Summary
I denne undersøgelse beskriver vi en i-ovo system som et lovende redskab til at teste insulin-mimetiske forbindelser i en levende organisme. De vigtigste fordele omfatter passende overførselshastigheder og acceptable omkostninger, som identifikation af fytokemikalier med insulin-mimetiske egenskaber.
Abstract
Forhøjet blod glucose niveauer i type 2 diabetes mellitus (T2DM), en kompleks og multifaktoriel metabolisk sygdom, er forårsaget af insulin resistens og β-celle fiasko. Forskellige strategier, herunder injektion af insulin eller brugen af insulin-sensibiliserende stoffer, blev forfulgt for at behandle T2DM eller i det mindste mindske symptomerne. Derudover har anvendelse af naturlægemidler forbindelser tiltrukket stadig større opmærksomhed. Det er således nødvendigt at finde effektive testsystemer til at identificere og karakterisere insulin-mimetiske forbindelser. Her udviklede vi en modificeret kylling embryo model, som gør det muligt for afprøvning af syntetiske forbindelser og urteekstrakter, med insulin-mimetiske egenskaber. Ved hjælp af et Fluorescens mikroskopi-baseret primær skærm, der kvantificerer omplantning af Glucose transporter 4 (Glut4) til plasma membran, var vi i stand til at identificere forbindelser, hovedsagelig urteekstrakter, som fører til en stigning af intracellulære glukose koncentrationer i adipocytter. Effekten af disse stoffer kræver imidlertid yderligere kontrol i en levende organisme. Dermed, vi brugte i ovo tilgang til at identificere deres blod glucose-reducerende egenskaber. Godkendelse af en etisk komité er ikke nødvendig, da anvendelsen af kylling embryoner i løbet af de første to tredjedele af embryonale udvikling ikke betragtes som et animalsk eksperiment. Her, er anvendelsen af denne model beskrevet i detaljer.
Introduction
Diabetes mellitus er en stofskiftesygdom, der er karakteriseret af hyperglykæmi og er forårsaget af defekter i insulinsekretion eller insulin aktion1. Halvfems procent af alle sukkersyge-tilfælde er kategori type 2 diabetes mellitus (T2DM), hvor individer vise insulinresistens og for det meste insulin-mangel2. Flere faktorer er kendt for at øge den globale forekomsten af T2DM, herunder ændringer i livsstil, især dem med tilknytning til overnutrition, aldring og fysisk inaktivitet. Ca. 400 millioner mennesker har diabetes mellitus verdensomspændende ifølge internationale Diabetes Føderation (IDF). Dette tal forventes at nå op på 600 millioner inden for de næste 20 år3.
Diabetiske komplikationer som følge af hyperglykæmi og insulinresistens, hypertension, dyslipidæmi, glucose intolerance, koronar hjertesygdom og cerebrale Vaskulære sygdomme, føre til en betydeligt reduceret levetid og kvalitet4. Berørte personer kræver glukose-sænkende Farmakoterapi; dog, brug af lægemidler såsom metformin5 er ofte forbundet med dramatiske bivirkninger6,7,8. Derfor, yderligere antidiabetika tilgange, der er sikker, bredt tilgængelig og billig er nødvendige.
Forskellige naturlægemidler forbindelser, ekstrakter, planter og nutraceuticals har været tilskrevet funktion insulin-mimetiske egenskaber af modulerende forskellige cellulære funktioner. Et vigtigt element er stimulation af omplantning af glucose transporter 4 (GLUT4) til plasma membran fra intracellulære opbevaringsrum, hvilket resulterer i en øget optagelse af glukose i muskler og fedtvæv i mangel af insulin, kendt som insulin-mimetiske egenskaber9. Tidligere, vi implementeret et Fluorescens mikroskopi-baseret tilgang til at kvantificere translokation proces af GLUT410. Analyse af talrige planteekstrakter fra en ekstrakt bibliotek11 ved hjælp af denne analyse resulterede i identifikation af lovende kandidater. Yderligere tests i levende organismer er dog påkrævet. Metoden beskrevet i detaljer i dette papir, en modificeret kylling embryo model, har vist sig for at være en lovende model til at identificere stoffer med insulin-mimetiske egenskaber. Det er en attraktiv værkstøj fylde den store kløft mellem in vitro og in vivo studier og giver flere fordele sammenlignet med eksisterende systemer såsom acceptable omkostninger, enkel håndtering procedurer og passende overførselshastigheder. Desuden er tilladelse af en etisk komité ikke påkrævet.
