Summary
Взаимодействия и осаждения глины и бактериальных клеток в морской области, наблюдаемые в природных средах, можно лучше всего исследовать в контролируемой лабораторной среде. Здесь мы описываем подробный протокол, определяющий новый метод для определения СОЭ глины и цианобактерий floccules.
Abstract
По-прежнему в значительной степени обсуждаются механизмы, лежащие в основе осаждения мелкозернистых, богатой органическими осадками. В частности последствия взаимодействия частиц глины с реактивной, планктонные цианобактерий клетки осадочным запись под изучал. Это взаимодействие является потенциально крупный вклад в модели осадконакопления сланца. В лабораторных условиях, флокуляции и седиментации ставки этих материалов можно изучить и измеряется в контролируемой среде. Здесь мы подробно протокол для измерения скорости седиментации цианобактерий/глиняных смесей. Эта методология проявляется через описание двух образцов экспериментов: первый использует каолин (обезвоженный форма каолинит) и Synechococcus sp. PCC 7002 (морской коккоидный синезеленых водорослей), а второй использует Каолин и Synechocystis sp. PCC 6803 (пресноводных коккоидный синезеленых водорослей). Цианобактерий культур смешиваются с различное количество глины в рамках специально разработанные бак аппарата, оптимизированы, чтобы позволить непрерывного, в реальном времени видео и фотографические записи. А также после сбора протокол для точного измерения хлорофилл из которых может быть определена концентрация цианобактерий клеток, оставшихся в подвеска описаны процедуры выборки. Через экспериментальный репликации профиль построен, отображающий СОЭ.
Introduction
С помощью нынешних экологических условий и процессов для выведения мимо осадконакопления механизмов уже давно является основой седиментологии. Хотя современные осадконакопления аналоги, такие как Чёрного моря, были использованы для понимания осаждения органических богатые, мелкозернистые отложения, лабораторных экспериментов имеют потенциал, чтобы пролить дополнительный свет на происхождение сланцевых месторождений. Одной из областей по расследованию в генезе черные сланцы является скорость осаждения и механизм первоначального формирования. Традиционно было предположить, что черные сланцы образуется в средах, где СОЭ, первичной продуктивности и частота дыхания органического вещества способствуют сохранению органических веществ в отложениях1,2 ,3. Однако роль цианобактерий и флокуляции глины оставалось unconsidered. Этот механизм флокуляции позволит для быстрого осаждения органических богатые, мелкозернистые отложения происходят и не требуют низким содержанием кислорода. С учетом этой посылки, этот протокол имеет две цели: 1) измерение СОЭ цианобактерий/глина floccules и 2) визуализировать процесс седиментации в режиме реального времени. Эта методология, помимо геохимического анализа, был использован для демонстрации, что флокуляции глины/цианобактерий в действительности может быть важным механизмом для формирования сланцы1. Будучи изначально предназначенной для моделирования осаждения сланцев, этот метод применим других дисциплин, таких как биология и восстановлению окружающей среды где влияние глины ввода на бактериальных метаболизм и населения должны быть измерены.
Были проведены многочисленные исследования соблюдать флокуляции цианобактерий и глины, для смягчения вредных цветений водорослей2,3,4,5,6,7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 1 2. Однако, при измерении концентрации клеток со временем, эти исследования не применили флокуляции цианобактерий/глина моделирования осаждения рок-запись. Таким образом эти исследования не хватает визуальных компонент, который может быть критическим, когда моделирования прошлом седиментологические процессов. Кроме того, большинство исследований использовать подсчета клеток (например, Пан и др. 11), который может быть трудоемким. Наш метод, с последних достижений в измерения цианобактерий флокуляции, определяет изменения в концентрации цианобактерий, измеряя хлорофилла (ХЛ ) в дискретные интервалы. Сопряжения Chl измерение с помощью визуальных данных является новый подход, который может использоваться для определения условий осадконакопления. Изображения, созданные может также использоваться для вычисления СОЭ после работы от Du и др. 13. сочетание визуальных и цифровых данных укрепляет надежность результатов. Кроме того мы приводим дополнительные протоколы, позволяющие седиментации мертвых биомассы и глины также соблюдаться. Это имеет важное значение при рассмотрении прошлых седиментологические средах, где живут и мертвых биомассы может совместно произошло. Различия в поведении мертвых биомассы во время флокуляции (например, уменьшение темпов процесса флокуляции) потенциально будет иметь седиментологические последствия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка культур цианобактерий
-
Подготовка прививка культур с использованием твердого носителя
- Получите стерильных цианобактерий клетки от американского типа культуры или коллекции Пастер культуры. К примеру одноклеточные, морской Synechococcus sp. PCC 7002 был получен из коллекции культуры Пастера, он будет передан далее как Synechococcus.
