Summary
마우스에 독도의 omental 이식 하는 방법을 소개 합니다. 격리 된 독도 히드로와 혼합 하 고 혼합 당뇨 마우스의 omental 주머니에 배치 됩니다. 그리고, 혈액 포도 당 감시 면역 조직화 학적인 분석을 수행 합니다.
Abstract
타입-1 당뇨병에 대 한 잠재적인 치료를 작은 섬 이식 제안 되었습니다. 최근 강력한 증거 나타냅니다 혈관 내 섬 주입 이상 까지입니다 이며 따라서는 omentum 섬 이식에 대 한 잠재적으로 가치 있는 사이트로 다시 신흥. 이 실험에는 고품질 독도의 고립과 당뇨병 받는 사람에 게 독도의 주입 필요합니다. omentum에 이식 수술 단계를 더 시각적으로 설명 될 수 있다 필요 합니다. 여기,이 절차에 대 한 자세한 내용은 표시 됩니다. 당뇨병 쥐의 omental 주머니에 혼합물을 배치 하기 전에 히드로와 격리 된 독도 혼합의 두 가지 방법은 여기 설명 되어 있습니다. 다른 hydrogels 다른 조건을 위해 사용 됩니다. Syngeneic 독도 omentum에서 받는 사람 당뇨 마우스의 혈당은 최대 35 일 동안 감시 되었다. 일부 동물 면역 조직화 학적인 분석을 수행 하기 위해 14 일 후에 희생 되었다. 전 임상 이식 이렇게 예비 데이터 임상 이식에 번역을 사용할 수 있습니다.
Introduction
국제 당뇨병 연맹 (IDF)에 따르면 당뇨병 mellitus 현재 382 백만 사람들, 20351592 백만 명 예상된 증가 함께 적용 됩니다. 두 수용자와 xenogeneic 섬 이식 조직 면역 치료가 필요 합니다. 면역 억제, 없이 면역 거부 이식 손실2의 주요 원인입니다. 또한 중재 인스턴트 혈액 염증 반응 (IBMIR)3,4인 이식된 섬 손실의 중요 한 문제가입니다. 그러나, syngeneic와 같은 면역 반응의 부재에도 자동 이식 모델, 작은 섬 세포는 문맥을 통해 간으로 이식 가난한 혈액 등 불리 한 환경 조건, 또는 염증 때문에 손실 됩니다 또는 공급 감소 산소 및 영양소5,6. 그 결과, 장기 신진 대사 기능을 보장 하기 위해 높은 섬 번호는 감소 engraftment7초기 세포 손실을 보상 하는 데 필요한.
섬 engraftment를 최적화 하기 위해 시도, 여러 대체 해 부 사이트 실험적으로 조사 뿐 아니라 임상, 약속, 아직 하지 확실 한 결과8. 대체 사이트 중 일부는 간단 하 고 안전한 액세스를 제공 하는 반면 (예., 피부, 신장 캡슐, 위 submucosa 및 눈의 앞쪽 챔버) 또는 더 큰 섬 대 중을 위한 더 넓은 표면 (예., 복 막 구멍), 생존 및 생리 신진 대사 이식된 독도의 제한는 성능과 우려9유지. 섬 engraftment에 대 한 더 적합 한 사이트에 대 한 검색 진행 중 이다.
omentum 많은 해 부 사이트를 작은 섬 이식의 초기 개발에 조사 하 고 독도10,,1112,13, 성공적인 환경 입증 했다 중 하나 였습니다. 14. 그러나, intraportal 섬 주입 임상 선택 인해 일부 절차의 상대적 단순 되었고 동물에 이른 성공 모델6. 또한, 부분적으로, 원판이 관련 사이트, 특히 대규모 초기 섬 손실, 덜 이해 하 고 덜 제한 필드 실험 섬 이식의 초기 시절에 했다 성숙. 최근 강력한 증거를 나타내는 혈관 내 섬 주입에서 멀리 이상적는 omentum은 세포 이식에 대 한 잠재적으로 가치 있는 사이트로 다시 신흥.
