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Biochemistry

झिल्ली प्रोटीन के बीच डिटर्जेंट-संवेदनशील बातचीत का पता लगाने

Published: March 7, 2018 doi: 10.3791/57179
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry, Boston University School of Medicine

Summary

हम झिल्ली प्रोटीन के बीच डिटर्जेंट-संवेदनशील बातचीत का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन छंटाई रिसेप्टर, sortilin, ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर प्रोटीन, GLUT4, एक उदाहरण के रूप में की पहली चमकदार पाश के लिए बाइंडिंग का उपयोग कर ।

Abstract

प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का पता लगाने की हमारी क्षमता सेल में विनियामक कनेक्शन को समझने की कुंजी है । हालांकि, कई मामलों में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का पता लगाना महत्वपूर्ण प्रायोगिक चुनौतियों से जुड़ा होता है. विशेष रूप से, छंटाई रिसेप्टर्स झिल्ली डिब्बों के लुमेन में अक्सर एक डिटर्जेंट-संवेदनशील फैशन में उनके प्रोटीन कार्गो के साथ बातचीत, इन प्रोटीन के सह immunoprecipitation बना अनुपयोगी । ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर GLUT4 के लिए छंटाई रिसेप्टर sortilin के बंधन झिल्ली प्रोटीन के बीच कमजोर चमकदार बातचीत का एक उदाहरण के रूप में सेवा कर सकते हैं । यहां, हम एक तेज, सरल, और सस्ती परख का वर्णन करने के लिए sortilin और GLUT4 के बीच बातचीत मांय । उसके लिए, हम डिजाइन और रासायनिक संश्लेषित किया है myc-टैग sortilin के चमकीले हिस्से में क्षमता बाध्यकारी epitope के अनुरूप पेप्टाइड GLUT4 । Sortilin छह histidines के साथ टैग स्तनधारी कोशिकाओं में व्यक्त किया गया था, और कोबाल्ट मोतियों का उपयोग कर सेल lysates से पृथक । मोतियों पर Sortilin मैटीरियल अलग पीएच मूल्यों पर पेप्टाइड समाधान के साथ मशीन था, और eluted सामग्री पश्चिमी सोख्ता द्वारा विश्लेषण किया गया था । यह परख आसानी से अंय डिटर्जेंट के प्रति संवेदनशील प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

Introduction

GLUT4 एक ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर प्रोटीन है जो मुख्य रूप से वसा और कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है, जहां यह पोस्ट-prandial रक्त ग्लूकोज की निकासी पर इंसुलिन का प्रभाव मध्यस्थता1. एक बहुत ही स्थिर प्रोटीन होने के नाते, GLUT4 एक के बाद अनुवाद स्तर पर विनियमित है । इंसुलिन के अभाव में, GLUT4 काफी हद तक प्लाज्मा झिल्ली से बाहर रखा गया है (इसलिए ग्लूकोज के लिए कम बेसल पारगम्यता) और मुख्य रूप से छोटे इंसुलिन उत्तरदायी बुलबुले में सेल के अंदर स्थानीयकृत (IRVs) और ट्रांस-Golgi नेटवर्क (TGN) है कि प्रतिनिधित्व करने की संभावना है IRV दाता डिब्बे । इंसुलिन प्रशासन पर, IRVs प्लाज्मा झिल्ली के साथ फ्यूज और अपने कामकाज की साइट के लिए GLUT4 उद्धार । यह ग्लूकोज के लिए प्लाज्मा झिल्ली की पारगम्यता बढ़ जाती है, इतना है कि adipocytes और कंकाल myocytes में रक्त से ग्लूकोज आगे बढ़ जाता है 10 करने के लिए 40 गुना. इंसुलिन वापसी के बाद, GLUT4 जल्दी में आंतरिक है/छंटाई endosomes और फिर TGN जहां IRVs फिर से बना रहे है के लिए प्राप्त की । दोनों GLUT4 मार्ग में कदम छँटाई, अर्थात् परिधीय जल्दी endosomes से perinuclear TGN के लिए है़, और IRVs दाता झिल्ली पर TGN के गठन Vps10p परिवार के सदस्य, sortilin द्वारा सक्षम हैं, जो एक प्रकार का प्रतिनिधित्व करता है i transmembrane प्रोटीन और एक छंटाई रिसेप्टर । एक मॉडल के अनुसार, sortilin एक transmembrane पाड़ प्रोटीन के रूप में काम करता है: यह endosomes और TGN के लुमेन में GLUT4 बांधता है, और अपनी सी के माध्यम से दाता झिल्ली के retromer पक्ष को clathrin या cytoplasmic एडेप्टर भर्ती-टर्मिनस2, 3. यह vesicular वाहकों में GLUT4 के वितरण की सुविधा है कि translocate GLUT4 के बीच intracellular डिब्बों ।

