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Biochemistry

Detección de detergente-sensible a las interacciones entre proteínas de la membrana

Published: March 7, 2018 doi: 10.3791/57179
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry, Boston University School of Medicine

Summary

Se describe un protocolo para la detección de detergente-sensible a las interacciones entre proteínas de la membrana mediante la Unión del receptor de la clasificación, sortilina, para el primer bucle luminal de la proteína del transportador de glucosa, GLUT4, como ejemplo.

Abstract

Nuestra capacidad para explorar las interacciones proteína-proteína es la clave para entender las conexiones reguladoras en la célula. Sin embargo, la detección de interacciones proteína-proteína en muchos casos se asocia con importantes desafíos experimentales. En particular, clasificación de los receptores interactúan con su carga de proteínas en el lumen de los compartimentos de membrana a menudo en una manera sensible al detergente, haciendo inservible la co-inmunoprecipitación de estas proteínas. Vinculantes de la ordenación del receptor sortilina al transportador de glucosa que GLUT4 puede servir como un ejemplo de interacciones débiles luminales entre proteínas de la membrana. Aquí, describimos un análisis rápido, sencillo y barato para validar la interacción entre sortilina y GLUT4. Para ello, hemos diseñado y sintetizado químicamente el péptido myc-con la etiqueta correspondiente para el epitopo sortilina Unión potencial en la parte luminal del GLUT4. Sortilina etiquetada con seis histidinas fue expresado en células de mamífero y aislada de lysates de la célula usando granos de cobalto. Sortilina inmovilizado en las cuentas se incubó con la solución del péptido a valores de pH diferentes, y se analizó el material eluído por borrar occidental. Este ensayo puede ser fácilmente adaptado para el estudio de otras interacciones de proteínas sensibles al detergente.

Introduction

GLUT4 es una proteína del transportador de glucosa que se expresa predominantemente en células del músculo esquelético y grasa donde interviene el efecto de la insulina en sangre post-prandial glucosa despacho1. Una proteína muy estable, GLUT4 es regulada a nivel poste-de translación. En ausencia de insulina, GLUT4 se excluye en gran parte de la membrana del plasma (por lo tanto, baja permeabilidad basal de glucosa) y se localiza principalmente dentro de la célula en vesículas pequeñas de insulina-responsivo (IRVs) y red trans-Golgi (TGN) que probablemente representan el compartimiento de donantes IRV. Administración de insulina, el IRVs se fusionan con la membrana plasmática y entregan GLUT4 en el sitio de su funcionamiento. Esto aumenta la permeabilidad de la membrana plasmática de la glucosa, por lo la absorción de glucosa de la sangre en adipocitos y miocitos esqueléticos eleva 10 a 40-fold. Tras la retirada de la insulina, GLUT4 se internalizan en endosomas tempranos, clasificación y luego a TGN donde el IRVs son re-formados. Clasificación de ambos pasos en el camino de GLUT4, es decir, recuperación de los endosomas tempranos periférica perinuclear TGN y la formación de las IRVs en el donante TGN membranas están habilitadas por el miembro de la familia Vps10p, sortilina, que representa un tipo I proteína de transmembrana y un receptor de la clasificación. Según un modelo, sortilina funciona como una proteína transmembrana: ATA GLUT4 en el lumen de endosomas y TGN y recluta retrómero o clatrina adaptadores en el lado citoplasmático de la membrana de donantes vía el C-terminal2, 3. Esto facilita la distribución de GLUT4 en portadores vesiculares que translocan GLUT4 entre compartimientos intracelulares.

