Summary
我们开发了一个简单和有效的协议, 以制备大量的大豆原生质体研究复杂的调控和信号机制的活细胞。
Abstract
大豆 (甘氨酸最大值(L.)含笑) 是一种重要的农作物品种, 已成为研究遗传和生物化学途径的豆科动物模型。因此, 建立高效的大豆瞬时基因表达系统是十分重要的。在这里, 我们报告了一个简单的协议, 大豆原生质体的制备及其应用的瞬态功能分析。我们发现, 大豆幼苗的幼单叶叶片产生了大量高质量的原生质体。通过优化 PEG-钙介导的转化方法, 利用大豆单叶原生质体实现了高转化率。该系统为检测活大豆细胞中复杂的调控和信号机制提供了一个高效、通用的模型, 有助于更好地了解豆类的不同细胞、发育和生理过程。
Introduction
原生质体是细胞壁被移除的植物细胞。由于它们保持植物细胞的大部分功能和活动, 原生质体是一个良好的模型系统, 观察和评价各种细胞事件, 是有价值的工具, 研究体细胞杂交1和植物再生2。原生质体也被广泛用于植物转化3,4,5, 因为细胞壁会阻止 DNA 进入细胞。原生质体具有完整植物的一些生理反应和细胞过程, 因此为研究亚细胞蛋白定位的基础研究提供了基本的价值6,7,8,蛋白质-蛋白质相互作用9,10和启动子活动11,12,13在活细胞中。
首次报道了植物原生质体的分离, 在 1960年14 , 对原生质体分离和转化的协议进行了开发和优化。原生质体分离的标准程序包括叶片的切割和细胞壁的酶消化, 然后分离出未被消化的组织碎片释放出的原生质体。转换策略包括电穿孔15,16, 微注射17,18, 和聚乙二醇基 (PEG)4,5,19方法。广泛的物种已报告原生质体分离成功, 包括柑桔20, 芸薹21, 茄22和其他观赏植物系列23,24。虽然不同的组织类型用于各种物种, 一个系统的瞬态表达在拟南芥叶肉原生质体 (TEAMP) 分离从模型植物的叶子拟南芥已经建立良好的25并广泛应用于不同的应用程序。
大豆 (甘氨酸最大值(L.)含笑.) 是最重要的蛋白质和油料作物之一26。与拟南芥和大米不同, 获得转基因大豆植株是相当困难和低效率的。农杆菌介导的浸润已普遍用于烟草表皮细胞的瞬态基因表达研究27和幼苗在拟南芥28,29, 而农杆菌杆菌已用于大豆毛状根的转化,30。病毒诱导的基因沉默方法已被用于下调的目标基因31,32和瞬态表达式33系统的方式。原生质体为这些方法提供了一个有价值的和多才多艺的替代品。原生质体可以从大豆的地上材料中获得, 并允许快速、同步的转基因表达。然而, 自从大豆原生质体在 198334初期成功分离后, 大豆原生质体的应用有了有限的报告35、36、37、38, 主要是由于大豆原生质体的产量相对较低。
本文介绍了一种简单有效的大豆原生质体分离方法及其在瞬态基因表达研究中的应用。利用大豆幼苗的幼单叶叶, 我们能够在几个小时内获得大量的重要原生质体。此外, 我们还优化了 PEG-钙介导的转化法, 使 DNA 转化为高效的大豆原生质体是简单、低成本的。
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Protocol
1. 植物的生长
- 母猪 5-10 大豆种子 (威廉斯 82) 在一个 13 cm 罐在温室在长的天情况下 (16 h 光在1500µmol m-2 s-1) 在25° c 在风俗土壤混合为大豆 (1:1: 1 土、珍珠岩和鱼雷砂的比值。
2. 质粒 DNA 的制备
- 使用无菌吸管尖端或牙签, 选择一个单一的殖民地或冷冻甘油库存的大肠杆菌携带的质粒含有的利益基因和接种它在20毫升 Luria Bertani (LB) 液体培养基与适当的抗生素在50毫升瓶。
