Summary
I denne studien beskriver vi et i-ovo -system som en lovende verktøy for å teste insulin-mimetic forbindelser i en levende organisme. De viktigste fordelene inkluderer tilstrekkelig overføringshastighet og akseptabel kostnader som aktiverer identifisering av fytokjemikaliene med insulin-mimetic egenskaper.
Abstract
Forhøyet blodsukker i type 2 diabetes mellitus (T2DM), en kompleks og multifaktoriell metabolsk sykdom, er forårsaket av insulin resistens og β-celle feil. Ulike strategier, inkludert injeksjon av insulin eller bruken av insulin-sensitiverende narkotika, ble forfulgt for å behandle T2DM eller i det minste redusere symptomene. I tillegg har programmet av urte forbindelser fått økende oppmerksomhet. Dermed er det nødvendig å finne effektive test-systemer for å identifisere og karakterisere insulin-mimetic forbindelser. Her utviklet vi en modifisert chick embryoet modell, som gjør testing av syntetiske stoffer og urte ekstrakter med insulin-mimetic egenskaper. Bruke en fluorescens mikroskopi-baserte primære skjerm, som quantifies translokasjon av glukose transportør 4 (Glut4) til plasma membranen, klarte vi å identifisere forbindelser, hovedsakelig urte ekstrakter, som fører til en økning av intracellulær glukose konsentrasjonene i adipocytter. Men krever effekten av disse stoffene ytterligere bekreftelse i en levende organisme. Derfor brukte vi i ovo tilnærming til å identifisere deres blod glukose-reduserende egenskaper. Godkjennelse fra en etisk komite er ikke nødvendig siden bruk av kylling embryoer under de første to-tredjedeler av embryonale utvikling er ikke et dyr eksperiment. Her, er anvendelse av denne modellen beskrevet i detalj.
Introduction
Diabetes mellitus er en metabolsk sykdom karakterisert ved hyperglykemi og er forårsaket av feil i insulinsekresjon eller insulin handling1. Nitti prosent av alle diabetes tilfeller er kategorien type 2 diabetes mellitus (T2DM), der enkeltpersoner demonstrere insulinresistens og mest insulin mangel2. Flere faktorer er kjent for å øke global forekomsten av T2DM, inkludert endringer i livsstil, spesielt de som er knyttet til overnutrition, aldring og fysisk inaktivitet. Ca 400 millioner mennesker har diabetes mellitus verden ifølge International Diabetes Federation (IDF). Dette er forventet å nå 600 millioner innen de neste 20 år3.
Diabetiker komplikasjoner forårsaket av hyperglykemi og insulinresistens, som hypertensjon, dyslipidemi, glukose intoleranse, koronar hjertesykdom og cerebral vaskulær sykdom, føre til en betydelig redusert levetid og kvalitet4. Berørte personer krever glukose-senking farmakoterapi; bruken av narkotika, for eksempel metformin5 er imidlertid ofte forbundet med dramatiske bivirkninger6,7,8. Derfor videre er antidiabetika tilnærmingsmåter som er rent, allment tilgjengelig og rimelig nødvendig.
Forskjellige urte forbindelser, ekstrakter, planter og nutraceuticals har blitt tilskrevet funksjonen insulin-mimetic egenskaper ved modulerende ulike cellulære funksjoner. En viktig funksjon er stimulering av translokasjon av glukose transportør 4 (GLUT4) til plasma membranen fra intracellulær oppbevaringsrom, noe som resulterer i en økt opptak av glukose i muskler og fettvev i fravær av insulin, kjent som insulin-mimetic egenskaper9. Tidligere har implementert vi en fluorescens mikroskopi-basert tilnærming for å kvantifisere translokasjon prosessen med GLUT410. Analyse av mange planteekstrakter fra en ekstra biblioteket11 ved hjelp av denne analysen resulterte i identifikasjon av lovende kandidater. Imidlertid kreves ytterligere tester i levende organismer. Tilnærming som er beskrevet i detalj i dette papiret, en modifisert chick embryoet modell, har vist seg for å være en lovende modell for å identifisere stoffer med insulin-mimetic egenskaper. Det representerer en attraktiv verktøyet fylle det store gapet mellom i vivo og in vitro studier og tilbyr flere fordeler sammenlignet med eksisterende systemer som akseptabelt kostnader, enkel håndteringsprosedyrer og tilstrekkelig overføringshastighet. I tillegg er tillatelse fra en etisk komite ikke nødvendig.
