Summary
Este protocolo descreve como visualizar a transiente compactação do DNA em cianobactérias. Cultivo síncrono, monitoramento por microscopia de fluorescência, congelação rápida e alta tomography do cryo-elétron de tensão são usados. É apresentado um protocolo para essas metodologias e desenvolvimentos e aplicações futuras são discutidos.
Abstract
Este protocolo descreve como visualizar a transiente compactação do DNA em cianobactérias. Compactação do DNA é um evento citoplasmático dramático recentemente encontrado para ocorrer em algumas cianobactérias antes da divisão celular. No entanto, devido o tamanho de células grandes e o caráter transitório, é difícil investigar a estrutura em detalhes. Para superar as dificuldades, primeiro, compactação do DNA é reproducibly produzida na associação Synechococcus elongatus PCC 7942 pela cultura síncrona usando 12 h cada ciclo claro/escuro. Em segundo lugar, compactação do DNA é monitorizada por microscopia de fluorescência e capturada por congelação rápida. Em terceiro lugar, a estrutura detalhada do DNA compactado células é visualizado em três dimensões (3D) pela tomografia computadorizada de cryo-elétron de alta tensão. Este conjunto de métodos é amplamente aplicável para investigar estruturas transientes em bactérias, por exemplo, a divisão celular, segregação do cromossomo, infecção do fago , etc., que são monitorados por microscopia de fluorescência e visualizado diretamente pela tomography do Cryo-elétron em pontos de tempo apropriado.
Introduction
Compactação do DNA é um acontecimento dramático citoplasmático que foi identificado em algumas cianobactérias. Quando Synechococcus elongatus era culta, abaixo dos 12 h cada ciclo claro/escuro, DNA aparecido condensada no final do período de luz, que era claramente diferente da sua aparência na época outra pontos1. Tem sido sugerido que este processo é controlado por um relógio circadiano baseado no Kai proteínas2. Seki et al relataram que o ADN manchado com Hoechst 33342 foi compactado em S. elongatus células no final do período de luz e mostrou uma ondulada em forma de haste sob um microscópio de fluorescência. O DNA compactado então separados em dois no centro da haste que a célula dividida e finalmente retornou para uma distribuição uniforme normal em cada célula filha3. No entanto, sua natureza transitória e tamanho grande para microscopia eletrônica impediu a análise estrutural. Murata et al combinados vários métodos, incluindo a cultura síncrona, microscopia de fluorescência, congelação rápida e alta tensão elétron cryo-tomografia computadorizada (cryo-HVET) e conseguiu identificar a estrutura de transiente compactação do DNA, incluindo a cinética de polifosfato corpos (PPBs)4. O manuscrito fornece uma explicação visual de um material tão difícil em detalhe, combinando os procedimentos experimentais.
S. elongatus tem uma forma de cápsula, um comprimento de 2 a 5 µm, uma largura de sobre 0.5 µm e a perfeita compactação do DNA aparece em células vivas apenas para um tempo muito curto. Portanto, as mudanças estruturais que ocorrem na compactação de DNA cianobactérias eram desconhecidas em detalhe. Para investigar essas estruturas por microscopia eletrônica, é necessário superar os dois principais problemas técnicos. Uma é a observação de um espécime tão grossa de toda bactéria em condições nativas quase, e o outro é a fixação rápida de uma estrutura dinâmica. Quanto ao primeiro problema, o percurso livre médio (iMFP) inelástico de elétrons varia de acordo com a tensão de aceleração do microscópio eletrônico5. Em um microscópio eletrônico de transmissão (TEM) de 300 kV, é menos de 350 nm. Por exemplo, quando uma associação de gelo-incorporado (espécime espessura ≈ 600 nm) é observada em 200kV TEM (≈ iMFP 250 nm), as estruturas no interior da célula são difíceis de observar. Por contraste, 1 MV TEM (iMFP ≈ 500 nm) pode dar e imagem da estrutura citoplasmática em toda a célula (Figura 1). Neste protocolo, como uma parte da solução, um microscópio de alta voltagem (HVEM) em uma tensão de aceleração de 1 MV foi empregado. No entanto, as instalações que implementam HVEM limitam-se em todo o mundo. Possíveis soluções alternativas também são discutidas na seção de discussão. O segundo problema foi resolvido pela microscopia cryo-elétron (cryo-EM). Esta é uma poderosa ferramenta para a visualização de estruturas dinâmicas em condições nativas, onde a amostra é rapidamente congelada em etano líquido usando um dispositivo de congelação rápido, e o momento congelado é diretamente observado com um mínimo de modificações6quase. Combinando com tomografia computadorizada, um instantâneo de estruturas tridimensionais (3D) pode ser reconstruído da inclinação série7. Neste experimento, compactação do DNA foi reproduzida em s. elongatus usando síncrona cultura abaixo dos 12 h cada claro/escuro do ciclo, e o momento do congelamento da amostra foi determinado pelo monitoramento sob um microscópio de fluorescência.