La interacción de la cola citoplásmica de sortilina retrómero y varias proteínas ha sido bien documentada. Sin embargo, la Unión de la sortilina GLUT4 (y varios de sus otros ligandos de la proteína) ha estado desafiando a probar. En particular, los intentos sortilina co-immunoprecipitate y GLUT4 no han tenido éxito probablemente debido a la naturaleza sensible al detergente de la interacción entre estas dos proteínas. Además, como una proteína de transporte típico, GLUT4 tiene 12 dominios transmembrana y 6 lazos luminales cualquier combinación que potencialmente puede representar un sitio sortilina-obligatorio. Al mismo tiempo, un cuerpo grande de evidencia indirecta, como la colocalización substancial en la célula, Cross-linking con DSP permeable a la membrana y la interacción en el sistema híbrido dos de levadura sugieren eso sortilina puede enlazar a GLUT4. Además, usando este último enfoque en combinacion con la alanina exploración mutagénesis, nos hemos determinado previamente que el dominio de Vps10p de sortilina se une principalmente a la primera lazada luminal de GLUT4. Sin embargo, la prueba de tal interacción en células de mamífero ha sido falta. Aquí hemos aislado sortilina su etiquetado de células transfected 3T3-L1 usando resina de cobalto y demostró que puede interactuar con el péptido síntesis química correspondientes al primer lazo luminal del GLUT4 a pH 6 y pH 8 que se asemejan a medio ácido en el endosomal luz y ambiente neutro en el lumen de las membranas TGN. Ningún enlace de péptido fue detectado en los experimentos de control donde extracto preparado a partir de las células transfectadas no fue cargado en las cuentas del mismo.

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Protocol

1. manipulación del péptido

  1. Diseño y pedidos del péptido
    1. Elegir la secuencia deseada del péptido y añadir una etiqueta, como myc epitopo (EQKLISEED) en su o N - o C-terminal.
    2. Verifique la solubilidad predicha del péptido en agua, utilizando péptidos solubilidad calculadora http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php. Si la solubilidad es baja, intente añadir otra etiqueta solubles en agua para cambiar el equilibrio de carga.
      Nota: Utilizamos el péptido correspondiente a la primera lazada luminal (LFT) de GLUT4 etiquetadas con el epitopo myc (negrita) en la terminal N (Myc-LFT-GLUT4): LNAPQKVIEQSYNATWLGRQGPGGPSSIPPGTLTTLWA de EQKLISEEDque tiene "buena" predicha solubilidad en agua .
    3. Ordenar el péptido personalizado con al menos 75% pureza que es suficiente para el ensayo y pida la prueba de solubilidad. Independiente del orden en al menos dos alícuotas en caso de problemas imprevistos con el péptido de disolución.
      Nota: Myc-LFT-GLUT4 se ordenó en dos alícuotas. Su solubilidad divulgado en agua ultrapura es ≤10 mg/mL.
  2. Disolución del péptido
    Nota: Agua ultrapura es el mejor solvente. Si el péptido parece no ser soluble en agua, consulte http://www.genscript.com/peptide_solubility_and_stablity.html para obtener instrucciones.
    1. Preparar 100 x solución de trabajo de los péptidos en agua ultrapura o almacenador intermediario de la opción, con la concentración de 100 μg/mL.
    2. Separar la solución en alícuotas de 50-100 μl y almacenar a-20 ° C.