Protocol
Ifølge direktiv 2010/63/EU trenger eksperimenter med ikke-klekket avian embryo under de første to-tredjedeler av embryonale utvikling ikke tillatelse fra en etisk komite.
1. plass og oppdrett av egg
- Få befruktet høne egg (Tabell for materiale) fra en lokal oppdretter.
Merk: Egg kan lagres på 14 ° C i en fuktet atmosfære i opptil 10 dager etter at før bruk for eksperimenter. - Ruge eggene på 38 ° C med en gjennomsnittlig fuktighet på 40-60% for 10 eller 11 dager i en inkubator som blir stadig eggene.
2. valg av egg
- Når eggene for befruktning etter inkubasjon opptil 11 dager. Bruk et candling lys for dette trinnet. Dyppe av candling lampen i en inkpad og stearinlys spisse siden av egg.
- For å identifisere luften-blære, sjekk for forskjellene i lysstyrke på egg.
Merk: Luften-blære vises som en runde, mer gjennomsiktig område, mens albumen er mørkere når egget er candled. - Etter oppdagelsen av air blæren, Merk plasseringen ved å trykke lysrøret litt mot egg tidligere brukt håndskriften.
- Ekskludere ikke-befruktet egg på dette trinnet, som ikke viser en forskjell i lysstyrke mellom albumen og luften-blære.
3. injeksjon av stoffer
- Klargjør stoffet av interesse (f.eks, urte ekstrakt eller insulin) ved å fortynne stoffet i ønsket konsentrasjonen i Hanks balansert salt løsning (HBSS) buffer. For eksempel 3.3 U/mL av en kommersielt tilgjengelig insulin analog i HBSS.
- For anvendelse av den valgte sammensatt, nøye peck eggeskall med en spiss pinsett i det merkede området i luften-blære. Utgjør ikke et hull større enn diameteren på nålen på sprøyten. Injisere buffer løsning (300 µL) som inneholder stoffet av interesse i området pecked via en sprøyte.
Merk: Bruk steril, 1-ml engangs-sprøyter, pipette-spisser og fartøy. Bruke hansker og en labfrakk for eksperimenter. - For å bestemme blod glukose-redusere effekten av et stoff, plassere eggene tilbake i inkubator for 60, 120 og 180 min, henholdsvis. For å bestemme basale blodsukker, Inkluder minst 10-15 ikke behandlet kontroll egg.
4. toksisitet tester
- Etter den valgte sammensatt 24 h, equilibrate eggeskallet membranen med fosfat bufrede saltvann (PBS) buffer (nok til å dekke hele eggeskallet membranen) minst 30 s.
- Fjerne overflødig PBS bufferen ved å helle den bort.
- Trekke av eggeskallet membranen nøye med en spiss pinsett.
- Sjekk blodkar etter leksjonen og bekrefte vitalitet (f.eks, bevegelse) av chick fosteret.
Merk: Se figur 1 for sammenligning av vitale versus ikke-vitale embryo etter en giftig urte ekstrakt.
5. måling av blod glukose verdien
- På det aktuelle tidspunktet, nøye fjerne eggeskall over luften-blære og equilibrate eggeskallet membranen med PBS buffer (nok til å dekke hele eggeskallet membranen).
- Fjerne overflødig PBS bufferen ved å helle den bort.
- Trekk forsiktig av eggeskallet membranen med en spiss pinsett.
- Skjær og fjern chorioallantoic membran med en mikro-saks, aktivere god tilgang til passende blodkar. Kutte membranen minst 2-3 cm. Ikke kutt alle store fartøy i membranen å unngå uønskede blodtap av fosteret.
- Finn store fartøyet fra magen av fosteret. Løft fartøyet av albumen med en lukket mikro-saks og plassere den på en plast pH-stripe. Flytte pH stripen under fartøyet, som holdes med mikro-saks, og trekk tilbake mikro-saks unna nøye.
- Fjerne 1-2 mL væske under chorioallantoic membran med en pipette å unngå fortynning av blodet i neste trinn. Tørk fartøyet og pH-stripen med filter papir, før skipet er kuttet.
