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Biochemistry

Erkennung von Waschmittel-Sensitive Interaktionen zwischen Membranproteine

Published: March 7, 2018 doi: 10.3791/57179
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry, Boston University School of Medicine

Summary

Wir beschreiben ein Protokoll für die Erkennung von Waschmittel-Sensitive Interaktionen zwischen Membranproteine mit Bindung des Sortier-Rezeptors, Sortilin, um die erste luminalen Schleife von der Glukose-Transporter-Protein, GLUT4, als Beispiel.

Abstract

Unsere Fähigkeit, Protein-Protein-Wechselwirkungen zu erforschen ist der Schlüssel zum Verständnis der rechtlicher Verbindungen in der Zelle. Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen in vielen Fällen ist jedoch mit erheblichen experimentelle Herausforderungen verbunden. Insbesondere interagieren Sortierung Rezeptoren mit ihrer Ladung Eiweiß in das Lumen der Membran Fächer oft in ein Waschmittel-Sensitive-Mode, so dass co-Immunopräzipitation dieser Proteine unbrauchbar. Bindung von der Sortierung Rezeptor Sortilin, Glukose-Transporter GLUT4 als Beispiel für schwache luminalen Wechselwirkungen zwischen Membranproteine dienen kann. Hier beschreiben wir einen schnelle, einfachen und kostengünstigen Assay um die Interaktion zwischen Sortilin und GLUT4 zu überprüfen. Dafür haben wir entworfen und chemisch synthetisiert die Myc-markierte Peptid entspricht der potenziellen Sortilin-Bindung-Epitop in der luminalen Teil des GLUT4. Sortilin mit dem Stichwort sechs Histidin war in Säugerzellen ausgedrückt und isoliert von Zelle Lysates mit Kobalt Perlen. Sortilin an den Perlen immobilisiert wurde die Peptid-Lösung bei verschiedenen pH-Werten inkubiert und der eluierten Material wurde durch Western Blot analysiert. Dieser Test kann leicht an andere Waschmittel-Sensitive Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen sein.

Introduction

GLUT4 ist ein Glukose-Transporter-Protein, das vorwiegend in Fett und skelettartigen Muskelzellen exprimiert ist wo es die Wirkung des Insulins auf postprandialen Blut Glukose Abstand1vermittelt. Ein sehr stabiles Protein ist, GLUT4 auf ein post-translationalen Ebene geregelt. In Abwesenheit von Insulin GLUT4 wird weitgehend von der Plasmamembran (daher niedrige basale Durchlässigkeit für Glukose) ausgeschlossen und wird vor allem innerhalb der Zelle in kleinen Insulin eine geschlechtergerechte Vesikeln (IRVs) lokalisiert und Trans-Golgi-Netzwerk (TGN), die voraussichtlich vertreten sind IRV-Spender-Fach. Bei der Insulinverabreichung die IRVs verschmelzen mit der Plasmamembran und liefern GLUT4 an die Seite seines Funktionierens. Dies erhöht die Durchlässigkeit der Plasmamembran für Glucose, so dass Glukoseaufnahme aus Blut in Adipozyten und Skelett Myozyten 10 bis 40-fold steigt. Nach dem Rückzug Insulin ist GLUT4 in frühen/Sortierung Endosomen verinnerlicht und dann abgerufen, TGN wo die IRVs neu formiert werden. Beide sortieren Schritte in den GLUT4 Weg, d.h. Entnahme von peripheren frühen Endosomen bis Perinukleäre TGN und die Bildung der IRVs auf der TGN-Spender, die Membranen von Vps10p Familienmitglied, Sortilin, aktiviert sind, die einen Typ darstellt ich transmembranen Protein und Sortier-Rezeptor. Nach einem Modell Sortilin arbeitet als ein transmembranen Gerüst-Protein: es bindet GLUT4 in das Lumen der Endosomen und TGN und Rekruten Retromer oder Clathrin-Adapter auf der cytoplasmatischen Seite der Spender Membran über dem C-Terminus2, 3. Dies erleichtert die Verteilung von GLUT4 in vesikuläre Träger, die GLUT4 zwischen intrazellulären Kompartimenten translozieren.