2. manipulación de las células

  1. Cultivo de células
    1. Utilizan células de tipo salvaje (WT) como un control negativo, células expresando la proteína diana etiquetada con seis histidinas (HisP).
      Nota: Utilizamos estable transfectadas con sortilina-myc/su5de pre-adipocitos 3T3 L1.
    2. Crecer las células de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) alta azúcar, suplementado con 10% suero bovino, glutamina (2 mM) y penicilina/estreptomicina (5 μg/mL) a 37 ° C en el 10% CO2.
    3. Sentarse cuatro platos de 10 cm de las células, dos de ellas con HisP transfectar y transfectar las otras dos con el plásmido de control (WT). 48 h después de la transfección, las células deberían alcanzar 80-90% de confluencia.
  2. Preparación de los Lysates de la célula
    1. Preparar el tampón de lisis (10 mM Hepes, 30 mM NaCl, 5% de glicerol, 10 mM imidazol, 0.5% Tritón X-100 y proteasa inhibidor de coctel sin EDTA para el aislamiento de proteínas de su etiquetado, pH 7,4) y guardar a 4 ° C:
    2. Lavar las células 3 veces con 10 mL de 1 x solución salina con tampón fosfato (PBS) a 4 ° C.
    3. Poner los platos en el hielo y agregar 500 μl de tampón de lisis para cada plato. Los lysates de la célula con un raspador de la célula de la cosecha.
    4. Lugar el lisado celular de cada plato en un tubo de 1,5 mL diferentes. Etiquetar los tubos como WT-pH6, WT-pH8, HisP-pH6, pH8 HisP.
    5. Pasar los lysates de la célula a través de una jeringa con una aguja de 26G cinco veces hacia arriba y hacia abajo, a la lisis completa.
    6. Centrifugue los lysates de la célula 16.000 x g por 10 min a 4 ° C.
    7. Transferir el sobrenadante a nuevos tubos idénticamente marcados.
    8. Analizar la concentración de proteína usando el Kit de ensayo de proteína BCA u otro kit.
    9. Usando el tampón de lisis, igualar la concentración de proteína de los lysates de la cuatro.
    10. Separar una alícuota de pequeño (aprox. 20 μl) de cada lisado y mantener a-20 ° C para posibles experimentos de control y/o resolución de problemas.

3. el atar de su etiquetado de proteínas para los granos HisPur Cobalt

  1. Tampón de lavado disponibles comercialmente o (50 mM de Na2HPO4/NaH2PO4, 300 mM de NaCl, imidazol de 20 mM, pH 8) preparar y mantener a 4 ° C.
  2. Preparar el lavado Tampón a pH 6 por risitas lavado tampón pH 8 con HCl. mantener a 4 ° C.
  3. Agitar suavemente la botella de los granos de cobalto para hacer suspensión homogénea.
  4. Añada 40 μl de la suspensión de perlas de cobalto en cuatro tubos de 1,5 mL marcados como el anterior (paso 2.2.4).
  5. Añadir 1 mL de tampón de lisis para cada tubo, centrifugar los tubos a 1000 x g durante 5 s. aspirar el sobrenadante y agregar 40 μL de tampón de lisis a perlas colocadas.
  6. Añada los lysates de la célula a los tubos correspondientes.
  7. Incubar los tubos durante 90 minutos a 4 ° C en un agitador de tubo a 20 rpm.
  8. Centrifugar los tubos a 1000 x g durante 5 s y recoger el sobrenadante. Mantener el sobrenadante a 4 ° C.
  9. Añadir 500 μl de tampón de lavado pH 6 o pH 8 a tubos correspondientes y Resuspenda suavemente los granos.
  10. Centrifugar los tubos a 1000 x g durante 5 s y descartar el sobrenadante.
  11. Repita los pasos del 3.9 y 3.10 para cuatro veces.

4. Unión del péptido a la proteína su etiquetado inmovilizado en las cuentas de

  1. Solución de trabajo x 100 del péptido (paso 1.2.1), preparar 1 x soluciones de trabajo de pH 6 o tampón de lavado pH 8 (alícuotas de dos 100 μl de cada una, 1 μg/mL).
  2. Añadir 100 μL de solución de péptido de x 1 a los granos lavados con el pH correspondiente.
  3. Incubar los granos durante 30 min a 4 ° C en un agitador de tubo a 20 rpm.
  4. Centrifugar los tubos a 1.000 x g durante 5 s, recoger el sobrenadante y mantener a-20 ° C.
  5. Repita los pasos del 3.9 y 3.10 para cuatro veces.
    Nota: Para disminuir el posible fondo, los siguientes pasos podrían sustituir pasos 4.4 y 4.5.
  6. Tomar cuatro columnas micro poros μm 30 etiqueta como en el paso 2.2.4 y colocar las columnas en tubos.
  7. Después de completar el paso 4.3, transferencia de la mezcla de incubación en las columnas, permiten la solución pasar por gravedad. Mantener el flujo a través de a-20 ° C.
  8. Pasar 500 μl de tampón de lavado con pH 6 o pH 8 a través de columnas correspondientes por gravedad. Deseche el flujo a través.
  9. Repita el paso 4.8 cuatro veces.
  10. Después del último lavado, centrifugar las columnas a 1.000 x g durante 15 s.