- Сохранить Synechococcus клеток на тарелках, содержащих твердых сред (+ жидких сред14 1,5% агар и15). Эти будут именоваться далее прививка культур.
- Проинкубируйте пластины на 32 ± 2 ° C с непрерывный свет на 30 – 50 мкмоль фотоны м-2 s-1,15,18.
- Повторите шаги 1.1 – 1.3 и заменить + СМИ с16 BG-11 на шаге 1.1.2 пресноводных видов цианобактерий, например Synechocystis sp. PCC 680316,17, упоминаемые ниже как Synechocystis. Обратитесь к в таблицах 1 – 4 для состава A + и БГ-11 средств массовой информации.
-
Подготовка жидких культур: каждый танк эксперимент требует один 400 мл цианобактерий культуры.
- Собирайте один 250 мл и два 1 Л-жаростойкие колбу Эрленмейера.
- Промойте каждый флакон с раствором соляной кислоты (HCl) 4 М (30 мл раствора HCl для каждого колбу), следуют дистиллированной воды.
Предупреждение: соляной кислотой коррозионных и токсичных. Убедитесь, что во время использования раствор HCl 4 M носят лаборатории пальто, защитные очки и кислотостойкие перчатки. Выполните этот шаг в лаборатории раковину и местные правила утилизации раствор HCl 4 М - Заполните 250 мл флакон с 50 мл жидких сред (A + или BG-11). Заполните один флакон 1 Л с 400 мл жидких сред (A + или BG-11) и другие флакон 1 Л с 600 мл СМИ (A + или BG-11).
- Печать каждый флакон с пробкой газа проницаемыми пены и покрывать шею пробкой и колбу пены с фольги.
- Метка и автоклав фляги при 121 ° C и 100 кПа для 25 min. позволяют флаконы ему остыть до комнатной температуры.
- Подготовьте Ламинарный шкаф, стерилизации поверхности с 70% спирта.
- Собираем петлю прививка проволока, горелка Бунзена, охлаждаемый 50 мл жидких сред колбу (из шага 1.2.5) и прививка культуры (из шага 1.1). Поместите эти элементы в стерилизованные потока Худ.
- Стерилизовать цикл прививка проволока, кратко с помощью пламени горелки Бунзена и дайте ему остыть.
- Перетащите прохладный петли вдоль поверхности прививка культуры для сбора цианобактерий клетки.
- Удалить пробку пены и фольги шапку из флакон 250 мл (без касатьться пробку пены) и стерилизовать ОПРАВЫ колбу Эрленмейера, передав его кратко через пламя.
- Наклоните колбу так СМИ возле шеи колбу и вставьте цикла прививка, покрытые клеток в колбу. После цикла погружен в СМИ, перемешайте цикла прививок для удаления клеток.
- Удаление цикла прививок и повторно стерилизовать губы колбу с помощью горелки Бунзена пламени.
- Замените пены пробкой и фольги колпачок на колбу Эрленмейера (без касатьться пены пробку).
- Стерилизуйте прививка цикл кратко в пламени горелки Бунзена.
- Подготовьте комнату роста (упоминаемый как рост палата) где поддерживается температура 30 ° C15,18 и интенсивности света составляет 30 – 50 мкмоль фотоны м-2 s-1,15,18 . Влажность не контролируется активно.
- Разрешить привитых 50 мл культуры для инкубации путем встряхивания на 150 об/мин в камере роста, с поддерживать температуру 30 ° c. Держите рот колбу, охвачены во время агитации для контроля испарений потери и предотвращения загрязнения.
- Разрешить цианобактерий общество расти за 96 ч. Успешной культуры должны появляются ярко-зеленый и оптической плотности (OD) на 750 Нм 0,4 – 0,6.
- После того, как культура достаточно вырос, место культуры 50 мл и 1 Л флакон, содержащий 400 мл жидких сред в Ламинарный шкаф (от шага 1.2.5). Убедитесь, что поток капот стерилизованные следующий шаг 1.2.6.
- Повторите шаг 1.2.10 для обоих колбы в пределах Ламинарный шкаф.
- Залить 50 мл культуры в 400 мл СМИ в флакон 1 Л и повторно стерилизовать губы флакон 1 Л, с помощью горелки Бунзена пламени.
- Месте пены пробкой и фольги шапку приложите стерильные восходящей аппарат, состоящий из пены пробкой, пипетки, пластиковые трубы, в линии фильтром и пленочные покрытия до устья колбу.
- Агитируйте флакон 1 Л на 150 об/мин при 30 ° C с аппаратом барботер придает воздушный насос, который циркулирует увлажненные воздушной смеси через15,решение18 300 мл/мин.
