Summary
On introduit une méthode pour l’épiploïques transplantation d’îlots dans une souris. Les îlots sont mélangés avec hydrogel et le mélange est placé dans la pochette omentaux de souris diabétique. Ensuite, la glycémie est contrôlée et l’analyse immuno-histochimique est réalisée.
Abstract
La transplantation d’îlots a été proposée pour être un traitement potentiel pour le diabète de type 1. Des preuves convaincantes récente indiquent qu’îlot intravasculaire infusion est loin d’être idéale et par conséquent, l’épiploon est ré-émergent comme un site potentiellement intéressants pour la transplantation d’îlots. Cette expérience nécessite l’isolement des îlots de haute qualité et l’implantation des îlots aux personnes diabétiques. Transplantation à l’épiploon requiert des étapes chirurgicales qui peuvent mieux démontrer visuellement. Ici, les étapes détaillées pour cette procédure sont présentés. Deux méthodes de mélange des îlots isolés avec hydrogel avant de placer le mélange dans la poche épiploïques des souris diabétiques sont décrites ici. Hydrogels différents sont utilisés pour les différentes conditions. Le taux de glucose sanguin des récipiendaires de souris diabétiques des îlots syngéniques dans l’épiploon ont été suivi pendant 35 jours. Certains animaux ont été sacrifiés après 14 jours pour réaliser une analyse immunohistochimique. Cette approche de transplantation préclinique peut servir de données préliminaires menant à la traduction de transplantation clinique.
Introduction
Selon la Fédération internationale du diabète (FID), mellitus de diabète touche actuellement 382 millions de personnes, avec une augmentation prévue à 592 millions de personnes par 20351. Dans les deux greffes d’îlots xénogéniques et allogéniques, traitement immunosuppresseur systémique est nécessaire. Sans immunosuppression, rejet immunitaire est une cause majeure de perte de greffon2. Il y a aussi un grave problème de perte des îlots transplantés en raison du sang immédiate médiée par réaction inflammatoire (IBMIR)3,4. Cependant, même en l’absence d’une réponse immunitaire comme syngéniques ou modèles auto-transplantation, des cellules des îlots transplantés dans le foie via la veine porte sont perdues en raison d’une inflammation et/ou à des conditions environnementales défavorables, tels que le mauvais sang d’alimentation avec oxygénation réduite et/ou nutriments5,6. Ainsi, afin d’assurer des fonctions métaboliques à long terme, îlot des nombres plus élevés sont nécessaires pour compenser la perte de la cellule initiale qui réduit la prise de greffe7.
Dans le but d’optimiser la greffe d’îlots pancréatiques, plusieurs sites anatomiques alternatifs ont été étudiées expérimentalement ainsi que sur le plan clinique, avec prometteur, encore non définitif résultats8. Considérant que certains des sites alternatifs offrent un accès facile et sûr (par exemple., la peau, capsule rénale, sous-muqueuse gastrique et la chambre antérieure de le œil) ou une surface plus large pour les plus grandes masses d’îlot (e.g., cavité péritonéale), survie et physiologiques rendement métabolique des îlots transplantés sont encore limitée et demeurent une préoccupation9. La recherche d’un site plus approprié pour la greffe d’îlots pancréatiques est en cours.
L’épiploon était parmi les nombreux sites anatomiques qui ont été étudiés dans le développement de la transplantation d’îlots et s’est avérés un environnement fructueux pour les îlots10,11,12,13, 14. Cependant, perfusion intraporte îlot est devenu la raison choice clinique en partie à la relative simplicité de la procédure, et le succès rapide des animaux modèles6. Aussi, en partie, les négatifs associés avec ce site, perte d’îlot précoce particulièrement massive, étaient moins connus et moins contraignante dans les premiers jours de la transplantation d’îlots expérimentale que le champ est arrivée à échéance. Avec les plus récentes preuves convaincantes indiquant que la perfusion intravasculaire îlot est loin d’être idéale, l’épiploon est ré-émergent comme un site potentiellement intéressants pour la transplantation de cellules.