Protocol
Ifølge direktiv 2010/63/EU behøver eksperimenter med ikke-udklækket aviær embryoner i løbet af de første to tredjedele af embryonale udvikling ikke tilladelse af en etisk komité.
1. opbevaring og avl af æggene
- Få befrugtede hønseæg (Tabel af materialer) fra en lokal avler.
Bemærk: Æg kan opbevares på 14 ° C i en fugtig atmosfære i op til 10 dage efter lægningen før brug for eksperimenter. - Inkuber æg ved 38 ° C med en gennemsnitlig luftfugtighed på 40-60% for 10 eller 11 dage i en inkubator, der forvandler konstant æggene.
2. udvælgelse af æggene
- Kontrollere æg til befrugtning efter inkubation af op til 11 dage. Bruge en gennemlysning lys for dette trin. Dyp kanten af gennemlysning lampen i en inkpad og stearinlys i spidse side af ægget.
- For at identificere luft blære, kontrollere, om forskelle i lysstyrke på toppen af ægget.
Bemærk: Luft blære vises som en rund, mere gennemsigtige område, mens æggehvidestof er mørkere, når ægget er lyses. - Efter påvisning af luft blære, mark placeringen ved at trykke på lampen lidt mod æg med den tidligere anvendte blæk.
- Udelukke ikke-befrugtede æg på dette trin, der ikke udviser en forskel i lysstyrke mellem æggehvidestof og luft blære.
3. indsprøjtning af stoffer
- Forberede indholdet af interesse (f.eks., urteekstrakt eller insulin) ved fortynding af stoffet i den ønskede koncentration i Hanks afbalanceret saltopløsning (HBSS) buffer. For eksempel 3.3 U/mL af en kommercielt tilgængelig insulin analog i HBSS.
- For anvendelsen af den valgte sammensatte, omhyggeligt peck æggeskallen med en spids pincet i det markerede område af luft blære. Ikke udgør et hul større end diameteren af nålen i sprøjten. Injicere bufferopløsning (300 µL) der indeholder stof af interesse i pecked-området via en sprøjte.
Bemærk: Brug sterile, 1 ml engangsbrug sprøjter, pipette tips og fartøjer. Bære handsker og en laboratoriekittel for forsøgene. - For at bestemme den blod glucose-reducerende effekt af et stof, placere æggene tilbage i inkubatoren for 60, 120, og 180 min., henholdsvis. For at bestemme basal blod glucose niveauer, omfatte mindst 10-15 ubehandlede kontrol æg.
4. toksicitet
- Efter anvendelse af den valgte sammensatte for 24 h, Blandingen henstår i æggeskal membran med phosphat bufferet saltvand (PBS) buffer (nok til at dække det hele æggeskal membran) i mindst 30 s.
- Fjern overskydende PBS buffer ved at hælde det væk.
- Trække ud i æggeskal membran forsigtigt med en spids pincet.
- Kontrollere blodkar for læsioner og bekræfte vitalitet (fx, flytning) af kylling embryo.
Bemærk: Se figur 1 for sammenligning af vitale versus ikke-vitale embryoner efter anvendelsen af en giftig urteekstrakt.
5. måling af blod Glucose værdi
- For de respektive tidspunkt, omhyggeligt fjerne æggeskal ovenfor luft blære og Blandingen henstår i æggeskal membran med PBS buffer (nok til at dække det hele æggeskal membran).
- Fjern overskydende PBS buffer ved at hælde det væk.
- Træk forsigtigt ned i æggeskal membran med en spids pincet.
- Skære og fjerne den chorioallantoic membran med en mikro-saks, så god adgang til passende blodkar. Skære membranen mindst 2-3 cm. Ikke skære store fartøjer i membranen selv at undgå uønskede blodtab af embryoet.
- Find det store fartøj med oprindelse fra maven af embryoet. Løfte dette fartøj ud af æggehvidestof med en lukket mikro-saks og placere den på en plastik pH-strip. Flytte pH strimmel under det fartøj, der er afholdt med mikro-saks, og trække tilbage mikro-saks væk omhyggeligt.