Das Zusammenspiel der cytoplasmatischen Schwanz des Sortilin mit Retromer und verschiedene Adapter-Proteine ist gut dokumentiert. Jedoch ist die Bindung des Sortilin GLUT4 (und einige seiner anderen Protein-Liganden) eine Herausforderung gewesen um zu beweisen. Insbesondere sind Versuche, co-Immunoprecipitate Sortilin und GLUT4 nicht wahrscheinlich aufgrund der Waschmittel-Sensitive Art der Interaktion zwischen diesen beiden Proteinen erfolgreich gewesen. Darüber hinaus als eine typische Transporter-Protein hat GLUT4 12 transmembranen Domänen und 6 luminalen Loops beliebige, die Kombination davon möglicherweise eine Sortilin-Bindungsstelle darstellen kann. Zur gleichen Zeit die ein großer Körper der indirekten Beweis, wie die erheblichen Co Lokalisierung in der Zelle, Vernetzung mit Membran durchlässig DSP und der Interaktion in Hefe-zwei-Hybrid-System empfehlen, dass Sortilin GLUT4 gebunden werden kann. Darüber hinaus haben mit den letzteren Ansatz in Kombination mit der Alanin Scannen Mutagenese, wir zuvor festgestellt, dass die Vps10p-Domäne des Sortilin in erster Linie an die erste luminalen Schleife von GLUT4 bindet. Allerdings hat der Beweis für solch eine Interaktion in Säugetierzellen gefehlt. Hier haben wir isoliert sein-tagged Sortilin von 3 t 3-L1 transfizierten Zellen mit Kobalt Harz und gezeigt, dass es chemisch synthetisierten Peptid entspricht der ersten luminalen Schleife des GLUT4 bei pH 6 und pH 8 interagieren kann, die im sauren Milieu ähneln die Endosomal Lumen und neutralen Umgebung in das Lumen der TGN-Membranen. Keine Peptid-Bindung wurde in Experimente nachgewiesen dem Extrakt aus nicht transfizierten Zellen vorbereitet auf den gleichen Perlen geladen wurde.

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Protocol

1. Handling des Peptids

  1. Gestaltung und Bestellung des Peptids
    1. Wählen Sie die gewünschte Reihenfolge des Peptids, und fügen Sie ein Tag, wie Myc Epitop (EQKLISEED) an die beiden N - oder C-Terminus.
    2. Überprüfen Sie die vorhergesagte Löslichkeit des Peptids in Wasser mit Peptid Löslichkeit Rechner http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php. Wenn die Löslichkeit gering ist, versuchen Sie, eine andere wasserlösliche markierst, um die Ladung Balance ändern.
      Hinweis: Wir haben das Peptid entspricht der ersten luminalen Schleife (Fll) von GLUT4 mit dem Stichwort Myc Epitop (Fette Schrift) am N-Terminus (Myc-Fll-GLUT4): EQKLISEEDLNAPQKVIEQSYNATWLGRQGPGGPSSIPPGTLTTLWA, das "gute" vorhergesagten Löslichkeit in Wasser hat .
    3. Bestellen Sie das benutzerdefinierte Peptid mit mindestens 75 % Reinheit, das reicht für den Assay und Löslichkeit Test den Anbieter erfragen. Trennen Sie die Reihenfolge, in mindestens zwei Aliquote bei unvorhergesehenen Problemen mit Auflösung das Peptid.
      Hinweis: Myc-Fll-GLUT4 wurde in zwei Aliquote bestellt. Die gemeldeten Löslichkeit in Reinstwasser ist ≤10 mg/mL.
  2. Das Peptid auflösen
    Hinweis: Reinstwasser ist das beste Lösungsmittel. Erscheint das Peptid nicht wasserlöslich sein, beziehen sich auf http://www.genscript.com/peptide_solubility_and_stablity.html für Anweisungen.
    1. Bereiten Sie 100 x Arbeitslösung des Peptids in Reinstwasser oder Puffer Wahl, mit der Konzentration von 100 μg/mL.
    2. Trennen Sie die Lösung in 50-100 µL Aliquots, und speichern sie bei-20 ° C.