L’épiploon (sous la forme d’une poche épiploïques) offre des avantages relatifs sur le foie15,16. Elle est très vascularisée et facilement accessible. Il permet la récupération de la prothèse (si nécessaire) et/ou une biopsie. La période ischémique vécue par les îlots est réduite par rapport au foie, et l’épiploon peut accepter relativement masses grand îlot qui n’est pas possible au, où une augmentation de la pression portale peuvent entraîner des complications.
Un modèle de souris syngénique des greffes a été utilisé dans le protocole testé dans l’étude, qui emploient les souris C57BL/6 mâles entre 6 à 8 semaines avec un poids de 20 – 25 bénéficiaires îlot g. ont été rendus diabétiques avec une seule injection de streptozotocine avec une dose de 250 mg/kg ip. L’induction du diabète peut être considéré comme réussie si le niveau de glucose sanguin de la souris est supérieur à 24 mmol/L 48 h après l’injection et se maintient au-dessus de ce niveau pendant au moins 5 jours.
Syngéniques îlots ont été isolés par le pancréas des donneurs appariés selon l’âge suivant des méthodes publiées antérieurement avec quelques modifications. En bref, la collagénase a été injecté dans la vésicule biliaire au lieu de la voie biliaire. Cela a été fait comme une amélioration pour faciliter l’injection. Infusion de collagénase a été suivie de l’incubation, perturbation du tissu, séparation gradient de densité et de cueillette à la main pour obtenir des îlots pures. Îlots ont été cultivées pendant la nuit dans un milieu CMRL-1066 additionné de 10 % inactivés par la chaleur bovine sérum fœtal (SVF) dans des flacons de T175 à 37 ° C, moins 95 % de l’air - 5 % CO2 avant la transplantation.
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Protocol
Toutes les souris utilisées dans cette étude proviennent de la Province médicale Animal Center du Guangdong. L’utilisation des animaux a été approuvée par hôpital l’éthique examen Comité de Shenzhen deuxième populaire, conformément aux principes du bien-être animal.
1. Transplantation d’îlots pancréatiques de l’épiploon
Remarque : Ce protocole nécessite 2 personnes à accomplir.
- Assembler des matériaux chirurgicaux qui sont énumérés au tableau 1. Préparer le champ aseptique dans domaine chirurgical stérile matériaux tels que des rideaux et produits jetables et maintenir des conditions d’asepsie tout au long de la chirurgie. Stériliser tous les instruments chirurgicaux. Porter des robes de chambre stériles.
- Choisissez les îlots à l’aide d’une pointe de pipette 200 µL sous le stéréomicroscope. Chaque souris recevra 450 – 500 îlots équivalents (IEQ) par tansplant. Pour chaque animal, placer suffisamment îlots pour une greffe unique dans un tube stérile de 1,5 mL à casser-dessus avec 100 µL de milieu CMRL-1066.
Remarque : Les îlots peuvent être isolés sur le jour de la transplantation, mais il est préférable d’isoler la veille pour permettre la récupération pour le processus d’isolement. - Garder les lampes casser-dessus avec îlots sur la glace jusqu’au moment de la transplantation.
- Décongeler la membrane basale matrice hydrogel et gardez-le sur la glace après son retrait du congélateur-20 ° C. L’hydrogel est liquide à 4 ° C à 10 ° C et se solidifie à des températures plus élevées.
- Peser et marquer toutes les souris diabétiques de destinataire. Injecter le pentobarbital sodique de 60 mg/kg par voie intrapéritonéale. Test le la profondeur de l’anesthésie par l’administration d’un pincement de l’orteil. Donner un pentobarbital sodique de 10 mg/kg supplémentaires si l’animal réagit à la pincée. Si il n’y a aucun retrait réflexe, le niveau de l’anesthésie est correct pour la chirurgie.
- Tamponner le site chirurgical sur l’abdomen à l’aide d’éthanol à 70 %. Se raser les cheveux sur le site avec une lame de razer et désinfecter la zone avec iodophore. Administrer vétérinaire onguent pour les yeux à prévenir le dessèchement tandis que sous anesthésie.
