Summary
Vi udviklet en enkel og effektiv protokol for forberedelse af store mængder af sojabønner protoplasts at studere komplekse regulerende og signalering mekanismer i levende celler.
Abstract
Sojabønner (Glycine max (L.) Merr.) er en vigtig afgrøde arter og er blevet en bælgplante model for studier af genetiske og biokemiske veje. Det er derfor vigtigt at etablere en effektiv forbigående gen expression system i sojabønner. Vi rapporterer her, en enkel protokol for forberedelse af sojabønner protoplasts og dens anvendelse for forbigående funktionelle analyser. Vi fandt, at unge unifoliate blade fra sojabønner frøplanter resulterede i store mængder af høj kvalitet protoplasts. Ved at optimere en PIND-calcium-medieret transformation metode, opnåede vi høj transformation effektivitet ved hjælp af sojabønner unifoliate protoplasts. Dette system giver en effektiv og alsidig model til undersøgelse af komplekse regulerende og signalering mekanismer i live sojabønner celler og kan hjælpe til bedre forstå forskellige cellulære, udviklingsmæssige og fysiologiske processer i bælgplanter.
Introduction
Protoplasts er planteceller, der har cellevægge fjernet. Som de fleste af funktioner og aktiviteter af planteceller påstår de, protoplasts er en god modelsystem til at observere og vurdere forskellige cellulære begivenheder, og er værdifulde værktøjer til at studere somatiske hybridisering1 og plante regenerering2. Protoplasts har udnyttet også bredt for anlægget transformation3,4,5, da cellevægge ville ellers blokere passage af DNA i cellen. Protoplasts besidder nogle af de fysiologiske reaktioner og cellulære processer af intakt planter, derfor tilbyder grundlæggende værdi i grundlæggende forskning til at studere subcellulært protein lokalisering6,7,8, protein-protein interaktioner9,10, og promotor aktivitet11,12,13 i levende celler.
Isolering af planten protoplasts blev først rapporteret i 196014 og protokoller for både isoleret og transformation af protoplasts er blevet udviklet og optimeret. En standard procedure protoplast isolation indebærer opskæring af blade og Enzymatisk nedbrydning af cellevægge, efterfulgt af adskillelse af frigivne protoplasts fra ikke-fordøjet væv debris. Transformation strategier omfatter elektroporation15,16, mikroinjektion17,18, og funderede polyethylenglycol (PEG)4,5,19 metoder. En bred vifte af arter, der er blevet rapporteret succes for protoplast isolation, herunder Citrus20, Brassica21, Solanaceae22 og andre prydplante familier23,24. Mens forskellige vævstyper bruges i forskellige arter, har et system af forbigående udtryk i Arabidopsis mesofyllet protoplast (TEAMP) isoleret fra bladene af model planten Arabidopsis thaliana været veletablerede25 og bredt vedtaget til forskellige applikationer.
Sojabønner (Glycine max (L.) Merr.) er en af de vigtigste protein og olie afgrøder26. I modsætning til Arabidopsis og ris, er opnåelse af transgene sojabønner planter kendt for at være temmelig vanskeligt og lav effektivitet. Agrobacterium tumefaciens-medieret infiltration har været populært anvendes for forbigående gen expression undersøgelser i den epidermale celler i tobak27 og stiklinger i Arabidopsis28,29, hvorimod Agrobacterium rhizogenes har været brugt til transformering af behårede rødder i sojabønner30. Virus-induceret gene silencing tilgange har været udnyttet til downregulation af target gener31,32 og forbigående udtryk33 på en systemisk måde. Protoplasts giver en værdifuld og alsidig alternativ til disse tilgange. Protoplasts kan opnås fra sojas overjordiske materialer og giver mulighed for hurtig og synkroniseret transgen udtryk. Siden den oprindelige vellykkede isolering af sojabønner protoplasts i 198334, har der dog været begrænset rapporter om anvendelsen af protoplasts i sojabønner35,36,37, 38, primært som følge af forholdsvis lave udbytter af sojabønner protoplasts.