5. elución de abalorios cobalto

  1. Comercial tampón tricino uso (200 mM Tris-HCl, glicerol al 40%, 2% SDS, 0.04% Coomassie Blue, pH 6,8) y añadir β-mercaptoetanol a la concentración final de 2%.
  2. Agregar 40 μl de tampón tricino (con β-mercaptoetanol) a los granos lavados y vórtice de la muestra.
  3. Calentar las muestras durante 10 minutos a 100 ° C, vórtice las muestras una vez más y centrifugar los tubos a 1.000 x g durante 5 s.
    Nota: Para disminuir el posible atascamiento no específico en la elución, lo siguiente podría sustituir pasos 5.1-5.3.
  4. Agregar 40 μL de tampón de elución imidazol (50 mM de Na2HPO4/NaH2PO4, 300 mM de NaCl, 0,25 M imidazol) para el lavado de perlas, vortex e incubar los tubos a temperatura ambiente durante 20 minutos.
  5. Centrifugar los tubos a 3.000 x g durante 30 s, recoger el sobrenadante (muestras eluídas) y transferir a tubos etiquetados nuevos.
  6. Agregar 40 μL de tampón tricino a cada tubo, calentar las muestras durante 10 minutos a 100 ° C, vortex y centrifugar los tubos a 1.000 x g durante 5 s.
    Nota: Si se utilizan micro columnas, añadir el tampón de elución a los granos lavados, incubar durante 20 min y recoger la elución por centrifugación a 8.000 x g durante 2 minutos.
    Nota: Las muestras pueden conservarse a-20 ° C hasta que se realiza la electroforesis.

6. electroforesis y Western Blot

Nota: Las muestras están listas para la separación por SDS-PAGE y el borrar occidental posterior. Seguir protocolo de la electroforesis del gel (https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot) con las siguientes modificaciones.

  1. Utilizar comercialmente disponibles 10-20% tricino geles de gradiente.
  2. De la carga en el gel, 20 μl de las muestras eluídas y 20 μl de lisados (paso 2.2.10). Para la resolución de problemas, se recomienda cargar 20 μl de material no Unido (paso 3.8) y 10 ng del péptido; antes de cargar, agregar igual cantidad de tampón tricino a estas muestras.
  3. Realizar electroforesis en comercial Tris/Tricina/SDS ejecuta buffer (100 mM Tris, 100 mM Tricina y 0.1% SDS, pH 8.3).
  4. Transferir el material desde el gel hacia una membrana de nitrocelulosa de 0,45 μm con tampón de transferencia (base de Tris 25 mM, glicina 192 mM, pH 8,4) suplementado con 20% de metanol.
  5. Bloquear la membrana con el 3% de seroalbúmina bovina (BSA) por 1 h a temperatura ambiente. Utilizando marcadores de peso molecular previamente manchada como guía, corte la membrana horizontalmente seque la parte superior con un anticuerpo contra HisP y seque la parte inferior con un anticuerpo contra el epitopo de myc para identificar el péptido tagged myc.
    Nota: En nuestro caso particular, corte de la membrana no se requiere ya que HisP y Myc-LFT-GLUT4 se pueden detectar con un anticuerpo anti-myc.

7. Análisis de resultados

  1. Cuantificar la intensidad de todas las señales de Western blot usando un programa de la estación de imagen o ImageJ.
  2. Normalizar la señal del péptido myc marcados contra la señal de HisP con ambos valores de pH.

