Summary
Qui presentiamo un metodo rapido, facile e a basso costo per la realizzazione di stampi di polidimetilsilossano personalizzato che possono essere utilizzati per la produzione di tessuti ingegnerizzati a base di idrogel con geometrie complesse. Descriviamo inoltre risultati dalle valutazioni meccaniche ed istologiche condotte su tessuti cardiaci ingegnerizzati prodotti utilizzando questa tecnica.
Abstract
Come il campo dell'ingegneria tissutale ha continuato a maturare, ci è stato interesse aumentato in una vasta gamma di parametri di tessuto, compresi la forma del tessuto. Manipolazione del tessuto forma sul micrometro per centimetro scala può dirigere l'allineamento di cella, alterare efficace proprietà meccaniche e indirizzo limitazioni legate alla diffusione dei nutrienti. Inoltre, il recipiente in cui viene preparato un tessuto può impartire vincoli meccanici sul tessuto, con conseguente campi di stress che possono influire ulteriormente sulla struttura della cellula e la matrice. Tessuti a forma con dimensioni altamente riproducibili hanno anche utilità per saggi in vitro nel quale campione dimensioni sono fondamentali, quali l'analisi meccanica del tessuto intero.
Questo manoscritto descrive un metodo di fabbricazione alternativi che utilizzano stampi master negativi preparati da acrilico inciso a laser: questi stampi eseguire bene con polidimetilsilossano (PDMS), per consentire di disegni con dimensioni sulla scala di centimetro e funzionalità taglie più piccolo di 25 µm e può essere rapidamente progettati e fabbricati a basso costo e con minimo grado di esperienza. Il tempo minimo e requisiti di costo consentono stampi incise al laser per essere rapidamente iterato su finché non viene determinato un design ottimale e per essere facilmente adattata a qualsiasi test di interesse, tra cui quelli oltre il campo dell'ingegneria tissutale.
Introduction
Durante le due decadi scorse, litografia soft è stato usato estesamente come una tecnica di fabbricazione per sostenere la ricerca scientifica, in particolare nei settori della microfluidica, ricerca dei materiali e dei tessuti ingegneria1,2, 3. Stampaggio di replica, in cui viene creato un oggetto con una forma desiderata da uno stampo negativo master, offre un metodo conveniente e a basso costo di produrre positivo che PDMS replica che può essere utilizzato per la colata a forma di idrogeli. Tuttavia, gli stampi master negativi richiesti sono in genere prodotte con tecniche di microfabbricazione che sono costosi, che richiede tempo, limitato nelle dimensioni, e richiedono spazio camera pulita e sofisticate attrezzature. Mentre stampa 3D offre un'alternativa potenziale, la sua utilità è alquanto limitata a causa dei limiti di risoluzione di stampanti a basso costo e le interazioni chimiche tra comune stampante 3D polimeri e PDMS che possono inibire la polimerizzazione.
Sistemi di taglio laser capace di taglio e incisione di materiali come plastica, legno, vetro e metallo sono di recente diventati drasticamente meno costosi e quindi più accessibile per la realizzazione di strumenti di ricerca. Taglio laser in grado commerciale è in grado di fabbricare oggetti sulla bilancia centimetro con requisiti minimi inferiori a 25 µm e richiede ulteriore formazione minima, esperienza e tempo di utilizzo. Mentre l'ablazione laser di PDMS è stato precedentemente utilizzato nella fabbricazione di dispositivi microfluidici, a nostra conoscenza nessun manoscritto ha descritto un processo da cui millimetri e un centimetro scala stampi possono essere fabbricate da stampi negativi master4 a taglio laser .
Noi abbiamo utilizzato questa tecnica principalmente per manipolare la forma di tessuti ingegnerizzati al fine di migliorare la diffusione dei nutrienti, allineamento cellulare e proprietà meccaniche5,6,7. Tuttavia, versatilità di questa tecnica consente l'utilizzo in qualsiasi campo dove modellati idrogeli sono di interesse, come droga consegna e materiale scienza ricerca8. Con accesso a una taglierina laser, PDMS stampo replicati possono essere fatte per quasi qualsiasi geometria senza sporgenze (che avrebbe inibito la rimozione senza una muffa multiparte, che esula dall'ambito di questo manoscritto) e che si inserisce all'interno delle dimensioni del letto laser.
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Protocol
1. creare i disegni di stampo Master formato vettoriale
- Assemblare la geometria di stampo desiderato in formato vettoriale utilizzando un programma di grafica vettoriale (Vedi materiali, attrezzature e tabella Software). Selezionare il File di | Nuovo e creare una tela di adeguate dimensioni con formato di colore RGB. Creare la geometria desiderata usando gli strumenti forma nel pannello sinistro: inserire le dimensioni desiderate nella parte superiore della finestra (clicca sul pulsante di trasformazione nella parte superiore se non inizialmente visibile) per definire con precisione le dimensioni della forma.