Her, beskriver vi en enkel og effektiv protokol for dyrkning af sojabønner protoplasts og dens anvendelse for forbigående gen expression undersøgelser. Ved hjælp af unge unifoliate blade fra sojabønner kimplanter, har vi kunnet opnå store mængder af afgørende protoplasts inden for et par timer. Derudover har vi optimeret en PIND-calcium-medieret transformation metode, der er enkel og billig at levere DNA i soja protoplasts med høj effektivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. vækst af planter
- So 5-10 sojabønner frø (Williams 82) i en 13 cm potte i drivhus betingelser længe-dag (16 h lys på 1.500 µmol m-2 s-1) på 25 ° C på den brugerdefinerede jord blanding for sojabønner (1:1:1 ratio af sand, jord, perlite og torpedo).
2. forberedelse af Plasmid DNA
- Med en steril pipette tip eller tandstikker, vælge en enkelt koloni eller frosne glycerol bestand af E. coli transporterer plasmid som indeholder gen af interesse og podes det i 20 mL Luria-Bertani (LB) flydende medium med passende antibiotika i en 50 mL målekolbe.
- Inkuber i kolben ved 37 ° C natten over på en shaker. Indsamle bakterier ved centrifugering suspension på 12.000 x g ved stuetemperatur i 5 min og kassere supernatanten. Uddrag og rense plasmid efter fabrikantens procedure for en plasmid prep kit.
3. protoplast isolation
- Skære nyligt udvidede unifoliate blade fra 10 - dage gamle sojabønner stiklinger (figur 1).
Bemærk: Udvalg af blade i en passende udviklingsstadiet er nøglen til succes for sojabønner protoplast forberedelse. Brug kun netop udvidet blade på tidlige udviklingsstadier. Da forlader modne, blive cellevægge sværere for at fordøje. - Med et frisk barberblad, skal du fjerne Midtribbe fra unifoliate blad og derefter skæres resterne i 0,5-1 mm strimler.
Bemærk: To unifoliate blade fordøjet i 10 mL enzym løsning vil give tilstrækkeligt protoplasts for mere end 10 transformationer. - Ved hjælp af en tang, overførsel strimler bladet straks og blidt i 10 mL frisk tilberedt enzym løsning (tabel 1) i en 15 mL tube. Vakuum infiltrere bladet strimler i 15 min. ved stuetemperatur.
- Inkuber blad strimler i enzym løsning med blid agitation (40 rpm) under svagt lys i 4-6 timer ved stuetemperatur. Sikre, at enzymet løsning vender gul-grøn, som protoplasts er frigivet. Kontrollere enzym/protoplasts løsning under mikroskop (X10).
Bemærk: De frigivne protoplasts er sfærisk formet, mens de nedbrudte celler har uregelmæssige eller oval figur. - Overfør 10 mL af enzym/protoplast løsning i en 50 mL tube ved forsigtigt hælde og der tilsættes 10 mL af W5 løsning (tabel 1) ved stuetemperatur til at stoppe fordøjelsen. Forsigtigt vendes i rør et par gange. Hæld forsigtigt enzym/protoplasts løsning på en ren 75 µm nylon mesh placeret på toppen af en 50 mL tube fjerne ufordøjet blad væv.
- Der centrifugeres gennemstrømnings-enzym/protoplasts løsning på 100 x g i 50 mL tube for 1-2 min. ved stuetemperatur. Forsigtigt fjernes supernatanten ved hjælp af 10 mL serologisk pipette uden at forstyrre protoplast pellet.
- Resuspend protoplasts og fortyndes til en koncentration af 2 x 105 mL-1 i kølet W5 løsning ved 4 ° C ved at tælle protoplast nummer på en hemacytometer under mikroskop (x10). Holde protoplasts på is i 30 min.
