Summary
En metod för omental transplantation av holmar i en mus introduceras. De isolera öarna är blandade med hydrogel och blandningen placeras i omental påsen diabetiker musklick. Sedan blodglukosnivån övervakas och immuno-histochemical analysen utförs.
Abstract
Ö-transplantation har föreslagits vara en potentiell behandling för typ 1-diabetes. Senaste tvingande bevis indikerar att intravaskulär holme infusion är långt ifrån idealisk och omentum är därför åter framväxande som en potentiellt värdefulla plats för ö-transplantation. Detta experiment kräver isolering av hög kvalitet holmar och implantation av kobbar och skär till diabetiker mottagarna. Transplantation till omentum kräver kirurgiska åtgärder som kan demonstreras bättre visuellt. Här presenteras de detaljerade anvisningarna för detta förfarande. Två metoder för att blanda de isolera öarna med hydrogel innan placera blandningen i den omental påsen av diabetiska möss beskrivs här. Olika hydrogeler används för olika förhållanden. Blodsockernivåer av diabetiker mus mottagare av syngena holmar i omentum övervakades för upp till 35 dagar. Vissa djur offrades efter 14 dagar att utföra immuno-histochemical analys. Detta prekliniska transplantation tillvägagångssätt kan användas som preliminära uppgifter fram till översättning till kliniska transplantationer.
Introduction
Enligt International Diabetes Federation (IDF), drabbar diabetes mellitus för närvarande 382 miljoner människor, med en väntas öka till 592 miljoner människor av 20351. I både allogen och xenogena ötransplantation är systemisk immunsuppressiv behandling nödvändig. Utan immunsuppression är immun avslag en viktig orsak till transplantat förlust2. Det finns också ett betydande problem för transplanterade holme förlust på grund av den omedelbara blod medierad inflammatorisk reaktion (IBMIR)3,4. Dock även i avsaknad av ett immunsvar som i syngena eller auto-transplantation modeller, cellöar transplanteras i levern via portalen ven går förlorade på grund av inflammation och/eller ogynnsamma miljöförhållanden, såsom dålig blod förse med nedsatt syresättning och/eller näringsämnen5,6. Som ett resultat, för att säkerställa långsiktig metabolisk funktion, är högre holme siffror nödvändigt att kompensera för den ursprungliga cellförlust som minskar engraftment7.
I ett försök att optimera holme engraftment, flera alternativa anatomiska platser har undersökts experimentellt samt kliniskt, med lovande, ännu inte slutgiltiga resultat8. Medan några av de alternativa webbplatserna erbjuder enkel och säker tillgång (t.ex., hud, njurar kapsel, gastric submucosa och främre kammaren i ögat) eller en bredare yta för större holme samlas (t.ex., bukhålan), överlevnad och fysiologiska metaboliska prestanda av de transplanterade holmarna är fortfarande begränsad och förbli en oro9. Sökandet efter en mer lämplig plats för holme engraftment pågår.
Omentum var bland de många anatomiska platser som utreddes i den tidiga utvecklingen av ötransplantation, och visade sig vara en framgångsrik miljö för holmar10,11,12,13, 14. Dock intraportal holme infusion blev med kliniska val beror delvis till den relativa enkelheten i förfarandet och tidig framgång i djur modeller6. Dessutom delvis negativ associerade med denna webbplats, särskilt massiva tidig holme förlust, var mindre förstås och mindre begränsande i början av experimentella ötransplantation som fältet mognat. Med nyare övertygande bevis som indikerar att intravaskulär holme infusion är långt ifrån perfekt, omentum är åter framväxande som en potentiellt värdefulla plats för stamcellstransplantation.
Omentum (i form av en omental påse) erbjuder relativa fördelar jämfört med de lever15,16. Det är välutvecklad simblåsa och lättillgängligt. Det tillåter hämtning av transplantat (om nödvändigt) eller biopsi. Perioden ischemisk upplevs av holmarna minskas jämfört med levern, och omentum kan acceptera relativt stor holme massorna vilket inte är möjligt intraportally, där portalen tryckökning kan orsaka komplikationer.
En syngena musmodell av transplantation användes i det protokoll som testades i studien, anställa C57BL/6 hanmöss mellan 6 – 8 veckor gammal med en kroppsvikt på 20 – 25 g. Islet mottagare var utförda diabetiker med en enda injektion av streptozotocin med en dos på 250 mg/kg ip. Induktion av diabetes kan anses framgångsrik om blodglukosnivån musen är större än 24 mmol/L 48 h efter injektion och förblir över denna nivå i minst 5 dagar.