Nota: Geometrie di stampo dovrebbero consentire almeno un bordo di 6 mm tra il bordo delle caratteristiche più esterne e la linea di taglio per consentire la rimozione del menisco PDMS dopo fusione in stampo. Ciò consentirà lo stampo finito gettare il filo con il fondo di una piastra di coltura. Ulteriormente, geometrie di stampo dovrebbero tener limitazioni considerazione associati al modello di taglierina laser che verrà utilizzato, tra cui larghezza taglio e dimensione minima funzionalità. Il laser utilizzato per i lavori descritti nel presente documento (Vedi materiali, attrezzature e tabella Software) in primo piano una larghezza di taglio di 0,2 mm e una dimensione minima caratteristica acidato di 25 µm (DPI massimo di 1.000). Dimensioni stampo possono essere scelto per accogliere una nave di cultura desiderata, ad esempio un piatto di 10 cm o 6 o 24 pozzetti. - Aprire il selettore colore nell'angolo superiore sinistro della finestra e definire nuovi campioni di colore compatibili con il software di taglio laser.
Nota: Usare il rosso (RGB 255, 0, 0) per il taglio e blu (RGB 0, 0, 255) per acquaforte. Ulteriori campioni possono essere definiti in base ai requisiti per la progettazione (ad esempio, se è desiderato più di una Incisione profondità).- Assegnare questi colori swatch a percorsi di taglio selezionando il percorso e quindi selezionare il campione di taglio per il colore del percorso e [Nessuno] per il colore di riempimento dal selettore colore.
- Analogamente, è possibile assegnare colori campione per acquaforte percorsi selezionando l'oggetto e quindi selezionando il percorso di incisione per il colore di riempimento e [Nessuno] per il colore del percorso dal selettore colore.
- Salvare i disegni come formati di file di or.pdf di either.ai, a seconda della vettoriale grafica programma e laser cutter compatibilità (Figura 1A e File supplementari).
2. gli stampi di acrilico Master a laser
- Selezionare un materiale di stampo master negativo.
Nota: Spessore acrilico è adatta a questa applicazione grazie alla sua compatibilità con taglio laser, costo relativamente basso, quarto di pollice e spessore che consente funzionalità fino a ~ 5,5 mm in altezza. Tuttavia, possono ricorrere anche altri materiali che soddisfano i seguenti requisiti: (i) Non reattivo con PDMS indurimento; (ii) Non-poroso/fortemente adesivo polimerizzato PDMS; (iii) taglia e incide in modo pulito con una taglierina laser; (iv) mantiene un vetroso dichiari fino a 60 ° C; (v) di spessore compatibile con l'altezza desiderata massima funzionalità. - Preparare il taglio laser per il taglio secondo le specifiche del produttore. Assicurarsi che viene utilizzata una ventilazione sufficiente e che l'altezza del letto è tarato correttamente per lo spessore del materiale scelto stampo master negativo.
- Aprire il file di disegno in un programma di grafica di vettori sul computer connesso per il taglio laser e fare clic su File | Stampa. Assicurarsi che il taglio laser è impostato come stampante e che "Non scala" è selezionato in scala discesa menu per evitare la distorsione del disegno prima di fare clic sul pulsante di stampa nella parte inferiore della finestra di dialogo Stampa.
- Nell'utilità di stampa laser cutter, fare clic sul pulsante Impostazioni in basso a destra. Assegnare la potenza, velocità e impulsi per pollice (PPI) impostazioni per ciascuno dei colori scelti in precedenza per impostare i parametri di taglio/etch per tutte le caratteristiche di progettazione.
Nota: Qui, il taglio laser dotato un 75 W del laser (Vedi materiali, attrezzature e tabella Software), le impostazioni utilizzate delle seguenti: 100% di potenza, velocità di 1% e 1.000 PPI taglia in modo pulito attraverso ¼" acrilico; potenza al 100%, 8% velocità e 500 PPI incide ad una profondità di 2,75 mm in acrilico; e potenza di 100%, 5% velocità, 500 PPI incide ad una profondità di 3,50 mm in acrilico. Se sconosciuto per una configurazione plotter laser o materiale, questi parametri possono essere determinati empiricamente attraverso tentativi ed errori con un pezzo di prova. - Clicca il pulsante verde grande software taglierina laser laser etch e tagliare gli stampi di matrice negativi.
- Preparare gli stampi negativi master per la colata di PDMS rimuovendo eventuali detriti di taglio residua con piccoli pennelli e/o aria compressa (Figura 1B).
3. preparare gli stampi PDMS per cella o coltura di tessuto
- Preparare una miscela di fusione PDMS secondo le indicazioni del produttore. Preparare 0,35 mL/cm2 di stampo master; Questo può variare sulla base delle caratteristiche di muffa e altezza.
- Degas il PDMS preparato in una camera sottovuoto collegato a una linea di vuoto lab standard (< 500 mmHg) per 1 h, o fino a quando tutte le bolle sono state eliminate.
