Summary
È stato introdotto un metodo per il trapianto omentale di isolotti in un mouse. Gli isolotti isolati sono mescolati con idrogel e la miscela viene inserita nel sacchetto omentale di un topo diabetico. Quindi, il glucosio nel sangue è controllato e viene eseguita l'analisi immuno-istochimica.
Abstract
Trapianto dell'isolotto è stato proposto per essere un potenziale trattamento per il diabete di tipo 1. Convincente la prova recente indica che l'infusione intravascolare isolotto è tutt'altro che ideale e di conseguenza, l'omento sta riemergendo come un sito potenzialmente importante per trapianto dell'isolotto. Questo esperimento richiede l'isolamento degli isolotti di alta qualità e l'impianto degli isolotti ai destinatari diabetici. Trapianto al omento richiede passaggi chirurgiche che possono essere meglio dimostrati visivamente. Qui, vengono presentati i passaggi dettagliati per questa procedura. Qui sono descritti due metodi di miscelazione isolotti isolati con idrogel prima di mettere la miscela nel sacchetto omentale di topi diabetici. Idrogeli differenti sono utilizzati per le diverse condizioni. Livelli di glucosio nel sangue dei destinatari di topo diabetico di isolotti syngeneic nell'omento sono stati controllati per fino a 35 giorni. Alcuni animali sono stati sacrificati dopo 14 giorni per eseguire analisi immuno-istochimica. Questo approccio pre-clinica di trapianto può essere utilizzato come dati preliminari che portarono alla traduzione a trapianto clinico.
Introduction
Secondo l'International Diabetes Federation (IDF), diabete mellito colpisce attualmente 382 milioni di persone, con un aumento previsto di persone 592 milioni di 20351. In entrambi trapianto di insule pancreatiche allogeniche e xenogeniche, terapia immunosoppressiva sistemica è necessaria. Senza immunosoppressione, rigetto immunitario è delle principali cause di perdita di innesto2. C'è anche un significativo problema di perdita dell'isolotto trapiantato dovuto il sangue istantaneo mediata reazione infiammatoria (IBMIR)3,4. Tuttavia, anche in assenza di una risposta immunitaria come syngeneic o modelli di auto-trapianto, cellule delle isole trapiantate nel fegato tramite la vena portale sono persi a causa di infiammazione e/o a condizioni ambientali sfavorevoli, come sangue povero alimentazione con ridotta ossigenazione e/o sostanze nutritive5,6. Di conseguenza, al fine di garantire a lungo termine funzione metabolica, numeri più alti dell'isolotto sono necessari per compensare la perdita di cellule iniziali che riduce il engraftment7.
Nel tentativo di ottimizzare attecchimento dell'isolotto, diversi siti anatomici alternativi sono stati studiati sperimentalmente come pure clinicamente, con promettenti, ma non definitivo risultati8. Considerando che alcuni dei siti alternativi offrono un accesso facile e sicuro (ad es., pelle, capsula del rene, submucosa gastrico e camera anteriore dell'occhio) o una superficie più ampia per grandi masse dell'isolotto (ad es., cavità peritoneale), sopravvivenza e fisiologico prestazione metabolica delle isole trapiantate sono ancora limitate e rimangono una preoccupazione9. La ricerca di un sito più adatto per attecchimento dell'isolotto è in corso.
L'omento è stato tra i tanti siti anatomici che sono stati studiati nello sviluppo iniziale di trapianto dell'isolotto e si è rivelati un ambiente di successo per gli isolotti10,11,12,13, 14. Tuttavia, infusione intraportal isolotto è diventato il clinico dovuto scelta in parte per la relativa semplicità della procedura e primi successi nell'animale modelli6. Inoltre, in parte, gli aspetti negativi associati con questo sito, particolarmente massiccia perdita iniziale dell'isolotto, erano meno comprensibili e meno vincolante nei primi giorni di trapianto dell'isolotto sperimentale come il campo maturata. Con più recente prova coercitiva che indica che l'infusione intravascolare isolotto è ben lungi dall'ideale, omento sta riemergendo come un sito potenzialmente importante per trapianto di cellule.