Syngena holmar var isolerade från bukspottkörteln åldersmatchade givare följande tidigare publicerade metoder med några ändringar. I korthet injicerades kollagenas i gallblåsan istället för gallgången. Detta gjordes som en förbättring att underlätta användarvänlighet injektion. Kollagenas infusion var följt av inkubation, vävnad störningar, täthet lutning separation och handplocka att få ren holmar. Holmar odlades över natten i CMRL-1066 medium kompletteras med 10% Värmeinaktiverade fetalt bovint serum (FBS) i T175 kolvar vid 37 ° C, under 95% luft - 5% CO2 före transplantation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla möss som används i denna studie erhölls från den medicinska djur Center i Guangdong-provinsen. Användning av djur godkändes av etik i utskottet av Shenzhen andra People's Hospital, enligt principerna för djurs välbefinnande.
1. ötransplantation till Omentum
Obs: Detta protokoll kräver 2 personer att utföra.
- Montera kirurgiska material som listas i tabell 1. Förbereda aseptiska fältet i kirurgiska området med sterilt material såsom draperier och engångsartiklar och underhålla aseptiska förhållanden under hela operationen. Sterilisera alla kirurgiska instrument. Bära sterila kappor.
- Plocka kobbar och skär med en 200 µL pipettspetsen under stereomikroskopet. Varje mus får 450 – 500 Islet motsvarande (IEQ) per tansplant. För varje djur, placera tillräckligt holmar för en enda transplantation i en steril 1,5 mL snapin-top tube med 100 µL av CMRL-1066 medium.
Obs: Holmar kan isoleras på dagen för transplantation, men det är bättre att isolera dem dagen innan för att tillåta återhämtning för isolering processen. - Håll snap-top rören med holmar på is tills det att transplantera.
- Tina den basalmembranet matrix hydrogel och hålla den på is efter att ta bort den från-20 ° C frysen. Hydrogel är flytande vid 4 ° C till 10 ° C och stelnar vid högre temperaturer.
- Väga och tagga alla diabetiker mottagarens möss. Injicera 60 mg/kg natrium pentobarbital intraperitonealt. Test av djup anestesi genom att administrera en tå nypa. Ge ett ytterligare 10 mg/kg pentobarbital natrium om djuret reagerar på att nypa. Om det finns ingen återkalla reflex, anestesi är korrekta för kirurgi.
- Svabba operationsområdet på buken med 70% etanol. Raka håret från platsen med en razer blade och desinficera området med Iodophor. Administrera vet salva till ögonen att förhindra torrhet under anestesi.
- Använd oftalmologiska saxen för att öppna buken längs buken mittlinjen med ett snitt på 4 till 5 cm. flytta tarmar till vänster sida och täck med saltlösning indränkt kompress för att förhindra överdriven uttorkning under förfarandet för kirurgi.
- Använda bomullspinnar att helt utsätta synfältet i magen och hitta de omentum (som finns nedanför magen). Använda två par fina pincett för att distend omentum. Var noga med för att undvika skador från Riva.
- Hydrogel är helt tinade på denna punkt. Snurra röret med kobbar och skär för 30 s vid 200 x g och ta bort supernatanten. Aspirera 50 µL av hydrogel, lägga till röret som innehåller holmarna och resuspendera blandningen försiktigt undvika bildandet av bubblor. Hålla rören på is under förfarandet.
- Använda två par pincett att plocka upp kanterna på omentum och försiktigt höja den för att bilda ett spår mellan gastric väggen och tarmar som kan rymma en liten volym av vätska med holme graften.
- Låt den andra personen hjälpa i förfarandet och aspirera återsuspenderade holme-hydrogel blandningen (hela innehållet i tuben) med en 200 µL pipettspetsen, leverera innehållet i spåret.
- Se till att blandningen är väl positionerat i spåret genom att försiktigt höja eller sänka kanterna på omentum. Komplett positionering av blandningen inom 3 min innan hydrogel stelnar som en effekt av kroppstemperaturen. Efter hydrogel, vik omentum för att täcka transplantatet.
Obs: omentum fäster på omgivande magsäckens vägg som hydrogel stelnar. - När hydrogel är helt stelnat, använda bomullspinnar flytta tarmarna tillbaka i bukhålan, noga med att inte röra platsen för transplantation.