- Разрешить общество расти в камере роста на 30 ° C для 120 – 168 ч. Успешной культуры должен появляются ярко-зеленый и ОД750 Нм 0,4 – 0,6.
- Повторите шаг 1.2 производить культуры управления, которая не следует смешивать с глиной.
- Эксперименты с использованием мертвых биомассы требуется дополнительный шаг. Автоклав флакон 1 Л культура 60 мин при температуре 121 ° C и дайте ему остыть до комнатной температуры.
2. Экспериментальная установка
- Место прямоугольные акриловые танк (длина 20 см), ширина 5,1 см и высотой 30 см перед банком флуоресцентных ламп (девять ламп T8, по крайней мере 2600 люмен; Рисунок 1) 19.
- Место прозрачный, белый пластиковый лист между банком огней и танк диффузный свет, который светит через бак. Эта установка была адаптирована из Сазерленд и др. 19
- Марк акриловый бак на высоте 10 см, измеренной вертикально от основания. Все измерения должно быть сделано на этой высоте в толщу воды для обеспечения согласованности всех проб.
- Установите камеру на штатив, 1 м спереди танк для записи каждого эксперимента. Видео камеры рекомендуется как можно извлечь изображения из видео файлов, и с помощью математического моделирования программного обеспечения, видео файлы могут использоваться для моделирования осаждения динамика19.
- Поместите черной ткани легких банк, танк и камеры, чтобы оградить эксперимент от внешних источников света (рис. 1).
3. флокуляции экспериментальный протокол
- Соберите 400 мл культуры (шаг 1.2), большой мерного цилиндра и 600 мл дополнительных питательных сред в колбе 1 Л (шаг 1.2.5).
- 400 мл культуры (первоначальная клеточная концентрация 4 – 6 мг/мл) с дополнительного роста СМИ (A + или BG-11) разбавляют до конечного объема 1 Л, с использованием мерного цилиндра. Добавьте это решение акриловый бак.
- Готовить 2 мл отцентрифугировать трубы, маркировки и размещение их в удобном месте вблизи акриловый бак. Мера 50 g глины для эксперимента.
- Начните запись видео. В случае нескольких экспериментов знаком с идентификатор эксперимента временно могут быть проведены перед камерой.
- С помощью пипетки, взять образец 1 мл и поместите его в трубу помечены отцентрифугировать. Используйте этот пример для определения первоначальных цианобактерий, измеряя ОД750 Нм значения. Принять все образцы в трех экземплярах для обеспечения точных результатов.
- Быстро залейте глины (50 g) в бак с энергичным перемешиванием с помощью перемешивания палку для 10 – 15 s.
- Запустите таймер и принимать начальный 1 мл капель для КХЛ определения с помощью пипетки P1000 (пример время0) .
- Принять дополнительные образцы в соответствующие временные интервалы (например, 1 мин, 2 мин, 3 мин, 4 мин, 5 мин, 10 мин, 15 мин, 30 мин, 60 мин, 180 мин и 240 мин).
- По окончании эксперимента сохранить видео файл, выключить видеокамеру и обрабатывать все образцы определения ХЛ (шаг 4).
- Автоклав оставшийся раствор глины/цианобактерий. В зависимости от видов цианобактерий местные правила и политики лаборатории, распоряжаться решения с помощью соответствующих методов. Очистить бак с мылом и водой, промойте его с дистиллированной водой, и его высушите на воздухе.
- Подготовьте эксперимент управления глиной, не добавлены. Брать пробы на тех же точках времени. Эти данные можно сравнить с другими экспериментальные данные для подтверждения, что урегулирование ставок повышаются благодаря флокуляции с глиной, не является результатом естественных урегулирования.
- Если мертвые биомасса используется в ходе эксперимента, используйте ту же процедуру экспериментальной. Однако процедура удаления решения не требует автоклавирования.
4. образец обработки и оценки
- Определите Chl концентрация в каждой ячейки выборки с помощью процедуры изменения от Owttrim16 . После сбора, окатышей клетки от каждого образца 3 мин на 13 000 x g с помощью microcentrifuge при комнатной температуре.
- Удалите излишки средств массовой информации, с помощью пипетки P1000 и добавьте 1 mL 100% метанола (20 ° C). Вихрь образца на полной скорости за 1 мин до Ресуспензируйте Пелле ячейки.
Предупреждение: Метанол, токсичными и легковоспламеняющимися. Надевайте перчатки и защитные очки и держать вдали от источников воспламенения метанола. - Проинкубируйте образцы в-20 ° C в течение 24 ч для облегчения извлечения КХЛ .