(Omental 주머니의 형태로) omentum 간15,16상대적 이점을 제공합니다. 그것은 쉽게 접근할 수 있는 잘 vascularized입니다. 이식 (필요한 경우) 생 검의 검색 수 있습니다. 독도 의해 경험 하는 허 혈 성 기간 간에 비해 감소 하 고 있는 omentum 불가능 intraportally, 어디 포털 압력에서 상승 큰 섬 대 중 합병증을 일으킬 수 있습니다 상대적으로 받아들일 수 있다.
이식의 syngeneic 마우스 모델 연구, 고용 6-8 주 몸 무게의 20-25 g. 섬 받는 250의 복용량 streptozotocin의 단일 주사와 당뇨병 렌더링 했다와 오래 된 사이 남성 마우스 C57BL/6에서에서 테스트 프로토콜에 사용 된 mg/kg ip입니다. 당뇨병의 유도 경우 마우스의 혈액 포도 당 수준 24 mmol/L 48 h 보다 큰 주입 후 최소 5 일에 대 한 해당 수준의 위 남아 성공적인 간주 될 수 있습니다.
Syngeneic 독도 일부 수정 이전 게시 된 방법에 따라 나이 일치 하는 기증자의 췌 장 으로부터 격리 했다. 간단히는 콜라 대신 담 관 담 낭에 주입 했다. 이 주입의 용이성을 촉진 하기 위하여 개선으로 이루어졌다. 콜라 주입이 했다 뒤에 부 화, 조직 파괴, 밀도 그라데이션 분리 및 순수 독도를 손으로 따기. 독도 아래 10% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 37 ° C에서 플라스 크 T175에에서 보충 하는 CMRL-1066 매체에서 하룻밤 배양 했다 이식 전에 95% 공기-5% CO2 .
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Protocol
이 연구에 사용 된 모든 마우스 의료 동물 센터의 광 동성에서 얻은 했다. 동물의 사용은 동물 복지의 원칙에 따라 윤리 검토 위원회의 심천 제 2 인민 병원에 의해 승인 되었다.
1. 섬 이식은 Omentum 하
참고:이 프로토콜 2 인을 달성 하기 위해 필요 합니다.
- 표 1에 나열 되는 수술 재료를 조립 한다. 커튼 및 disposables와 같은 메 마른 재료로 외과 영역에서 무 균 필드를 준비 하 고 수술을 통해 무 균 상태를 유지. 모든 수술 기구를 소독. 멸 균 가운 착용.
- 독도 stereomicroscope에서 200 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 선택 합니다. 각 마우스 450-500 섬 상응 (IEQ) tansplant 당 받게 됩니다. 각 동물에 대 한 CMRL-1066 매체의 100 µ L 살 균 1.5 mL 스냅-탑 튜브에 단일 이식에 대 한 충분 한 독도 놓습니다.
참고: 독도 이식의 날에 고립 될 수 있다 하지만 격리 프로세스에 대 한 복구를 허용 하도록 하루 전에 그들을 분리 하는 것이 좋습니다. - 이식 준비까지 얼음에 독도 스냅-탑 튜브를 유지.
- 지하실 막 매트릭스 히드로 해 동 고-20 ° C 냉장고에서 그것을 제거한 후 얼음에 그것을 유지. 히드로 4 ° C ~ 10 ° C에 액체 이며 높은 온도에 고형화 한다.
- 모든 당뇨병 받는 사람 마우스 태그 및 무게. Intraperitoneally 60 mg/kg pentobarbital 나트륨을 주입. 테스트는 발가락 꼬 집 음을 투여 하 여 마 취의 깊이. 동물 꼬 집 음에 반응 하는 경우는 추가 10 mg/kg pentobarbital 나트륨을 제공 합니다. 경우 없는 철수 반사, 마 취의는 수술에 대 한 올바른.
- 70% 에탄올을 사용 하 여 복 부에 수술 부위의 면봉. Razer 블레이드와 사이트에서 머리를 면도 하 고 소독 Iodophor 지역. 수 의사 연 고 마 취에서 건조를 방지 하기 위해 눈을 관리 합니다.
- 복 부 중간에 따라 복 부 절 개의 4 ~ 5 cm. 이동 열 왼쪽에 창 안과 위를 사용 하 고 수술 절차 동안 과도 한 탈수를 방지 하기 위해 염 분 젖은 거 즈로 커버.