- Tillsätt 20 µL av cefalosporin (5 ~ 10 mg) i bukhålan att förhindra infektion, Använd sedan 4-0 sutur för att stänga buken.
- Återgå musen till sin bur och upprepa alla steg för varje mus mottagare. Hålla mössen varm och övervaka visuellt tills de återfår fullt tillräckligt medvetande för att upprätthålla sternala koordinationsrubbning. Hålla mössen åtskilda från andra djur tills de har återhämtat sig helt.
- Injicera 50 µL cefazolin natrium (0,05 mg/mL) varje dag i en vecka som efter operationen profylax. Administrera Bupivicaine + buprenorfin, dvs. Applicera 1-3 droppar 0,25% Bupivicaine på webbplatsen snitt lokalt innan placering av såret klipp. Administrera Buprenorphine(0.03 mg/ml with sterile 0.9% saline, 0.05-0.10 mg/kg) via sträckan intraperitoneal (IP).
- Mäta icke-fastande blodsockernivå från svans-ven blodprov med hjälp av en blodsockermätare dagligen efter transplantationen. När omplantering till omentum, kan holme transplantat har en fördröjd funktion och inte nå en helt normal blodsockernivå 2 – 3 veckor.
- För histologi, ta bort omental transplantat från musen i slutet av experimentet efter transplantation. Fixa vävnaden enligt protokollen histologiska. Transplantatet kan analyseras för immunfärgning eller immunofluorescens studier.
2. alternativa metod för Transplantation till Omentum
Obs: En alternativ fibrin-trombin hydrogel som används i rumstemperatur kan ersättas av basalmembranet matrix hydrogel. Den består av 2 komponenter, en fibrin sealer protein lösning (50 U/mL trombin och fibrinogen 10 mg/mL). När komponenterna är blandade, bildar de en propp som håller holmarna på plats.
- Använd det fibrin-thombin hydrogel förening vid rumstemperatur. Liksom i steg 1.2 får varje mus 450 – 500 holme medel (IEQ) per transplantation. Placera holmarna i en steril 1,5 mL snapin-top tube med 100 µL av CMRL-1066 medium. Omedelbart före transplantation, sug upp holmarna i en steril PE50 slangar för en längd av 10 cm och centrifugera försiktigt (30 s vid 200 x g) att bilda en lös pelleten.
- Förbereda djuret enligt ovan (steg 1,5-1,8) med de omentum utspridda. Blanda hydrogel komponenterna (10 µL/styck) och placera på omentum. (Figur 3D)
- Omedelbart utvisa kobbar och skär från slangen på hydrogel. Hydrogel bildar en propp runt holmarna. (Figur 3E)
- Vik omentum över hydrogel och holmar att bilda en påse. (Figur 3F) Fortsätt med steg 1.13 till 1,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Post-Digestive tillstånd av bukspottkörteln visas i figur 1A. Renat holmar visas i figur 1B. Dithizone färgning och genomförbarhet testning av holmarna visas i figur 2. De viktigaste stegen i ötransplantation till omentum visas i figur 3. Blodglukosnivån av mottagarna efter omental transplantation visas i figur 4. Histologisk analys av hårstrips visas i figur 5.
Figur 1 : Bukspottkörteln matsmältningen och islet isolation. (A) bukspottkörteln efter matsmältningen. Observera de sand-storlek partiklarna i suspensionen. (B) ljusmikroskopi bild av holmarna efter isolering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Holme dithizone färgning och fluorescens livskraft färgämnen. (A) holmar färgas rött av dithizone. (B) ljusmikroskopi. (C) Propidium jodid fluorescens röd färgning (döda hudceller). (D) Calcein-AM grön färgning (viabla celler). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Transplantation i omentum. (A) efter den mottagande laparotomi, magen är utsatt och omentum ligger. (B) holmar blandas i hydrogel och långsamt placeras på omental vävnaden. (C) holme ympa på högre förstoring. Den Hydrogelen en semi stelnat stat. (D) alternativ metod. Hydrogel är placerad på omentum utan holmar. (E) holmar placeras ovanpå hydrogel. (F) omentum viks runt holmarna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Blod glukos nivåer efter transplantation. Icke-fastande blodsockernivåerna mottagare (n = 7) upp till 35 dagar efter transplantation. Transplantat mottagarna fick inte alla samma parti av holmar så det finns skillnader i kvalitet och funktion vilket resulterar i stora svängningar i blodsockernivå.