- После инкубации Пелле сотовой мусора, как описано в пункте 4.1, передавать зеленый супернатанта кювета с помощью пипетки и поместите кювету в спектрофотометра. Разрешить для отдыха в спектрофотометре за 1 мин для того, чтобы любые оставшиеся глины в образце оседает и не вмешиваться с измерением образца.
- Определение концентрации Chl спектрофотометрически путем измерения оптической плотности на 665 нм и 652 Нм и ОД на 750 Нм. Концентрации Chl определяется с использованием формулы Chl = 16.29 x (665 - ОД750) - 8,54 x (652 - ОД750) 20. КХЛ концентрация используется в качестве прокси для концентрации клеток. Кроме того, коэффициент пересчета 7,4 x 1010 клеток/Л = 10 г/Л21 может использоваться для расчета концентрации клеток в граммах некоторых цианобактерий видов.
- Участок Chl расчитанным против времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
При контакте с глиной, цианобактерий клетки были привлечены из подвеска22. Это проявляется в результатах представителя здесь. Чтобы определить эффект глины на популяций цианобактерий и соблюдать седиментации ставок, были проведены две эксперименты, во время которых подвергаются Synechococcus и Synechocystis до 50 г/Л каолиновые глины (Таблица 5-6, Рисунок 2-3). Цианобактерий культур выращивали как описано в шаге 1. Впоследствии после настройки танк (шаг 2), разбавленных Synechococcus культура заливается в бак и смешивают с 50 г каолиновой глины, после шага 3. Это было повторено для Synechocystis культуры. Все образцы были собраны из той же позиции в баке. Образцы были обработаны и измерения ОД652 и ОД665 , а также расчетное значение Chl даны для Synechococcus (Таблица 5) и Synechocystis (Таблица 6). Эти результаты были изобразить графически в линии участков и сравниваются с результатами стандартов для определения, если уровень осаждения цианобактерий/глиняных смесей был выше, чем уровень естественной усадки цианобактерий только. Эти результаты показывают, что цианобактерий населения были привезены из подвеска в течение 10 минут воздействия глины (рис. 2– 3). Морской Synechococcus показали более быстрые темпы седиментации чем пресная вода Synechocystis, которая согласуется с гипотезой, что трехвалентный катионов (распространены в среднего роста, который имитирует соленость морской воды) выступать в качестве промежуточного агента между глинистых частиц и бактериальные клетки, облегчение процесса флокуляции и, следовательно, седиментации1.
Важно отметить, что на рисунке 3, есть некоторые аномально высокие результаты, специально в данных момент 2. Это пример обработки образца, во время которого шага 4.4 достаточно не последовало и образца стала мутная во время измерения. Это производит искусственно высокий результат (рис. 2, точка данных 2). Пример изображения в ряды, извлеченных из видео предоставляются в Рисунок 4, взято из Playter и др. 22. Важно отметить, что каолинит (не каолин) был использован в Playter и др. 22.
Рисунок 1 : Пояснительная диаграмма, иллюстрирующая экспериментальной установки. Видео камеры установлен по крайней мере 1 м из бака аппарата. Бак наполнен 1 Л цианобактерий и жидких сред. Огни освещают цистерны сзади и свет рассеивается, полупрозрачная пленка. Этот весь набор draped с черной тканью, чтобы устранить дополнительные источники света. Этот рисунок был изменен с Сазерленд и др. 19. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : КХЛ концентрации рассчитаны от ОД значения, приведенные в таблице 1. Эти значения являются от Synechococcus /смеси каолина (желтый). Сравнение с Chl концентрации для Synechococcus только (синий) показывает увеличение СОЭ цианобактерий/глина смеси. Этот показатель был изменен с Playter и др. 22. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: ХЛ концентрации рассчитаны от ОД значения, приведенные в таблице 2. Эти значения являются от Synechocystis /смеси каолина (желтый). Сравнение с Chl концентрации для Synechocystis только (синий) показывает увеличение СОЭ цианобактерий/глина смеси. Этот показатель был изменен с Playter и др. 22. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Представитель время курс Synechococcus-осаждения каолинита. Эти снимки извлекаются из записанного видео в дискретные интервалы (1 мин). Этот показатель был изменен с Playter и др. 22. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| На 1 Л |
| 18 г NaCl |
| 0,6 г хлористого калия |
| 1 g NaNO3 |
| 5 г MgSO4 ∙ 7 H2O |
| 1 мл х2PO4 |
| 7.2 мл CaCl2 |
| 161 мкл Na2ЭДТА |
| 1 мл FeCl3 ∙ 6 H2O |
| 10 мл трис-HCl рН 8,2 |
| 1 мл P1 металлов складе * |
Таблица 1: рецепт + СМИ 14 . Обратитесь к таблице 2 для состава запасов металлов P1. Этот рецепт производит 1 Л средств массовой информации.