retromer और विभिंन एडेप्टर प्रोटीन के साथ sortilin के cytoplasmic पूंछ की बातचीत अच्छी तरह से प्रलेखित किया गया है । हालांकि, GLUT4 करने के लिए sortilin के बंधन (और इसके अंय प्रोटीन लाइगैंडों के कई) को साबित करने के लिए चुनौती दी गई है । विशेष रूप से, सह के लिए प्रयास immunoprecipitate sortilin और GLUT4 सफल नहीं किया गया है शायद इन दो प्रोटीन के बीच बातचीत के डिटर्जेंट के प्रति संवेदनशील प्रकृति के कारण । इसके अलावा, एक ठेठ ट्रांसपोर्टर प्रोटीन के रूप में, GLUT4 12 transmembrane डोमेन और 6 चमकदार छोरों जो के संभावित रूप से एक sortilin-बाध्यकारी साइट का प्रतिनिधित्व कर सकते है किसी भी संयोजन है । एक ही समय में, अप्रत्यक्ष सबूत के एक बड़े शरीर, जैसे कोशिका में पर्याप्त सह स्थानीयकरण, झिल्ली के साथ पार-पारगंय डीएसपी, और खमीर में बातचीत दो संकर प्रणाली सुझाव है कि sortilin GLUT4 के लिए बाध्य कर सकते हैं । इसके अलावा, alanine स्कैनिंग mutagenesis के साथ एक संयोजन में उत्तरार्द्ध दृष्टिकोण का उपयोग करना, हम पहले से निर्धारित किया है कि sortilin के Vps10p डोमेन मुख्य रूप से GLUT4 के पहले चमकदार पाश को बांधता है । हालांकि, स्तनधारी कोशिकाओं में इस तरह के एक बातचीत के सबूत याद आ रही है । यहां, हम अपने-transfected 3T3-L1 कोबाल्ट राल का उपयोग कर कोशिकाओं से sortilin टैग अलग है और प्रदर्शन किया है कि यह रासायनिक संश्लेषित पेप्टाइड पीएच 6 और पीएच 8 में GLUT4 के पहले चमकदार पाश करने के लिए इसी के साथ बातचीत कर सकते है कि अंलीय वातावरण में समान TGN झिल्ली के लुमेन में endosomal लुमेन और तटस्थ वातावरण । नियंत्रण प्रयोगों में कोई पेप्टाइड बाइंडिंग का पता लगाया गया था जहां गैर-transfected कक्षों से तैयार निकालने एक ही मोतियों पर लोड किया गया था ।