- Nastro bordo esterno dello stampo con vinile o nastro adesivo (etichetta colorata nastro funziona bene) tale che il nastro si estende > 3 mm sopra il volto inciso dello stampo master negativo. Premere il nastro saldamente contro il lato dello stampo per evitare perdite più tardi.
Nota: Se lo stampo master acrilico dotato di fori passanti, può essere necessario applicare nastro sul fondo dello stampo pure (Figura 1). - Versare il PDMS degassato sopra il volto inciso dello stampo master negativo.
Nota: Il target spessore PDMS dipenderà l'applicazione, anche se PDMS spessore stampo parti inferiori può rendere impegnativo di imaging. Uno spessore minimo di ~ 1,5 mm colpisce un buon equilibrio tra imaging considerazioni e facilità di rimozione della muffa. - Posizionare lo stampo di matrice negativo rivestite con PDMS in una camera a vuoto e degassare nuovamente per 1 h, o fino a quando tutte le bolle sono state eliminate.
- Posizionare lo stampo master negativo rivestite con PDMS degassato in forno a 60 ° C per curare per almeno 6 h. Assicurarsi che il ripiano del forno è di livello. In alternativa, consentire il PDMS curare a 37 ° C durante la notte, o a temperatura ambiente per ~ 72 h.
- Se stampi multipli sono stati espressi sullo stesso stampo master negativo, è possibile utilizzare una lametta per tagliare questi stampi apart mentre essi sono ancora sullo stampo master negativo. Poi, sbucciare ogni stampo PDMS fuori lo stampo negativo di master. Riscossione di PDMS stampi lentamente e con attenzione per evitare la caratteristica muffa lacerazione durante la raccolta.
- Tagliare utilizzando una lama di rasoio, regioni con il menisco da casting, che impedirebbe la muffa da menzogne materiale piatto, così come l'eventuale eccedenza o detriti (Figura 1).
- Se necessario, è possibile preparare stampi per la fusione di cellule/tessuti in autoclave.
4. avviare il collagene e la fibrina idrogel tessuti
Nota: Utilizzare una procedura in asepsi corretta per mantenere la sterilità.
- Rispettare gli stampi sul fondo del vaso desiderato. Rispettare nuovi stampi sul fondo di un piatto di trattati di non-tessuto cultura premendo saldamente lo stampo contro la plastica non trattato (a causa di idrofobicità di PDMS).
Nota: Tuttavia, se la coltura di tessuti trattati in policarbonato deve essere utilizzato, o nel caso di stampi riutilizzabili, che tendono ad aderire meno saldamente, una colla naturale o sintetica (ad esempio di fibrina o silicone sigillante curato durante la notte) può essere utilizzata per assicurare allegato. - Preparare collagene neutralizzate casting soluzioni tali che la concentrazione desiderata di ciascuno sarà raggiunto nel tessuto del cast, fibrinogeno e trombina. Tenere collagene su ghiaccio fino al casting.
Nota: Fibrinogeno e trombina non dovrebbe essere consentiti mescolare sino al momento della fusione. Se necessario, le soluzioni di fibrinogeno e trombina possono anche essere refrigerate per aumentare il tempo di polimerizzazione. Abbiamo usato una concentrazione di fibrinogeno finale tra 0-8 mg/mL, una concentrazione di trombina finale tra 10-100 U/mL e una concentrazione finale di collagene tra 0,8 - 2,0 mg/mL (Figura 2). Per tessuti cardiaci ingegnerizzati, spesso usiamo cardiomiociti a 12 x 106 cellule/mL con 1,6 mg/mL, 4 mg/mL fibrinogeno e trombina di 20 U/mL (trombina viene aggiunto immediatamente prima del pezzo fuso). Concentrazioni ottimali (anche di fuori di questi intervalli suggeriti) dovrebbero essere determinate empiricamente. - Raccogliere le cellule seguendo protocolli standard e risospendere in concentrazione appropriata ottenere la densità desiderata iniziale delle cellule nel tessuto del cast.
Nota: Cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane sono state raccolte come descritto in Lian et al. 9 tenere le cellule prelevate sul ghiaccio. Volume delle cellule deve essere contabilizzato nel preparare la sospensione cellulare. Abbiamo usato le concentrazioni cellulari che vanno da 9-18 x 106 cellule/mL, anche se gamme ottimali sono tenute a variare con popolazione di cellule (Figura 2). - Il fibrinogeno, collagene neutralizzato e sospensione cellulare (Vedi punto 4.2 per un esempio) si combinano per creare un mix di colata. Mantenere il mix di colata sul ghiaccio.
Nota: Concentrazioni e a temperature di fibrinogeno e trombina saranno determinare la cinetica di polimerizzazione; al fine di evitare la polimerizzazione durante il casting, può essere necessario preparare lotti separati del mix colata a seconda del numero e volume dei costrutti che verrà eseguito il cast. - Trattare le superfici dello stampo che saranno esposti alla miscela di colata per mitigare idrofobicità PDMS (idrofobicità PDMS aumenterà di adsorbimento di proteine e rendere difficile la fusione).