- Utiliser les ciseaux ophtalmiques pour ouvrir l’abdomen le long de la médiane de l’abdomen par une incision de 4 à 5 cm. déplacer les intestins vers le côté gauche et couvrir avec une gaze imbibée saline pour prévenir la déshydratation excessive au cours de la procédure de chirurgie.
- Utiliser des cotons-tiges pour exposer le champ visuel de l’estomac puis Localisez l’épiploon (situé sous l’estomac). Utiliser deux paires de pinces fines à distendre l’épiploon. Prendre soin d’éviter d’endommager de déchirement.
- L’hydrogel est complètement décongelée à ce stade. Tourner le tube avec les îlots de 30 s à 200 x g et enlever le surnageant. Aspirer 50 µL d’hydrogel, ajoutez-le dans le tube contenant les îlots et remettre en suspension le mélange doucement en évitant la formation de bulles. Garder les tubes sur la glace lors de la procédure.
- Utiliser deux paires de pinces pour ramasser les bords de l’épiploon et soulevez doucement pour former un sillon entre la paroi gastrique et l’intestin qui peut accueillir un petit volume de liquide avec la greffe d’îlots pancréatiques.
- Laissez la seconde personne assister dans la procédure et aspirer le mélange resuspendues îlot-hydrogel (tout le contenu du tube) avec une pointe de pipette de 200 µL, délivrer le contenu dans la rainure.
- Veiller à ce que le mélange est bien positionné dans la rainure en élevant ou en abaissant les bords de l’épiploon doucement. Positionnement du mélange moins de 3 min avant l’hydrogel complète se solidifie sous l’effet de la température corporelle. Après que l’hydrogel définit, plier l’épiploon pour couvrir la prothèse.
NOTE : l’épiploon va adhérer à la paroi gastrique environnante comme l’hydrogel se solidifie. - Après que l’hydrogel est complètement solidifié, utiliser cotons-tiges pour repositionner les intestins dans la cavité abdominale, en prenant soin de ne pas pour toucher le site de la transplantation.
- Ajouter 20 µL de céphalosporine (5 ~ 10 mg) dans la cavité abdominale pour prévenir l’infection, puis utilisez la suture 4-0 pour fermer l’abdomen.
- Retourner la souris à sa cage et répétez toutes les étapes pour chaque destinataire de la souris. Réchauffer les souris et surveiller visuellement jusqu'à ce qu’ils reprennent pleinement conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal. Séparer les souris des autres animaux jusqu'à ce qu’ils ont pleinement récupéré.
- Injecter 50 µL de céfazoline sodique (0,05 mg/mL) chaque jour pendant une semaine en prophylaxie post-opératoire. Administrer Bupivicaine + buprénorphine, c'est-à-dire appliquer 1 à 3 gouttes de 0,25 % Bupivicaine sur le site de l’incision par voie topique avant la pose de clips de la plaie. Administrer Buprenorphine(0.03 mg/ml with sterile 0.9% saline, 0.05-0.10 mg/kg) par voie intrapéritonéale (IP).
- Mesurer le niveau de glucose de sang non-jeûne auprès d’un échantillon de sang de la veine caudale à l’aide d’un lecteur de glycémie une fois par jour après la transplantation. En transplantant à l’épiploon, la greffe d’îlots pancréatiques peut avoir une fonction de retardée et n’atteint pas un niveau de glycémie tout à fait normal pendant 2 – 3 semaines.
- Pour histologie, retirer la prothèse omentaux de la souris à la fin de l’expérience après la transplantation. Fixer le tissu selon les protocoles histologiques. La prothèse peut être analysée pour études immunostaining ou immunofluorescence.
2. autre méthode destinés à la Transplantation de l’épiploon
Remarque : Un hydrogel de fibrine-thrombine alternatif qui est utilisé à la température ambiante peut se substituer à la membrane basale matrice hydrogel. Il se compose de 2 éléments, une solution de protéine de fibrine scellant (50 U/mL thrombine et le fibrinogène de 10 mg/mL). Lorsque les composants sont mélangés, ils forment un caillot qui maintient les îlots en place.
