Summary
Neste estudo, descrevemos um sistema no ovo como uma ferramenta promissora para testar compostos insulino-mimética em um organismo vivo. As principais vantagens incluem taxas de transferência adequada e a custos aceitáveis, que permitam a identificação de fitoquímicos com propriedades insulino-mimética.
Abstract
Níveis elevados de glicose no diabetes mellitus tipo 2 (T2DM), uma doença metabólica complexa e multifatorial, são causados por falha de resistência e β-célula de insulina. Várias estratégias, incluindo a injeção de insulina ou o uso de medicamentos insulino-sensibilizantes, foram perseguidas para tratar T2DM ou pelo menos reduzir os sintomas. Além disso, a aplicação de compostos à base de plantas tem atraído cada vez mais atenção. Assim, é preciso encontrar sistemas de teste eficiente para identificar e caracterizar compostos insulino-mimética. Aqui nós desenvolvemos um modelo de embrião de pintinho modificados, que permite testes de compostos sintéticos e extractos de ervas com propriedades insulino-mimética. Usando uma fluorescência baseado em microscopia tela primária, que quantifica a translocação do transportador de glicose (Glut4) de 4 para a membrana plasmática, fomos capazes de identificar compostos, principalmente extratos de ervas, que levam a um aumento de glicose intracelular concentrações nos adipócitos. No entanto, a eficácia destas substâncias requer mais verificação em um organismo vivo. Assim, usamos uma abordagem no ovo para identificar suas propriedades de redução de glicose do sangue. A aprovação por um Comitê de ética não é necessário desde que a utilização de embriões de galinha durante os primeiros dois terços do desenvolvimento embrionário não é considerada um experimento animal. Aqui, a aplicação deste modelo é descrita em detalhes.
Introduction
Diabetes mellitus é uma doença metabólica caracterizada por hiperglicemia e é causada por defeitos na secreção de insulina ou de ação de insulina1. Noventa por cento de todos os casos de diabetes são categoria diabetes mellitus tipo 2 (T2DM), onde os indivíduos demonstram resistência à insulina e principalmente insulina deficiência2. Vários fatores são conhecidos por aumentar a incidência global de T2DM, incluindo mudanças de estilo de vida, particularmente as relacionadas com overnutrition, Envelhecimento e sedentarismo. Cerca de 400 milhões de pessoas têm diabetes mellitus em todo o mundo de acordo com a Federação Internacional de Diabetes (IDF). Esse número deve chegar a 600 milhões dentro os próximos 20 anos3.
Complicações do diabético causadas por hiperglicemia e resistência à insulina, tais como hipertensão arterial, dislipidemia, intolerância à glicose, doença coronariana e doença vascular cerebral, levam a um significativamente reduzida expectativa de vida e de qualidade4. Indivíduos afetados requerem farmacoterapia reduzindo a glicose; no entanto, o uso de drogas, como a metformina5 é frequentemente associado com efeitos colaterais dramáticos6,7,8. Portanto, mais antidiabéticos abordagens que são seguros, amplamente disponível e barato são necessárias.
Nutracêuticos, extratos, plantas e compostos de ervas diferentes tenham sido atribuídos Propriedades insulino-mimética característica modulando várias funções celulares. Uma característica importante é a estimulação de translocação do transportador de glicose (GLUT4) de 4 para a membrana plasmática de compartimentos de armazenamento intracelular, resultando em um aumento da absorção de glicose no músculo e tecido adiposo, na ausência de insulina, conhecida como Propriedades insulino-mimética9. Anteriormente, nós implementamos uma abordagem baseada em microscopia de fluorescência para quantificar o processo de translocação de GLUT410. Análise de numerosos extractos de plantas de uma biblioteca de extrato11 usando este ensaio resultou na identificação de candidatos promissores. No entanto, testes em organismos vivos são necessários. A abordagem descrita detalhadamente neste trabalho, um modelo de embrião de pintinho modificados, provou para ser um modelo promissor para a identificação de substâncias com propriedades insulino-mimética. Representa uma ferramenta atraente, enchendo o abismo entre os estudos in vitro e in vivo e oferece várias vantagens em comparação com sistemas existentes, tais como custos aceitáveis, procedimentos de manuseio simples e taxas de transferência adequada. Além disso, a permissão por uma Comissão de ética não é necessária.
Protocol
De acordo com a Directiva 2010/63/UE, experiências com embriões aviários não-nascidos durante os primeiros dois terços do desenvolvimento embrionário não precisa de permissão por um Comitê de ética.