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Representative Results

Lisados fueron preparados del 3T3 L1 las células transfectadas estable con sortilina-myc/su5 y desde las células WT 3T3 L1, utilizadas como control negativo. Ambos lysates fueron incubados con abalorios cobalto a pH 6 o pH 8 y lavados muy bien. Granos con proteínas inmovilizadas luego fueron incubados en la solución de Myc-LFT-Glut4. Después de lavados cuidadosos, las proteínas a los granos fueron eluidas con 0.25 M imidazol. Las muestras se sometieron, junto con el originales lisados, a SDS-PAGE en un tricino de 10-20% gel gradiente seguida de Western Blot con anticuerpos anti-Myc que permitió la detección de ambos sortilina-myc/su (110 kD) y Myc-LFT-GLUT4 (5 kD) (figura 1) .

MYC-LFT-GLUT4 (10 ng) fue cargado por el primer carril del gel como una referencia. Como la pureza del péptido es 75%, contaminación es evidentes (bandas superiores). Lysates de la célula original de WT y sortilina-myc/su expresando las células contienen múltiples bandas reconocidas por el anticuerpo anti-myc. Material aislado de células expresa sortilina-myc/su es mucho más limpio. Además de algunas bandas no específica menores, tiene sólo dos componentes que contiene el myc: sortilina-myc/su y Myc-LFT-GLUT4. Péptidos contaminantes en el primer carril no parecen enlazar con sortilina-myc/su. Control negativo (efluente de la WT) tiene bandas predominantemente inespecífica.

Como GLUT4 pasa a través de compartimientos intracelulares, como endosomas y TGN, que tengan diferente pH luminal, queríamos evaluar interacción de GLUT4 con la sortilina a pH 6 y pH 8 (figura 2). Densitometría de resultados (no mostrado) no ha revelado diferencias significativas en la relación entre Myc-LFT-GLUT4 y sortilina-myc/su retenido en las cuentas con valores de pH diferentes. Así concluimos que el GLUT4 tiene la capacidad de interactuar con sortilina en endosomas y TGN.

Figure 1
Figura 1 . Interacción de sortilina-myc, su con Myc-LFT-GLUT4 en abalorios cobalto. Prepararon de lisados de las células 3T3-L1 WT y las células 3T3-L1 expresando estable sortilina-myc/su (S) se pasó sobre abalorios cobalto, lavadas, incubadas con Myc-LFT-Glut4 a pH 8, lavado otra vez y eluida con tampón de imidazol. MYC-LFT-Glut4 (10 ng) fue cargado por el primer carril como referencia.

Figure 2
Figura 2 . Sortilina-myc/su interactúa con Myc-LFT-GLUT4 en pH 6 y pH 8. MYC-LFT-Glut4 se incubó con el material inmovilizado en las cuentas a pH 6 y pH 8, lavados y eluida con tampón de glicina. La figura ha sido adaptada de Pan X., et al3.

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Discussion

Sortilina es un receptor evolutivo conservado multi-ligando proteína que participa en ambas señales en la membrana plasmática y en intracelular clasificación eventos6,7. Sin embargo, la búsqueda de ligandos de sortilina auténtico (algunas de las cuales son proteínas de la membrana luminal o integral) es complicada como la interacción de sortilina con algunos de sus socios de la Unión parece ser sensible a los detergentes. Por lo tanto, una fácil y forma generalizada para el estudio de las interacciones proteína-proteína, co-inmunoprecipitación, no se puede aplicar fácilmente. Algunos grupos de investigación han utilizado co-inmunoprecipitación para demostrar la interacción entre la sortilina y sus potenciales ligandos8,9. Sin embargo, estos experimentos se han realizado en 0,1% Triton o en grietas del 0,6% que arroja dudas en la exactitud de la solubilización de la membrana.