2. Umgang mit Zellen

  1. Zellkultur
    1. Verwenden Sie Wildtyp (WT) Zellen als eine Negativkontrolle und Zellen mit dem Ausdruck des Zielproteins getaggt mit sechs Histidin (HisP).
      Hinweis: Wir haben 3 t 3 L1 Pre Adipozyten mit Sortilin-Myc/His5stabil transfiziert.
    2. Wachsen die Zellen in Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) stark zuckerhaltige, ergänzt mit 10 % Kälberserum bovine, Glutamin (2 mM) und Penicillin/Streptomycin (5 μg/mL) bei 37 ° C in 10 % CO2.
    3. Sitzen Sie vier 10 cm-Gerichte der Zellen, transfizieren Sie zwei davon mit HisP und transfizieren Sie, die anderen beiden mit Kontrolle Plasmid (WT). 48 h nach Transfektion Zellen sollten 80-90 % Konfluenz zu erreichen.
  2. Vorbereitung der Zelle Lysates
    1. Lyse-Puffer (10 mM Hepes, 30 mM NaCl, 5 % Glycerin, 10 mM Imidazol, 0,5 % Triton x-100 und Protease Inhibitor cocktail ohne EDTA für die Isolierung des His-Tags Proteine, pH 7,4) vorbereiten und halten Sie es bei 4 ° C:
    2. Waschen Sie Zellen dreimal mit 10 mL 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei 4 ° C.
    3. Die Gerichte auf Eis gelegt und jedes Gericht 500 µL Puffer Lyse hinzufügen. Die Zelle Lysates mit einem Schaber Zelle zu ernten.
    4. Setzen Sie die Zelle lysate aus jedem Gericht ein anderes 1,5 mL-Tube. Beschriften Sie die Rohre als WT-pH6, WT-pH8, HisP-pH6, HisP-pH8.
    5. Durchlaufen der Zelle Lysates eine Spritze mit einer Nadel 26G fünfmal rauf und runter, komplette Lyse.
    6. Zentrifugieren Sie die Zelle Lysates 16.000 x g für 10 min bei 4 ° C.
    7. Übertragen Sie die Überstände auf neue identisch gekennzeichneten Rohre.
    8. Mit dem BCA Protein Assay Kit oder andere Kit Proteinkonzentration zu analysieren.
    9. Mit Lyse Puffer, Proteinkonzentration von allen vier Lysates auszugleichen.
    10. Trennen Sie eine kleine (ca. 20 µL) Aliquot der jeweils lysate zu und halten Sie sie bei-20 ° C für mögliche Experimente und/oder Fehlersuche.

3. verbindliche sein-tagged Proteine, die HisPur Kobalt-Perlen

  1. Verwenden Sie handelsübliche Waschpuffer oder bereiten Sie vor (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol, pH 8) und halten Sie es bei 4 ° C.
  2. Bereiten Sie waschen-Puffer mit pH 6 kichern waschen Puffer pH 8 mit HCl. halten Sie es bei 4 ° C.
  3. Vorsichtig schwenken die Flasche die Kobalt-Perlen, homogene Suspension zu machen.
  4. 40 µL der Kobalt-Perlen-Suspension in vier 1,5 mL Röhrchen markiert wie oben beschrieben (Schritt 2.2.4) zu verzichten.
  5. Jedes Rohr 1 mL Lyse Puffer hinzu und Zentrifugieren Sie der Rohre bei 1000 X g für 5 S. Aspirat überstand, und ständiger Perlen fügen Sie 40 μL der Lyse Puffer hinzu.
  6. Entsprechenden Röhren der Zelle Lysates hinzufügen.
  7. Inkubieren Sie die Rohre für 90 min bei 4 ° C auf ein Rohr Rotator bei 20 u/min.
  8. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 1000 x g für 5 s und sammeln der Überstand. Halten Sie den Überstand bei 4 ° C.
  9. Entsprechende Rohre 500 µL pH 8 oder pH 6 Waschpuffer hinzufügen und erneut aussetzen der Perlen sanft.
  10. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 1000 X g für 5 s und entsorgen die Überstände.
  11. Wiederholen Sie die Schritte, 3.9 und 3.10 viermal.