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Protocol

1. पेप्टाइड की हैंडलिंग

  1. डिजाइन और पेप्टाइड के आदेश
    1. पेप्टाइड के वांछित अनुक्रम चुनें, और एक टैग जोड़ें, जैसे myc epitope (EQKLISEED) पर या तो एन-या सी-टर्मिनस ।
    2. पानी में पेप्टाइड की अनुमानित घुलनशीलता की जाँच करें, पेप्टाइड घुलनशीलता कैलकुलेटर http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php का उपयोग कर. यदि घुलनशीलता कम है, तो चार्ज संतुलन बदलने के लिए एक अंय जल-घुलनशील टैग जोड़ने का प्रयास करें ।
      नोट: हम एन टर्मिनस (myc-fll-GLUT4) में myc epitope (बोल्ड फ़ॉन्ट) के साथ टैग GLUT4 के पहले चमकदार पाश (fll) के लिए इसी पेप्टाइड का इस्तेमाल किया: EQKLISEEDLNAPQKVIEQSYNATWLGRQGPGGPSSIPPGTLTTLWA है कि "अच्छा" पानी में घुलनशीलता की भविष्यवाणी की है .
    3. आदेश कस्टम पेप्टाइड के साथ कम से 75% शुद्धता जो परख के लिए पर्याप्त है, और घुलनशीलता परीक्षण के लिए प्रदाता से पूछो । पेप्टाइड को भंग करने के साथ अप्रत्याशित समस्याओं के मामले में कम से कम दो aliquots में आदेश अलग ।
      नोट: दो aliquots में Myc-fll-GLUT4 का आदेश दिया गया था । इसकी सूचना घुलनशीलता में ultrapure पानी में ≤ 10 मिलीग्राम/एमएल है ।
  2. पेप्टाइड भंग
    नोट: Ultrapure पानी सबसे अच्छा विलायक है । यदि पेप्टाइड के लिए पानी में घुलनशील प्रतीत नहीं होता है, निर्देशों के लिए http://www.genscript.com/peptide_solubility_and_stablity.html को देखें ।
    1. ultrapure पानी में या पसंद के बफर में पेप्टाइड के 100x काम समाधान तैयार, 100 μg/एमएल की एकाग्रता के साथ ।
    2. समाधान को 50-100 µ l aliquots में अलग करें, और उन्हें-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर कर दें ।

2. कोशिकाओं की हैंडलिंग

  1. सेल संस्कृति
    1. एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में जंगली प्रकार (WT) कोशिकाओं का प्रयोग करें, और कोशिकाओं को छह histidines (HisP) के साथ टैग लक्ष्य प्रोटीन व्यक्त ।
      नोट: हमने 3T3 L1 प्री-adipocytes छुरा transfected के साथ Sortilin-myc/
    2. Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) उच्च शर्करा में कोशिकाओं को विकसित, 10% बछड़ा गोजातीय सीरम, glutamine (2 मिमी) और पेनिसिलिन/streptomycin (5 μg/एमएल) 37 ° c में 10% सह के साथ पूरक.2.
    3. बैठो ४ १० कोशिकाओं के मुख्यमंत्री व्यंजन, उनमें से दो transfect के साथ HisP और transfect नियंत्रण प्लाज्मिड (WT) के साथ अंय दो । 48 ज अभिकर्मक के बाद, कोशिकाओं 80 तक पहुंच जाना चाहिए-90% प्रवाह ।
  2. सेल Lysates की तैयारी
    1. lysis बफर तैयार (10 मिमी Hepes, 30 मिमी NaCl, 5% ग्लिसरॉल, 10 मिमी Imidazole, 0.5% ट्राइटन एक्स-100 और अपने-टैग प्रोटीन, पीएच 7.4 के अलगाव के लिए EDTA बिना चिढ़ाने के कॉकटेल) और 4 डिग्री सेल्सियस पर रख:
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x फास्फेट-बफर खारा (पंजाब) के 10 मिलीलीटर के साथ तीन बार कोशिकाओं को धो लें ।
    3. बर्फ पर बर्तन रखो और प्रत्येक डिश के लिए lysis बफर के 500 µ एल जोड़ें । एक सेल खुरचनी का उपयोग कर सेल lysates फसल ।
    4. प्रत्येक डिश से अलग 1.5 एमएल ट्यूब में सेल lysate प्लेस । WT के रूप में ट्यूब लेबल-pH6, WT-pH8, HisP-pH6, HisP-pH8 ।
    5. एक 26G सुई के साथ एक सिरिंज के माध्यम से सेल lysates पास पांच बार ऊपर और नीचे, lysis पूरा करने के लिए.
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 16,000 x g पर सेल lysates केंद्रापसारक ।
    7. supernatants को नए हूबहू लेबल ट्यूबों में ट्रांसफर करें ।
    8. का विश्लेषण प्रोटीन एकाग्रता का उपयोग कर बीसीए प्रोटीन परख किट या अंय किट ।
    9. lysis बफर का प्रयोग, सभी चार lysates के बराबर प्रोटीन एकाग्रता ।
    10. एक छोटा (ca. 20 µ l) प्रत्येक lysate के aliquot को अलग करें और संभव नियंत्रण प्रयोगों और/या मुसीबत शूटिंग के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर रखें ।