- Ottenere modificazione della superficie idrofila trattando con plasma ad ossigeno, ad esempio con un generatore portatile ad alta frequenza (ad esempio, BD-20A da Litton Engineering). Esporre tutte le superfici dello stampo che a contatto con la miscela di cella/gel per il trattamento al plasma per 3-5 s, circa 5 min prima del getto.
- In alternativa, trattare con un tensioattivo, come Pluronic F-127 (1% p/v)10. Eseguire il trattamento di superficie come vicino il tempo di lancio possibile, come il cambiamento di polarità si deteriora nel tempo.
- Immediatamente prima del pezzo fuso, aggiungere la trombina mix del pezzo fuso e mescolare accuratamente pipettando su e giù senza introdurre bolle.
- Lavorare rapidamente, pipettare il mix di colata negli stampi, facendo attenzione a depositare il mix in tutti gli angoli e le fessure dello stampo. Evitare l'espulsione di pipetta oltre la prima fermata per prevenire la formazione di bolle all'interno i costrutti.
- Ripetere i passaggi da 4.6 e 4.7 come necessario per qualsiasi ulteriori lotti di mix di colata.
- Posizionare il vaso di coltura del tessuto in un incubatore a 37 ° C per 45 min. Se l'incubatrice non è ben umidificato, deposito cell supporti intorno gli stampi prima dell'incubazione per prevenire la disidratazione del costrutto.
Nota: Il tipo di cella media dipenderà il tipo di cella, ma per i costrutti di tessuto cardiaco ingegnerizzato usiamo RPMI 1640 + supplemento B27. - Dopo 45 min, restituire i costrutti per il cofano e il coperchio con cell supporti prima di tornare nell'incubatore.
- Cambiare il supporto cellulare ogni 48-72 h come necessaria per la cella e costruire tipo.
Nota: Variazione Media deve essere pianificato secondo le istruzioni fornite dal fornitore per garantire la salute massima della cella. Prestare attenzione quando si modificano i media per non disturbare i costrutti. Non abbiamo mai sperimentato problemi con costrutti di galleggiamento, ma in questo caso, può essere evitata mediante l'aggiunta di alti pali per il disegno di muffa che si estendono oltre il livello di media. - Dopo l'uso, lavare gli stampi in modo sequenziale con candeggina al 10%, 70% di etanolo e acqua distillata. Poi l'aria a secco e autoclave per il riutilizzo fino a ~ 10 volte.
5. analisi tecniche: Tessuto compattazione
Nota: Compattazione derivanti da rimodellamento della matrice è un indicatore della vitalità del tessuto e dello sviluppo che può essere facilmente misurato mediante analisi di immagine e microscopia ottica.
- Raccogliere immagini di microscopia ottica dei costrutti negli stampi a incrementi di tempo che vanno da 2 h a 96 ore dopo la colata.
Nota: A causa del basso grado di ingrandimento richiesto, un microscopio di dissezione con un attacco telecamera è ben si adatta a questa applicazione. - Tracciare l'area visibile del costrutto in una suite di analisi di immagine quali ImageJ (opensource, imagej.nih.gov/ij/).
- Analizzare il tasso e il grado finale di compattazione (Figura 2).
6. analisi tecniche: Prove di trazione
Nota: Entrambi attivi meccanica (forze o ceppi generati da un tessuto ingegnerizzato a causa di attività delle cellule) e meccanica passiva (forze o ceppi generati in risposta alle forze o ceppi applicate) è critiche caratteristiche funzionali di molti ingegnerizzati tessuti e questo è particolarmente vero per i tessuti cardiaci ingegnerizzati. L'analizzatore di micromeccanica utilizzato per le analisi è descritto nella Tabella materiali. Altre apparecchiature di collaudo meccanici potrebbero essere applicati allo stesso modo supponendo che consentono per il test idratata e sono in grado di controllo di lunghezza e misure di forza sopra gli intervalli e le risoluzioni pertinenti per il tessuto. Per tessuti con sezioni trasversali nell'ordine di millimetri quadrati singoli e durezze dell'ordine di decine di kPa, una cella di carico di 5 mN è una buona misura. Materiali più grandi e più rigidi richiederebbe una cella di carico più grande. Prima della prova, assicurarsi che il trasduttore di forza e il regolatore di lunghezza corretta taratura.
- Accendere il regolatore di lunghezza, forza trasduttore, generatore di impulsi e regolatore di temperatura.
- Riempire la meccanica attraverso test con soluzione di Tyrode (cloruro di calcio di 1,8 mM, 1,0 mM di cloruro di magnesio, 5,4 mM di cloruro di potassio, 140 mM di cloruro di sodio, fosfato di sodio 0,33 mM, 10 mM HEPES e glucosio di 5 mM in ddH2O, pH regolato a 7.4) per progettato tessuti cardiaci. Regolare la termocoppia in modo che si ottiene una temperatura di 37 ° C.
- Caricare un protocollo di test meccanico per la raccolta dati di contrazione attiva.