1. armazenamento e reprodução dos ovos
- Obter ovos fertilizados de galinha (Tabela de materiais) de um criador local.
Nota: Os ovos podem ser armazenados a 14 ° C, em um ambiente umidificado para até 10 dias após a postura antes da utilização para experimentos. - Incubar os ovos a 38 ° C com uma umidade média de 40-60% para 10 ou 11 dias em uma incubadora que constantemente transforma os ovos.
2. selecção dos ovos
- Verifique os ovos para fertilização após incubação de até 11 dias. Use uma luz transiluminação para esta etapa. Mergulhe um inkpad a franja da lâmpada transiluminação e vela o lado pontiagudo do ovo.
- Para identificar a bexiga de ar, verifique se há diferenças de brilho na parte superior do ovo.
Nota: A bexiga de ar aparece como uma região mais transparente, redonda, enquanto a albumina é mais escura, quando o ovo é transiluminado. - Após a detecção da bexiga de ar, marca o local pressionando a lâmpada ligeiramente contra o ovo com a tinta aplicada anteriormente.
- Exclua os ovos não-fertilizados neste passo, que não mostram uma diferença de brilho entre a albumina e a bexiga de ar.
3. a injeção de substâncias
- Prepare a substância de interesse (por exemplo, o extrato de ervas ou insulina) diluindo a substância na concentração desejada no buffer de solução salina equilibrada (HBSS) do Hank. Por exemplo, 3.3 U/mL de um análogo em HBSS de insulina comercialmente disponível.
- Para a aplicação do composto selecionado, cuidadosamente bicar a casca de ovo com um aguçado par de pinças na área marcada da bexiga de ar. Não fazem um buraco maior que o diâmetro da agulha da seringa. Injete a solução-tampão (300 µ l) contendo a substância de interesse para a área de perfura através de uma seringa.
Nota: Use seringas de uso único estéril de 1 ml, pontas de pipetas e navios. Use luvas e avental para os experimentos. - Para determinar o efeito de reduzir a glicose do sangue de uma substância, coloque os ovos para a incubadora para 60, 120 e 180 min, respectivamente. Para determinar os níveis basais de glicose, inclua pelo menos 10-15 ovos de controle não tratados.
4. toxicidade
- Após a aplicação do composto selecionado para 24h, equilibrar a membrana da casca de ovo com tampão de fosfato salina tamponada (PBS) (suficiente para cobrir a membrana da casca de ovo inteiro) pelo menos 30 s.
- Remova o excesso tampão PBS por coloca-lo fora.
- Retire a membrana da casca cuidadosamente um aguçado par de pinças.
- Verifique os vasos sanguíneos para lesões e confirme a vitalidade (por exemplo, movimento) do embrião do pintinho.
Nota: Consulte a Figura 1 para comparação de vital versus não-vitais embriões após a aplicação de um extrato de ervas tóxica.
5. medição do valor de glicose no sangue
- No ponto respectivo tempo, retire a casca de ovo acima da bexiga de ar cuidadosamente e equilibrar a membrana da casca de ovo com o tampão PBS (suficiente para cobrir a membrana da casca de ovo inteiro).
- Remova o excesso tampão PBS por coloca-lo fora.
- Cuidadosamente retire a membrana da casca com um aguçado par de pinças.
- Corte e retire a membrana corioalantoicas com uma microtesoura, para permitir bom acesso adequado dos vasos sanguíneos. Cortar a membrana pelo menos 2-3 cm. Não corte qualquer grandes vasos na membrana própria para evitar a perda de sangue não desejadas do embrião.
- Localize o grande navio proveniente do abdômen do embrião. Levante este navio fora a albumina com uma microtesoura fechada e coloque-o em uma pH-tira de plástico. Mover a faixa de pH sob o vaso, que é realizado com o microtesoura, e puxar para trás a microtesoura fora cuidadosamente.
- Retire 1 a 2 mL do líquido sob a membrana corioalantoicas com uma pipeta para evitar a diluição do sangue na próxima etapa. Seca o vaso e tira de pH com papel de filtro, antes do navio é cortado.
- Corte o vaso sanguíneo cuidadosamente com uma tesoura microde um lado. Não corte o navio completamente.