3. HisPur कोबाल्ट मोतियों को अपने-टैग प्रोटीन के बंधन

  1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध धोने बफर का प्रयोग करें या एक (50 मिमी ना2HPO4/NaH2पीओ4, 300 मिमी NaCl, 20 मिमी imidazole, पीएच 8) तैयार है और यह 4 डिग्री सेल्सियस पर रहते हैं ।
  2. tittering धो बफर पीएच 8 द्वारा पीएच 6 के साथ धो बफर एचसीएल के साथ तैयार करें । इसे 4 ° c पर रखें ।
  3. धीरे समरूप निलंबन बनाने के लिए कोबाल्ट मोतियों की बोतल घूमता है ।
  4. चार 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों (step 2.2.4) के रूप में चिह्नित में कोबाल्ट मोती निलंबन के 40 µ एल बांटना ।
  5. प्रत्येक ट्यूब के लिए lysis बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें, और 5 एस महाप्राण supernatant के लिए 1000 x जी में ट्यूबों, और lysis बफर के 40 μL जोड़ने के लिए मोती बसे ।
  6. इसी ट्यूबों के लिए सेल lysates जोड़ें ।
  7. 20 rpm पर एक ट्यूब रोटेटर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए ट्यूबों की मशीन ।
  8. 5 एस के लिए 1000 x g पर ट्यूबों के केंद्रापसारक और supernatant इकट्ठा । 4 ° c पर supernatant रखें ।
  9. जोड़ने के 500 µ एल या तो पीएच 8 या पीएच 6 धो बफर इसी ट्यूबों और फिर से धीरे मोतियों को सस्पेंड ।
  10. 5 एस के लिए 1000 x g पर ट्यूबों के केंद्रापसारक और supernatants त्यागें ।
  11. चार बार के लिए कदम 3.9 और 3.10 दोहराएं ।

4. अपने-टैग प्रोटीन के लिए पेप्टाइड के बंधन मोतियों पर मैटीरियल

  1. पेप्टाइड (step 1.2.1) के 100x कार्य समाधान का उपयोग करके, या तो ph 6 या ph 8 वाश बफर (२ १०० µ l aliquots प्रत्येक के लिए, 1 µ g/एमएल) में 1x कार्य समाधान तैयार करें ।
  2. इसी पीएच के साथ धोया मोतियों के लिए 1x पेप्टाइड समाधान के 100 μL जोड़ें ।
  3. 20 rpm पर एक ट्यूब रोटेटर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मोतियों की मशीन ।
  4. 5 एस के लिए 1,000 x जी में ट्यूबों केंद्रापसारक, supernatant इकट्ठा करने और इसे रख-20 डिग्री सेल्सियस ।
  5. चार बार के लिए कदम 3.9 और 3.10 दोहराएं ।
    नोट: संभव पृष्ठभूमि कम करने के लिए, निम्न चरणों का पालन करें चरण 4.4 & 4.5 बदल सकता है ।
  6. 30 माइक्रोन pores के साथ चार सूक्ष्म कॉलम ले लो, उंहें कदम 2.2.4 में के रूप में लेबल, और संग्रह ट्यूबों में कॉलम जगह है ।
  7. 4.3 कदम के पूरा होने के बाद, कॉलम में गर्मी मिश्रण हस्तांतरण, समाधान गुरुत्वाकर्षण द्वारा पारित करने के लिए अनुमति देते हैं । -20 डिग्री सेल्सियस के माध्यम से प्रवाह रखें ।
  8. पीएच 6 या पीएच 8 के साथ धोने बफर के 500 µ एल पास गुरुत्वाकर्षण द्वारा इसी कॉलम के माध्यम से । के माध्यम से प्रवाह त्यागें ।
  9. चरण 4.8 चार बार दोहराएँ ।
  10. पिछले धोने के बाद, 15 एस के लिए 1,000 x g पर कॉलम केंद्रापसारक ।