Nota: Abbiamo valutato attivo contrattile meccanica utilizzando un protocollo di passo di lunghezza nella quale lunghezza passaggi nel ceppo di 5% incrementi fino al 30% sono tenuti per 120 s per valutare l'impatto del ceppo sulla forza di contrazione (Figura 3A). Inoltre, abbiamo valutato passive caratteristiche meccaniche attraverso un protocollo di tiro-a-break a una velocità di deformazione costante di 10% ceppo/min (Figura 3B). Entrambi questi protocolli possono servire come buoni punti di partenza per l'analisi meccanica attiva e passiva. - In un ambito di dissezione, staccare con cura il costrutto di tessuto ingegnerizzato dallo stampo PDMS, tale che sta galleggiando liberamente.
Nota: Costrutti cellularizzati che sono stati sottoposti a compattazione del tessuto verranno probabilmente già scollegati dalle superfici di stampo interni, e in quei casi la manipolazione minima è necessaria.- Se la compattazione non ha causato il costrutto rilasciare, usare il forcipe per separare delicatamente il costrutto dai lati e fondo dello stampo per evitare di danneggiare il tessuto.
- Usando il forcipe, delicatamente pick up il costrutto e trasferirlo al bagno prova meccanico.
- Vedendo il costrutto attraverso un microscopio di dissezione, montare entrambe le estremità del costrutto ai ganci collegato al trasduttore di forza e braccio di leva.
- Regolare la posizione del braccio di leva con il micromanipolatore finché il costrutto è posizionato senza sforzo applicato. Zero il regolatore di lunghezza e forza controller.
- Immagine del costrutto attraverso il cannocchiale di dissezione in modo che le dimensioni del costrutto possono essere misurate attraverso l'analisi di immagine.
- Avviare il protocollo di forza attiva e salvare i raccolti dei dati una volta che il protocollo è stato completato (Figura 3).
- Se sono necessari anche passivi dati meccanici, regolare nuovamente il braccio di leva fino a quando non c'è zero sforzo applicato. La lunghezza zero e forza controllori e immagine il costrutto una seconda volta prima di caricare e avviare il protocollo di meccanica passiva (Figura 3). Salvare i dati raccolti.
7. analisi tecnica: Paraffina istologia ed immunoistochimica
Nota: Abbiamo avuto il più grande successo in sezioni di tessuto ingegnerizzato utilizzando blocchi di paraffina, in modo che la morfologia del tessuto è meglio conservato di imaging. Tutte le fasi del processo devono essere attentamente considerate e su misura per il tessuto ingegnerizzato, compreso il trattamento dei campioni senza pressione o vuoto, empiricamente determinare i metodi di recupero dell'antigene appropriato e titolazione l'anticorpo primario concentrazione. Altre tecniche, come l'utilizzo di blocchi congelati per la preparazione dei vetrini, possono richiedere meno tempo e spese durante producendo risultati sufficienti a seconda dell'applicazione prevista.
- In un ambito di dissezione, attentamente staccare il costrutto di tessuto ingegnerizzato dallo stampo PDMS utilizzando forcipe scivolato tra il costrutto e PDMS separato delicatamente dal PDMS, tale che sta galleggiando liberamente. Trasferire questi costrutti a un tubo del microcentrifuge per la fissazione.
Nota: Costrutti Fragile o quelli da fissare sotto la condizione di sollecitazione statica fornita da stampo stesso può essere fissati nello stampo cambiando soluzioni nella cultura bene e rimuovendo il costrutto dallo stampo dopo la fissazione. - Difficoltà immediatamente l'utilizzo di tessuti ingegnerizzati immergendo in paraformaldeide al 4% (PF) per 10 min a temperatura ambiente. Stima non più di 1 h per 1 mm di spessore del tessuto; non eccessiva difficoltà.
- Sciacquare i tessuti con tamponato fosfato salino (PBS).
- Mantenendo il tessuto bagnato, mettere una goccia di eosina su di esso per macchia rosa per 10-30 secondi e poi risciacquare con etanolo al 70%.
Nota: Il colore rosa aiuta a identificarlo nel blocco di paraffina per il sezionamento più tardi e sarà lavato via durante Sparaffinatura. - Avvolgere il tessuto in carta per lenti e posto in una cassetta di istologia. Utilizzare cuscinetti in schiuma nel cassetto come necessario per mantenere il tessuto piatto.
- Immergere la cassetta con 70% EtOH e conservare a 4 ° C fino al momento per l'elaborazione di paraffina.
- Elaborare il tessuto dalla disidratazione e in aumento delle concentrazioni di etanolo (2 x 30 min ogni di 70, 95 e 100%). Quindi il bagno campioni in tre bagni di xilene sequenziale per 30 minuti ciascuno.
- Immergere i campioni in tre bagni di paraffina sequenziale per 30 minuti ciascuno.
- Scaldare le cassette, attentamente dispiegare e rimuovere il tessuto eosina-macchiate dalla carta per lenti e incorporare il tessuto paraffina-infiltrato in un blocco di paraffina. Fare attenzione a porre il campione piatta sul fondo dello stampo per consentire il taglio più facile.