- Kuttet blodkaret med en mikro-saks på én side. Ikke skjære gjennom fartøyet helt.
Merk: Fartøyet er ca 1 mm tykk. Ikke klippe mer enn halvparten av fartøyet å unngå klipping gjennom fartøyet helt, som det kan skli av stripen og ingen blod samling er mulig. - Samle lekker blod på pH-stripen bruker en pipette. Ti microliters blod må bestemme glucose høyder med blodsukkermåler.
6. statistiske evalueringer
- Beregne middelverdien av minst 10 personlige egg per punkt og normalisere disse verdiene til en av kontroll egg (ikke-buffer-behandlet eller egg).
- Deretter bestemme andelen nedgang. I tillegg bruk insulin som en positiv.
Merk: Gjenta hvert eksperiment minst tre ganger.
Representative Results
Beskrivelse av Gluc-HET tilnærming:
Etter inkubasjon med stoffer rundt er befruktede eggene åpnet og forberedt for blod samling av fjerning av eggeskall (figur 2). Videre utarbeidelse inkluderer balanse og fjerning av eggeskallet membranen tilgang til chorioallantoic membranen. Denne membranen deretter kuttet nøye for å gi tilgang til en passende blodåre for blod samling. Helst, store fartøyet fra magen av embryoet er plassert på en plast pH-stripe. For å unngå fortynning av blodet under innsamling, er fartøyet og pH-stripen klappet tørt med filter papir. Blodkaret er så kuttet og blod lekker på pH-stripen samles for analyse ved hjelp av en pipette.
Effekter av valgte urte ekstrakter i blodsukkernivået:
Med nylig etablerte GLUT4-translokasjon kvantifisering-baserte primære skjerm er vi i stand til å identifisere stoffer med en insulin-mimetic karakteristiske10. Screening av hundrevis av vannløselige urte ekstrakter resulterte i identifikasjon av flere treff. Disse utdragene ble testet i i -ovo modellen. Ekstrakter forberedt fra Blytre indicum (Rangoon creeper) og en ikke-publisert pakke (kalt ekstrakt 0845) ble brukt til disse eksperimentene. Vi oppløst ekstrakter HBSS buffer på 300 mg/L, en konsentrasjon som viste seg for å være riktig i tidligere studier12,13. Stoffer var brukes embryoer ruges i 11 dager. Som vist i Figur 3, resulterte utdrag fra Rangoon creeper ikke i en betydelig blod glukose reduksjon i ovo. Imidlertid redusert blod glukose konsentrasjonen ble med ekstrakt 0845, med en mindre nedgang etter 60 min, som er sammenlignbare med effekten observert ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig insulin analoge. En betydelig effekt ble observert når inkubasjon da eggene ble forlenget.
Figur 1: påvirkning av giftige forbindelser på fosteret vitalitet. Egg var ruges i 11 dager (A og C) eller behandlet med en giftig urte ekstrakt på dag 10 for en annen 24 h (B og D). Anvendelse av ekstraktet førte til alvorlige lesjoner av blod fartøy i chorioallantoic membranen (D) og fosteret (B).