5. कोबाल्ट मोतियों से रेफरेंस

  1. वाणिज्यिक Tricine नमूना बफर (200 मिमी Tris-एचसीएल, 40% ग्लिसरॉल, 2% एसडीएस, 0.04% Coomassie नीला, पीएच 6.8) का उपयोग करें और 2% की अंतिम एकाग्रता के लिए β-mercaptoethanol जोड़ें ।
  2. Tricine नमूना बफर के 40 µ एल जोड़ें (β-mercaptoethanol के साथ) धोया मोती और भंवर नमूने के लिए ।
  3. 100 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए नमूनों गर्मी, भंवर फिर नमूने, और 5 एस के लिए 1,000 x जी पर ट्यूबों केंद्रापसारक ।
    नोट: संभव गैर-विशिष्ट बाइंडिंग में रेफरेंस को कम करने के लिए, निम्न चरणों का पालन 5.1-5.3 चरणों को प्रतिस्थापित कर सका ।
  4. जोड़ें 40 μL का रेफरेंस Imidazole बफर (५० मि. मी.२HPO४/NaH२पो४, ३०० मि. NaCl, ०.२५ एम Imidazole) को धोकर मोतियों की माला, भंवरी को तथा कमरे के तापमान पर नलियों को २० मिनट के लिए मशीनी.
  5. 30 एस के लिए 3,000 एक्स जी में ट्यूबों केंद्रापसारक, supernatant इकट्ठा (eluted नमूने) और यह नया लेबल ट्यूबों के लिए स्थानांतरण ।
  6. प्रत्येक ट्यूब के लिए Tricine नमूना बफर के 40 μL जोड़ें, 100 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए नमूने गर्मी, भंवर और 5 एस के लिए 1,000 x जी पर ट्यूबों केंद्रापसारक ।
    नोट: यदि माइक्रो कॉलम का उपयोग किया जाता है, धो मोती के लिए रेफरेंस बफर जोड़ने के लिए, 20 मिनट के लिए मशीन और 2 मिनट के लिए 8,000 एक्स जी में केंद्रापसारक द्वारा रेफरेंस इकट्ठा ।
    नोट: नमूने ट्रो किया जाता है जब तक-20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है ।

6. ट्रो और वेस्टर्न सोख्ता

नोट: नमूने एसडीएस द्वारा जुदाई के लिए तैयार कर रहे हैं-पृष्ठ और बाद में पश्चिमी सोख्ता. निंनलिखित संशोधनों के साथ जेल ट्रो (https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot) के प्रोटोकॉल का पालन करें ।