| За 1 Л P1 складной приклад |
| 34.26 g H3Бо3 |
| 4.32 g НКД ∙2 H2O |
| 0,315 g ZnCl |
| 0,03 г MoO3 (85%) |
| 0,003 г CuSO4 ∙ 5 H2O |
| 0.01215 г CoCl2 ∙ 6 H2O |
Таблица 2: Рецепт для P1 металлов запасов, необходимых для + СМИ.
| На 1 Л |
| 10 мл NaNO3 |
| 1 мл K2HPO4 |
| 1 мл MgSO47 H2O |
| 1 мл CaCl2 2 H2O |
| 1 мл раствора лимонной кислоты H2O |
| 1 мл раствора железа аммония цитрат |
| 1 мл DiNaEDTA |
| 1 мл Na2CO3 |
| 1 мл A5 микроэлементов * |
Таблица 3: рецепт для BG-11 СМИ 16 . Обратитесь к таблице 4 состава микроэлементов A5. Этот рецепт производит 1 Л средств массовой информации.
| На 1 Л Стоковый раствор |
| 2.86 g H3Бо3 |
| 1.81 g НКД2 4 H2O |
| 0,222 g ZnSO4 7 H2O |
| 0.390 g Na2MoO4 2 H2O |
| 0.079 g CuSO4 5 H2O |
| 0,40 г CoCl2 6 H2O |
Таблица 4: Рецепт для A5 микроэлемент запасов, необходимых для BG-11 СМИ.
| Образец время (мин) | OD 665 Нм | OD 652 Нм | КХЛ (мг/мл) |
| -1 | 0.563 | 0.373 | 5.986 |
| 0 | 0.428 | 0,33 | 4.154 |
| 5 | 0,112 | 0,046 | 1.432 |
| 10 | 0,024 | 0,036 | 0,084 |
| 15 | 0,027 | 0,025 | 0.226 |
| 30 | 0,007 | 0,002 | 0,097 |
| 60 | 0 | 0,061 | 0,000 |
| 120 | 0,007 | 0,061 | 0,000 |
| 180 | 0.005 | 0,012 | 0,000 |
| 240 | 0.005 | 0,012 | 0,000 |
Таблица 5: OD 665 и ОД 652 измерения для Synechococcus присутствии каолиновые глины 50 г/Л. КХЛ значения вычисляются по формуле в шаге 4.4. Обратите внимание, что образцы Т6 и Т7 отсутствуют. Это пример не соблюдая интервал последовательной выборки согласно протокола ячейки выборки. Данные для стандарта взяты из Playter, и др. (2017) 2.
| Образец время (мин) | OD 665 Нм | OD 652 Нм | КХЛ (мг/мл) |
| -1 | 0,384 | 0.345 | 3.309 |
| 0 | 1.863 | 1,739 | 15.497 |
| 5 | 0,64 | 0.528 | 5.916 |
| 10 | 0,217 | 0.216 | 1.690 |
| 15 | 0,104 | 0,089 | 0.934 |
| 30 | 0,126 | 0.169 | 0.609 |
| 60 | 0.424 | 0.402 | 3.474 |
| 90 | 0.115 | 0,048 | 1,463 |
| 120 | 0,016 | 0,007 | 0,201 |
| 180 | 0,012 | 0,004 | 0.161 |
| 240 | 0,011 | 0.005 | 0,136 |
Таблица 6: OD 665 и ОД 652 измерения для Synechocystis в присутствии 50 г/Л каолиновые глины. КХЛ значения вычисляются по формуле в шаге 4.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Флокуляции, катализируемые цианобактерий клеток глина взаимодействия привлекла большой интерес в области экологии и инженерных2,3,4,5,6,7 ,8,9,10,11,12, однако расследование этих взаимодействий с целью моделирования осаждения осадочных Депозиты (например, сланцы) является относительно новой. Визуализация этого процесса, в этом случае для седиментологические приложений, не сообщалось. В последних исследованиях флокуляции эти взаимодействия были исследованы путем смешивания глины и цианобактерии в банки, пробирки, или мензурки и выборки в дискретные время интервалов9,11,12, 26 для определения изменений в концентрации клеток через время. Эти исследования измеренные концентрации цианобактерий клеток различными способами. Например пробы цианобактерий населения были измерены путем подсчета с помощью микроскопа9,11,12,26. По сравнению с первоначальной ячейки концентрации, эффективность удаления может быть вычисляемых9,11,12,26. В отдельном исследовании, после позволяя смесь глины/ячейку поселиться оставшееся жидкости выше поселились клеток/глина отложений пробы и проанализированы для флуоресценции оценить количество оставшихся ячеек в подвески3. Измерений ХЛ столбец пробах воды также были использованы для расчета концентрации клеток8,10.
