Summary
É apresentado um método para o omental transplante de ilhotas em um rato. As ilhotas isoladas são misturadas com hidrogel e a mistura é colocada em bolsa omental de um rato diabético. Então, a glicose no sangue é monitorada, e é realizada a análise imuno-histoquímico.
Abstract
Transplante de ilhotas tem sido proposto para ser um potencial tratamento para o diabetes tipo 1. Recentes evidências indicam que a infusão intravascular Ilhéu está longe do ideal e, portanto, o omento é re-emergente como um local potencialmente valioso para transplante de ilhotas. Esse experimento requer o isolamento de ilhotas de alta qualidade e a implantação dos ilhéus aos destinatários diabéticos. Transplante para o omento requer etapas cirúrgicas que podem ser melhor demonstradas visualmente. Aqui, as etapas detalhadas para este procedimento são apresentadas. Dois métodos de misturar as ilhotas isoladas com hidrogel antes de colocar a mistura dentro da bolsa omental de ratos diabéticos são descritos aqui. Hidrogel diferentes é utilizados para as diferentes condições. Níveis de glicose de destinatários de rato diabético de ilhotas syngeneic no omento foram monitorados por até 35 dias. Alguns animais foram sacrificados após 14 dias para realizar a análise imuno-histoquímico. Esta abordagem pré-clínico de transplante pode ser usada como dados preliminares que antecederam a tradução para transplante clínico.
Introduction
De acordo com a Federação Internacional de Diabetes (IDF), o diabetes mellitus afeta atualmente 382 milhões de pessoas, com um aumento previsto de 592 milhões de pessoas por 20351. Em ambos os transplante alogênico e xenogénica ilhéu, terapia imunossupressora sistêmica é necessária. Sem imunossupressão, imune a rejeição é das principais causas de perda de enxerto2. Há também um problema significativo de perda de ilhéu transplantado devido o sangue instantânea mediada por reação inflamatória (IBMIR)3,4. No entanto, mesmo na ausência de uma resposta imune, tal como em syngeneic ou modelos de autotransplante, células das ilhotas transplantadas para o fígado através da veia porta são perdidas devido à inflamação e/ou a condições ambientais desfavoráveis, tais como sangue pobre fornecer com oxigenação reduzida e/ou nutrientes5,6. Como resultado, para assegurar a função metabólica a longo prazo, os números mais altos da ilha são necessários para compensar a perda de célula inicial que reduz a enxertia7.
Na tentativa de otimizar a enxertia ilhéu, vários sítios anatômicos alternativos têm sido investigados experimentalmente bem como clinicamente, com promissor, ainda não definitiva resulta8. Considerando que alguns dos sites alternativos oferecem acesso fácil e seguro (ex., pele, cápsula renal, submucosa gástrica e câmara anterior do olho) ou uma superfície mais ampla para maiores massas ilhéu (EG., cavidade peritoneal), sobrevivência e fisiológica performance metabólica dos ilhéus transplantados ainda são limitado e permanecem uma preocupação9. A busca de um local mais apropriado para enxertia Ilhéu está em curso.
O omento estava entre os muitos sites anatômicos que foram investigados no desenvolvimento precoce do transplante de ilhotas e provou ser um ambiente bem sucedido para Ilhéus10,11,12,13, 14. No entanto, infusão intraportal ilhota tornou-se o clínico escolha devido em parte para a relativa simplicidade do procedimento e6modelos de sucesso precoce no animal. Também, em parte, os negativos associados com este site, particularmente maciça perda precoce do Ilhéu, eram menos compreendido e menos a restrição nos primeiros dias do transplante de ilhotas experimental como o campo amadureceu. Com as mais recentes evidências indicando que a infusão intravascular Ilhéu está longe do ideal, o omento é re-emergente como um local potencialmente valioso para transplante de células.