Figur 5 : Histologi. Transplantat sektioner (transplantat hämtning 14 dagar efter transplantation) var färgas med hematoxylin DAPI (kärnor) och insulin anti-mus antikroppar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ö-transplantation till levern via portalen ven är den vanligaste metoden av ötransplantation hos människor, men det finns fortfarande effektivitet och säkerhet oro såsom portalen ven trombos och levern steatos17. Nyligen genomförda studier visar att omentum kan vara ett lämpligt alternativ till levern, men mer forskning behöver göras innan kliniska översättning12,14,18,19.
Musen är en lämplig modell för testning av omentum som en plats för ö-transplantation. I musen, omentum ligger under magen väggen och viks generellt. Storleken på omentum hos möss är dock små och utmanande till access. För att använda det för transplantation, är det nödvändigt att försiktigt sprida ut till sin fulla storlek sedan vik den över efter holmar/hydrogel mixen deponeras. I ett större djur, den omental vävnaden är mer omfattande och kan vara sys för att konstruera en eller flera påsar som deponeras kobbar och skär. Mus omentum är bräcklig och accepterar inte enkelt suturer utan att bryta. Av den anledningen används en hydrogel att göra påsen utan suturer.
I den första metoden (steg 1.1 – 1.18), den hydrogel som används är en basalmembranet matris och består av laminin, kollagen IV och tillväxtfaktorer. Det stelnar när det värms till kroppstemperatur. I den andra metoden (steg 2.1 – 2.4), används en annan hydrogel består av 50U/mL trombin och fibrinogen 10 mg/mL. Två olika hydrogeler används för att visa mångsidigheten hos denna teknik. Det kan skräddarsys för att passa många omständigheter och att upprätta bevis för principen. För kliniska applikationer, oavsett om ett sys påse eller en klinisk-grade hydrogel används, tekniken kan kombineras med en minimalt invasiv metod, (t.ex., en endoskopisk metod för leverans till omentum). I detta syfte krävs ytterligare studier med större däggdjur prekliniska modeller.
Tid att normalisera blodglukosnivån i mus mottagarna efter transplantation i omentum i vår samt andra studier tyder på att de små öarna i omentum kräver något längre tid att uppnå tillräcklig insulinproduktion. Revaskularisering effektivitet verkar vara en viktig faktor, som beskrivs i studien. Om förekomsten av en hydrogel påverkar hastigheten på islet revaskularisering och prestanda, som återstår för att fastställas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna rapportera inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Några av författarna till detta arbete var stöds delvis genom bidrag från nationella tangenten R & D Program i Kina (2017YFC1103704), Sanming Project i medicin i Shenzhen (SZSM201412020), fonden för hög nivå medicinsk disciplin konstruktion av Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation för vetenskap och teknik (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425110110658), Shenzhen grunden för hälsa och familjeplanering kommissionen (SZXJ2017021).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 5 inch (12-13 cm) Scissors | RWD Life Science | S12030-11 | |
| Fine Forceps | RWD Life Science | F11010-13 | |
| Small wound clips | RWD Life Science | R33003-01 | |
| Acutenaculum | RWD Life Science | F31044-13 | |
| 2 pair tissue forceps | RWD Life Science | F13023-10 | |
| 4-0 Suture with needle | Chenghe, China | 17094 | |
| 200 μL Pipette and tips | Gilson | PN11 | |
| One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| razor blade | Philips | HC1099/15 | |
| Material and animals | |||
| Pentobarbital Sodium | Sigmaaldrich.com | P3761 | For anesthesia |
| Hydrogel | bdbiosciences.com | 356234 | Basement Membrane Matrix |
| Fibrin-Thrombin Hydrogel | Baxter.com | 1501250 | Components clot when mixed |
| 70% Ethanol | Yingniu medical, Anhui, China | 23170608 | |
| Iodophor | Lierkang medical technology, Shangdong, China | 170521 | |
| Normal saline | Baxter.com | 2B1324 | |
| Cephalosporin | Lukang medical, Shangdong, China | 150303 | |
| Cefazolin | Baxter.com | 2G3508 | |
| lubricant eye ointment | Major Pharmaceuticals | 203964 | |
| streptozotocin | Sigmaaldrich.com | S0130 | |
| collagenase Type V | Sigmaaldrich.com | C9262 | |
| CMRL-1066 media | celltrans, Wenzhou, China | X018D1 | |
| histopaque | Sigmaaldrich.com | 10771 | density gradient |
| PE50 tubing | Braintreesci.com | PE50 100 FT | Polyethylene .023" x .038 |
| Calcein AM | Sigmaaldrich.com | C1359 | |
| Propidium iodide | Sigmaaldrich.com | P4864 | |
| optimal cutting temperature compound (OCT) | Tissue-Tek; Miles, Naperville, IL | 4583 | embedding medium |
| insulin antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 8138S | |
| hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 14166S | |
| eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc. | D1306 | |
| C57Bl/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | / | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| T175 flasks | Falcon | 353112 | |
| 1.5 mL Snap-top tubes | Axygen | MCT-150-C |
References
- Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes research and clinical practice. 103 (2), 137-149 (2014).