As abordagens descritas aqui são amplamente aplicáveis ao estudo das estruturas dinâmicas em células bacterianas, por exemplo, a divisão celular, segregação do cromossomo e infecção do fago e têm um potencial para abrir novos caminhos na investigação microbiológica.
Protocol
1. síncrona cultura de cianobactérias
- Cultura de S. elongatus PCC 7942 BG 11 placa esterilizada (em uma 9cm plástico Petri estéril) contendo ágar 1,5% (p/v) e 0,3% (p/v) de tiosulfato de sódio8.
- Coloque as placas em uma câmara de crescimento a 23 ° C com uma intensidade de luz de 50 µE/m2/s e sujeitas a ciclos de escuro h da luz/12 h 12.
- Transferi as células em placas de ágar BG11 frescas uma vez por semana.
Nota: As culturas em ágar aparecerá como bandas verdes de pilhas ativamente proliferating depois de uma semana sob essa condição de cultura. - Leve verdes aglomerados de células com um laço de fio esterilizado flama e raia as células em uma placa de ágar BG11 fresca. Fazer isso em uma bancada limpa.
2. monitorização por microscopia de fluorescência
- Use células cultivadas na placa de ágar para 6 dias para observar a compactação do DNA. Colete células da placa no final do período de luz derramando 1 mL de solução 0,2 M de sacarose sobre as células. Repita derramando a solução para as células, para que a maioria das células é coletadas. Transferi a solução de células suspensas em um micro tubo para coloração de DNA.
- Adicione a DNA mancha solução corante (por exemplo, Hoechst 33342) a 500 µ l da solução de células suspensas em um micro tubo para uma concentração final de 1 µ g/mL. Então, mantenha o tubo no escuro por 10 min.
- Centrifugar por 1 min a 2.000 x g de sedimentos das células. Desprezar o sobrenadante e adicionar 10 µ l de solução de sacarose 0,2 M para obter uma suspensão de células densas.
- Transferir 1 µ l da solução contendo células coradas para um vidro de slide, colocar uma lamínula e observar com um microscópio de fluorescência, equipado com um filtro UV usando uma lente objetiva com uma ampliação de 100 X e óleo de imersão.
- Confirmar que a compactação do DNA é observada neste ponto da maioria das células e, em seguida, preparar a amostra para a próxima etapa de congelamento.
3. amostra de congelamento por Cryo-HVET
- Configure um dispositivo de mergulho-congelamento. Encha o reservatório com nitrogênio líquido e começar a cryo-câmara de resfriamento depois de ligar a câmara e o tanque com um tubo de Teflon.
- Preencha o etano líquido em uma panela de cobre pequeno dentro da câmara depois de arrefecer a câmara para temperatura do nitrogênio líquido. Use óculos durante a operação, porque etano líquido é explosivo.
- Brilho do carbono-lado de uma sala de concertos EM carbono revestido de descarga grade (grade holey) por 30 s a 50 mA usando um bombarder de íon do plasma.
- Aplicar 1 µ l do tracer BSA ouro (15 nm) para a sala de concertos grade como um marcador fiducial.
- Aplica uma alíquota de 2,5 µ l de células na fase de compactação do DNA à grade da sala de concertos. Borre fora a solução em excesso com um papel de filtro. Mergulhe a grade etano líquido usando um desentupidor no dispositivo de congelamento de mergulho imediatamente.