O omento (sob a forma de uma bolsa omental) oferece vantagens relativas sobre o fígado15,16. É facilmente acessível e bem vascularizado. Permite a recuperação do enxerto (se necessário) e/ou biópsia. O período isquêmico vivido por Ilhéus é reduzido em comparação com o fígado, e o omento pode aceitar relativamente massas ilhéu grande, que não é possível intraportally, onde um aumento da pressão portal podem causar complicações.
Um modelo de mouse syngeneic de transplante foi usado no protocolo testado no estudo, empregando camundongos C57BL/6 do sexo masculino entre 6-8 semanas de idade com um peso corporal de 20 – 25 destinatários do Ilhéu de g. foram renderizados diabéticos com uma única injeção de estreptozotocina com uma dose de 250 mg/kg ip. A indução do diabetes pode ser considerada bem sucedida se o nível de glicose do sangue do rato é maior que 24 mmol/L 48 h após a injeção e permanece acima desse nível por um período mínimo de 5 dias.
Syngeneic ilhéus foram isoladas a partir do pâncreas de doadores de idade-combinadas seguindo métodos publicados anteriormente, com algumas modificações. Em breve, a colagenase foi injetado a vesícula em vez do ducto biliar. Isso foi feito como uma melhoria para facilitar a facilidade de injeção. Infusão de colagenase foi seguido de incubação, rompimento de tecido, separação de gradiente de densidade e de mão-colheita para obter puras ilhotas. Ilhéus foram cultivados durante a noite em CMRL-1066 suplementado com 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino (FBS) em balões T175 a 37 ° C, abaixo dos 95% ar - 5% CO2 antes do transplante.
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Protocol
Todos os mouses utilizados neste estudo foram obtidos a partir da centro médico Animal de Guangdong província. A utilização de animais foi aprovada pelo Hospital de ética revisão Comissão de Shenzhen segundo do povo, em conformidade com os princípios de bem-estar animal.
1. ilhéu transplante para o omento
Nota: Este protocolo requer 2 pessoas realizar.
- Monte o material cirúrgico, que está listado na tabela 1. Preparar o campo asséptico na área cirúrgica com materiais estéreis, como cortinas e descartáveis e manter condições assépticas durante cirurgia. Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos. Use vestidos estéril.
- Escolha os ilhéus usando uma ponta de pipeta 200 µ l sob o microscópio. Cada rato receberá 450-500 ilhéu equivalente (IEQ) por transplante. Para cada animal, coloque bastante Ilhéus para um único transplante em um tubo de pressão-top estéril 1,5 mL com 100 µ l de meio CMRL-1066.
Nota: Ilhéus podem ser isoladas no dia do transplante, mas é melhor para isolá-los um dia antes para permitir a recuperação para o processo de isolamento. - Manter os tubos de pressão-top com ilhotas no gelo até que esteja pronto para o transplante.
- Descongelar o hidrogel de matriz da membrana basal e mantê-lo no gelo depois de removê-lo do congelador a-20 ° C. O hidrogel é líquido a 4 ° C a 10 ° C e solidifica a temperaturas mais altas.
- Pesar e etiquetar todos os mouses destinatários diabéticos. 60 mg/kg pentobarbital de sódio injete intraperitonealmente. Teste a profundidade da anestesia através da administração de uma pitada de dedo do pé. Dar um adicional de 10 mg/kg pentobarbital de sódio, se o animal reage para o aperto. Se não houver nenhum retirar o reflexo, o nível da anestesia é correto para a cirurgia.
- Esfregue o local cirúrgico no abdômen usando etanol a 70%. Raspar o cabelo do site com uma lâmina de razer e desinfetar a área com Iodofor. Administre o vet pomada para os olhos para evitar ressecamento enquanto sob anestesia.
- Utilizar a tesoura oftalmológica para abrir o abdômen ao longo da linha média do abdômen com uma incisão de 4 a 5 cm. movimento dos intestinos para o lado esquerdo e cobrir com gaze embebida salina para prevenir a desidratação excessiva durante o procedimento de cirurgia.