- Fjerne 1-2 mL af væske under den chorioallantoic membran med en pipette til at undgå fortynding af blod i næste trin. Tør fartøj og pH-strip med filtrerpapir, før fartøjet er skåret.
- Skære blodkar omhyggeligt med en mikro-saks på den ene side. Kan ikke skære gennem fartøjet helt.
Bemærk: Skibet er ca 1 mm tyk. Kan ikke skære mere end halvdelen af fartøjet til at undgå at skære gennem fartøjet helt, som det kan glide af strimlen og ingen blod samling er muligt. - Indsamle de utætte blod på pH-strip ved hjælp af en pipette. Ti microliters af blod skal fastslå glucose niveauer ved hjælp af blod glucose meter.
6. statistisk vurdering
- Beregner den gennemsnitlige værdi af mindst 10 individuelle æg pr. tidspunkt og normalisere disse værdier til en af kontrol æg (eller buffer-ubehandlede æg).
- Efterfølgende, bestemme procentdelen af fald. Derudover brug insulin som positiv kontrol.
Bemærk: Gentag hvert forsøg mindst tre gange.
Representative Results
Beskrivelse af Gluc-HET tilgang:
Efter inkubering med stoffer af interesse, de befrugtede æg åbnes og forberedt til indsamling af fjernelse af æggeskal (figur 2). Yderligere forberedelse omfatter ækvilibrering og fjernelse af æggeskal membran til at få adgang til den chorioallantoic membran. Denne membran er derefter klippe omhyggeligt for at give adgang til et egnet blodkar blod samling. Helst, det store fartøj med oprindelse fra maven af embryonet er placeret på en plastik pH-strip. For at undgå udvanding af blod under indsamlingen, er fartøj og pH-strip klappede tør med filtrerpapir. Blodkar er derefter klippe og blodet siver ind på pH-strip indsamles til analyse ved hjælp af en pipette.
Virkningerne af udvalgte urteekstrakter på blod glucose niveauer:
Med en nyligt etablerede GLUT4-translokation kvantitering-baseret primær skærm er vi i stand til at identificere stoffer, med en insulin-mimetiske karakteristiske10. Screening af hundredvis af vandopløselige urteekstrakter resulterede i identifikation af flere hits. Disse ekstrakter blev testet i vores in -ovo model. Ekstrakter fremstillet af Combretum indicum (Rangoon creeper) og en ikke-offentliggjort ekstrakt (betegnes ekstrakt 0845) blev brugt til disse eksperimenter. Vi opløste ekstrakter i HBSS buffer på 300 mg/L, en koncentration, der viste sig for at være relevante i tidligere undersøgelser12,13. Stoffer, der blev anvendt til embryoner inkuberes i 11 dage. Som angivet i figur 3, resulterede ekstrakt fra Rangoon creeper ikke i en betydelig blod glucose reduktion i ovo. Men blod glukose koncentration var med held reduceret med ekstrakt 0845, med en mindre nedgang efter 60 min, som er sammenlignelig med effekten observeres ved hjælp af en kommercielt tilgængelig insulin analog. En betydelig effekt blev observeret, da inkubationstiden for æg blev forlænget.
Figur 1: indflydelse af giftige forbindelser på embryo vitalitet. Æg blev udruget i 11 dage (A og C) eller behandlet med en giftig urteekstrakt dag 10 for en anden 24 h (B og D). Anvendelse af ekstraktet førte til alvorlige læsioner af blodkar i chorioallantoic membranen (D) og embryo (B).