- Sezione i tessuti utilizzando un microtomo come desiderato (5-8 µm di spessore) e macchia utilizzando le procedure standard ottimizzate per il tessuto ingegnerizzato (Figura 4).
Nota: Un'alternativa alla paraffina sezioni è utilizzare blocchi congelati, anche se la morfologia del campione può essere compromessa. Posizionare i costrutti fissi in saccarosio 30% in PBS per 3 ore o fino a quando il campione è equilibrato (ad es., durante la notte). Scambiare la soluzione con 50/50 v/v 30% saccarosio e temperatura di taglio ottimale (OCT) congelamento medio per 1 h. Inserire i costrutti di blocchi congelati con OCT congelamento medio utilizzando un 70% EtOH con liquami di ghiaccio secco per blocco rapido congelamento in vassoi di plastica. Sezione i blocchi con un criostato per sezioni spesse di 10-50 µm.
8. analisi tecnica: Allineamento della cella
Nota: Manipolare la forma di tessuto e campi di tensioni interne possono modulare l'allineamento di cella, una caratteristica di definizione di molti tessuti nativi.
- Preparare i costrutti di tessuto ingegnerizzato in stampi PDMS con geometrie di interesse.
- Alla fine del periodo di cultura, lavare i costrutti in PBS, difficoltà nel 4% PF (Vedi punto 7.2) e raccogliere costrutti a preparare per l'imaging di sezionamento e di istologia (vedere sezione 7) o montare tutta la macchiatura.
Nota: Intero supporto colorazione segue una procedura simile alla istologia/immunohistochemistry ma richiede periodi di incubazione più lungo, e la profondità di penetrazione dei coloranti, gli anticorpi e le tecniche di imaging (come profondità di penetrazione della luce nei costrutti) sarà devono essere empiricamente determinate per la composizione di costrutto. - Orientare le sezioni di tessuto sul piano orizzontale (parallelo al piano della parte inferiore di muffa) e macchia per un marcatore per la cella di interesse. Utilizzare un'etichetta di f-actina, come falloidina, per contrassegnare le fibre di actina stress della maggior parte dei tipi di cellule. In alternativa, utilizzare un indicatore specifico delle cellule.
Nota: Nel caso di tessuti cardiaci ingegnerizzati, orientamento è stata determinata sarcomeri macchiati con α-actinina. - Valutare l'asse maggiore di tutte le celle o i nuclei della regione di interesse manualmente o utilizzando un'analisi nello strumento (ad es., ImageJ, MATLAB).
Nota: Potrebbe essere utile classificare le diverse regioni del costrutto stesso, a seconda della geometria come ("nodo" e "bundle" regioni in una geometria mesh-come, o "core") e "edge" in una geometria circolare.
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Representative Results
L'ottica della taglierina laser causerà acidati aree avere molto leggermente in diminuzione dimensioni come incisione profondità aumenta, e risultati in muffa pareti con uno smusso molto sottile, dovuto a affusolata del fascio laser. Questo vi aiuterà a facilitare la rimozione degli stampi cast PDMS, ma devono essere considerato attentamente se inciso molto profondamente negativi stampi master (> 6 mm) sono necessari (Figura 1).
Nel corso del tempo nella cultura, costrutti cellularizzati saranno compatto, grazie alla matrice rimodellamento, però la velocità e l'entità di questo fenomeno dipenderà la composizione dell'impalcatura, carico delle cellule e le condizioni di coltura.
Rimodellamento della matrice può avvenire attraverso la riorganizzazione e la degradazione della circostante matrice (così come deposizione di nuova matrice), ma è in genere associato a un aumento della rigidità meccanica a causa della diminuzione nella sezione trasversale. Con collagene-solo costrutti composti di collagene di 1,6 mg/mL e 12 x 106 cardiomyocytes/mL, vediamo costrutti compatto al 19,7 ± 2,8% della loro larghezza iniziale durante i quattro giorni dopo la fusione (Figura 2) via l'analisi di compattazione. Mentre questo test produce un'approssimazione 2D rappresentativa di un processo 3D, la facilità di raccolta dei dati e la natura distruttiva lo rendono uno strumento potente per studiare il processo di sviluppo del costrutto. Si noti che in condizioni di coltura delle cellule, anche in assenza di cellule, meccanica di collagene possa cambiare nel tempo a causa di entrambi auto-assemblaggio e cross-linking11. Fibrina può essere rapidamente degradata dalla fibrinolisi sia in vivo che in vitro se non in presenza di un antifibrinolitico, ad esempio aprotinina o aminocaproico acido12. Pertanto, l'impatto dei componenti del ponteggio su uno sviluppo di lungo termine del tessuto e non solo la formazione di tessuto, dovrebbe essere considerato quando si seleziona una formulazione di costrutto. Se la dimensione finale del tessuto è importante per un'applicazione specifica, compattazione deve essere considerato anche nella progettazione di stampi ed empiricamente determinato sulla base della composizione di matrice e stili di cella. Si noti che compattazione del tessuto può anche indurre stress campi all'interno del tessuto, che può essere manipolato in costrutti cellularizzati per favorire l'allineamento di cella (Figura 4).