L'omento (sotto forma di un sacchetto omentale) offre vantaggi relativi sopra il fegato15,16. È bene-vascularized e facilmente accessibile. Esso consente il recupero di innesto (se necessario) e/o biopsia. Il periodo ischemico sperimentato dagli isolotti è ridotto rispetto al fegato, e l'omento può accettare relativamente masse di grande isolotto che non è possibile intraportally, dove un aumento della pressione portale possono causare complicazioni.
Un modello syngeneic del topo del trapianto è stato usato nel protocollo testato nello studio, che impiegano i topi maschii C57BL/6 tra 6 – 8 settimane con un peso corporeo di 20 – 25 destinatari dell'isolotto di g. sono stati resi diabetici con una singola iniezione dello streptozotocin con una dose di 250 mg/kg ip. L'induzione del diabete può essere considerato riuscito se il livello di glucosio nel sangue del mouse è maggiore di 24 mmol/L 48 h dopo l'iniezione e rimane sopra quel livello per un minimo di 5 giorni.
Isolotti syngeneic sono stati isolati dal pancreas di pari età donatori seguendo metodi precedentemente pubblicati con alcune modifiche. In breve, la collagenasi è stato iniettato nella vescica di scorticatura invece il dotto biliare. Questo è stato fatto come un miglioramento per facilitare la facilità di iniezione. Collagenasi infusione è stata seguita da incubazione, la rottura del tessuto, separazione di gradienti di densità e raccolta a mano per ottenere puri isolotti. Gli isolotti sono stati coltivati durante la notte in CMRL-1066 supplementato con 10% inattivati siero bovino fetale (FBS) in matracci T175 a 37 ° C, meno 95% aria - 5% CO2 prima del trapianto.
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Protocol
Tutti i topi utilizzati in questo studio sono stati ottenuti dal centro medico animale di Guangdong. L'uso degli animali è stato approvato dall'ospedale del popolo secondo Shenzhen di comitato recensione etica, secondo i principi del benessere degli animali.
1. islet trapianto al omento
Nota: Questo protocollo richiede 2 persone compire.
- Assemblare materiali chirurgici che sono elencati nella tabella 1. Preparare campo asettico in area chirurgica con materiali sterili quali tende e USA e getta e mantenere condizioni asettiche durante la chirurgia. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici. Indossare abiti da sterile.
- Scegli gli isolotti utilizzando una punta di pipetta 200 µ l sotto lo stereomicroscopio. Ogni mouse riceverà 450 – 500 isolotto equivalente (IEQ) a tansplant. Per ogni animale, posto abbastanza isolotti per un singolo trapianto in un tubo di snap-top sterili da 1,5 mL con 100 µ l di terreno di CMRL-1066.
Nota: Gli isolotti possono essere isolati il giorno del trapianto, ma è meglio isolarli il giorno prima per permettere il recupero per il processo di isolamento. - Mantenere le provette snap-top con isolotti su ghiaccio fino al momento del trapianto.
- Scongelare l'idrogel di matrice della membrana dello scantinato e tenerlo sul ghiaccio dopo averlo tolto dal congelatore a-20 ° C. L'idrogel è liquido a 4 ° C a 10 ° C e si solidifica a temperature più elevate.
- Pesare e tag tutti i topi diabetici di destinatario. Iniettare sodio pentobarbital 60 mg/kg per via intraperitoneale. Prova la profondità dell'anestesia con la somministrazione di un pizzico di punta. Dare un sodio pentobarbital ulteriori 10 mg/kg se l'animale reagisce per il pizzico. Se non c'è nessun ritirare riflesso, il livello di anestesia è corretto per la chirurgia.
- Tamponare il sito chirurgico sull'addome con etanolo al 70%. Radersi i capelli dal sito con una lama di razer e disinfettare la zona con iodoforo. Amministrare veterinario unguento per gli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
- Utilizzare le forbici oftalmiche per aprire l'addome lungo la linea mediana dell'addome con un'incisione di 4-5 cm. mossa gli intestini al lato sinistro e coprire con garza imbevuta salina per prevenire la disidratazione eccessiva durante la procedura di chirurgia.