Nota: O navio é aproximadamente 1 mm de espessura. Não corte mais da metade do navio para evitar cortar através do navio inteiramente, como ele pode escorregar na Strip e não coleta de sangue é possível. - Colete o sangue vazando na faixa de pH usando uma pipeta. 10 microlitros de sangue são necessários para determinar os níveis de glicose, usando o medidor de glicose no sangue.
6. estatística avaliação
- Calcular o valor médio de pelo menos 10 ovos individuais por ponto do tempo e normalizar esses valores para o controle ovos (ovos não ou tampão-tratados).
- Posteriormente, determine a percentagem de redução. Além disso, uso de insulina como um controle positivo.
Nota: Repita cada experiência pelo menos três vezes.
Representative Results
Descrição da abordagem Glic-HET:
Após a incubação com as substâncias de interesse, os ovos fertilizados são abertos e preparados para coleta de sangue pela remoção da casca da ovo (Figura 2). Preparação adicional inclui a equilibração e a remoção da membrana da casca de ovo para obter acesso à membrana corioalantoicas. Esta membrana é então cortada cuidadosamente para fornecer acesso a um vaso sanguíneo adequado para coleta de sangue. De preferência, o grande navio proveniente do abdômen do embrião é colocado em uma pH-tira de plástico. Para evitar a diluição do sangue durante a coleta, o vaso e tira de pH é deu um tapinha seco com papel de filtro. O vaso sanguíneo é então cortado e sangue vazando a faixa de pH é recolhida para análise usando uma pipeta.
Efeitos de extratos de ervas selecionados sobre níveis de glicose no sangue:
Com uma recém criada translocação de GLUT4 baseada em quantificação tela primária, nós somos capazes de identificar as substâncias com um característico insulino-mimética10. Rastreio de centenas de extratos de ervas Water-soluble resultou na identificação de vários hits. Estes extratos foram testados em nosso modelo de ovo em. Extratos preparados a partir de Combretum indicum (trepadeira de Rangoon) e um extrato não-divulgado (denominado extrato 0845) foram usados para estes experimentos. Nós dissolvido os extratos em buffer HBSS a 300 mg/L, uma concentração que acabou por ser apropriado em anteriores estudos12,13. Substâncias foram aplicadas para os embriões incubados durante 11 dias. Conforme indicado na Figura 3, o extrato da trepadeira de Rangum não resultou em uma glicose de sangue significativa redução no ovo. No entanto, a concentração de glicose do sangue foi reduzida com sucesso com extrato 0845, com uma diminuição menor após 60 min, que é comparável ao efeito observado usando um análogo de insulina comercialmente disponível. Observou-se um efeito significativo quando se prolongou o tempo de incubação dos ovos.
Figura 1: influência de compostos tóxicos na vitalidade do embrião. Ovos foram incubados durante 11 dias (A e C) ou tratados com um extrato de ervas tóxico no dia 10 para outro 24h (B e D). Aplicação do extrato levou a graves lesões dos vasos sanguíneos da membrana corioalantoicas (D) e o embrião (B).
Figura 2: Descrição do modelo no ovo . Da esquerda para a direita: abertura e remoção da casca da ovo (1 - 2); equilibrio e remoção da membrana da casca de ovo com membrana corioalantoicas expostos (3); vaso preparado em uma faixa de pH (4); a coleta de sangue e medição da concentração de glicose, usando um medidor de glicose (5). Adaptado de Haselgruebler et al., 201712. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: efeito de extratos de ervas sobre níveis de glicose em comparação com ovos não tratados ou tratada com insulina. Os ovos foram incubados durante 11 dias e tratados com as substâncias indicadas (análogo de insulina comercialmente disponível: 3.3 U/mL; extractos: 300 mg/L) dissolvido em tampão HBSS (volume de 300 µ l) para até 3 h. sangue os níveis de glicose foram determinados usando um medidor de glicose do sangue. Os resultados são mostrados sem o efeito do buffer. Barras de erro são baseadas no erro padrão da média. * P < 0,05 e * * * P < 0,0001, significativa diminuição em relação a ovos de HBSS-tratado ao mesmo tempo de incubação. Adaptado de Haselgruebler et al., 201712. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