- 면봉을 사용 하 여 완벽 하 게 위장의 시야 노출과 omentum (위 아래에 있는)을 찾습니다. 두 켤레 미세 집게를 사용 하 여 distend는 omentum. 끊어지고 손상 되지 않도록 주의.
- 완전히는 하이드로 겔이 시점에서 해 동. 30 독도와 튜브를 회전 g 및 제거는 상쾌한 x 200에서 s. 하이드로 겔의 50 µ L 발음, 독도, 포함 된 튜브에 그것을 추가 하 고 부드럽게 거품의 형성을 방지 하는 믹스 resuspend. 절차 동안 얼음에 튜브를 유지.
- 집게의 2 개 쌍을 사용 하 여는 omentum의 가장자리를 선택 하 고 부드럽게 위 벽과 창 자 섬 이식 한 액체의 작은 볼륨을 수용할 수 있는 사이 홈을 형성 하기 위하여 그것을 인상.
- 두 번째 사람은 절차에 200 µ L 피 펫 팁 resuspended 섬-히드로 혼합물 (튜브의 전체 내용)를 발음, 홈으로 콘텐츠를 전달 하자.
- 혼합물 부드럽게 올리거나 낮추는 omentum의 가장자리에 의해 홈에 잘 배치 됩니다 확인 하십시오. 체온의 효과로 하이드로 겔 전에 3 분 이내 혼합물의 위치 완전 한 굳은 것 이다. 후에 하이드로 겔 세트, 커버는 이식 omentum 접어.
참고:는 히드로 굳은는 omentum 주변 위 벽에 준수 합니다. - 히드로 경화 완전히 후 면봉을 사용 하 여 내장을 만지지 이식의 사이트 돌 복 부 구멍으로 위치를.
- 20 µ L cephalosporin의 추가 (5 ~ 10 mg) 감염을 방지 하기 위해 복 부 구멍으로를 사용 하 여 4-0 봉합 복 부를 닫습니다.
- 그것의 감 금 소를 마우스를 반환 하 고 마우스 받는 사람 각각에 대 한 모든 단계를 반복 합니다. 쥐를 따뜻하게 유지 하 고 그들은 완전히 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 때까지 시각적으로 모니터링 합니다. 그들은 완전히 복구 될 때까지 쥐를 다른 동물에서 별도 유지.
- 수술 후 예방으로 일주일 동안 매일 50 µ L cefazolin 나트륨 (0.05 mg/mL)의 주입. Bupivicaine + Buprenorphine 관리, 즉 0.25%의 1-3 방울을 적용 상처 클립의 배치 이전에 몸에 붙이기도 절 개 사이트에 Bupivicaine. 관리 Buprenorphine(0.03 mg/ml with sterile 0.9% saline, 0.05-0.10 mg/kg) 복 (IP) 루트를 통해.
- 측정 비 단식 혈액 포도 당 수준을 혈액 포도 당 미터를 사용 하 여 꼬리 정 맥 혈액 샘플에서 이식 후 하루에 한 번. omentum, 이식 때 섬 이식 지연 기능 하 고 2-3 주 동안 완전 하 게 정상적인 혈액 포도 당 수준에 도달 하지 않을 수 있습니다.
- 조직학, omental 이식 다음 이식 하는 실험의 끝에 마우스에서 제거 합니다. 조직학 프로토콜에 따라 조직 수정. 이식 immunostaining 또는 면역 형광 연구 분석할 수 있습니다.
2. 대체는 Omentum에 이식 방법
참고: 실 온에서 사용 되는 대체 섬유 소-트 롬 빈 히드로 지하실 멤브레인 매트릭스 하이드로 겔에 대 한 대체 수 있습니다. 2 부품, 섬유 소 마감재 단백질 해결책 (50 U/mL 트 롬 빈 10 mg/mL fibrinogen) 그것에 의하여 이루어져 있다. 구성 요소가 혼합 되어, 그들은 장소에는 독도 보유 하는 응고 형성.
- 섬유 소 thombin 하이드로 겔 화합물을 사용 하 여 실내 온도에. 1.2 단계에서 각 마우스 이식 당 450-500 섬 등가물 (IEQ)를 받게 됩니다. CMRL-1066 매체의 100 µ L 살 균 1.5 mL 스냅-탑 튜브에는 독도 놓습니다. 즉시 이식, 전에 10 cm의 길이 대 한 살 균 PE50 튜브에는 독도 발음 하 고 부드럽게 원심 (30에서 200 x g s) 느슨한 펠 릿을 형성 하기 위하여.