- Utilizzare tamponi di cotone per completamente esporre il campo visivo dello stomaco e individuare l'omento (situato sotto lo stomaco). Utilizzare due coppie di una pinzetta per distendere l'omento. Fare attenzione a evitare danni dallo strappo.
- L'idrogel è completamente sciolto a questo punto. Girare il tubo con gli isolotti per 30 s a 200 x g e rimuovere il surnatante. 50 µ l di idrogel di aspirare, aggiungerlo nella provetta contenente gli isolotti e risospendere il mix delicatamente evitando la formazione di bolle. Mantenere i tubi sul ghiaccio durante la procedura.
- Utilizzare due paia di pinze per prendere i bordi dell'omento e sollevarlo delicatamente per formare una scanalatura tra la parete gastrica e dell'intestino che può ospitare un piccolo volume di liquido con l'innesto dell'isolotto.
- Lasciate che la seconda persona assistere nella procedura e aspirare la miscela di sedimento dell'isolotto-idrogel (l'intero contenuto del tubo) con una punta di pipetta 200 µ l, distribuire il contenuto nella scanalatura.
- Assicurare che la miscela sia ben posizionata nella scanalatura delicatamente alzando o abbassando i bordi dell'omento. Completo di posizionamento della miscela all'interno di 3 min prima l'idrogel si solidifica come un effetto della temperatura corporea. Dopo aver impostato l'idrogel, piegare l'omento per coprire l'innesto.
Nota: omento aderirà alla parete gastrica circostante come l'idrogel si solidifica. - Dopo l'idrogel è completamente solidificato, utilizzare tamponi di cotone per riposizionare l'intestino nella cavità addominale, facendo attenzione a non per toccare il sito di trapianto.
- Aggiungere 20 µ l di cefalosporina (5 ~ 10 mg) nella cavità addominale per prevenire l'infezione, quindi utilizzare sutura 4-0 per chiudere l'addome.
- Tornare il mouse alla sua gabbia e ripetere tutti i passaggi per ogni destinatario del mouse. Tenere in caldo i topi e monitorare visivamente fino a quando non riacquistano pienamente sufficiente coscienza per mantenere decubito sternale. Tenere i topi separati dagli altri animali fino a quando non hanno pienamente recuperato.
- Iniettare 50 µ l di sodio cefazolina (0,05 mg/mL) ogni giorno per una settimana come profilassi post-operatoria. Amministrare la lidocaina + buprenorfina, vale a dire applicare 1-3 gocce di 0,25% lidocaina al sito di incisione per via topica prima del posizionamento delle clip di ferita. Amministrare Buprenorphine(0.03 mg/ml with sterile 0.9% saline, 0.05-0.10 mg/kg) la via della intraperitoneale (IP).
- Misurare il livello di glucosio nel sangue non a digiuno da un campione di sangue della vena caudale utilizzando un misuratore di glucosio del sangue una volta al giorno dopo il trapianto. Quando trapiantare l'omento, l'innesto dell'isolotto può avere una funzione in ritardo e non raggiungere un livello di glucosio nel sangue completamente normale per 2 – 3 settimane.
- Per istologia, rimuovere l'innesto omentale dal mouse alla fine dell'esperimento dopo il trapianto. Difficoltà il tessuto secondo i protocolli istologici. L'innesto può essere analizzato per immunostaining o immunofluorescenza studi.
2. in alternativa per il trapianto al omento
Nota: Un idrogel di fibrina-trombina alternativo che viene utilizzata a temperatura ambiente può essere sostituito per l'idrogel di matrice della membrana dello scantinato. Si compone di 2 componenti, una soluzione di proteine del sigillante di fibrina (50 U/mL trombina e fibrinogeno di 10 mg/mL). Quando i componenti vengono miscelati, formano un coagulo che trattiene gli isolotti in posizione.