Una vasta gamma di concentrazioni di polimero di impalcatura e semina la densità iniziale delle cellule sono stati utilizzati per creare tessuti ingegnerizzati in letteratura, e questo può essere attribuito principalmente alle diverse esigenze per vari tipi di cellule, linee cellulari e applicazioni. Basato sul nostro lavoro con cardiomiociti derivati hiPSC, crediamo che una concentrazione di collagene di 1,25 mg/mL e una densità di semina di ~ 15 milioni di cellule/mL è un buon punto di partenza13. In alternativa, della fibrina è ampiamente usata come materiale di impalcatura di tessuto cardiaco pure, in genere nell'intervallo di 3-4 mg/mL14. Densità di semina cellulare può essere selezionato basato su una serie di fattori a seconda dell'applicazione, ma la densità delle cellule dei tessuti nativi forniscono un buon punto di riferimento. Considera anche che soluzioni altamente concentrata di cellule possono diventare difficile da utilizzare, soprattutto per piccoli volumi. Per una popolazione determinata cella, la formulazione di ponteggio può essere sintonizzata; in genere aumentando la concentrazione del polimero quando i tessuti sono troppo fragili o rompono su compattazione e aumentando la concentrazione del polimero quando tessuti sono troppo rigide o non riescono a compattare15.
Prima di eseguire l'analisi meccanica passiva in qualsiasi momento punto durante la coltura, può essere opportuno meccanicamente presupposto il campione di costrutto. Precondizionamento del polimero naturale idrogeli e tessuti ingegnerizzati aumenterà la riproducibilità del risultato del test a causa di materiale viscoelasticità e fornirà una migliore indicazione delle proprietà che il costrutto esporrà in una clinica applicazione. Usiamo 8 cicli di 10% di deformazione in una forma d'onda triangolare a un tasso del 10% ceppo/min prima di iniziare la valutazione meccanica (Figura 3).
Tessuto e cellula-tipo morfologia specifica può essere valutata attraverso l'istologia e l'immunoistochimica con metodi tradizionali. Tuttavia, abbiamo trovato che l'ottimizzazione di quasi tutte le fasi di paraffina trasformazione, l'incorporamento, sezionamento, ricupero dell'antigene e colorazione sono state necessarie per il tessuto cardiaco ingegnerizzato rispetto al placcato cellule o sezionato nativo tessuto (Figura 4).
Figura 1 : Descrizione del processo per la progettazione e preparazione stampi PDMS dal laser taglio acrilici maestri. (A) preparati in formato grafico vettoriale progettazione di stampi. (B) ripuliti laser acidato acrilico master negativo. (C) PDMS espressi sulla superficie dello stampo master acrilico nastrata. (D) risultante PDMS stampo pronto per la sterilizzazione prima della coltura del tessuto. Inserto: Vista dall'alto, stessa scala. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Costruire la compattazione nel corso del tempo nella cultura. (A) le immagini di costrutti rettangolare preparati in triplice copia la compattazione nel corso del tempo nella cultura. Sovrapposizioni di verde rappresentano maschere utilizzate per calcolare l'area visibile del costrutto per l'analisi di immagine. (B) trama del costrutto di zona (una metrica bidimensionale di costrutto compattazione) nel corso del tempo. Linee orizzontali rappresentano i valori medi e le barre di errore indicano la deviazione standard. Per tutti i gruppi, n = 3 e * indica p < 0,05 come valutata mediante ANOVA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Tracce del raw per la caratterizzazione meccanica dei tessuti cardiaci ingegnerizzati. Inserti in visualizzare una traccia di contrazione contrazione rappresentante singolo (stessi assi come trama principale). (A) risposta meccanica attiva risultante da rapidi passi seguiti da tiene a incrementi di 5% di deformazione. (B) risposta meccanica passiva derivante da una prova di tiro-a-break a un tasso del 10% ceppo/min. Tutti i campioni sono stati analizzati in un bagno di 37 ° C della soluzione di Tyrode. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Paraffina bloccare le immagini di istologia per i costrutti di tessuto cardiaco ingegnerizzato di vari disegni. Immagini di istologia blocco paraffina per i costrutti di tessuto cardiaco ingegnerizzato di vari disegni colorati con (A) ematossilina ed eosina, (B) diaminobenzidina (anti-cardiaca troponina T, marrone) ed ematossilina controcolorazione nucleare, (C ) percentuale rossi macchia per il collagene con veloce verde controcolorazione citoplasmatico e (D) anticorpo anti-α-actinina (verde) e 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) nucleare colorante di contrasto (blu). Allineamento della cella è diverso come risultato la compattazione di design e tessuti di costrutto. Barra della scala nel A si applica pure a B e C. Inserto in D Mostra cardiomyocytes striato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Geometrie di stampo PDMS personalizzate che sono compatibili con la coltura del tessuto hanno grande utilità nella sintonizzazione proprietà importante tessuto ingegnerizzato, quali l'allineamento di cella, tasso di diffusione e la rigidezza efficace. Inoltre, questi stampi sono molto utili per la preparazione di tessuti per applicazioni di analisi in cui geometria è importante, come meccanico test16,17. Preparare questi dispositivi dal laser taglio negativo stampi master offre un metodo rapido, facile e basso costo di utilizzando questi strumenti, soprattutto se confrontato con il tempo e il costo associato microfabbricazione tradizionale. Taglio laser permette anche una dimensione maggiore di stampo massimo, limitata solo dalle dimensioni letto della fresa. Abbiamo utilizzato con successo questi stampi versatili per eseguire un'ampia varietà di studi con tessuti ingegnerizzati cardiache, tra cui mappatura ottico di propagazione del potenziale d'azione, valutazione delle proprietà meccaniche di forza produzione e passivo e l'impianto in un modello del ratto di infarto miocardico13,18. Ci rendiamo conto che di là della ricerca di nicchia di ingegneria rigenerativa cardiovascolare, le applicazioni per l'ingegneria tissutale campi, somministrazione di farmaci e ricerca sui materiali sono vaste.