- 퍼져 omentum와 (단계 1.5-1.8) 위에 말한 대로 동물을 준비 합니다. 하이드로 겔 구성 요소 (10 µ L/각)을 혼합 하 고는 omentum에. (그림 3D)
- 바로 독도 히드로에 튜브에서 추방. 히드로 독도 주위 응고를 형성 한다. (그림 3E)
- 히드로와 주머니를 형성 하는 독도 omentum 접어. (그림 3 층) 1.13 1.18 단계를 계속 합니다.
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Representative Results
췌 장 post-digestive 상태는 그림 1A에 표시 됩니다. 순화 독도 그림 1B에서 표시 됩니다. Dithizone 얼룩이 지 고는 독도의 생존 테스트는 그림 2에 표시 됩니다. omentum 작은 섬 이식의 주요 단계는 그림 3에 나와 있습니다. 혈액 포도 당 수준은 omental 이식 후 받는 사람의 그림 4에 나와 있습니다. 이식의 조직학 분석은 그림 5에 표시 됩니다.
그림 1 : 췌 장 소화와 섬 고립. (A) 다음 소화 하는 췌 장. 에 모래 크기의 입자 note (B) 격리 후 독도의 가벼운 현미경 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 섬 dithizone 얼룩 및 형광 생존 염료. (A) 독도 dithizone에 의해 빨간색으로 얼룩진. (B) 가벼운 현미경 검사 법입니다. (C) Propidium 요오드 화물 형광 레드 얼룩 (죽은 세포). (D) Calcein-오전 녹색 얼룩 (가능한 셀). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 :는 omentum 이식. (A)는 omentum 위치 하 고 받는 사람 개복 술 후 복 부 노출 됩니다. (B) 독도 히드로에서 혼합 하 고 천천히 omental 조직에 배치. (C) 섬 높은 확대에 이식. 히드로 세미 응고 상태입니다. (D) 대체 방법입니다. 하이드로 겔은 독도. 하지 않고 omentum에 배치 (E) 독도 히드로 위에 배치 됩니다. (F)는 omentum는 독도 주변에 접혀 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 혈액 포도 당 수준 포스트 이식. 받는 사람 혈액 포도 당 수준 비 금식 (n = 7) 이식 후 최대 35 일. 이식 받는 사람 않았다 모든 받을 독도의 동일한 배치 그래서 혈액 포도 당 수준에 큰 변동이 발생 하는 기능과 품질에 차이가 있다.
그림 5 : 조직학. (검색 14 일 이식 후 이식) 이식 섹션 DAPI (핵), 반대로 마우스 인슐린 항 체와 되며 스테인드 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
문맥을 통해 간 섬 이식 가장 일반적으로 사용 되는 작은 섬 이식의 방법 인간, 하지만 여전히 포털 정 맥 혈전 증과 간 steatosis17등 효율성과 안전 문제입니다. 최근 연구는 omentum 간, 하지만 더 많은 연구 필요 임상 번역12,14,,1819전에 실시 해야 적당 한 대안이 있을 수 있습니다 보여줍니다.
마우스 섬 이식에 대 한 사이트는 omentum 테스트를 위해 적합 한 모델입니다. 마우스에는 omentum는 위 벽 아래 있으며 일반적으로 접혀 있다. 그러나, 쥐에서 omentum의 크기는 작고 접근 하기 어려운. 이식에 대 한 사용, 그것은 부드럽게 전체 크기에 그것을 밖으로 확산 다음 독도/히드로 혼합 입금 후 그것을 접고 필요가 있다. 더 큰 동물에 omental 조직 보다 광범위 한 이며 하나 이상의 파우치로는 독도 예금 생성 하 봉합 될 수 있습니다. 마우스 omentum 깨지기 이며 쉽게 끊기 없이 봉합을 허용 하지 않습니다. 이러한 이유로 히드로 봉합 없이 주머니를 만드는 데 사용 됩니다.