- Use cotonetes de algodão totalmente expor o campo visual do estômago e localize o omento (localizado abaixo do estômago). Use dois pares de pinças bem para distender o omento. Tome cuidado para evitar danos de destruírem.
- O hidrogel é completamente descongelado neste ponto. Girar o tubo com os ilhéus por 30 s em 200 x g e remover o sobrenadante. Aspirar a 50 µ l de hidrogel, adicioná-lo ao tubo contendo os ilhéus e ressuspender a mistura suavemente, evitando a formação de bolhas. Manter os tubos em gelo durante o procedimento.
- Use dois pares de pinças para pegar as bordas do omento e delicadamente levantá-lo para formar um sulco entre a parede gástrica e intestinos que podem acomodar um pequeno volume de líquido com o enxerto de ilhéu.
- Deixe a segunda pessoa ajudar no procedimento e aspirar a mistura de ressuspensão ilhéu-hidrogel (todo o conteúdo do tubo) com uma ponta de pipeta de 200 µ l, entregar o conteúdo na ranhura.
- Certifique-se de que a mistura está bem posicionada no sulco suavemente, aumentando ou diminuindo as bordas do omento. Completa de posicionamento da mistura dentro de 3 min antes o hidrogel se solidifica como um efeito da temperatura do corpo. Depois define o hidrogel, dobre o omento para cobrir o enxerto.
Nota: O omento irá aderir à parede gástrica circundante como o hidrogel solidifica. - Depois que o hidrogel é completamente solidificado, use cotonetes para reposicionar os intestinos volta na cavidade abdominal, tomando cuidado para não tocar o site de transplante.
- Adicionar 20 µ l de cefalosporina (5 ~ 10 mg) na cavidade abdominal, para prevenir a infecção, em seguida, use 4-0 sutura para fechar o abdome.
- Retorne o mouse para sua gaiola e repetir todos os passos para cada destinatário de rato. Manter os ratos quentes e monitorar visualmente até totalmente recobra a consciência suficiente para manter a prostração esternal. Manter os ratos separado dos outros animais até que eles se recuperaram totalmente.
- Injete 50 µ l de sódio cefazolina (0,05 mg/mL) a cada dia por uma semana como profilaxia pós-operatório. Administrar bupivacaina + buprenorfina, ou seja, aplicar 1-3 gotas de 0.25% bupivacaina no local da incisão topicamente antes da colocação de clipes de ferida. Administrar Buprenorphine(0.03 mg/ml with sterile 0.9% saline, 0.05-0.10 mg/kg) via via intraperitoneal (IP).
- Medir o nível de glicose no sangue não-jejum de uma amostra de sangue da cauda-veia usando um medidor de glicose de sangue uma vez por dia após o transplante. Ao transplantar para o omento, o enxerto de ilhéu pode ter uma função retardada e não alcançar um nível de glicose no sangue completamente normal para 2-3 semanas.
- Para histologia, remova o enxerto omental do mouse ao final do experimento após o transplante. Fixe o tecido de acordo com os protocolos histológicos. O enxerto pode ser analisado para estudos de imunocoloração ou imunofluorescência.
2. título subsidiário para transplante para o omento
Nota: Um hidrogel de fibrina-trombina alternativo que é usado em temperatura ambiente pode ser substituído para o hidrogel de matriz de membrana basal. Consiste em 2 componentes, uma solução de proteína de selante de fibrina (50 U/mL trombina e fibrinogênio de 10 mg/mL). Quando os componentes são misturados, formam um coágulo que prende as ilhotas no lugar.
- Use o hidrogel de fibrina-thombin composto à temperatura ambiente. Como na etapa 1.2, cada rato receberá equivalentes do Ilhéu de 450-500 (IEQ) por transplante. Coloca os ilhéus num tubo estéril 1,5 mL agarrar-parte superior com 100 µ l de meio CMRL-1066. Imediatamente antes do transplante, Aspire os ilhéus para um tubo estéril de PE50 para um comprimento de 10 cm e centrifugar suavemente (30 s a 200 x g) para formar uma bola solta.