(4) die Bindung des Peptids zu sein-tagged Proteins an den Perlen immobilisiert

  1. Mit 100 X Arbeitslösung des Peptids (Schritt 1.2.1), 1 x Arbeitslösungen in pH 6 oder pH 8 Waschpuffer (zwei 100 µL Aliquots für jede, 1 µg/mL) vorzubereiten.
  2. Die gewaschenen Perlen mit den entsprechenden pH-Wert 100 μl 1 X Peptid-Lösung hinzufügen.
  3. Inkubieren Sie die Perlen für 30 min bei 4 ° C auf ein Rohr Rotator bei 20 u/min.
  4. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 1.000 x g für 5 s, den Überstand zu sammeln und bewahren Sie es bei-20 ° C.
  5. Wiederholen Sie die Schritte, 3.9 und 3.10 viermal.
    Hinweis: Um möglichen Hintergrund zu verringern, können die folgenden Schritte Schritte 4.4 und 4.5 ersetzen.
  6. Nehmen Sie vier Mikro Spalten mit 30 μm Poren, beschriften Sie sie wie in Schritt 2.2.4 und legen Sie die Spalten in Röhrchen.
  7. Nach Abschluss von Schritt 4.3, übertragen Sie die Inkubation-Mischung in die Spalten, lassen Sie die Lösung durch die Schwerkraft durchlaufen. Halten Sie die Durchströmung bei-20 ° C.
  8. Übergeben Sie 500 µL Waschpuffer mit pH 6 und pH 8 durch entsprechenden Spalten, durch die Schwerkraft. Die Durchströmung zu verwerfen.
  9. Wiederholen Sie Schritt 4.8 viermal.
  10. Nach der letzten Wäsche Zentrifuge die Spalten bei 1.000 x g für 15 s.

5. Elution von Kobalt-Perlen

  1. Verwendung kommerzieller Tricine Probenpuffer (200 mM Tris-HCl, 40 % Glycerin, 2 % SDS, 0,04 % Coomassie Blau, pH 6,8) und die letztendliche Konzentration von 2 % β-Mercaptoethanol hinzufügen.
  2. Die gewaschenen Perlen und Wirbel der Probe 40 µL Probenpuffer Tricine (mit β-Mercaptoethanol) hinzufügen.
  3. Die Proben für 10 min bei 100 ° C erwärmen Wirbel wieder, die Proben und Zentrifugieren der Rohre bei 1.000 x g für 5 s.
    Hinweis: Um mögliche unspezifische Bindung in der Elution zu verringern, können die folgenden Schritte Schritte 5.1-5.3 ersetzen.
  4. Die gewaschenen 40 μL der Elution Imidazol-Puffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 300 mM NaCl, 0,25 M Imidazol) hinzufügen Perlen, Wirbel und die Rohre bei Raumtemperatur für 20 min inkubieren.
  5. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 3.000 x g für 30 s, den überstand (eluierten Proben) zu sammeln und auf neue beschriftete Rohre übertragen.
  6. Jedes Rohr 40 μl Probenpuffer Tricine hinzu, die Proben für 10 min bei 100 ° C, Wirbel und Zentrifuge Erwärmen der Röhren bei 1.000 x g für 5 s.
    Hinweis: Wenn Mikro Spalten die gewaschenen Perlen der Elution Buffer hinzufügen verwendet werden, 20 min inkubieren Sie und sammeln Sie die Elution durch Zentrifugation bei 8.000 x g 2 min. lang.
    Hinweis: Proben können bei-20 ° C gehalten werden, bis die Elektrophorese durchgeführt wird.