- 在37° c 的瓶子上一夜之间孵育瓶。在室温下离心 1.2万 x g 的悬浮液收集细菌5分钟, 丢弃上清。按照制造商的质粒准备试剂盒的程序提取和纯化质粒。
3. 原生质体分离
- 从10天的老大豆幼苗 (图 1) 中切下新扩展的单叶叶。
注: 在适宜的发育阶段选择叶片是大豆原生质体制备成功的关键。只有在早期发育阶段才使用扩大叶。随着树叶的成熟, 细胞壁变得更加难以消化。 - 用新鲜的剃刀刀片, 从单叶叶中取出中脉, 然后将残余切成 0.5-1 毫米的条纹。
注意: 两个单叶的叶子在10毫升的酶溶液中消化, 将为超过10的转化提供足够的原生质。 - 使用一对镊子, 立即和轻轻地转移到10毫升的新准备的酶溶液 (表 1) 在15毫升管的叶子条。真空在室温下渗透15分钟的叶子条。
- 在室温下, 用柔和的搅拌 (40 rpm) 在低光照下孵育酶溶液中的叶子条, 4-6 小时。确保当原生质体释放时, 酶溶液变成黄绿色。检查显微镜下的酶/原生质体溶液 (X10)。
注意: 释放的原生质体是球形的, 而未消化的细胞有不规则或椭圆形的形状。 - 将10毫升的酶/原生质体溶液在50毫升的试管中轻轻地浇注并加入10毫升的 W5 溶液 (表 1) 在室温下, 以停止消化。轻轻地倒置管几次。将酶/原生质体溶液轻轻倒入一个干净的75µm 尼龙网格上, 放在50毫升管上, 除去未消化的叶子组织。
- 将流经的酶/原生质体溶液离心于50毫升的 100 x g, 室温下为1-2 分钟。用10毫升的血清吸管轻轻移除上清液, 不干扰原生质体颗粒。
- 通过在显微镜下 hemacytometer 下的原生质体数 (x10), 在 W5 溶液中重原生质体并稀释到 2 x 105 mL-1的浓度。将原生质体保持在冰上30分钟。
- 离心悬浮在 100 x g 在室温下1-2 分钟, 用1毫升吸管轻轻地移除 W5 溶液, 而不干扰原生质体颗粒。重 MMG 溶液 (表 1) 中的原生质, 在室温下浓度为 2 x 105 mL-1 。
4. 原生质体转化
- 100µL 等分原生质体 (2 x 104原生质体在 2 x 105 ml-1) 在1.5 毫升低粘离心管使用未切割的200µL 吸管提示。把一个分放在一旁作为负控制。在原生质体的其余分中加入10µL 质粒 (10-20 µg)。
- 在 1.5 mL 离心管的内壁上缓慢地加入110µL 的新制备的 PEG 溶液 (表 1), 然后轻轻地倒置和旋转管, 直到溶液变得均匀。
- 室温下孵育转化混合物15分钟。
- 为了停止转换, 慢慢地在室温下将400µL 的 W5 溶液加到1.5 毫升的管中, 然后轻轻地倒置管子, 直到溶液变得均匀。离心管在100克在室温下1-2 分钟, 用吸管丢弃上清液。
- 将1毫升的 WI 解决方案 (表 1) 添加到试管和重中, 轻轻移1-2 次。添加1毫升的 5% (卷/卷) 无菌小牛血清在每个井的 6-良好的组织培养板, 以大衣的表面, 并防止原生质体黏附在板块。
- 几秒钟后, 用吸管将小牛血清丢弃。将悬浮原生质体转移到培养板的井中。用盖子盖住盘子。
5. 原生质体培养和收获
- 在室温下在黑暗中孵育原生质1-2 天。
注意: 我们发现, 两天的孵化产生更强的荧光蛋白信号一般与一天的孵化相比, 和荧光蛋白信号可能持续长达3-4 天。 - 将原生质体溶液转移到1.5 毫升低粘离心管。离心管在 100 x g 为1-2 分钟在室温下收获原生质体。用吸管移除上清液, 并将10µL 原生质体转移到玻片上。