Figur 2: Beskrivelse af modellens i ovo . Fra venstre mod højre: åbning og fjernelse af æggeskallen (1 - 2); ækvilibrering og fjernelse af æggeskal membran med chorioallantoic membran udsat (3); rede fartøj på en pH-strip (4); tapning af blod og måling af glukose koncentration ved hjælp af en glucose meter (5). Tilpasset fra Haselgruebler mfl., 201712. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: effekt af urteekstrakter på blod glucose niveauer i forhold til ubehandlede eller insulin-behandlede æg. Æg blev udruget i 11 dage og behandlet med de angivne stoffer (kommercielt tilgængelige insulin analog: 3.3 U/mL; uddrag: 300 mg/L) opløst i HBSS buffer (300 µL volumen) for op til 3 h. blod glucose niveauer blev bestemt ved hjælp af et blodsukkerapparat. Resultaterne er vist uden effekt af bufferen. Fejllinjer er baseret på standard fejl af middelværdien. * P < 0,05 og *** P < 0,0001, betydelige fald med hensyn til HBSS-behandlet æg af den samme inkubationstiden. Tilpasset fra Haselgruebler mfl., 201712. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
HET-CAM assay er en udbredt alternativ testsystem til dyreforsøg industrien12. I-ovo systemet beskrevet her repræsenterer en modificeret version af HET-CAM assay. I sin oprindelige form, HET-CAM forsøg er udført for at studere de irriterende egenskaber af forbindelser og formulering eller analyse af angiogenese14,15,16, har vi tilpasset tilgang til test forbindelser med formodede insulin-mimetiske egenskaber12. Eksperimenter med ikke-udklækket aviær embryoner i løbet af de første to tredjedele af embryonale udvikling behøver ifølge direktiv 2010/63/EU, ikke tilladelse af en etisk komité, da disse forsøg ikke betragtes som dyreforsøg. Nylige undersøgelser har dokumenteret egnetheden af i-ovo -system til at karakterisere effekten af udvalgte urteekstrakter, som er blevet påvist i en GLUT4-omplantning-baserede primære skærm10, for at reducere blodsukkerniveauet i den manglen på insulin12,13. Kritiske punkter for en god præstation i ovo system omfatter: første, en pålidelig opdrætter levere de befrugtede æg. Lohmann klassisk brun kyllingen er et godt valg af race. For det andet gennemførelsen af toksicitet prøver for at udelukke toksisk virkning af de undersøgte stof skal gøres. Udarbejdelsen af et egnet blodkar for blod samling er derudover vigtigt. Det er vigtigt at undgå skæring af store fartøjer i chorioallantoic membranen selv, da dette kan føre til ikke at foretrække tab af blod. Derudover før fartøjet er skåret på pH strimmel, det har at være klappede tør bruge filtrerpapir for at forhindre udvanding af det indsamlede blod. Endelig, et tilstrækkeligt antal forsøg synes at være vigtig. Vi anbefaler at bruge mindst 10 æg for hvert tidspunkt, og en tredobbelt gentagelse af de respektive eksperiment.
Der er naturligvis nogle begrænsninger af denne i ovo tilgang. Da det tager op til 30 minutter, indtil stofferne optages gennem den æggeskal membran og kommer i tæt kontakt med chorioallantoic membranen, er det ikke muligt at kvantificere en hurtig reaktion af embryonet til det anvendte stof. Derudover kan nogle forbindelser være giftige i den anvendte koncentration, hvilket ofte resulterer i læsioner af blodkar i chorioallantoic membranen. Således forekommer cytotoksicitet test baseret på langsigtede inkubation af forbindelser, for omkring 24 timer rimeligt. Endelig fandt vi at den buffersystem til ansøgning af forbindelser har en betydelig effekt på udførelsen af analysen. 12 i øjeblikket HBSS buffer benyttes fordi det resulterer i den mindste virkning på blod glucose niveauer af embryoet.
For fremtidige ansøgninger prøves yderligere buffersystemer som et alternativ til HBSS. Desuden kan urteekstrakter indflydelse på ekstra blodparametre såsom kolesterol, triglycerider eller lipoprotein være en attraktiv spørgsmål.
Vores nye i-ovo system er en lovende og vigtigt værktøj til at teste stoffer med insulin-mimetiske kendetegn i en levende organisme uden brug af en animalsk eksperiment. Derfor, det udfylder hullet mellem in vitro og in vivo tilgange. I forhold til eksisterende i-ovo model systemer17 er der ingen grund til at inducere diabetes ved streptozotocin (STZ) behandling, som vi bruger embryoner på dag 10 eller 11 inkubation. På dette stadium, insulinproduktion er startet ikke, men embryonerne er allerede insulin følsomme. Derudover kan tilladelse af en etisk komité være påkrævet, hvis embryoner i alderen 14-17 dage er brugt17. Desuden, i forhold til alternative strategier18, sammensatte programmet er som beskrevet her mindre skadelige og besværlig, øge eksperimentelle gennem læg priser.