  1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 10-20% Tricine ग्रैडिएंट जैल का उपयोग करें ।
  2. पर जेल, लोड 20 µ l के eluted नमूने और 20 µ l के lysates (step 2.2.10). मुसीबत शूटिंग के लिए, यह 20 µ l को सीमित सामग्री (3.8 कदम) और 10 पेप्टाइड के एनजी लोड करने के लिए सिफारिश की है; लोड करने से पहले, इन नमूनों के लिए Tricine नमूना बफ़र की बराबर मात्रा जोड़ें ।
  3. ट्रो वाणिज्यिक Tris/Tricine/एसडीएस चल रहे बफ़र (100 mm Tris, 100 mm Tricine, और 0.1% एसडीएस, pH 8.3) में बाहर ले जाने के लिए ।
  4. स्थानांतरण बफर का उपयोग कर एक 0.45 µm nitrocellulose झिल्ली पर जेल से सामग्री हस्तांतरण (25 मिमी Tris आधार, 192 मिमी glycine, 8.4 पीएच) 20% मेथनॉल के साथ पूरक ।
  5. 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 3% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) के साथ झिल्ली ब्लॉक । गाइड के रूप में पूर्व दाग आणविक वजन मार्कर का प्रयोग, क्षैतिज झिल्ली में कटौती, HisP के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ शीर्ष भाग दाग, और myc epitope के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ नीचे भाग दाग myc की पहचान के लिए-पेप्टाइड टैग की गईं ।
    नोट: हमारे विशेष मामले में, झिल्ली के काटने की आवश्यकता नहीं है क्योंकि दोनों HisP और Myc-fll-GLUT4 एक विरोधी Myc एंटीबॉडी के साथ पता लगाया जा सकता है ।

7. परिणामों का विश्लेषण

  1. एक छवि स्टेशन या ImageJ कार्यक्रम का उपयोग कर सभी पश्चिमी दाग संकेतों की तीव्रता यों तो ।
  2. myc-टैग किए गए पेप्टाइड से सिग्नल HisP से संकेत के विरुद्ध दोनों पीएच मान पर सामान्य ।

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Representative Results

Lysates 3T3 L1 कोशिकाओं से तैयार किए गए छुरे transfected के साथ Sortilin-myc/अपने5 और WT 3T3 L1 कोशिकाओं से, एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया । दोनों lysates पीएच 6 या पीएच 8 में कोबाल्ट मोतियों के साथ मशीन थे और अच्छी तरह से धोया । मैटीरियल प्रोटीन के साथ मोती तो Myc-fll-Glut4 के समाधान में मशीन थे । सावधान धोने के बाद, मोतियों को बंधे प्रोटीन 0.25 मीटर Imidazole के साथ eluted थे । नमूने के अधीन थे, मूल lysates के साथ, एसडीएस के लिए-एक 10-20% Tricine ढाल जेल में विरोधी के साथ पश्चिमी सोख्ता द्वारा पीछा किया-Myc एंटीबॉडी कि दोनों sortilin का पता लगाने के लिए अनुमति दी-Myc/त्यांच्या (११० केडी) आणि Myc-fll-GLUT4 (५ केडी) (चित्र १) .

Myc-fll-GLUT4 (10 एनजी) एक संदर्भ के रूप में जेल की पहली लेन पर लोड किया गया था । पेप्टाइड की शुद्धता के रूप में केवल 75% है, संदूषणों (उच्च बैंड) स्पष्ट कर रहे हैं । दोनों WT और Sortilin-myc से मूल कोशिका lysates/उनके व्यक्त कोशिकाओं विरोधी myc एंटीबॉडी द्वारा मांयता प्राप्त कई बैंड होते हैं । Sortilin से अलग सामग्री-myc/उनके व्यक्त कोशिकाओं बहुत क्लीनर है । कुछ गौण गैर-विशिष्ट बैंड्स के अलावा, इसमें केवल दो myc-युक्त अवयव हैं: Sortilin-myc/उनकी और myc-fll-GLUT4 । पहली लेन में प्रदूषित पेप्टाइड्स को Sortilin से बाँधते नहीं दिखते-myc/ नकारात्मक नियंत्रण (WT eluate) मुख्य रूप से गैर विशिष्ट बैंड है ।

के रूप में GLUT4 intracellular डिब्बों के माध्यम से गुजरता है, जैसे endosomes और TGN, कि अलग चमकदार पीएच है, हम पीएच 6 और पीएच 8 में GLUT4 के साथ sortilin के संपर्क का आकलन करना चाहता था (चित्रा 2) । परिणामों के Densitometry (नहीं दिखाया गया है) Myc-fll-GLUT4 और Sortilin-Myc के बीच अनुपात में किसी भी महत्वपूर्ण अंतर का पता नहीं चला है अलग पीएच मूल्यों पर मोतियों पर रखा हम इस प्रकार निष्कर्ष है कि GLUT4 दोनों endosomes और TGN में sortilin के साथ बातचीत करने की क्षमता है ।