- 在荧光或共聚焦显微镜下观察荧光信号。使用非转化的原生质体作为阴性控制 (没有信号应该被观察)。
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Representative Results
对10天的老大豆不同器官进行了原生质体准备 (图 1), 并在显微镜下观察了产量 (图 2)。从下胚轴和上的细胞壁几乎没有被消化, 有些细胞相互连接 (图 2B, 2C)。在子叶 (图 2D) 和根 (图 2A) 中, 单元格壁仅在单元格的一小部分中被移除。相比之下, 在使用单叶时观察到大量的原生质体 (图 2E-g)。进一步研究了不同发育阶段的单叶叶 (图 2H)。虽然未和刚刚扩大的单叶叶导致原生质体的高产, 从刚刚展开的单叶的原生质体的大小更均匀 (图 2F) 比未单叶 (图 2E)。对于完全展开的单叶, 单元格壁在大多数单元格中仍然完好无损 (图 2G)。我们测试了三不同制造商的细胞壁消化酶, 并取得了类似的结果如上所述。基于这些观察, 我们得出结论, 植物材料的选择是一个关键的因素, 刚刚扩大单叶叶片从年轻的大豆幼苗是最好的材料的原生质体准备。
对大豆单叶原生质体的最佳转化效率 (图 3A-d) 测试了一系列不同数量的质粒 DNA (0.1 µg、1µg、5µg 和20µg)。20µg 质粒 DNA 的转化率最高, 具有50% 以上的转换速率 (图 3D), 而0.1 µg 显示最低 (少于 1%)(图 3A)。我们获得了可比的转化效率使用不同的 DNA 纯化试剂盒从三制造商。这一结果表明, 大量的质粒 DNA 将大大有助于提高转化效率。
图 4是用构造 p2GWF7-E1 变换的大豆原生质体的共焦图像, 它表示GFP与豆科特定基因E1 (Glyma 06G207800) 融合, 由 CaMV 35S启动子在矢量 p2GWF7 中驱动39. E1-GFP 融合蛋白显示了大豆原生质体的核定位, 这与先前研究使用拟南芥原生质体系统40相一致。考虑到E1是豆科特定的基因, 我们使用大豆原生质体系统的结果为 E1 蛋白的亚细胞定位提供了确凿的见解。
图1。本试验研究了大豆幼苗的器官, 包括根、下胚轴、子叶、上和单叶.经过一对单叶叶, 大豆幼苗发展枳叶。请单击此处查看此图的较大版本.
图2。从不同器官和大豆幼苗发育阶段制备的原生质体细胞.(A-D)10天老大豆幼苗不同器官制备的细胞: 根 (a)、下胚轴 (B)、上 (C)、子叶 (D)。(电子 G)从不同发育阶段单叶叶制备的原生质体细胞: 未 (E)、刚膨大 (F) 和完全膨大的 (G) 单叶, 分别对应于左、中、右的大豆幼苗 (H)。刻度条是25µm (A-G) 或25毫米 (H)。请单击此处查看此图的较大版本.
图3。用不同质粒 DNA 对大豆单叶原生质体转化效率的共焦图像进行了研究。绿色荧光蛋白 (代表绿) 和明亮的领域 (灰色) 的图像合并.原生质体转化为不同数量的质粒 p2GWF7-E1: 0.1 µg (A), 1 µg (B), 5 µg (C) 和20µg (D)。在显微镜下转换后24小时, 对 GFP 的荧光信号进行监测。黑色刻度条是50µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图4。共焦图像显示 E1-GFP 在大豆单叶原生质体的细胞核内的亚细胞定位.质粒 p2GWF7-E1 用于转化。绿色荧光蛋白 (代表绿) 和明亮场 (灰色) 的图像被合并。在转化后24小时内监测 GFP 的荧光信号。黑色刻度条是5µm.请单击此处查看此图的较大版本.