Figur 2: Beskrivelse av i-ovo modell. Fra venstre til høyre: åpning og fjerning av eggeskall (1 - 2); balanse og fjerning av eggeskallet membranen med chorioallantoic membran utsatt (3); forberedt fartøy på en pH-strip (4); samlingen av blod og måling av glukose konsentrasjon bruker glukose meter (5). Tilpasset fra Haselgruebler et al., 201712. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: effekten av urte ekstrakter på blodsukker sammenlignet med ubehandlet eller insulin-behandlet egg. Egg ruges i 11 dager og behandlet med de angitte stoffene (kommersielt tilgjengelig insulin analog: 3,3 U/mL, ekstrakter: 300 mg/L) oppløst i HBSS buffer (300 µL volum) for opptil 3 h. Blood blodsukkeret var bestemmes ved hjelp av en blodsukkermåler. Resultatene vises uten effekten av bufferen. Feilfelt er basert på standard feil av gjsnitt. * P < 0,05 og *** P < 0,0001, betydelig redusere med hensyn til HBSS-behandlet egg av inkubasjon samtidig. Tilpasset fra Haselgruebler et al., 201712. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
HET-CAM analysen er en mye brukt alternativ testsystem å dyreforsøk i bransjen12. I-ovo systemet beskrevet her representerer en modifisert versjon av HET-CAM analysen. Mens i sin opprinnelige form, HET-CAM eksperimenter utføres for å studere de irriterende for forbindelser og utforming eller analyse av angiogenese14,15,16, vi har tilpasset tilnærming til test forbindelser med antatte insulin-mimetic egenskaper12. Ifølge direktiv 2010/63/EU trenger eksperimenter med ikke-klekket avian embryo under de første to-tredjedeler av embryonale utvikling ikke tillatelse fra en etisk komite siden disse eksperimentene ikke anses dyreforsøk. Nyere studier har vist hensiktsmessigheten av i-ovo systemet å karakterisere effekten av valgte urte ekstrakter, som har blitt identifisert i en GLUT4-translokasjon-baserte primære skjermen10, redusere blodsukkernivået i den fravær av insulin12,13. Kritiske punkter for god ytelse ved i-ovo systemet inkluderer: første, en pålitelig oppdretter levere befruktede egg. Lohmann klassisk Brun kyllingen er et godt valg av rasen. Second, implementeringen av toksisitet tester utelate toksiske effekter på undersøkte sammensatte må gjøres. I tillegg er utarbeidelsen av en egnet blodåre for blod samling viktig. Det er viktig å unngå skjæringen av store fartøy i chorioallantoic membran, da dette kan føre til ikke å foretrekke tap av blod. Videre før fartøyet er kuttet på pH stripen, den har å bli klappet tørr bruke filter papir for å hindre fortynning samlet blod. Til slutt, et tilstrekkelig antall eksperimenter synes å være viktig. Vi anbefaler at du bruker minst 10 egg for hvert punkt, og en tre-fold gjentagelse av respektive eksperimentet.
Naturligvis, det er noen begrensninger av denne i ovo . Siden det tar opptil 30 minutter før stoffene er absorbert gjennom eggeskallet membran og kommer i nærkontakt med chorioallantoic membran, er det ikke mulig å kvantifisere en rask respons av embryoet til anvendt sammensatte. Videre kan noen forbindelser være giftig i anvendt konsentrasjon, som ofte resulterer i lesjoner i blodårene i chorioallantoic membranen. Dermed vises cytotoksisitet tester basert på langsiktige inkubering av forbindelser i 24 timer rimelig. Til slutt, vi fant at bufferen systemet brukes for anvendelse av forbindelsene har en betydelig effekt på resultatene av analysen. 12 for tiden HBSS bufferen brukes fordi det resulterer i minste effekten på blodsukkernivået av embryoet.
For framtidige applikasjoner, ekstra buffer systemer som et alternativ til HBSS kan testes. Videre kan påvirker urte ekstrakter ytterligere blod parametere som kolesterol, triglyserider eller lipoproteiner være et attraktivt spørsmål.
Våre nye i ovo -system er et lovende og viktig verktøy for å teste stoffer med insulin-mimetic egenskaper i en levende organisme uten behovet av et dyr eksperiment. Derfor fyller det gapet mellom in vitro og i vivo tilnærminger. I forhold til eksisterende i-ovo modell systemer17 er det ikke nødvendig å indusere diabetes ved streptozotocin (STZ) behandling, som vi bruker embryoer på dag 10 eller 11 av inkubasjon. På dette stadiet, insulin produksjon startet ikke, men embryoene er allerede insulin følsom. I tillegg kan tillatelse fra en etisk komite være nødvendig hvis embryo alderen 14-17 dager er brukt17. Videre er i forhold til alternative strategier18, sammensatte programmet som beskrevet her mindre skadelig og arbeidskrevende, øke eksperimentelle lakkeringsverksteder priser.