Otros investigadores estudiaron la interacción entre la sortilina y sus ligandos por resonancia de plasmón superficial10,11. Aunque resonancia de plasmones superficiales es, sin duda, el mejor enfoque para el problema, requiere de equipo costoso y cantidades significativas de proteínas recombinantes puras que es costoso y desperdiciador de tiempo.

Aquí, describimos una técnica que, en combinación con otros métodos, tales como cross-linking y el sistema de dos híbridos de levaduras, sugieren fuertemente que sortilina puede enlazar a GLUT4. El ensayo es rápido y fácil y puede ser fácilmente adaptado a otras proteínas y péptidos de diferentes tamaños.

Hay algunos pasos críticos en este ensayo. La primera es la solubilidad del péptido en el agua. Otra es la selección de un control adecuado. Claramente, una importante cantidad de material biológico puede interactuar con cobalto granos vía endógena su alcance secuencias o no específica. Por lo tanto, es esencial para inmovilizar a los granos lisados de células de peso y las células transfected con la proteína de interés, en nuestro caso sortilina-myc/su. En un diseño experimental, material vinculado a las cuentas se diferencia en solamente una proteína, sortilina-myc/su, por lo que puede tolerar un cierto grado de unión del fondo del péptido a cuentas de control. Todavía, el enlace de fondo del péptido a los granos puede reducirse aumentando el rigor de los pasos de lavado final. El uso de las mini columnas para el lavado de los granos puede disminuir fondo obligatorio aún más.

Debido a la naturaleza de la "vía de GLUT4", hemos querido Unión dirección de Myc-LFT-GLUT4 a sortilina en valores de pH diferentes. Nos damos cuenta de que el pH en el lumen de principios de clasificación endosomas pueden caer por debajo de 6. Sin embargo, pH inferior a 6 interrumpe la Unión de las proteínas de su etiquetado para abalorios cobalto que pueden considerarse como una limitación del método.

Aislamiento de la proteína diana en abalorios cobalto utilizando su método es preferible a otros pasos de purificación de afinidad, como la inmunoprecipitación con anticuerpos específicos, en términos de rendimiento y fijación no específica. Aún así, es totalmente posible que el aislamiento de la proteína diana en cualquier otra resina (preferiblemente, bolas magnéticas) con controles adecuados resultará exitosa.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por becas de investigación DK52057 y DK107498 de los NIH para K.V.K. X.P fue apoyado por la 2T32DK007201 de grant de formación institucional de los NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protease inhibitor cocktail Sigma P8849 for use in purification of histidine tag protein
Phosphate-Buffered Saline  Corning 21-040-CV PBS
1mL Insulin Syringe U-100 BD 329652 26G x 1/2
BCA Protein Assay Kit Pierce 23228
Wash buffer Boston BioProducts BP-234 For His-tag protein purification
HisPur Cobalt Resin Thermo Scientific 89964
Tricine sample Buffer Bio-Rad 161-0739 with SDS, bMercaptaethanol should be added
Elution  Buffer Boston BioProducts BP-236 For His-tag protein purificationwith 250mM Imidazole
Mini-Protean Tris-Tricine precast gels 10-20%  Bio-Rad 456-3115 For seperation of peptide and small protein
Tris/Tricine/SDS running buffer  Bio-Rad 161-0744
Transfer Buffer Boston BioProducts BP-190 Add 20% methanol
Nitrocellulose membrane  0.45 mm Bio-Rad 1620115
Bovine Serum Albumin Sigma A9647 BSA
Anti Myc antibody Cell Signaling 2272 Rabbit
Peptide Genscipt customize ordering
Precision Plus Protein Dual color Standarts BioRad 161-0374

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References

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  3. Pan, X., Zaarur, N., Singh, M., Morin, P., Kandror, K. V. Sortilin and retromer mediate retrograde transport of Glut4 in 3T3-L1 adipocytes. Mol Biol Cell. 28 (12), 1667-1675 (2017).
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