O ensaio de HET-CAM é um sistema amplamente utilizado testes alternativos à experimentação animal no setor12. O sistema no ovo descrito aqui representa uma versão modificada do ensaio HET-CAM. Enquanto em sua forma original, são realizados experimentos de HET-CAM para estudar as propriedades irritantes de compostos e formulação ou a análise da angiogênese14,15,16, adaptámos a abordagem para testar compostos com características insulino-mimética putativo12. De acordo com a Directiva 2010/63/UE, experiências com embriões aviários não-nascidos durante os primeiros dois terços do desenvolvimento embrionário não precisa de permissão por um Comité de ética desde que estas experiências não são consideradas as experiências com animais. Estudos recentes demonstraram a adequação do sistema no ovo para caracterizar a eficácia de extratos de ervas selecionadas, que foram identificados em uma tela principal GLUT4 translocação-com base em10, para reduzir os níveis de glicose do sangue na ausência de insulina12,13. Pontos críticos para um bom desempenho do sistema no ovo incluem: primeiro, um criador de confiança entregar os ovos fertilizados. A galinha marrom clássica de Lohmann é uma boa escolha da raça. Em segundo lugar, a implementação de toxicidade testes para excluir os efeitos tóxicos do composto investigado precisa ser feito. Além disso, a preparação de um vaso sanguíneo adequado para coleta de sangue é importante. É importante evitar o corte de grandes vasos na membrana corioalantoicas em si, como isso pode levar a uma não-preferível perda de sangue. Além disso, antes do navio é cortado na faixa de pH, tem que ser revistado seco usando papel de filtro para evitar a diluição do sangue coletado. Finalmente, um número suficiente de experiências parece ser importante. Nós recomendamos usar pelo menos 10 ovos para cada ponto de tempo e uma tríplice repetição do experimento respectivo.
Naturalmente, há algumas limitações desta abordagem no ovo . Uma vez que leva até 30 minutos até que as substâncias são absorvidas através da membrana da casca e entraram em contato com a membrana corioalantoicas, não é possível quantificar uma resposta rápida do embrião para o composto aplicado. Além disso, alguns compostos podem ser tóxicos na concentração aplicada, que frequentemente resulta em lesões dos vasos sanguíneos na membrana corioalantoicas. Assim, testes de citotoxicidade baseado em incubação a longo prazo dos compostos por cerca de 24 horas parece razoável. Finalmente, achamos que o sistema de tampão usado para aplicação dos compostos tem um efeito significativo sobre o desempenho do ensaio. 12 -atualmente, HBSS buffer é usado porque resulta no menor efeito sobre os níveis de glicose do sangue do embrião.
Para futuras aplicações, sistemas de reserva adicionais como uma alternativa ao HBSS podem ser testados. Além disso, a influência de extratos de plantas medicinais em parâmetros adicionais de sangue, como colesterol, triglicérides ou lipoproteínas pode ser uma pergunta atraente.
Nosso novo sistema no ovo é uma ferramenta importante e promissor para testar substâncias com características insulino-mimética em um organismo vivo sem a necessidade de uma experiência animal. Portanto, ele preenche a lacuna entre abordagens in vitro e in vivo . Em comparação com os existentes no ovo modelo sistemas17 não há nenhuma necessidade para induzir diabetes por tratamento de estreptozotocina (STZ), como nós usamos os embriões no dia 10 ou 11 de incubação. Nesta fase, não se tenha iniciado a produção de insulina, mas os embriões já são sensíveis de insulina. Além disso, permissão por uma Comissão de ética pode ser necessário se embriões com idades entre 14-17 dias são usados17. Além disso, em comparação com estratégias alternativas18, o aplicativo composto conforme descrito aqui é menos prejudiciais e laborioso, aumentando as taxas de através de-colocar experimentais.
Tomados em conjunto, esta no ovo abordagem é um sistema atraente se um efeito de diminuição de sangue de uma substância insulino-mimética precisa ser testado em um organismo vivo.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Agência de promoção de pesquisa austríaco (FFG: Projeto número 850681), a iniciativa da University of Applied Sciences Upper Austria financiamento básico (projeto GlucoSTAR) e o centro de inovação tecnológica na medicina (centro de temporizado) que recebe financiamento básico pela província de Alta Áustria.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom | L1825 | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH30268.02 | |
| NovoRapid | Novo Nordisk | 8-0905-82-304-6 | |
| Hens eggs (Lohmann classic brown chicken) | Local Breeder | ||
| Accu-check performa | Roche | 6454011 | |
| Accu-check Inform II Teststreifen | Roche | 5942861 | |
| Incubator HEKA- Turbo 288 | HEKA Brutgeräte | ||
| Syringe Omnican F 1 mL | Braun | 09161502S | |
| Extracts | PEKISH extract library | ||
| Lamp Tempo Nr. 119 | ORBAN |
References
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