В противоположность этому наша методология меры клеток в суспензии с течением времени, основываясь на методологии Sengco, et al. 4 путем проведения измерений выберите время на протяжении всего процесса и сопряжения эти интервалы времени с видео в реальном времени изображений. По сравнению с другими экспериментальные протоколы с участием урегулирования глины присутствии анионные флокулянты, используя биологические (водоросли и цианобактерии) или флокулянты небиологических (синтетический хлопьевидный агентов), наш анализ отличается по многим отсчеты. Во-первых наше исследование предполагает использование коккоидный видов морских цианобактерий, тогда как многие другие исследования связаны с пресной воды видов или видов, которые производят внеклеточный полисахарид веществ5,,2324 , 25. Кроме того, наше исследование предполагает использование стандартной цистерны, в течение которого решение остается неизменным. Это контрастирует с исследований, проведенных с использованием пробирки или цилиндров3,12,14 или лотковыми танков, где поток жидкости является переменной интерес6,7. Статический характер нашего экспериментального метода позволяет для измерения базовых ставок седиментации, где floccules не удерживаются во взвешенном состоянии турбулентного потока. Кроме того использование танк вместо пробирку, jar или стакан, позволяет для наглядности результирующая отложений из-за плоской танк сторон; видео изображения показывают отсутствие искажения из-за изгиба и свет равномерно рассеяны. В-третьих, методология описываемые меры флокуляции ставки на коротких (2 мин интервалами) и длинный срок (часовыми интервалами); Кроме того изображения может быть скомпилирован в масштабах от секунд до минут, позволяя как визуализация процесса, так и дополнительные измерения коэффициента усадки. Большинство исследований мера флокуляции ставки свыше половины час интервалами5,6,23,25 или просто мера окончательное количество ячеек слева в подвеска после одного времени точки (2 – 2.5 ч)9,24, хотя некоторые исследования9 измерить изменения в ячейке или Chl концентрации за 2 минуты интервалы . Выбранный интервал выборки имеет решающее значение, как флокуляции может произойти быстро (в течение 5-10 мин)22. Наконец, одним из основных преимуществ нашей методологии является, что она производит в реальном времени изображений процесса флокуляции, не просто производимых агрегатов (например., Avnimelech и др., 1982)24. Имея две строки данных, концентрация клеток от проб и визуальных доказательств, усиливает достоверность результатов и поддерживает надежные выводы.
В то время, как это подходит для измерения ставки флокуляции глины и цианобактерий, наш протокол требует осмотрительности в отношении выборки расположение внутри цистерны. Той же области танк (x, y, z) должны отбираться каждый раз или образец результаты могут стать искажены. Также необходимо чтобы все частицы поселиться до од измерений. Важнейшие шаги включают в себя: i) с помощью соответствующей выборки интервал, который остается согласованным для всех экспериментов и ii) обеспечение глины/цианобактерий Пелле достаточно сломанной после добавления метанола для обеспечения надлежащего добычи хлорофилл от клеток.
Метод, описанный здесь также ограничивается моделирования флокуляции полностью кислородом условиях. Экспериментальный аппарат и процедура будет нужно быть изменены моделировать столбец стратифицированной воды с анаэробной нижней воды.