- Utilizzare l'idrogel di fibrina-thombin composto a temperatura ambiente. Come descritto al punto 1.2, ogni mouse riceverà 450 – 500 equivalenti di isolotto (IEQ) per trapianto. Posizionare gli isolotti in un tubo di snap-top sterili da 1,5 mL con 100 µ l di terreno di CMRL-1066. Immediatamente prima del trapianto, aspirare gli isolotti in una tubazione PE50 sterile per una lunghezza di 10 cm e centrifugare delicatamente (30 s a 200 x g) per formare un pellet sciolto.
- Preparare l'animale come indicato in precedenza (passaggi 1.5-1.8) con l'omento sparso. Miscelare i componenti di idrogel (10 µ l/CAD) e posizionare il omento. (Figura 3D)
- Espellere immediatamente gli isolotti dal tubo sull'idrogel. L'idrogel forma un coagulo intorno gli isolotti. (Figura 3E)
- Ripiegare l'omento l'idrogel e isolotti per formare un sacchetto. (Figura 3F) Continuare con i passaggi 1.13 a 1.18.
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Representative Results
Stato post-digestivo del pancreas è illustrato nella Figura 1A. Purificata isolotti sono mostrati in Figura 1B. Ditizone macchiatura e test di vitalità degli isolotti sono mostrati nella Figura 2. Le fasi principali del trapianto dell'isolotto di omento sono mostrate nella Figura 3. Il glucosio nel sangue dei destinatari dopo trapianto omentale sono mostrati in Figura 4. L'analisi istologica degli innesti è illustrato nella Figura 5.
Figura 1 : Isolamento di digestione e dell'isolotto del pancreas. (A) il pancreas dopo la digestione. Nota le particelle di sabbia e medie nella sospensione. (B) immagine di microscopia chiara degli isolotti dopo l'isolamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Isolotto Ditizone macchiatura e fluorescenza attuabilità coloranti. (A) isolotti sono colorati in rosso di Ditizone. Microscopia ottica (B). (C) (cellule morte) di colorazione rossa di fluorescenza di ioduro di propidio. (D) calceina-AM verde colorazione (cellule vitali). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Trapianto nell'omento. (A) dopo la laparotomia destinatario, è esposto lo stomaco e l'omento situato. (B) isolotti sono mescolati in idrogel e lentamente inseriti il tessuto omentale. (C) isolotto dell'innesto a maggiore ingrandimento. L'idrogel è uno stato di semi-solidificato. Metodo alternativo (D). Idrogel è collocato il omento senza isolotti. (E) isolotti sono collocati in cima l'idrogel. (F), l'omento è piegato intorno gli isolotti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Post-trapianto di sangue del glucosio livelli. Livelli di glucosio nel sangue non-digiuno dei destinatari (n = 7) fino a 35 giorni dopo il trapianto. I destinatari di innesto non tutti ricevere la stessa serie di isolotti quindi non ci sono differenze di qualità e funzione con conseguente grandi fluttuazioni nel livello di glucosio nel sangue.
Figura 5 : Istologia. Sezioni di innesto (innesto recupero 14 giorni dopo il trapianto) sono state macchiate con DAPI (nuclei), anticorpi anti-topo dell'insulina ed ematossilina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Trapianto dell'isolotto al fegato tramite la vena portale è il più diffuso metodo di trapianto dell'isolotto in esseri umani, ma ci sono ancora problemi di efficienza e sicurezza come vena portale trombosi e fegato steatosi17. Studi recenti dimostrano che l'omento può essere un'alternativa adatta per il fegato, ma più ricerca deve essere condotta prima della traduzione clinica12,14,18,19.
Il mouse è un modello adatto per il test omento come un sito per trapianto dell'isolotto. Nel topo, l'omento si trova sotto la parete dello stomaco e generalmente è piegato. Tuttavia, la dimensione dell'omento in topi è piccolo e difficile accesso. Al fine di utilizzarlo per il trapianto, è necessario delicatamente stenderlo alla dimensione completa quindi ripiegare dopo il mix di isolotti/idrogel è depositato. In un animale più grande, il tessuto omentale è più ampio e può essere suturato per costruire uno o più sacchetti in cui sono depositati gli isolotti. L'omento del mouse è fragile e non accetta facilmente suture senza rompersi. Per questo motivo, un idrogel viene utilizzato per fare il sacchetto senza suture.