| 酵素解答 (新鲜地准备) | |
| MES, pH 值5。7 | 20mM |
| 纤维素酶自尊 | 2% (w/五) |
| Pectolyase Y-23 | 0.1% (w/五) |
| 甘露醇 | 0.75 M |
| CaCl2 | 0.2 毫米 |
| 波塞军 | 0.1% (w/五) |
| dtt | 0.5 毫米 |
| W5 解决方案 | |
| nacl | 154毫米 |
| CaCl2 | 125毫米 |
| 氯化钾 | 5毫米 |
| MES, pH 值5。7 | 2毫米 |
| MMg 解决方案 | |
| MES, pH 值5。7 | 4毫米 |
| 甘露醇 | 400毫米 |
| 氯化镁2 | 15毫米 |
| PEG 溶液 (新鲜制备) | |
| PEG4000 | 20% (w/五) |
| 甘露醇 | 200毫米 |
| CaCl2 | 100毫米 |
| 无线解决方案 | |
| MES, pH 值5。7 | 4毫米 |
| 甘露醇 | 0.5 M |
| 氯化钾 | 20毫米 |
表1。大豆原生质体分离与转化的解决方案。
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Discussion
本方案对大豆原生质体的分离及在瞬态表达研究中的应用进行了全面的测试, 并在实验室中得到了很好的效果。程序简单易得, 需要普通设备和最低成本。我们的协议产生了大量的均匀, 高质量的原生质相比, 以前报告的方法34,35,36,37,38。然而, 由于有许多因素影响原生质体的产量和转化率, 强烈建议研究人员根据他们的实验条件, 理想的结果和使用的材料来优化条件。虽然这个系统是非常有用的检查直接调节和生物化学事件的植物细胞, 它不适合观察长期细胞过程和事件发生在组织或个体水平。
我们发现, 在理想的发育阶段选择大力生长的植物材料是大豆原生质体制备中最关键的因素。它不仅决定了原生质体的产量, 而且影响了随后的 DNA 转化的质量。在不受任何压力的环境中, 如干旱、洪涝、极端温度或害虫等, 经常种植大豆植株是很重要的。利用幼苗刚扩单叶叶, 可获得最高的原生质体产量和转化效率。对于初学者, 建议在不同的发育阶段使用单叶叶, 并进行比较以获得最佳效果。
原生质体/DNA 比值是优化转化效率的重要因素。通常最好从 2 x 104 protoplasts/10-20 µg DNA 的比值开始, 但对于单个构造的比率的优化建议为25。强烈推荐使用 dna 纯化试剂盒获得的高质量 dna。
在原生质体的瞬态表达载体的选择中, 高拷贝数和小尺寸向量通常是首选。尽管农杆菌介导的二进制载体--植物的转化可以用于原生质体转化, 但这些载体的大尺寸可能导致较少的最佳转化效率。对于 GFP-融合蛋白表达, 我们通常使用不具有植物选择标记的向量, 因此相对较小 (6-7kb), 如 p2GWF7 和 p2FGW739 (https://gateway.psb.ugent.be)。
多种载体可同时转化为原生质体。我们成功地表达了 BiFC 载体检测蛋白-蛋白质相互作用, 以及多种荧光蛋白的细胞和亚细胞标记的大豆原生质体。此外, 我们的方法的简单性和大的收益率提供了一个理想的系统, 检查监管和生物化学事件, 基因靶向载体设计, 分离瞬时表达蛋白和蛋白质复合体, 并纯化特定细胞核等细胞器官, 能够进一步应用于新出现的基因组和蛋白质的方法。
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Disclosures
作者声明他们没有竞争的金融利益。
Acknowledgments
这项工作得到了来自国家科学基金会 (NSF-PGRP-IOS-1339388) 的植物基因组研究项目的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES | Sigma Aldrich | M8250-100G | |
| Cellulase CELF | Worthington Biological Corporation | LS002611 | |
| Pectolyase Y-23 | BioWorld | 9033-35-6 | |
| CELLULASE "ONOZUKA" R-10 | yakult | 10g | |
| MACEROZYME R-10 | yakult | 10g | |
| Mannitol | ICN Biomedicals | 152540 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500g | |
| BSA | NEB | R3535S | |
| DTT | Sigma Aldrich | D5545-5G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653-1kg | |
| KCl | Fisher | P217-500g | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100g | |
| PEG4000 | Fluka | 81240 | |
| nylon mesh | carolina | 652222N | |
| Tissue Culture Plates | USA Scientific | CC7682-7506 | |
| Razor Blades | Fisher | 12-640 | |
| hemacytometer | hausserscientific | 1483 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| EZNA plasmid miniprep kit | Omega | D6942-01 | |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Thermo Scientific | K0502 | |
| Centrifuge 5810 | eppendorf | 5811000827 | |
| Centrifuge 5424 | eppendorf | 22620401 | |
| Jencons Powerpette Plus Pipet Controller | Jencons | 14526-202 | |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | N/A | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12450 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1018-P | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1060-P | |
| Newborn Calf Serum | Thermo Scientific | 16010159 | |
| Soil | Ingram's Nursery | ||
| perlite | Vigoro | 100521091 | |
| Torpedo Sand | JKS Ventures | ||
| LB Broth, Lennox (Powder) | Fisher | BP1427-500 |
References
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