В седиментологические контексте этот метод имеет потенциал для применяться для моделирования месторождений соотношения различных глины или биологических материалов для того, чтобы понять такие аспекты, как изменения органического вещества и солености из речного ввода. Кроме того отложений, производится с помощью этого метода может использоваться для изучения последствий потенциальных шторма, переработку на флок согласованности ремиксы или агитации. По спаривания прямого измерения концентрации цианобактерий с визуальные образы, этот протокол выходит за рамки традиционных приложений процессы флокуляции цианобактерий/глина и позволяет для этих процессов в отношении седиментологические Моделирование рок-запись.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы с благодарностью признать, финансирование от естественных наук и инженерных исследований Совет Канады (05448, 165831 и 213411).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cyanobacteria (in this study: Synechococcus sp. PCC 7002 and Synechocystis sp. PCC 6803) | Pasteur Culture Collection | PCC 7002 or PCC 6803 | used to inoculate the plates |
| agar | Thermo Scientific | CM0003 | used to fill two petri dishes |
| Petri plates (standard bacteriology, 100 x 15 mm) | Sarstedt | 82.1473.001 | 2 required |
| 1 L heat resistant Erlenmeyer flask | Pyrex | 4980-125 | 1 required |
| 250 mL heat resistant Erlenmeyer flask | Pyrex | 4980-250 | 1 required |
| Nichrome inoculating loop with handle | Fisher Scientific | 14-956-103 | 1 required |
| tinfoil | Reynolds Wrap Aluminum Foil | 89079-067 | 50 cm required; used to cover foam stopper and neck of erlenmeyer flasks |
| growth media (e.g. A+) | 1050 mL required; produced using composition described in tables 1-4 | ||
| Bunsen Burner | Fisher Scientific | S95941 | 1 required |
| plastic tubing | Fisher Scientific | S504591 | 1 m required; used to create the bubbling apparatus |
| sponge stopper | Jaece Industries Inc | 14-127-40E | 1 required; hole made in center for pipette; used for constructin the bubbling apparatus |
| acrylic sheet | Home Depot | Optix clear acrylic sheet model # MC-102S | 1 required; used to construct acrylic tank (20 x 30 x 5.1 cm) |
| clear waterproof silicone adhesive | Home Depot | Loctite clear silicone model # 908570 | 1 required; used to construct acrylic tank (20 x 30 x 5.1 cm) |
| camera or video recorder | Panasonic | HC-V770 HD camcorder | 1 required |
| tripod | Magnus | VT-300 | 1 required |
| black cloth | primomart | EAN 0726670162199; Part number 680254blacknappedfr | 1 required; duvetyne light block-out cloth; approximatly 152 x 213 cm to cover tank experiment |
| heat resistant serological pipet | corning incorporated C708510 | 13-671-101G | 1 required; used to create the bubbling apparatus |
| sample vials | Dynalon | S30467 | at least 12 (will vary with time interval chosen) |
| heat resistant glass pipette | Fisher Scientific | Corning Incorporated C708510, 13-671-101G | 1 required; used to create the bubbling apparatus; Polystyrene serological pipet would also work, but should be connected to the tubing and stopper after the rest of the apparatus is autoclaved. |
| microcentrifuge | Eppendorf | 22 62 120-3 | 1 required;Comparable products may be used if capable of centrifuging 1.5 -2 mL microfuge tubes at 13,000 x g |
| vortex machine (Vortex-Genie 2) | Scientific Industries, Inc | SI-0236 | 1 required |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-500 SDS | at least 12 mL (1mL per sample) required; Caution: Flammable, toxic. Wear gloves and safety glasses. Do not use or store near ignition source. Alternate sources may be used. |
| cuvettes (1.6 mL, polystyrene) | Sarstedt | 67.742 | at least 12 required |
| spectrophotometer | Fisher Scientific | 222-271600 | 1 required; Pharmacia Biotech Novaspec ll could also be used. |
| light bulbs | Home Depot | model # 451807; internet #205477895; store SKU #1001061538 | 6-8 bulbs required to provide light for the tank experiments |
| pipette (Pipetman Classic P1000 | Gilson | F123602 | used to collect samples |
| 37 % Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | Caution: Corrosive and toxic. Wear lab coat, safety glasses and acid-resistant gloves while using. Prepared to 4 N before use by dilution into deionized water in a chemical fumehood. |
| Foam stopper (small) | Canlab | T 1385 | |
| Foam stopper (large) | Canlab | T 1387 | Requires some intact stoppers and some with a single hole through the centre |
| 30 °C incubator/growth room with continuous illumination | 1 required | ||
| 70 % Ethanol | Fisher Scientific | BP8201500 | 30 mL required;Caution: Toxic and flammable. Wear lab coat and safety glasses |
| hydrophobic air filter (Midisart 2000, 0.2 µm) | Sartorius | 17805 | 1 required |
| clay (e.g. kaolin) | Fisher Scientific | MFCD00062311 | at least 50 g required |
| microfuge tubes (2 mL, polypropylene) | Sarstedt | 72.695.500 | Comparable products may be used. At least 12 (will vary with time interval chosen) |
| 1000 µL pipet tips | Sarstedt | 70.762 | 1 required |
References
- Macquaker, H. S., Keller, M. A., Davies, S. J. Algal blooms and "marine snow": mechanisms that enhance preservation of organic carbon in ancient fine-grained sediments. J. Sediment. Res. 80, 934-942 (2010).
- Tyson, R. V. Sedimentation rate, dilution, preservation and total organic carbon: some results of a modeling study. Org. Geochem. 32, 333-339 (2001).
- Piper, D. Z., Calvert, S. E. A marine biogeochemical perspective on black shale deposition. Earth-Sci. Rev. 95, 63-96 (2009).
- Sengco, M. R., Li, A. S., Tugend, K., Kulis, D., Anderson, D. M. Removal of red- and brown-tide cells using clay flocculation I. Laboratory culture experiments with Gymnodiniumbreve and Aureococcus anophagefferens. Mar. Ecol. Prog. Ser. 210, 41-53 (2001).