- Prepare o animal como acima referido (etapas 1.5-1.8) com o omento espalhar-se. Misturar os componentes de hidrogel (10 µ l/cada) e coloque sobre o omento. (Figura 3D)
- Imediatamente expulse os ilhéus da tubagem para o hidrogel. O hidrogel forma um coágulo em torno dos ilhéus. (Figura 3E)
- Dobre o omento o hidrogel e ilhotas para formar uma bolsa. (Figura 3F) Continue com passos 1.13 para 1.18.
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Representative Results
Post-digestive estado do pâncreas é mostrado na figura 1A. Purificada ilhotas são mostradas na figura 1B. Ditizona manchando e teste de viabilidade dos ilhéus são mostrados na Figura 2. As principais etapas da transplante de ilhotas para o omento são mostradas na Figura 3. Os níveis de glicose do sangue dos destinatários após transplante omental são mostrados na Figura 4. Análise histológica de enxertos é mostrado na Figura 5.
Figura 1 : Isolamento de digestão e ilhotas do pâncreas. (A) após a digestão do pâncreas. Observe as partículas de tamanho de areia em suspensão. (B) imagem de microscopia de luz dos ilhéus depois de isolamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Corantes de viabilidade ilhéu ditizona coloração e fluorescência. (A) ilhéus estão manchadas de vermelho pela ditizona. (B) microscopia de luz. (C) vermelho de fluorescência de iodeto de Propidium coloração (células mortas). (D) calceína-AM verde coloração (células viáveis). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Transplante no omento. (A) após a destinatário laparotomia, o estômago é exposto e o omento localizado. (B) ilhéus são misturados em hidrogel e lentamente colocadas o tecido omental. (C) ilhéu do enxerto na maior ampliação. O hidrogel é um estado semi solidificado. (D) método alternativo. Hidrogel é colocado sobre o omento sem ilhotas. (E) ilhotas são colocadas em cima do hidrogel. (F) o omento é dobrado em torno dos ilhéus. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Sangue glicose níveis pós-transplante. Non-jejum glicemia de destinatários (n = 7) até 35 dias após o transplante. Os destinatários do enxerto nem todos receber o mesmo lote de ilhotas para que existem diferenças na qualidade e função, resultando em grandes flutuações no nível de glicose no sangue.
Figura 5 : Histologia. Seções de enxerto (enxerto recuperação de 14 dias após transplante) foram coradas com hematoxilina, anticorpos anti-rato insulina e DAPI (núcleos). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Transplante de ilhotas no fígado através da veia portal é o método mais usado de transplante de ilhotas em seres humanos, mas ainda existem preocupações de segurança e eficiência como a veia porta-trombose e fígado esteatose17. Estudos recentes mostram que o omento pode ser uma alternativa adequada para o fígado, mas mais pesquisa precisa ser realizada antes da tradução clínica12,14,18,19.
O mouse é um modelo apropriado para testar o omento como um site de transplante de ilhotas. No rato, o omento está localizado sob a parede do estômago e geralmente é dobrado. No entanto, o tamanho do omento em camundongos é pequeno e desafiador para acesso. Para usá-lo para o transplante, é necessário que gentilmente se espalhar para fora para seu tamanho máximo, em seguida, dobre-o após a mistura de Ilhéus/hidrogel é depositada. Em um animal maior, o tecido omental é mais extensivo e pode ser suturado para construir uma ou mais bolsas no qual são depositados os ilhéus. O omento de rato é frágil e não aceita facilmente as suturas sem quebrar. Por esta razão, um hidrogel é usado para fazer a bolsa sem suturas.