Nel primo metodo (punti 1.1 – 1,18), idrogel usato è una matrice della membrana basale e si compone di laminina, collagene IV e fattori di crescita. Si solidifica come si riscalda alla temperatura corporea. Nel secondo metodo (passaggi 2.1-2.4), un idrogel diversi viene utilizzato composto di 10 mg/mL fibrinogeno e trombina 50U/mL. Due differenti idrogeli vengono utilizzati per mostrare la versatilità di questa tecnica. Può essere adattato a molte circostanze e di stabilire la prova di principio. Per applicazioni cliniche, se viene utilizzato un sacchetto suturato o un idrogel di uso clinico, la tecnica può essere combinata con un approccio mini-invasivo, (ad es., un metodo endoscopico della consegna al omento). A questo scopo, sono necessari ulteriori studi utilizzando più grandi modelli pre-clinici di mammifero.
Il tempo per normalizzare i livelli di glucosio nel sangue nei destinatari del mouse dopo trapianto nell'omento in nostro così come altri studi suggeriscono che gli isolotti nell'omento richiedono un tempo leggermente più lungo per ottenere sufficiente produzione di insulina. Efficienza di rivascolarizzazione sembra essere un fattore importante, come indicato nello studio. Se la presenza di un idrogel influisce sulla velocità di rivascolarizzazione delle isole e delle prestazioni, che rimane essere determinata.
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Disclosures
Gli autori non segnalano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Alcuni degli autori di questo lavoro sono state sostenute in parte dalle concessioni dal nazionali chiave R & D programma della Cina (2017YFC1103704), progetto di Sanming di medicina a Shenzhen (SZSM201412020), fondo per l'alto livello medico disciplina costruzione di Shenzhen (2016031638), Shenzhen Fondazione di scienza e tecnologia (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425110110658), Fondazione di Shenzhen della salute e della Commissione di pianificazione familiare (SZXJ2017021).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 5 inch (12-13 cm) Scissors | RWD Life Science | S12030-11 | |
| Fine Forceps | RWD Life Science | F11010-13 | |
| Small wound clips | RWD Life Science | R33003-01 | |
| Acutenaculum | RWD Life Science | F31044-13 | |
| 2 pair tissue forceps | RWD Life Science | F13023-10 | |
| 4-0 Suture with needle | Chenghe, China | 17094 | |
| 200 μL Pipette and tips | Gilson | PN11 | |
| One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| razor blade | Philips | HC1099/15 | |
| Material and animals | |||
| Pentobarbital Sodium | Sigmaaldrich.com | P3761 | For anesthesia |
| Hydrogel | bdbiosciences.com | 356234 | Basement Membrane Matrix |
| Fibrin-Thrombin Hydrogel | Baxter.com | 1501250 | Components clot when mixed |
| 70% Ethanol | Yingniu medical, Anhui, China | 23170608 | |
| Iodophor | Lierkang medical technology, Shangdong, China | 170521 | |
| Normal saline | Baxter.com | 2B1324 | |
| Cephalosporin | Lukang medical, Shangdong, China | 150303 | |
| Cefazolin | Baxter.com | 2G3508 | |
| lubricant eye ointment | Major Pharmaceuticals | 203964 | |
| streptozotocin | Sigmaaldrich.com | S0130 | |
| collagenase Type V | Sigmaaldrich.com | C9262 | |
| CMRL-1066 media | celltrans, Wenzhou, China | X018D1 | |
| histopaque | Sigmaaldrich.com | 10771 | density gradient |
| PE50 tubing | Braintreesci.com | PE50 100 FT | Polyethylene .023" x .038 |
| Calcein AM | Sigmaaldrich.com | C1359 | |
| Propidium iodide | Sigmaaldrich.com | P4864 | |
| optimal cutting temperature compound (OCT) | Tissue-Tek; Miles, Naperville, IL | 4583 | embedding medium |
| insulin antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 8138S | |
| hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 14166S | |
| eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc. | D1306 | |
| C57Bl/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | / | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| T175 flasks | Falcon | 353112 | |
| 1.5 mL Snap-top tubes | Axygen | MCT-150-C |
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