Figure 1
चित्र 1 . Sortilin की बातचीत-myc/उनके साथ कोबाल्ट मोतियों पर myc-fll-GLUT4. WT 3T3 से तैयार Lysates-L1 कोशिकाओं और 3T3-L1 कोशिकाओं को छुरा Sortilin-myc व्यक्त/उनकी (ओं) कोबाल्ट मोतियों पर पारित किया गया, धोया, myc के साथ मशीन-fll पीएच 8 में Glut4, फिर से धोया, और eluted बफर के साथ Imidazole । Myc-fll-Glut4 (10 एनजी) एक संदर्भ के रूप में पहली लेन पर लोड किया गया था ।

Figure 2
चित्र 2 . Sortilin-myc/अपने दोनों पीएच 8 और पीएच 6 पर myc-fll-GLUT4 के साथ बातचीत । Myc-fll-Glut4 पीएच 6 और पीएच 8 में मोतियों पर मैटीरियल सामग्री के साथ मशीन था, धोया, और Glycine नमूना बफर के साथ eluted । यह आंकड़ा पैन एक्स., एट अल3से अनुकूलित किया गया है ।

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Discussion

Sortilin एक विकासवादी बहु ligand प्रोटीन रिसेप्टर है कि दोनों प्लाज्मा झिल्ली में संकेतन और intracellular छंटाई की घटनाओं में शामिल है6,7है । हालांकि, प्रामाणिक है sortilin लाइगैंडों के लिए खोज (जिनमें से कुछ चमकदार या अभिंन झिल्ली प्रोटीन हैं) अपनी बाध्यकारी भागीदारों में से कुछ के साथ sortilin की बातचीत के रूप में जटिल है डिटर्जेंट के प्रति संवेदनशील प्रतीत होता है । इसलिए, प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन, co-immunoprecipitation, का अध्ययन करने के लिए एक आसान और व्यापक दृष्टिकोण आसानी से लागू नहीं किया जा सकता । कुछ अनुसंधान समूहों सह immunoprecipitation का इस्तेमाल किया है sortilin और उसके संभावित लाइगैंडों8,9के बीच बातचीत का प्रदर्शन । हालांकि, इन प्रयोगों बाहर किया गया है या तो 0.1% ट्राइटन में या 0.6% लोग में जो झिल्ली solubilization की पूर्णता में संदेह डाले ।

अंय शोधकर्ताओं ने sortilin और उसके लाइगैंडों के बीच की सतह plasmon अनुनाद10,11से बातचीत का अध्ययन किया । हालांकि सतह plasmon अनुनाद यकीनन समस्या के लिए सबसे अच्छा तरीका है, यह महंगा उपकरण और शुद्ध रिकॉमबिनेंट प्रोटीन की महत्वपूर्ण मात्रा है जो महंगी और समय लेने की आवश्यकता है ।

यहां, हम एक तकनीक का वर्णन है कि, इस तरह के पार के रूप में अंय तरीकों, के साथ संयोजन में जोड़ने, और खमीर दो संकर प्रणाली, दृढ़ता से सुझाव है कि sortilin GLUT4 को बांध सकते हैं । परख तेजी से और आसान है और आसानी से अंय प्रोटीन और पेप्टाइड्स के विभिंन आकारों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