첫 번째 방법 (1.1-1.18 단계)에서 사용 하는 하이드로 겔 지하실 멤브레인 매트릭스 이며 laminin, 콜라겐 IV 및 성장 요인의 구성 된다. 그것은 체온을 따뜻하게으로 굳은 것 이다. 두 번째 방법은 (단계 2.1-2.4), 다른 히드로 50U/mL 트 롬 빈 및 10 mg/mL fibrinogen의 구성 사용 됩니다. 두 개의 다른 hydrogels는이 기술의 다양성을 표시 하는 데 사용 됩니다. 그것은 원리의 증거를 확립 하 고 많은 상황에 맞게 맞출 수 있습니다. 임상 응용 프로그램에 대 한 sutured 주머니 또는 임상 등급 하이드로 겔 사용 여부는 기술 결합 될 수 있다 최소한 침략 적 접근 (예.는 omentum에 배달 하는 내 시경 방법). 이 목표에 큰 포유동물 전 임상 모델을 사용 하 여 추가 연구는 필요 합니다.
우리 뿐 아니라 다른 연구에서 omentum에 이식 후 마우스 받는 혈액 포도 당 수치를 정상화 하는 시간에는 omentum 독도 충분 한 인슐린 생산을 달성 하기 위해 약간 더 긴 시간이 필요 것이 좋습니다. 연구에 명시 된 대로 revascularization 효율 하나의 중요 한 요소 것 같습니다. 여부는 히드로의 존재에 섬 revascularization 성과의 속도 영향을 미치는, 그 결정에 남아 있다.
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Disclosures
저자는 충돌의 관심을 보고.
Acknowledgments
이 작품의 저자 중 일부 국가 키 R & D 중국 프로그램 (2017YFC1103704), 심천 (SZSM201412020), 높은 수준의 의료 분야 건설의 심천 (2016031638)에 대 한 기금에서에서 의학의 인민 프로젝트에서 교부 금에 의해 부분적으로 지원 되었다 심천 과학 및 기술 (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425110110658), 보건 및 가족 계획 위원회 (SZXJ2017021)의 심천 기초의 기초.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 5 inch (12-13 cm) Scissors | RWD Life Science | S12030-11 | |
| Fine Forceps | RWD Life Science | F11010-13 | |
| Small wound clips | RWD Life Science | R33003-01 | |
| Acutenaculum | RWD Life Science | F31044-13 | |
| 2 pair tissue forceps | RWD Life Science | F13023-10 | |
| 4-0 Suture with needle | Chenghe, China | 17094 | |
| 200 μL Pipette and tips | Gilson | PN11 | |
| One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| razor blade | Philips | HC1099/15 | |
| Material and animals | |||
| Pentobarbital Sodium | Sigmaaldrich.com | P3761 | For anesthesia |
| Hydrogel | bdbiosciences.com | 356234 | Basement Membrane Matrix |
| Fibrin-Thrombin Hydrogel | Baxter.com | 1501250 | Components clot when mixed |
| 70% Ethanol | Yingniu medical, Anhui, China | 23170608 | |
| Iodophor | Lierkang medical technology, Shangdong, China | 170521 | |
| Normal saline | Baxter.com | 2B1324 | |
| Cephalosporin | Lukang medical, Shangdong, China | 150303 | |
| Cefazolin | Baxter.com | 2G3508 | |
| lubricant eye ointment | Major Pharmaceuticals | 203964 | |
| streptozotocin | Sigmaaldrich.com | S0130 | |
| collagenase Type V | Sigmaaldrich.com | C9262 | |
| CMRL-1066 media | celltrans, Wenzhou, China | X018D1 | |
| histopaque | Sigmaaldrich.com | 10771 | density gradient |
| PE50 tubing | Braintreesci.com | PE50 100 FT | Polyethylene .023" x .038 |
| Calcein AM | Sigmaaldrich.com | C1359 | |
| Propidium iodide | Sigmaaldrich.com | P4864 | |
| optimal cutting temperature compound (OCT) | Tissue-Tek; Miles, Naperville, IL | 4583 | embedding medium |
| insulin antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 8138S | |
| hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 14166S | |
| eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc. | D1306 | |
| C57Bl/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | / | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| T175 flasks | Falcon | 353112 | |
| 1.5 mL Snap-top tubes | Axygen | MCT-150-C |
References
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