- Guenther, M., Bozelli, R. Factors influencing algae-clay aggregation. Hydrobiologia. 523, 217-223 (2004).
- Archambault, M. -C., Grant, J., Bricelj, V. M. Removal efficiency of the dinoflagellate Heterocapsa triquetra by phosphatic clay and implications for the mitigation of harmful algal blooms. Mar. Ecol. Prog. Ser. 253, 97-109 (2003).
- Beaulieu, S. E., Sengco, M. R., Anderson, D. M. Using clay to control harmful algal blooms: deposition and resuspension of clay/algal flocs. Harmful Algae. 4, 123-138 (2005).
- de Magalhães, L., Noyma, N., Furtado, L., Mucci, M., van Oosterhout, F., Husza, V., Marinho, M., Lürling, M. Efficacy of coagulants and ballast compounds in removal of cyanobacteria (Microcystis) from water of the tropical lagoon Jacarepaguá (Rio de Janeiro, Brazil). Estuaries and Coasts. 40, 121-133 (2017).
- Li, L., Pan, G. A universal method for flocculating harmful algal blooms in marine and fresh waters using modified sand. Environ. Sci. Tech. 47, 4555-4562 (2013).
- Miranda, M., Noyma, N., Pacheco, F. S., de Magalhães, L., Pinto, E., Santos, S., Soares, M., Huszar, V., Lürling, M., Marinho, M. The efficiency of combined coagulant and ballast to remove harmful cyanobacterial blooms in a tropical shallow system. Harmful Algae. 65, 27-39 (2017).
- Pan, G., Chen, J., Anderson, D. Modified local sands for the mitigation of harmful algal blooms. Harmful Algae. 10, 381-387 (2011).
- Shi, W., Tan, W., Wang, L., Pan, G. Removal of Microcystis aeruginosa using cationic starch modified soils. Water Research. 97, 19-25 (2016).
- Du, J., Pushkarova, R. A., Smart, R. A cryo-SEM study of aggregate and floc structure changes during clay settling and raking processes. Int. J. Miner. Process. 93, 66-72 (2009).
- A+ Medium Recipe, 2017. UTEX Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin. , Available from: http://web.biosci.utexas.edu/utex/Media%20PDF/a%20plus%20medium.pdf (2017).
- Stevens, S. E., Porter, R. D. Transformation in Agmenellum quadruplicatum. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77, 6052-6056 (1980).
- Owttrim, G. W. RNA helicases in cyanobacteria: biochemical and molecular approaches. Methods Enzymol. 511, 385-403 (2012).
- Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria. Microbiology. 111, 1-61 (1979).
- Chamot, D., Owttrim, G. W. Regulation of cold shock-induced RNA helicase gene expression in the cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120. J. Bacteriol. 182, 1251-1256 (2000).
- Sutherland, B. R., Barrett, K. J., Gingras, M. K. Clay settling in fresh and salt water. Environ. Fluid Mech. 15, 147-160 (2014).
- Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta. 975, 384-394 (1989).
- Liu, Y. X., Alessi, D. S., Owttrim, G. W., Petrash, D. E., Mloszewska, A. M., Lalonde, S. V., Martinez, R. E., Zhou, Q. X., Konhauser, K. O. Cell surface reactivity of Synechococcus sp. PCC 7002: implications for metal sorption from seawater. Geochim. Cosmochim. Acta. 169, 30-44 (2015).
- Playter, T., Konhauser, K., Owttrim, G., Hodgson, C., Warchola, T., Mloszewska, A. M., Sutherland, B., Bekker, A., Zonneveld, J. -P., Pemberton, S. G., Gingras, M. Microbe-clay interactions as a mechanism for the preservation of organic matter and trace metal biosignatures in black shales. Chem Geol. 459, 75-90 (2017).
- Verspagen, J. M. H., Visser, P. M., Huisman, J. Aggregation with clay causes sedimentation of the buoyant cyanobacteria Microcystis spp. Aquat. Microb. Ecol. 44, 165-174 (2006).
- Avnimelech, Y., Troeger, B. W., Reed, L. W. Mutual flocculation of algae and clay: evidence and implications. Science. 216, 63-65 (1982).
- Chen, L., Men, X., Ma, M., Li, P., Jiao, Q., Lu, S. Polysaccharide release by Aphanothece halophytica inhibits cyanobacteria/clay flocculation. J. Phycol. 46, 417-423 (2010).
- Pan, G., Zhang, M. -M., Chen, H., Zou, H., Yan, H. Removal of cyanobacterial blooms in Taihu Lake using local soils. I. Equilibrium and kinetic screening on the flocculation of Microcystis aeruginosa using commercially available clays and minerals. Environ. Poll. 141, 195-200 (2006).