इस परख में कुछ महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं । पहले एक पानी में पेप्टाइड की घुलनशीलता है । एक और एक उचित नियंत्रण का चयन है । जाहिर है, जैविक सामग्री की एक महत्वपूर्ण राशि अंतर्जात अपने-पहुंच दृश्यों या गैर विशेष रूप से के माध्यम से कोबाल्ट मोतियों के साथ बातचीत कर सकते हैं । इसलिए, यह आवश्यक है कि WT कोशिकाओं और कोशिकाओं के मोतियों को lysates पर स्थिर कर ब्याज के प्रोटीन से transfected, हमारे मामले में Sortilin-myc/ इस तरह के एक प्रयोगात्मक डिजाइन में, मोती के लिए बाध्य सामग्री केवल एक प्रोटीन, Sortilin-myc/में अलग होगा, ताकि मोतियों को नियंत्रित करने के लिए पेप्टाइड की पृष्ठभूमि बाध्यकारी की एक निश्चित डिग्री सहन किया जा सकता है । फिर भी, मोतियों को पेप्टाइड की पृष्ठभूमि बाध्यकारी अंतिम धुलाई चरणों के stringency को बढ़ाने से कम किया जा सकता है । मोतियों को धोने के लिए मिनी कॉलम का इस्तेमाल आगे भी बैकग्राउंड बाइंडिंग को कम कर सकता है.

"GLUT4 मार्ग" की प्रकृति की वजह से, हम अलग पीएच मूल्यों पर sortilin के लिए Myc-fll-GLUT4 के बंधन को संबोधित करना चाहता था । हमें पता है कि जल्दी/छंटाई endosomes के लुमेन में पीएच 6 से नीचे गिर सकता है । हालांकि, पीएच से कम 6 अपने-कोबाल्ट मोतियों को टैग प्रोटीन जो विधि की एक सीमा के रूप में माना जा सकता है की बाध्यकारी बाधित ।

अपने epitope का उपयोग कोबाल्ट मोतियों पर लक्ष्य प्रोटीन का अलगाव, उपज और गैर विशिष्ट बाध्यकारी के संदर्भ में, विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ immunoprecipitation के रूप में अन्य अपनत्व शुद्धि कदम के लिए बेहतर है । फिर भी, यह पूरी तरह से संभव है कि किसी भी अंय राल पर लक्ष्य प्रोटीन का अलगाव (अधिमानतः, उचित नियंत्रण के साथ चुंबकीय मोती) सफल साबित होगा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस कार्य के लिए अनुसंधान अनुदान DK52057 और DK107498 से NIH से K.V.K. एक्स. पी द्वारा समर्थित 2T32DK007201 से संस्थागत प्रशिक्षण अनुदान NIH का समर्थन किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protease inhibitor cocktail Sigma P8849 for use in purification of histidine tag protein
Phosphate-Buffered Saline  Corning 21-040-CV PBS
1mL Insulin Syringe U-100 BD 329652 26G x 1/2
BCA Protein Assay Kit Pierce 23228
Wash buffer Boston BioProducts BP-234 For His-tag protein purification
HisPur Cobalt Resin Thermo Scientific 89964
Tricine sample Buffer Bio-Rad 161-0739 with SDS, bMercaptaethanol should be added
Elution  Buffer Boston BioProducts BP-236 For His-tag protein purificationwith 250mM Imidazole
Mini-Protean Tris-Tricine precast gels 10-20%  Bio-Rad 456-3115 For seperation of peptide and small protein
Tris/Tricine/SDS running buffer  Bio-Rad 161-0744
Transfer Buffer Boston BioProducts BP-190 Add 20% methanol
Nitrocellulose membrane  0.45 mm Bio-Rad 1620115
Bovine Serum Albumin Sigma A9647 BSA
Anti Myc antibody Cell Signaling 2272 Rabbit
Peptide Genscipt customize ordering
Precision Plus Protein Dual color Standarts BioRad 161-0374

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References

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जैव रसायन निर्गम 133 Sortilin GLUT4 झिल्ली प्रोटीन सेलुलर जीवविज्ञान प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत डिटर्जेंट मुक्त परख
झिल्ली प्रोटीन के बीच डिटर्जेंट-संवेदनशील बातचीत का पता लगाने
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Zaarur, N., Pan, X., Kandror, K. V.… More

Zaarur, N., Pan, X., Kandror, K. V. Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (133), e57179, doi:10.3791/57179 (2018).

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