6. Elektrophorese und Western blotting

Hinweis: Die Proben sind bereit für die Trennung von SDS-PAGE und spätere westliche Beflecken. Folgen Sie Protokoll der Gelelektrophorese (https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot) mit den folgenden Änderungen.

  1. Verwenden Sie handelsübliche 10-20 % Tricine gradient Gele.
  2. Laden Sie auf das Gel 20 µL der eluierten Proben und 20 µL Lysates (Schritt 2.2.10). Für die Fehlersuche, es wird empfohlen, 20 µL des ungebundenen Materials (Schritt 3,8) laden und 10 ng des Peptids; Diese Proben vor dem Laden gleich viel Tricine Probenpuffer hinzugefügt.
  3. Elektrophorese in kommerziellen Tris/Tricine/SDS laufen Puffer (100 mM Tris, 100 mM Tricine, und 0,1 % SDS, pH 8,3) durchführen.
  4. Übertragen Sie das Material, aus dem Gel auf eine 0,45 µm Nitrozellulose-Membran mit Transfer-Puffer (25 mM Tris-Base, 192 mM Glycin, pH 8,4) ergänzt mit 20 % Methanol.
  5. Blockieren Sie die Membran mit 3 % Bovine Serum Albumin (BSA) für 1 h bei Raumtemperatur. Pre-gefärbten Molekulargewicht Marker als Hilfslinien verwenden, schneiden Sie die Membran horizontal, Tupfen Sie das Oberteil mit einem Antikörper gegen HisP und tupfen Sie den Unterteil mit einem Antikörper gegen das Myc-Epitop, das Myc-markierte Peptid zu identifizieren.
    Hinweis: In unserem speziellen Fall ist Schneiden der Membran nicht erforderlich da HisP und Myc-Fll-GLUT4 mit einem Anti-Myc-Antikörper nachgewiesen werden können.

7. Analyse der Ergebnisse

  1. Quantifizieren Sie die Intensität aller Western-Blot-Signale mit einem Bild Station oder ImageJ-Programm.
  2. Das Signal vom Myc-markierte Peptid gegen das Signal vom HisP bei beiden pH-Werten zu normalisieren.

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Representative Results

Lysates wurden von 3 t 3 L1 Zellen stabil transfizierten mit Sortilin-Myc/His5 und von WT 3 t 3 L1 Zellen, verwendet als Negativkontrolle vorbereitet. Beide Lysates waren mit Kobalt Perlen bei pH 6 und pH 8 inkubiert und gründlich gewaschen. Kügelchen mit immobilisierten Proteine wurden dann bei der Lösung von Myc-Fll-Glut4 inkubiert. Nach sorgfältiger Wäschen waren Proteine gebunden, die Perlen mit 0,25 M Imidazol eluiert. Proben wurden ausgesetzt, zusammen mit der ursprünglichen Lysates, SDS-PAGE in eine 10-20 % Tricine gradient Gel gefolgt von Western blotting mit Anti-Myc-Antikörper, die für die Erkennung der beiden Sortilin-Myc/HSI erlaubt (110 kD) und Myc-Fll-GLUT4 (5 kD) (Abbildung 1) .

MYC-Fll-GLUT4 (10 ng) wurde auf der ersten Spur des Gels als Referenz geladen. Die Reinheit des Peptids nur 75 % beträgt, sind Verunreinigungen sichtbar (höhere Bänder). Ursprüngliche Zelle Lysates von WT und Sortilin-Myc/His mit dem Ausdruck ihrer Zellen enthalten mehrere Bänder, die von der Anti-Myc-Antikörper erkannt. Material aus Sortilin-Myc/His mit dem Ausdruck ihrer Zellen isoliert ist viel sauberer. Zusätzlich einige kleinere unspezifische Bänder, hat es nur zwei Myc-haltigen Komponenten: Sortilin-Myc/HSI und Myc-Fll-GLUT4. Kontaminierende Peptide auf der ersten Spur erscheinen nicht an Sortilin-Myc/HSI zu binden. Negativkontrolle (WT Eluat) hat überwiegend unspezifische Bänder.