- Armazene as grades congeladas no armazenamento de nitrogênio líquido até que eles são examinados.
4. Cryo-HVET
- Configurar o HVEM com uma alta tensão de 1 MV.
- Monte a grade congelada em um suporte de cryo-amostra para HVEM pré-resfriado a-150 º C com nitrogênio líquido dentro cryo-estação de trabalho e carregá-lo para o HVEM. Tenha cuidado para evitar a contaminação por gelo.
- Selecione uma área de imagem em uma baixa ampliação de 1, 000 X. Ajuste a altura do eixo z eucentric.
- A fase de amostra a-60 ° de inclinação e retire a folga da rotação da inclina.
- Ajuste o foco perto do local de destino em uma ampliação de 10, 000 X. Definir um sob foco de 6 a 10 µm por desvio em relação a imagem focada. Para a imagem latente, definir a dose para 2 e–/Å-2 ou menos na amostra previamente.
- Medir a dose de elétrons pela densidade de corrente na tela de imagem em HVEM. Ter uma imagem em um filme de elétron ou pela câmera digital com a mesma ampliação como no processo de focalização.
- Recolha imagens de inclinação manualmente com o mesmo procedimento como (4,5) de-60 ° a + 60 ° em um incremento de ângulo de inclinação de 2 ° a 4 °.
Nota: Em muitos modernos microscópios, a aquisição da série inclinação é automatizada pela combinação de uma câmera digital. Nesse caso, siga o manual de instruções. Para filmes negativos, desenvolver os filmes para min 12 a 20° C, em um tanque de desenvolvedor, usando um força total de desenvolvedor e correção em um fixador para 10 min. digitalizar os filmes com uma resolução de 4.000 dpi (0.635 nm/pixel na imagem) usando um scanner de mesa. No caso de uma câmera digital, submeta as imagens coletadas diretamente para a próxima etapa de processamento de imagem. Se necessário, reduza o tamanho da imagem em um filtro mediano usando duas a quatro binning (tamanho reduzindo fator) e software apropriado (por exemplo, ImageJ).
5. tomográfica reconstrução
- Fazer um arquivo de imagem de pilha de indivíduo incline imagens usando o comando "tif2mrc" ou "newstack" no IMOD software9.
- Iniciar o software eTomo GUI no IMOD e definir parâmetros de imagem: tamanho de pixel de diâmetro fiducial, rotação de imagem, etc. Em seguida, crie scripts.
- Executar programas individuais de acordo com o software listado nas tabelas de materiais, onde a série de inclinação é alinhada usando marcadores fiduciais (com um médio erro residual inferior a 0,5). Finalmente, reconstrua uma tomografia 3D usando o algoritmo SIRT em IMOD.
- Extrair uma região de interesse (ROI) da tomografia e denoise usando um filtro denoise: um filtro de difusão anisotrópica em uma morfologia matemática, um filtro bilateral na EMAN10ou IMOD filtro11, etc., com parâmetros adequados para realçar o contraste.
6. segmentação da característica de interesse
Nota: O procedimento descrito abaixo é específico para o software utilizado (ver Tabela de materiais), mas outros pacotes de software podem ser usados em vez disso. Consulte seu guia do usuário.
- Na janela do visualizador 3D, abra o arquivo de tomografia no software Amira e gerar um OrthoSlice.
- Na janela Editor de segmentação, crie um arquivo de segmentação, selecionando um novo campo"rótulo".
- Manualmente, traçar a fronteira da característica de interesse (FOI). Siga o FOI através de todas as fatias de tomografia. Para o segundo FOI, criar um novo "material" e repita a mesma operação.
- Gere uma superfície de renderização, selecionando o menu "SurfaceGen". Para visualizar o volume segmentado, selecione o menu "SurfaceView". Para mover, girar e ampliar o volume 3D, use as ferramentas na janela do visualizador 3D.
- Para segmentação automática, use a ferramenta de varinha mágica. Clique em um objeto e ajuste os controles deslizantes no Display e mascaramento para cobrir o intervalo de valores para que o objeto é totalmente selecionado por suas características.