- Bellin, M. D., et al. Potent Induction Immunotherapy Promotes Long-Term Insulin Independence After Islet Transplantation in Type 1 Diabetes. American Journal of Transplantation. 12 (6), 1576-1583 (2012).
- Moberg, L., et al. Production of tissue factor by pancreatic islet cells as a trigger of detrimental thrombotic reactions in clinical islet transplantation. The lancet. 360 (9350), 2039-2045 (2002).
- Nilsson, B., Ekdahl, K. N., Korsgren, O. Control of instant blood-mediated inflammatory reaction to improve islets of Langerhans engraftment. Current Opinion in Organ Transplantation. 16 (6), 620-626 (2011).
- Bellin, M. D., et al. Similar islet function in islet allotransplant and autotransplant recipients, despite lower islet mass in autotransplants. Transplantation. 91 (3), 367-372 (2011).
- Bruni, A., Gala-Lopez, B., Pepper, A. R., Abualhassan, N. S., Shapiro, A. J. Islet cell transplantation for the treatment of type 1 diabetes: recent advances and future challenges. Diabetes, metabolic syndrome and obesity: targets and therapy. 7, 211 (2014).
- Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature reviews Endocrinology. 13 (5), 268-277 (2017).
- Cantarelli, E., Piemonti, L. Alternative transplantation sites for pancreatic islet grafts. Current diabetes reports. 11 (5), 364 (2011).
- Cantarelli, E., et al. Murine animal models for preclinical islet transplantation: no model fits all (research purposes). Islets. 5 (2), 79-86 (2013).
- Beli, E., et al. Erratum to: CX3CR1 deficiency accelerates the development of retinopathy in a rodent model of type 1 diabetes. J Mol Med (Berl). 95 (5), 565-566 (2017).
- Hafner, J., et al. Regional Patterns of Retinal Oxygen Saturation and Microvascular Hemodynamic Parameters Preceding Retinopathy in Patients With Type II Diabetes. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (12), 5541-5547 (2017).
- Schmidt, C. Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum. Nature Biotechnology. 35 (1), 82017 (2017).
- Voigt, M., et al. Prevalence and Progression Rate of Diabetic Retinopathy in Type 2 Diabetes Patients in Correlation with the Duration of Diabetes. Exp Clin Endocrinol Diabetes. , (2017).
- Baidal, D. A., et al. Bioengineering of an Intraabdominal Endocrine Pancreas. New England Journal of Medicine. 376 (19), 1887-1889 (2017).
- Espes, D., et al. Rapid restoration of vascularity and oxygenation in mouse and human islets transplanted to omentum may contribute to their superior function compared to intraportally transplanted islets. American Journal of Transplantation. , (2016).
- Berman, D. M., et al. Bioengineering the endocrine pancreas: intraomental islet transplantation within a biologic resorbable scaffold. Diabetes. 65 (5), 1350-1361 (2016).
- Delaune, V., Berney, T., Lacotte, S., Toso, C. Intraportal islet transplantation: the impact of the liver micro-environment. Transplant International. 30 (3), 227-238 (2017).
- Espes, D., et al. Rapid restoration of vascularity and oxygenation in mouse and human islets transplanted to omentum may contribute to their superior function compared to intraportally transplanted islets. American Journal of Transplantation. 16 (11), 3246-3254 (2016).
- Hajizadeh-Saffar, E., et al. Inducible VEGF expression by human embryonic stem cell-derived mesenchymal stromal cells reduces the minimal islet mass required to reverse diabetes. Scientific Reports. 5, (2015).