Mentre ci sono pochi passi tecnicamente impegnativi nella fabbricazione degli stampi stessi, ci sono un numero di passaggi critici coinvolti nella creazione di tessuti funzionali. Se costrutti non riescono a compattare la matrice circostante dopo 24 h, prima di confermare l'attuabilità delle cellule attraverso la vitalità di colorazione dei tessuti ingegnerizzati. Se attuabilità delle cellule è elevato, è consigliabile alterare la composizione del costrutto per la prossima serie di tessuti. Mentre i risultati variano notevolmente a seconda della popolazione delle cellule, abbiamo osservato una maggiore compattazione associato a maggiore densità di semina e concentrazioni più basse di collagene. Infine, può anche essere utile integrare la popolazione delle cellule seminato con un tipo di cella adatto per il rimodellamento della matrice, come i fibroblasti, per incoraggiare la compattazione.
Una limitazione di questi stampi è il potenziale per PDMS adsorbire piccole molecole idrofobiche. Mentre per le nostre applicazioni questo non è stato problematico, può essere di preoccupazione nelle analisi molto sensibili alla perdita di queste molecole. In questi casi, adsorbimento di proteine PDMS possa essere attenuato mediante trattamento con un agente di Antivegetativa ad esempio polyhydrophilic o polyzwitterionic materiali19. In alternativa, uno stampo PDMS sterilizzato potrebbe essere preparato come un maestro negativo (da uno stampo positivo inciso al laser) per uno stampo di cultura per essere gettati in un altro materiale non-adsorbente, quali agarosio.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono finanziamenti dal NIH R00 HL115123 e Brown University School of Engineering. Sono anche grati per il Workshop di progettazione di Brown e Chris Bull per formazione e supporto con la taglierina del laser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Item | |||
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630-5G | Constructs |
| Bovine thrombin | Sigma | T6634-250UN | Constructs |
| Bovine aprotinin | Sigma | 10820-25MG | Constructs |
| Rat tail collagen I, 4 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5153-100MG | Constructs |
| Sodim chloride | Fisher | BP358-10 | Constructs |
| PBS | Life Technologies | 14190-250 | Constructs |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Constructs |
| Sylgard 184 silicone elastomer | Corning | 4019862 | PDMS Molds |
| Lab tape | Fisher | 15-901-5R | PDMS Molds |
| Acrylic, 1/4" thick | McMaster-Carr | 8560K356 | PDMS Molds |
| HEPES Buffer, 1 M | Sigma | H3537-100ML | Constructs |
| RPMI 1640 medium, powder | Fisher | 31800-089 | Constructs |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher | AC423520250 | Constructs |
| Magnesium chloride hexahydrate | Fisher | M33 500 | Constructs |
| Potassium chloride | Sigma | P9541-500G | Constructs |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9390-500G | Constructs |
| Glucose | Sigma | G5767-25G | Constructs |
| OCT | VWR | 25608-930 | Histology |
| Frozen block molds | VWR | 25608-916 | Histology |
| Hematoxylin | Fisher | 3530 1 | Histology |
| Eosin Y | Fisher | AC152880250 | Histology |
| Fast green FCF | Fisher | AC410530250 | Histology |
| Software | |||
| Illustrator | Adobe Systems | Vector Graphics | |
| Inkscape | (Open Source) | Vector Graphics | |
| UCP (Universal Control Panel) | Universal Laser Systems | Laser Cutter Interface | |
| Equipment | |||
| PLS6.75 Laser Cutter | Universal Laser Systems | Laser Cutter | |
| Micromechanical Analyzer | Aurora Scientific | 1530A with 5 mN load cell | Mechanical Analysis |
References
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