Representative Results
Em uma cultura síncrona precisa menos de 12h cada luz/escuro ciclo, DNA rotulado com Hoechst mostra uma distribuição uniforme normal na condição de escuro (Figura 2a). No entanto, ele progressivamente compacta dentro da célula durante o período de luz e aparece como uma estrutura ondulada de haste-como (Figura 2b) no final do período de luz. Finalmente, a haste divide no centro (setas na Figura 2C) e duas partes são distribuídos para as células filhas (Figura 2d). Após a divisão celular, o DNA compactado desaparece imediatamente, e o DNA retorna para uma distribuição uniforme normal.
Quando uma alíquota de células que contêm as células em fase final de compactação do DNA foram imediatamente transferidos para um sala de concertos grid e rápida congelado em etano líquido, e a grade congelada foi observada por 1 MV cryo-HVEM, as estruturas internas das cianobactérias incluindo DNA, camadas de membrana tilacoides, paredes celulares e PPBs, aparecem como um instantâneo no momento do congelamento (Figura 3a). Muitas células mostraram distinta compactação do DNA nas células (setas brancas na Figura 3a) e podem ser facilmente distinguidas de células normais (pontas de seta brancas na Figura 3b). Alguns exibiram uma constrição no centro das células como esperado antes da divisão celular (seta amarela na Figura 3a).
Em tomograms 3D, principais organelas da célula poderiam ser segmentadas; parede celular, camadas de membrana tilacoides, DNA e PPBs poderia ser distinto (Figura 4). Em particular, o DNA compactado foi separado por uma diferença distinta no citoplasma onde o DNA foi cercado por material de baixa densidade e as camadas de membrana tilacoides foram distorcidas ao longo da haste ondulado de DNA compactada. Comportamento dinâmico dos PPBs observou-se recentemente: no DNA compactado células, muitas pequenas PPBs foram vistos a aderir ao DNA, Considerando que eles são grandes e menos em células normais. Além disso, a maioria dos PPBs apareceu como pares, e DNA aparentava estar em um processo de separação dos PPBs. Isto sugere que PPBs se são divididos em dois pela duplicação de DNA e função como fornecedores de fosfato para a síntese de DNA.
Figura 1. Imagens de Cryo-EM de cianobactérias normais incorporado no gelo, S. elongatus PCC 7942 com diferentes voltagens de aceleração. a) 200kV e b) 1000kV. Barra de escala = 500 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Microscopia de fluorescência das células de S. elongatus associação. Após cultura síncrona ciclos de cada luz/escuro de menos de 12 horas, as células foram coradas com Hoechst 33342. (a) células após 2 h do início do estado escuro mostram uniforme DNA rotulagem. O DNA em muitas células condensado gradualmente durante o período de luz. Em última análise, formou-se uma haste ondulado grosso (b) típico de compactação do DNA. Após esta etapa, as estruturas de DNA compactadas rapidamente divididas em seus centros (setas) durante a divisão celular (c) e os dois fragmentos separaram em células-filhas (d). As células-filhas retornado a rotulagem uniforme do DNA no período escuro. Barra de escala = 2 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: imagem de Cryo-HVEM de cianobactérias incorporado no Gelo amorfo (a) mostra uma imagem raw na inclinação de 0 °. Imagens foram tomadas no final do período de luz. Algumas células mostram corpos ondulados de DNA de forma cilíndrica semelhante aos cromossomas condensadas eucarióticas (setas brancas). Em células normais, cianobactérias exibem uma estrutura de DNA discernível no citoplasma (setas brancas). Alguns apresentam uma constrição no centro das células como esperado antes da divisão celular (seta amarela). (b) xy, xz e yz-fatias de uma tomografia 3D. Linhas amarelas pontilhadas mostrar interseções de fatias. Barra de escala = 2 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: ultraestrutura de células contendo compactado DNA. Os componentes principais são segmentados: parede celular (amarelo brilhante), membranas tilacoides (vermelhas) e DNA (azul). (a) mostra uma z-fatia de uma tomografia 3D. (b) todos os segmentos. A constrição indicando a separação de célula aparece no centro da célula (seta). PPBs são modelados como esferas de amarelas ou laranja; cada esfera laranja representa a contrapartida da esfera amarela mais próxima. Barra de escala = 500 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Nós apresentamos uma sequência de protocolos para a visualização de transiente compactação do DNA em cianobactérias. O conceito básico é semelhante da luz correlativo e microscopia eletrônica de varredura (CLEM)12. Além disso, nesse método, cianobactérias ao vivo foram monitoradas por microscopia de fluorescência, rapidamente congeladas nas grades EM e visualizadas diretamente com tomografia computadorizada de cryo-elétron de alta tensão. Como uma primeira aplicação, a estrutura detalhada do DNA compactado células bacterianas com êxito foi visualizado em 3D. Atualmente, este procedimento é específico para este assunto, mas será aplicado mais extensivamente, com metodologia modificada em alguns casos. Aqui, as vantagens, as limitações e as possibilidades futuras deste método são discutidas.