Til sammen har dette i ovo er tilnærming en attraktiv system hvis en blod-redusere effekten av en insulin-mimetic stoffet skal bli testet i en levende organisme.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av det østerrikske Research forfremmelse Agency (FFG, prosjektnummer 850681), University of Applied Sciences øvre Østerrike grunnleggende finansiering initiativ (project GlucoSTAR) og Center for teknologisk innovasjon i medisin (tidsbestemt Center) som mottar grunnleggende finansiering av provinsen i øvre-Østerrike.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom | L1825 | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH30268.02 | |
| NovoRapid | Novo Nordisk | 8-0905-82-304-6 | |
| Hens eggs (Lohmann classic brown chicken) | Local Breeder | ||
| Accu-check performa | Roche | 6454011 | |
| Accu-check Inform II Teststreifen | Roche | 5942861 | |
| Incubator HEKA- Turbo 288 | HEKA Brutgeräte | ||
| Syringe Omnican F 1 mL | Braun | 09161502S | |
| Extracts | PEKISH extract library | ||
| Lamp Tempo Nr. 119 | ORBAN |
References
- Defronzo, R. A. Banting Lecture. From the triumvirate to the ominous octet: a new paradigm for the treatment of type 2 diabetes mellitus. Diabetes. 58 (4), 773-795 (2009).
- American_Diabetes_Association. Diagnosis and classification of diabetes mellitus. Diabetes Care. 37, S81-S90 (2014).
- Han Cho, N., et al. IDF Diabetes Atlas. Cavan, D. 7, International Diabetes Federation. (2015).
- Bailey, C. J., et al. Individualized glycaemic targets and pharmacotherapy in type 2 diabetes. Diabetes & vascular disease research. 10 (5), 397-409 (2013).
- Maruthur, N. M., et al. Diabetes Medications as Monotherapy or Metformin-Based Combination Therapy for Type 2 Diabetes: A Systematic Review and Meta-analysis. Annals of internal medicine. 164 (11), 740-751 (2016).
- Aleman-Gonzalez-Duhart, D., Tamay-Cach, F., Alvarez-Almazan, S., Mendieta-Wejebe, J. E. Current Advances in the Biochemical and Physiological Aspects of the Treatment of Type 2 Diabetes Mellitus with Thiazolidinediones. PPAR research. , 7614270 (2016).
- Cohen, F. J., Neslusan, C. A., Conklin, J. E., Song, X. Recent antihyperglycemic prescribing trends for US privately insured patients with type 2 diabetes. Diabetes care. 26 (6), 1847-1851 (2003).
- Desai, N. R., et al. Patterns of medication initiation in newly diagnosed diabetes mellitus: quality and cost implications. The American journal of medicine. 125 (3), e301-e307 (2012).
- Martel, J., et al. Anti-obesogenic and antidiabetic effects of plants and mushrooms. Nature reviews. Endocrinology. , (2016).
- Lanzerstorfer, P., et al. Identification of novel insulin mimetic drugs by quantitative total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. British journal of pharmacology. 171 (23), 5237-5251 (2014).
- Onur, S., Stöckmann, H., Zenthoefer, M., Piker, L., Döring, F. The Plant Extract Collection Kiel in Schleswig-Holstein (PECKISH) Is an Open Access Screening Library. Journal of Food Research. 2 (4), (2013).
- Haselgrubler, R., et al. Gluc-HET, a complementary chick embryo model for the characterization of antidiabetic compounds. PloS one. 12 (8), e0182788 (2017).
- Stadlbauer, V., et al. Biomolecular Characterization of Putative Antidiabetic Herbal Extracts. PloS one. 11 (1), e0148109 (2016).
- Greywe, D., et al. Applicability and robustness of the hen's egg test for analysis of micronucleus induction (HET-MN): results from an inter-laboratory trial. Mutation research. 747 (1), 118-134 (2012).
- Manakova, E., Hubickova, L., Kostalova, J., Zemanova, Z. Embryotoxicity of mirtazapine: a study using Chick Embryotoxicity Screening Test. Neuro endocrinology letters. 31, Suppl 2. 8-10 (2010).
- Ribatti, D. Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis. International review of cell and molecular biology. 270, 181-224 (2008).
- Yoshiyama, Y., Sugiyama, T., Kanke, M. Experimental diabetes model in chick embryos treated with streptozotocin. Biological & pharmaceutical bulletin. 28 (10), 1986-1988 (2005).
- Wolf, T., Niehaus-Rolf, C., Luepke, N. P. Some new methodological aspects of the hen's egg test for micronucleus induction (HET-MN). Mutation research. 514 (1-2), 59-76 (2002).
