ziekteverwekkers, kunnen de vrijgegeven EVs moduleren van de immuunrespons van de gastheer of cellulaire communicatie tussen de parasieten6bemiddelen. Toch is er weinig aanwijzingen hoe deze kleine blaasjes bijdragen aan de ziekte malaria. Hier hebben we verschillende manieren om te onderzoeken van de functie van het EVW tijdens Plasmodium infectie beschreven. Bijvoorbeeld, kan de opname van het EVW door ontvangende cellen in vivo doeltreffend worden gecontroleerd door hen te labelen met de PKH67 fluorescerende kleurstof. Verschillende controles moeten worden uitgevoerd teneinde de specificiteit van de labeling. Het is belangrijk op te merken dat zodra gemengd met de verdunningsmiddel C, de kleurstof PKH67 neiging om vorm aggregaten, en daarom is het noodzakelijk om een besturingselement met de kleurstof alleen zonder EVs om de niet-specifieke kleuring. Confocale microscopie is de methode van keuze om te differentiëren tussen blaasjes gebonden aan de oppervlakte en echt door de ontvangende cellen worden geïnternaliseerd. Daarnaast biedt het een uitstekend hulpmiddel als u wilt bijhouden en controleren van het aantal blaasjes in beslag genomen door de cellen. Het blijft echter onduidelijk hoe EVs worden verwerkt in de ontvangende cellen14; Dus, het uitvoeren van een tijd-cursus met behulp van tijd-punten voor 2, 4 en 8 h, zeer nuttig om te bepalen van de optimale voorwaarden voor opname kan worden. De toevoeging van subcellular compartiment markers kan worden gebruikt voor het bijhouden van het EVW in de cellen door confocale microscopie. EV opname heeft aangetoond dat het optreden via membraan fusion of endocytose15. De fusie kan door labeling EVs met octadecylmethacrylaat rhodamine B (R18) worden gecontroleerd. De fusie van het EVW met de resultaten van de cellulaire membranen in de verdunning van R18, die tot een verhoging van fluorescentie16 leidt. Opname van het EVW door endocytose kan bestudeerd worden met behulp van specifieke remmers van actine, microtubulus en dynamin10.
Om te bestuderen van de Fysiologie van het EVW, kan het label van de iRBCs rechtstreeks met de PKH kleurstoffen en samen de cultuur van de iRBCs met endotheliale cellen. Het probleem hier is dat de cellen verschillende media vereisen en gas composities en de hoeveelheid EV overdracht mogelijk is er onvoldoende. Bovendien, vesiculaire eiwitten, gesmolten met een fluorescerende tag kunnen worden uitgedrukt in de donor cellen in vitro en in vivo. Echter, tot nu toe het is niet getest met iRBCs
Geïnfecteerde RBC zijn cytoadherent aan de microvasculature van de hersenen, in een proces beschouwd als verantwoordelijk voor het veroorzaken van cerebrale malaria17. Daarom is de overdracht van parasiet materiaal via EVs endotheliale cellen en vandaar vasculaire functie18invloed zouden kunnen zijn. De in vitro -assay hier beschreven, biedt een makkelijke manier te onderzoeken enkele van de fundamentele eigenschappen van endotheliale cellen, zoals bijvoorbeeld de permeabiliteit19. Aanvullende proef zoals TEER of immunokleuring met ZO-1 bieden meer informatie over de strakke junction integriteit10.