- Utiliser la fibrine-thrombine hydrogel composé à température ambiante. Comme à l’étape 1.2, chaque souris recevra 450 – 500 îlots d’équivalents (IEQ) par greffe. Placer les îlots dans un tube stérile de 1,5 mL de casser-dessus avec 100 µL de milieu CMRL-1066. Immédiatement avant la transplantation, aspirer les îlots dans un tuyau PE50 stérile pour une longueur de 10 cm et centrifuger doucement (30 s à 200 x g) pour former une boulette de lâche.
- Préparer l’animal comme indiqué ci-dessus (étapes 1,5-1,8) avec l’épiploon étalé. Mélanger les composants hydrogel (10 µL/chacun) et le placer sur l’épiploon. (Figure 3D)
- Immédiatement expulser les îlots de la tubulure sur l’hydrogel. L’hydrogel forme un caillot autour des îlots. (Figure 3E)
- Repliez l’épiploon l’hydrogel et les îlots pour former une pochette. (Figure 3F) Suivez les étapes 1.13 à 1,18.
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Representative Results
Post-digestive état du pancréas est montré dans la Figure 1 a. Îlots purifiées sont indiquées dans la Figure 1 b. Dithizone coloration et viabilité des îlots sont indiquées à la Figure 2. Les principales étapes de la transplantation d’îlots à l’épiploon sont indiquées à la Figure 3. Le taux de glucose sanguin des destinataires après transplantation épiploïques est indiqué à la Figure 4. L’analyse histologique des greffes est montré dans la Figure 5.
Figure 1 : Isolement de digestion et îlots de pancréas. (A) du pancréas suite à la digestion. Notez les particules de sable dans la suspension. (B) les image de microscopie photonique des îlots après l’isolement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Îlot dithizone coloration et fluorescence viabilité des colorants. (A) îlots sont colorées en rouge par dithizone. (B) microscopie optique. (C) l’iodure de Propidium fluorescence une coloration rouge (cellules mortes). (D) Calcéine-AM green coloration (cellules viables). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Transplantation dans l’épiploon. (A) après la destinataire laparotomie, affleure l’estomac et l’épiploon situé. (B) îlots sont mélangés en hydrogel et lentement placés sur le tissu épiploïques. (C) îlot greffer à fort grossissement. L’hydrogel est un état semi-solidifié. Méthode Alternative (D). Hydrogel est placée sur l’épiploon sans ilots. (E) îlots sont placés sur le dessus de l’hydrogel. (F), l’épiploon est plié autour des îlots. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Blood glucose niveaux suivant la transplantation. Non-le jeûne des taux de glucose sanguin des bénéficiaires (n = 7) jusqu'à 35 jours après la transplantation. Les receveurs de greffe pas tous recevaient le même lot d’îlots il y a des différences dans la qualité et de fonctionnement, ce qui entraîne des fluctuations importantes dans les taux de glycémie.
Figure 5 : Histology. Sections de greffe (greffe récupération 14 jours après la transplantation) ont été colorées au DAPI (noyaux), anticorps anti-insuline anti-souris et l’hématoxyline. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Transplantation d’îlots pancréatiques pour le foie via la veine porte est la plus couramment utilisée méthode de transplantation d’îlots pancréatiques chez l’homme, mais il y a encore des préoccupations de l’efficacité et la sécurité comme veine thrombose et foie stéatose17. Des études récentes montrent que l’épiploon peut être une alternative appropriée pour le foie, mais des efforts supplémentaires de recherche à effectuer avant la traduction clinique12,14,18,19.
La souris est un modèle approprié pour l’essai de l’épiploon comme un site pour la transplantation d’îlots. Chez la souris, l’épiploon est situé sous la paroi de l’estomac et est généralement plié. Cependant, la taille de l’épiploon chez la souris est petite et difficile d’accès. Afin de l’utiliser pour la transplantation, il faut doucement l’étaler à sa taille complète puis pliez-le après que le mélange des îlots/hydrogel est déposé. Chez un animal plus gros, le tissu épiploïques est plus large et peut être suturé pour construire un ou plusieurs sachets dans lequel sont déposés les îlots. L’épiploon souris est fragile et n’accepte pas facilement les sutures sans risque de bris. Pour cette raison, un hydrogel est utilisé pour faire la pochette sans sutures.