Tilsammen, dette i ovo er tilgang et attraktivt system, hvis en blod-faldende effekt af et insulin-mimetiske stof skal afprøves i en levende organisme.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af den østrigske forskning erhvervsfremme Styrelsen (FFG; projektnummer 850681), University of Applied Sciences øvre Østrig grundlæggende finansiering initiativ (projekt GlucoSTAR) og Center for teknologisk Innovation i medicin (tidsindstillet Center) der modtager grundlæggende finansiering af provinsen Oberösterreich.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom | L1825 | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH30268.02 | |
| NovoRapid | Novo Nordisk | 8-0905-82-304-6 | |
| Hens eggs (Lohmann classic brown chicken) | Local Breeder | ||
| Accu-check performa | Roche | 6454011 | |
| Accu-check Inform II Teststreifen | Roche | 5942861 | |
| Incubator HEKA- Turbo 288 | HEKA Brutgeräte | ||
| Syringe Omnican F 1 mL | Braun | 09161502S | |
| Extracts | PEKISH extract library | ||
| Lamp Tempo Nr. 119 | ORBAN |
References
- Defronzo, R. A. Banting Lecture. From the triumvirate to the ominous octet: a new paradigm for the treatment of type 2 diabetes mellitus. Diabetes. 58 (4), 773-795 (2009).
- American_Diabetes_Association. Diagnosis and classification of diabetes mellitus. Diabetes Care. 37, S81-S90 (2014).
- Han Cho, N., et al. IDF Diabetes Atlas. Cavan, D. 7, International Diabetes Federation. (2015).
- Bailey, C. J., et al. Individualized glycaemic targets and pharmacotherapy in type 2 diabetes. Diabetes & vascular disease research. 10 (5), 397-409 (2013).
- Maruthur, N. M., et al. Diabetes Medications as Monotherapy or Metformin-Based Combination Therapy for Type 2 Diabetes: A Systematic Review and Meta-analysis. Annals of internal medicine. 164 (11), 740-751 (2016).
- Aleman-Gonzalez-Duhart, D., Tamay-Cach, F., Alvarez-Almazan, S., Mendieta-Wejebe, J. E. Current Advances in the Biochemical and Physiological Aspects of the Treatment of Type 2 Diabetes Mellitus with Thiazolidinediones. PPAR research. , 7614270 (2016).
- Cohen, F. J., Neslusan, C. A., Conklin, J. E., Song, X. Recent antihyperglycemic prescribing trends for US privately insured patients with type 2 diabetes. Diabetes care. 26 (6), 1847-1851 (2003).
- Desai, N. R., et al. Patterns of medication initiation in newly diagnosed diabetes mellitus: quality and cost implications. The American journal of medicine. 125 (3), e301-e307 (2012).
- Martel, J., et al. Anti-obesogenic and antidiabetic effects of plants and mushrooms. Nature reviews. Endocrinology. , (2016).
- Lanzerstorfer, P., et al. Identification of novel insulin mimetic drugs by quantitative total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. British journal of pharmacology. 171 (23), 5237-5251 (2014).
- Onur, S., Stöckmann, H., Zenthoefer, M., Piker, L., Döring, F. The Plant Extract Collection Kiel in Schleswig-Holstein (PECKISH) Is an Open Access Screening Library. Journal of Food Research. 2 (4), (2013).
- Haselgrubler, R., et al. Gluc-HET, a complementary chick embryo model for the characterization of antidiabetic compounds. PloS one. 12 (8), e0182788 (2017).
- Stadlbauer, V., et al. Biomolecular Characterization of Putative Antidiabetic Herbal Extracts. PloS one. 11 (1), e0148109 (2016).
- Greywe, D., et al. Applicability and robustness of the hen's egg test for analysis of micronucleus induction (HET-MN): results from an inter-laboratory trial. Mutation research. 747 (1), 118-134 (2012).
- Manakova, E., Hubickova, L., Kostalova, J., Zemanova, Z. Embryotoxicity of mirtazapine: a study using Chick Embryotoxicity Screening Test. Neuro endocrinology letters. 31, Suppl 2. 8-10 (2010).
- Ribatti, D. Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis. International review of cell and molecular biology. 270, 181-224 (2008).
- Yoshiyama, Y., Sugiyama, T., Kanke, M. Experimental diabetes model in chick embryos treated with streptozotocin. Biological & pharmaceutical bulletin. 28 (10), 1986-1988 (2005).
- Wolf, T., Niehaus-Rolf, C., Luepke, N. P. Some new methodological aspects of the hen's egg test for micronucleus induction (HET-MN). Mutation research. 514 (1-2), 59-76 (2002).