Bovendien is het in vitro model blijkt te zijn een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen achter de cellulaire communicatie tussen parasieten en gastheer cellen. Naast opname, deze opstelling toe het onderzoek naar de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij dit proces. Bijvoorbeeld, hebben wij de overdracht van miR451a aan de cellen van de acceptor door Real-Time PCR en fluorescente in situ hybridisatie gecontroleerd. Daarnaast beschrijven we hoe te genereren van overexpressing een bijzondere miRNA, direct aan de rol van deze kleine RNA in vasculaire functie10cellijnen. Echter, verschillende besturingselementen moeten worden uitgevoerd met inbegrip van tests van niet-getransduceerde cellen, aangezien de signaaltransductie zelf invloed kan zijn op de cellulaire functie. Bovendien kunnen de miRNA remmers te neutraliseren van het effect van de miRNAs worden gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd financieel gedeeltelijk ondersteund door de Stichting Novartis voor medisch - biologisch onderzoek (naar PYM), de Gottfried en Julia Bangerter-Rhyner-Stiftung (aan MW en PYM) en het zwembad van het onderzoek van de Universiteit van Freiburg (naar PYM). Aanvullende rechten omvatten de Zwitserse regering Excellence beurzen voor buitenlandse geleerden (KAB en SM). Wij danken Isabelle Fellay en Solange Kharoubi Hess voor technische ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich | G8278 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| PBS | ThermoFisher - Gibco | 10010023 | |
| Phalloidin CF594 | Biotium | #00045 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | ThermoFisher | R9379-250MG | |
| Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells | Falcon | 353095 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | Promocell | C-22020 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit | Biovision | K300-500 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| MISSION Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a | Sigma-Aldrich | HLMIR0583 | |
| MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles | Sigma-Aldrich | NCLMIR001 | |
| MISSION Lenti microRNA, Human | Sigma-Aldrich | NCLMIR0001 | |
| Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| miRNeasy mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions | ThermoFisher | 4366597 | |
| hsa-mir-451a RT/750 PCR rxns | ThermoFisher | 001141 | |
| U6 snRNA | ThermoFisher | 001973 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, with UNG | ThermoFisher | 4440038 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | ThermoFisher | 4376600 |
References
- WHO. WHO Malaria Report 2015. , (2015).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
- Mantel, P. Y., Marti, M. The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan parasites. Cell Microbiol. 16 (3), 344-354 (2014).
- Couper, K. N., et al. Parasite-derived plasma microparticles contribute significantly to malaria infection-induced inflammation through potent macrophage stimulation. PLoS Pathog. 6 (1), e1000744 (2010).
- Schofield, L., Grau, G. E.
- Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
- Regev-Rudzki, N., et al. Cell-cell communication between malaria-infected red blood cells via exosome-like vesicles. Cell. 153 (5), 1120-1133 (2013).
- Szempruch, A. J., et al. Extracellular Vesicles from Trypanosoma brucei Mediate Virulence Factor Transfer and Cause Host Anemia. Cell. 164 (1-2), 246-257 (2016).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Mantel, P. Y., et al. Infected erythrocyte-derived extracellular vesicles alter vascular function via regulatory Ago2-miRNA complexes in malaria. Nat Commun. 7, 12727 (2016).
- Mbagwu, S., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. Production and Characterization of Extracellular Vesicles in Malaria. Methods Mol Biol. 1660, 377-388 (2017).
- Schweitzer, K. M., et al. Characterization of a newly established human bone marrow endothelial cell line: distinct adhesive properties for hematopoietic progenitors compared with human umbilical vein endothelial cells. Lab Invest. 76 (1), 25-36 (1997).
- Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. J Vis Exp. (98), (2015).
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- French, K. C., Antonyak, M. A., Cerione, R. A. Extracellular vesicle docking at the cellular port: Extracellular vesicle binding and uptake. Semin Cell Dev Biol. 67, 48-55 (2017).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
- Idro, R., Jenkins, N. E., Newton, C. R. Pathogenesis, clinical features, and neurological outcome of cerebral malaria. Lancet Neurol. 4 (12), 827-840 (2005).
- Jambou, R., et al. Plasmodium falciparum adhesion on human brain microvascular endothelial cells involves transmigration-like cup formation and induces opening of intercellular junctions. PLoS Pathog. 6 (7), e1001021 (2010).
- Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).