Uma das vantagens deste método é a visualização em 3D da célula inteira. 1 MV HVEM visualizado com êxito a dinâmica estrutura das organelas subcelulares no DNA compactada de células. No entanto, a estrutura fina dentro de células normais não poderiam ser distinguida devido a imagem de baixo contraste. Aumentando inelástica e a dispersão de vários espécimes grosso desfoca a imagem13. Zero-perda e mais-provável-perda de imagem filtrando por um filtro de energia pode melhorar o contraste da imagem, reduzindo a dispersão inelástica14,15, mas não vai funcionar para amostras mais espessas do que iMFP. Os picos de perda nula e a maior perda de provável diminuem drasticamente com espessura do espécime. É particularmente difícil obter uma relação sinal / ruído suficiente para os espécimes elétron sensível incorporado no gelo. Murata et al . demonstraram que transmissão de digitalização de 1MV dá de microscopia (haste) maior contraste de imagem do que uma imagem de campo brilhante em plástico incorporado células de levedura com espessura de 5 µm, onde o contraste da imagem é principalmente dada pelo contraste de amplitude13 . No entanto, espera-se que o efeito de danos de arrastamento sobre elétrons acelerados superiores cria outra limitação para a dose de irradiação para danos sensíveis cryo-espécimes16. O pedido de Volta e Zernike fase placas17,18 de HVEM pode ser capaz de reduzir os danos de arrastamento, reduzindo a dose total no futuro. Outra limitação usando HVEM para espécimes grossos vem do fato de que as instalações do usuário que fornecem HVEM são escassas em todo o mundo.
Utilizando um método alternativo para observar espécimes grossos, tomografia computadorizada de crio-haste em 300 kV demonstrou imagens de alto contraste em espécimes congelados-hidratado com espessura superior a várias centenas de nanômetros19. Para recuperar o contraste de fase em crio-haste, microscopia eletrônica de pthychographic também foi introduzida, na qual a placa de fase na lente condensadora transpõe uma difração de fase modulada para detector 2D pixelado20. As imagens são recuperadas pelo cálculo de múltiplas difrações. Para direto e rápido 3D cryo-imagens de grande nativo congelada amostras, cryo-FIB-SEM também podem ser usado21, onde serial seccionamento com um feixe de íon focalizado e bloquear a imagem do rosto é aplicada para a imagem totalmente hidratado amostras congeladas. Embora estas tecnologias expandem o intervalo de visualização de espécimes biológicos, é difícil encontrar o local de destino das bactérias, rotulado por exemplo, as bactérias, porque o alvo está completamente sob o gelo e não pode ser identificado antes de aparar.