O primeiro método (passos 1.1 – 1.18), o hidrogel usado é uma matriz de membrana basal e é composto de laminina, colágeno IV e fatores de crescimento. Ela se solidifica como aquece a temperatura do corpo. No segundo método (passos 2.1 – 2.4), um hidrogel diferente é usado composto de 50U/mL trombina e fibrinogênio de 10 mg/mL. Dois hidrogel diferentes é usados para mostrar a versatilidade desta técnica. Que pode ser adaptado para caber muitas circunstâncias e para estabelecer a prova do princípio. Para aplicações clínicas, se um malote suturado ou um hidrogel grau clínico é usado, a técnica pode ser combinada com uma abordagem minimamente invasiva, (ex., um método endoscópico de entrega para o omento). Para este objectivo, usando modelos pré-clínicos de mamíferos maiores de estudos adicionais são necessários.
O tempo para normalizar os níveis de glicose do sangue nos destinatários de rato após transplante no omento em nossos, bem como outros estudos sugerem que os ilhéus no omento exigem um pouco mais tempo para atingir a produção de insulina suficiente. Eficiência de revascularização parece ser um fator importante, conforme descrito no estudo. Se a presença de um hidrogel afeta a velocidade de revascularização ilhéu e desempenho, que permanece para ser determinado.
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Disclosures
Os autores relatam que não há conflitos de interesse.
Acknowledgments
Alguns dos autores deste trabalho foram apoiados em parte por concessões do nacional chave R & D programa de China (2017YFC1103704), projeto de Sanming de medicina em Shenzhen (SZSM201412020), fundo para alto nível médico disciplina construção de Shenzhen (2016031638), Shenzhen Fundação de ciência e tecnologia (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425110110658), Fundação de Shenzhen, da saúde e da Comissão de planejamento familiar (SZXJ2017021).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 5 inch (12-13 cm) Scissors | RWD Life Science | S12030-11 | |
| Fine Forceps | RWD Life Science | F11010-13 | |
| Small wound clips | RWD Life Science | R33003-01 | |
| Acutenaculum | RWD Life Science | F31044-13 | |
| 2 pair tissue forceps | RWD Life Science | F13023-10 | |
| 4-0 Suture with needle | Chenghe, China | 17094 | |
| 200 μL Pipette and tips | Gilson | PN11 | |
| One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| razor blade | Philips | HC1099/15 | |
| Material and animals | |||
| Pentobarbital Sodium | Sigmaaldrich.com | P3761 | For anesthesia |
| Hydrogel | bdbiosciences.com | 356234 | Basement Membrane Matrix |
| Fibrin-Thrombin Hydrogel | Baxter.com | 1501250 | Components clot when mixed |
| 70% Ethanol | Yingniu medical, Anhui, China | 23170608 | |
| Iodophor | Lierkang medical technology, Shangdong, China | 170521 | |
| Normal saline | Baxter.com | 2B1324 | |
| Cephalosporin | Lukang medical, Shangdong, China | 150303 | |
| Cefazolin | Baxter.com | 2G3508 | |
| lubricant eye ointment | Major Pharmaceuticals | 203964 | |
| streptozotocin | Sigmaaldrich.com | S0130 | |
| collagenase Type V | Sigmaaldrich.com | C9262 | |
| CMRL-1066 media | celltrans, Wenzhou, China | X018D1 | |
| histopaque | Sigmaaldrich.com | 10771 | density gradient |
| PE50 tubing | Braintreesci.com | PE50 100 FT | Polyethylene .023" x .038 |
| Calcein AM | Sigmaaldrich.com | C1359 | |
| Propidium iodide | Sigmaaldrich.com | P4864 | |
| optimal cutting temperature compound (OCT) | Tissue-Tek; Miles, Naperville, IL | 4583 | embedding medium |
| insulin antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 8138S | |
| hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 14166S | |
| eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc. | D1306 | |
| C57Bl/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | / | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| T175 flasks | Falcon | 353112 | |
| 1.5 mL Snap-top tubes | Axygen | MCT-150-C |
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