Als intrazelluläre Kompartimente, wie Endosomen und TGN, GLUT4, die unterschiedlichen luminalen pH haben durchläuft, wollten wir Wechselwirkung von GLUT4 mit Sortilin bei pH 6 und pH 8 (Abbildung 2) zu bewerten. Densitometrie Ergebnisse (nicht dargestellt) ergab nicht signifikante Unterschiede im Verhältnis zwischen Myc-Fll-GLUT4 und Sortilin-Myc/His auf die Perlen bei verschiedenen pH-Werten beibehalten. So schließen wir, dass GLUT4 die Fähigkeit zur Interaktion mit Sortilin in Endosomen und TGN hat.

Figure 1
Abbildung 1 . Sortilin-Myc/seine Wechselwirkung mit Myc-Fll-GLUT4 an Kobalt Perlen. Lysaten aus WT-3 t 3-L1-Zellen vorbereitet und 3 t 3-L1 Zellen stabil mit dem Ausdruck Sortilin-Myc/HSI (S) wurden übergangen Kobalt Perlen, gewaschen, mit Myc-Fll-Glut4 bei pH 8, wieder gewaschen und mit Imidazol-Puffer eluiert inkubiert. MYC-Fll-Glut4 (10 ng) wurde auf der ersten Spur als Referenz geladen.

Figure 2
Abbildung 2 . Sortilin-Myc/His interagiert mit Myc-Fll-GLUT4 bei pH 8 und pH 6. MYC-Fll-Glut4 wurde mit Material an den Perlen bei pH 6 und pH 8, gewaschen und mit Glycin Probenpuffer eluiert immobilisiert inkubiert. Die Figur wurde von Pan X., Et al.3angepasst.

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Discussion

Sortilin ist ein evolutionär konservierte Multi-Liganden-Protein-Rezeptor, der bei beiden Signalisierung an der Plasmamembran und in intrazellulären Sortierung Veranstaltungen6,7beteiligt ist. Die Suche nach dem authentischen Sortilin Liganden (einige davon sind luminalen oder integraler Membranproteine) ist jedoch komplizierter, wie das Zusammenspiel von Sortilin mit einigen seiner Bindungspartner zu empfindlich auf Waschmittel zu sein scheint. Daher eine einfache und weit verbreitete Ansatz für die Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen, co-Immunopräzipitation, nicht ohne weiteres übertragbar. Einige Forschungsgruppen haben co-Immunopräzipitation verwendet, um die Interaktion zwischen Sortilin und seinen möglichen Liganden8,9zu demonstrieren. Aber diese Experimente durchgeführt wurden entweder in 0,1 % Triton oder 0,6 % CHAPS die Zweifel in der Vollständigkeit der Membran Solubilisierung wirft.

Andere Forscher untersuchten die Interaktion zwischen Sortilin und seine Liganden durch Surface Plasmon Resonance10,11. Obwohl Oberflächenplasmonenresonanz wohl die beste Herangehensweise an das Problem, es erfordert teure Ausrüstung und erhebliche Mengen an reinen rekombinante Proteine, die kostspielig und zeitaufwendig ist.

Hier beschreiben wir eine Technik, die in Kombination mit anderen Methoden, wie Vernetzung und das Hefe-zwei-Hybrid-System stark darauf hin, dass diese Sortilin GLUT4 gebunden werden kann. Der Test ist schnell und einfach und kann ohne weiteres auf andere Proteine und verschiedene Größen von Peptiden angepasst werden.