Compactação do DNA produz uma estrutura distinta em cianobactérias. DNA compactado células distinguem-se facilmente mesmo sem ser manchada devido a um viés de grande densidade no interior das células que não está presente em células normais. No entanto, a fim de Visualizar mais eventos locais dentro da célula, é necessário transferir o ROI fluorescente etiquetado para o microscópio de elétron. Para correlativo luz e microscopia eletrônica de varredura (CLEM), imagens de microscópio de luz e microscópio eletrônico são geralmente correlacionadas usando contas de látex fluorescentes ou pontos quânticos em localizador grades12. As partículas de rotulagem devem ser de densidade de elétrons alta além de fluorescência. Eles podem com precisão e confiabilidade correlacionar as posições entre as duas imagens. Além disso, confirmando a área rotulada com microscopia cryo-luz, completa sobreposição de ROI pode ser conseguida entre os dois microscópios. Quando caracterizam eventos estruturais mais detalhados na compactação do DNA, estas partículas e microscópio crio-luz será uma ferramenta indispensável para uma correlação mais robusta e precisa no futuro.
Este artigo mostra como caracterizar a estrutura transitória de compactação do DNA em cianobactérias por uma combinação de cultura síncrona, microscopia de fluorescência e tomografia computadorizada de cryo-elétron de alta tensão. Este protocolo centra-se na observação de DNA compactada. Combinando este método com outras novas tecnologias mencionadas acima, será possível investigar o processo de compactação do DNA em um detalhe mais adicional, e devidamente modificados métodos são amplamente aplicáveis a outros eventos dinâmicos e estruturais em bactérias.
Disclosures
Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.
Acknowledgments
Os autores agradecer Tammo Reisewitz leitura crítica do manuscrito e Mako Hayashi e Sayuri Hagiwara para cultivo de cuidado e observação das cianobactérias, Yoshitaka Kimori para processamento de imagem, Chihong Song, Naoyuki Miyazaki e Miyoko Nagayoshi por ajudar com a segmentação das estruturas. Este trabalho foi financiado pelo programa de estudo colaborativo do Instituto Nacional de Ciências fisiológicas (NIPS) para YK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hoechst 33342 solution | Dojindo | 346-07951 | 1mg/mL in H2O |
| Agar Powder (for plant culture) | Wako | 016-11875 | |
| Boric acid | Wako | 027-02192 | 99.5% |
| Manganese chloride tetrahydrate | Wako | 139-00722 | 99% |
| Zinc sulfate heptahydrate | Wako | 264-00405 | 99.5% |
| Sodium molybdate | Wako | 196-02472 | 99% |
| Copper sulfate pentahydrate | Wako | 039-04412 | 99.5% |
| Cobalt nitrate hexahydrate | Wako | 031-03752 | 99.5% |
| Sodium nitrate | Wako | 191-02542 | 99% |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Wako | 131-00405 | 99.5% |
| Calcium chloride dehydrate | Wako | 031-00435 | 99.5% |
| Citric acid | Wako | 036-05522 | 98% |
| EDTA-2Na | Dojindo | 343-01861 | 99.5% |
| Sodium carbonate | Wako | 197-01581 | 99.8% |
| Potassium phosphate dibasic | Wako | 164-04295 | 99% |
| TES (Good’s buffer) | Dojindo | 344-02653 | 99% |
| Ferric ammonium citrate | Wako | 092-00802 | 1st Grade |
| Sodium thiosulfate pentahydrate | Wako | 197-03585 | 99% |
| BSA gold tracer 15nm | Aurion | 215.133 | |
| Quantifoil EM grid | Quantifoil MicroTools | R3.5/1 Copper grid | |
| Electron films | Kodak | SO-163 | |
| Developer | Kodak | D19 | |
| Fixer | Kodak | Rapid fixer | Solution |
| Filter paper | Whatman | Grade 1 | |
| Growth chamber | NKsystem | LH-100SP | |
| Fluorescent microscope | Nikon | ECLIPSE 50i | |
| High voltage TEM | HItachi | H1250M | |
| Cryo-specimen holder for HVEM | Gatan | ||
| plunge-freezing device | Leica | EM CPC | |
| Plasma Ion bombarder | Vacuum device | PIB-10 | |
| Liquid nitrogen storage | Taylor-Wharton | 25LDB | |
| Developing tank | Dosaka EM | TB-3-75 | |
| flatbed scanner | Nikon | Coolscan 9000ED | |
| Segmentation software | FEI | Amira | https://www.fei.com/software/amira |
| Tomographic Reconstruction software | eTOMO | http://bio3d.colorado.edu/imod |
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