Dans la première méthode (étapes 1.1 – 1.18), l’hydrogel utilisé est une matrice de la membrane basale et se compose de laminine, collagène IV et facteurs de croissance. Elle se solidifie comme il chauffe à la température du corps. Dans la deuxième méthode (étapes 2.1 – 2.4), un hydrogel différent est utilisé composé de 10 mg/mL fibrinogène et de thrombine 50U/mL. Deux hydrogels différents sont utilisés pour montrer la polyvalence de cette technique. Il peut être adapté pour s’adapter à beaucoup de circonstances et d’établir la preuve de principe. Pour des applications cliniques, si une poche suturée ou un hydrogel de cliniques de qualité est utilisé, la technique peut être combinée avec une approche mini-invasive, (e.g., une méthode endoscopique de la livraison à l’épiploon). Dans ce but, des études supplémentaires à l’aide de modèles précliniques de plus grands mammifères sont nécessaires.
Le temps de normaliser le taux de glucose sanguin chez les receveurs de souris après la transplantation dans l’épiploon dans notre ainsi que d’autres études suggèrent que les îlots dans l’épiploon nécessitent un peu plus longtemps pour atteindre une production suffisante d’insuline. Efficacité de revascularisation semble être un facteur important, comme indiqué dans l’étude. Si la présence d’un hydrogel influe sur la vitesse de revascularisation de l’îlot et de performance, qui reste à déterminer.
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Disclosures
Les auteurs ne rapportent aucun conflit d’intérêt.
Acknowledgments
Certains des auteurs de ces travaux appuyés en partie par des subventions du National clé de R & D programme de la Chine (2017YFC1103704), Sanming projet de médecine à Shenzhen (SZSM201412020), fonds de haut niveau médical Discipline Construction de Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425110110658), fondation de Shenzhen de la santé et de la Commission de planification familiale (SZXJ2017021).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 5 inch (12-13 cm) Scissors | RWD Life Science | S12030-11 | |
| Fine Forceps | RWD Life Science | F11010-13 | |
| Small wound clips | RWD Life Science | R33003-01 | |
| Acutenaculum | RWD Life Science | F31044-13 | |
| 2 pair tissue forceps | RWD Life Science | F13023-10 | |
| 4-0 Suture with needle | Chenghe, China | 17094 | |
| 200 μL Pipette and tips | Gilson | PN11 | |
| One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| razor blade | Philips | HC1099/15 | |
| Material and animals | |||
| Pentobarbital Sodium | Sigmaaldrich.com | P3761 | For anesthesia |
| Hydrogel | bdbiosciences.com | 356234 | Basement Membrane Matrix |
| Fibrin-Thrombin Hydrogel | Baxter.com | 1501250 | Components clot when mixed |
| 70% Ethanol | Yingniu medical, Anhui, China | 23170608 | |
| Iodophor | Lierkang medical technology, Shangdong, China | 170521 | |
| Normal saline | Baxter.com | 2B1324 | |
| Cephalosporin | Lukang medical, Shangdong, China | 150303 | |
| Cefazolin | Baxter.com | 2G3508 | |
| lubricant eye ointment | Major Pharmaceuticals | 203964 | |
| streptozotocin | Sigmaaldrich.com | S0130 | |
| collagenase Type V | Sigmaaldrich.com | C9262 | |
| CMRL-1066 media | celltrans, Wenzhou, China | X018D1 | |
| histopaque | Sigmaaldrich.com | 10771 | density gradient |
| PE50 tubing | Braintreesci.com | PE50 100 FT | Polyethylene .023" x .038 |
| Calcein AM | Sigmaaldrich.com | C1359 | |
| Propidium iodide | Sigmaaldrich.com | P4864 | |
| optimal cutting temperature compound (OCT) | Tissue-Tek; Miles, Naperville, IL | 4583 | embedding medium |
| insulin antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 8138S | |
| hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 14166S | |
| eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc. | D1306 | |
| C57Bl/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | / | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| T175 flasks | Falcon | 353112 | |
| 1.5 mL Snap-top tubes | Axygen | MCT-150-C |
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