Es gibt ein paar wichtige Schritte in diesem Test. Die erste ist das Peptid Löslichkeit in Wasser. Ein weiterer ist die Auswahl des entsprechenden Steuerelements. Natürlich kann eine erhebliche Menge des biologischen Materials mit Kobalt Perlen über endogene seine Reichweite Sequenzen oder unspezifisch interagieren. Daher ist es wichtig, auf die Perlen Lysates WT-Zellen zu immobilisieren und transfizierten Zellen mit dem Protein des Interesses, in unserem Fall Sortilin-Myc/HSI. In dieser Versuchsanordnung wird Material gebunden, die Perlen unterscheiden sich in nur ein Protein, Sortilin-Myc/HSI, so dass ein gewisses Maß an Hintergrund-Bindung des Peptids zu Kontrolle Perlen toleriert werden kann. Dennoch kann die Hintergrund-Bindung des Peptids an die Perlen durch die Erhöhung der Stringenz der endgültigen Waschschritte reduziert werden. Die Verwendung von Mini-Spalten für das Waschen der Perlen kann Hintergrund verbindlich noch weiter verringern.

Aufgrund der Natur des "GLUT4-Signalwegs" wollten wir Adresse Bindung von Myc-Fll-GLUT4 an Sortilin bei verschiedenen pH-Werten. Wir sind uns bewusst, dass pH in das Lumen der frühen/Sortierung Endosomen unter 6 fallen können. Allerdings stört pH-Wert niedriger als 6 Bindung des His-Tags Proteine Kobalt-Perlen, die als eine Einschränkung der Methode angesehen werden können.

Isolierung des Zielproteins auf Kobalt-Perlen mit seinem Epitop ist vorzuziehen, andere Affinität Reinigungsschritte wie Immunopräzipitation mit spezifischen Antikörpern, in Bezug auf den Ertrag und die unspezifische Bindung. Dennoch ist es durchaus möglich, dass Isolation des Zielproteins auf anderen Harzen (vorzugsweise magnetische Beads) mit angemessener Kontrollen wird als erfolgreich erweisen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von Forschungsstipendien, die DK52057 und DK107498 von der NIH, K.V.K. X.P wurde unterstützt durch die institutionelle Ausbildung Grant 2T32DK007201 vom NIH unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protease inhibitor cocktail Sigma P8849 for use in purification of histidine tag protein
Phosphate-Buffered Saline  Corning 21-040-CV PBS
1mL Insulin Syringe U-100 BD 329652 26G x 1/2
BCA Protein Assay Kit Pierce 23228
Wash buffer Boston BioProducts BP-234 For His-tag protein purification
HisPur Cobalt Resin Thermo Scientific 89964
Tricine sample Buffer Bio-Rad 161-0739 with SDS, bMercaptaethanol should be added
Elution  Buffer Boston BioProducts BP-236 For His-tag protein purificationwith 250mM Imidazole
Mini-Protean Tris-Tricine precast gels 10-20%  Bio-Rad 456-3115 For seperation of peptide and small protein
Tris/Tricine/SDS running buffer  Bio-Rad 161-0744
Transfer Buffer Boston BioProducts BP-190 Add 20% methanol
Nitrocellulose membrane  0.45 mm Bio-Rad 1620115
Bovine Serum Albumin Sigma A9647 BSA
Anti Myc antibody Cell Signaling 2272 Rabbit
Peptide Genscipt customize ordering
Precision Plus Protein Dual color Standarts BioRad 161-0374

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References

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  2. Kandror, K. V., Pilch, P. F. The sugar is sIRVed: sorting Glut4 and its fellow travelers. Traffic. 12 (6), 665-671 (2011).
  3. Pan, X., Zaarur, N., Singh, M., Morin, P., Kandror, K. V. Sortilin and retromer mediate retrograde transport of Glut4 in 3T3-L1 adipocytes. Mol Biol Cell. 28 (12), 1667-1675 (2017).
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