- Centrifugeres suspension på 100 x g i 1-2 min. ved stuetemperatur og forsigtigt fjerne W5 løsning ved hjælp af 1 mL pipette uden at forstyrre protoplast pellet. Resuspend protoplasts i MMG løsning (tabel 1) i en koncentration på 2 x 105 mL-1 ved stuetemperatur.
4. protoplast transformation
- Gøre 100 µL delprøver af protoplasts (2 x 104 protoplasts på 2 x 105 mL-1) i 1,5 mL lav friktion microcentrifuge rør ved hjælp af uslebne 200 µL pipette tips. Sætte en alikvot til side for at tjene som negativ kontrol. Tilføje 10 µL plasmid (10-20 µg) i hver af resten alikvot af protoplasts.
- Langsomt tilføje 110 µL af frisklavede PIND løsning (tabel 1) på indersiden af 1,5 mL microcentrifuge rør, og derefter forsigtigt vendes og rotere røret, indtil løsningen bliver homogen.
- Inkuber transformation blandingen ved stuetemperatur i 15 min.
- At stoppe transformationen, langsomt tilføje 400 µL af W5 løsning til 1,5 mL tube ved stuetemperatur og forsigtigt invertere røret indtil løsningen bliver homogen. Centrifugeres tube på 100 g i 1-2 min. ved stuetemperatur og supernatanten ved hjælp af en pipette.
- Der tilsættes 1 mL af WI løsning (tabel 1) til røret og resuspend af forsigtigt pipettering 1 - 2 gange. Tilsættes 1 mL 5% (vol/vol) sterile kalveserum i hver brønd med en 6-godt vævskultur plade til pels overfladen og forhindre protoplasts klistrer til pladen.
- Efter et par sekunder, kassere kalveserum ved hjælp af en pipette. Overføre de resuspenderede protoplasts i en brønd i kultur-pladen. Dække pladen med et låg.
5. protoplast inkubation og høst
- Inkubér protoplasts ved stuetemperatur i 1-2 dage i mørke.
Bemærk: Vi fandt, at to-dages inkubation udbytter stærkere fluorescerende proteiner signal generelt i forhold til en-dages inkubation, og at de fluorescerende proteiner signal kan vare i op til 3-4 dage. - Protoplast opløsning overføres til en 1,5 mL lav friktion microcentrifuge tube. Der centrifugeres tube på 100 x g i 1-2 min. ved stuetemperatur til at høste protoplasts. Fjern supernatanten ved hjælp af en pipette og overføre 10 µL protoplasts på en glas dias.
- Observere fluorescerende signal under fluorescens eller Konfokal mikroskopi. Bruge ikke-transformeret protoplasts som negativ kontrol (ingen signal skal overholdes).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Forskellige organer i 10 - dage gamle sojabønner blev testet for protoplast forberedelse (figur 1) og udbyttet blev observeret under mikroskop (figur 2). Cellevægge fra hypocotyl og epicotyl var næppe fordøjes, og nogle celler blev knyttet til hinanden (figur 2B, 2 C). I Kimblad (figur 2D) og root (figur 2A), blev cellevægge fjernet kun i en lille del af cellerne. Derimod en lang række protoplasts blev observeret når unifoliate blev brugt (figur 2E-G). Unifoliate blade på forskellige udviklingsstadier blev yderligere undersøgt (figur 2 H). Mens begge uudvidede og bare udvidet unifoliate bladene resulteret i høje udbytter af protoplasts, størrelsen af protoplasts fra den netop udvidet unifoliate var mere ensartet (figur 2F) end den uudvidede unifoliate (figur 2E). For de fuldt udbygget unifoliate, cellevægge var stadig intakt i de fleste af cellerne (fig. 2 g). Vi testede cellevæg-fordøjelse enzymer fra tre forskellige producenter og opnåede sammenlignelige resultater, som beskrevet ovenfor. Baseret på disse observationer, konkluderede vi, at udvælgelsen af plantematerialer var en afgørende faktor og at netop udvidet unifoliate blade fra unge sojabønner frøbedsplanter var det bedste materiale til protoplast forberedelse.
En vifte af forskellige mængder af plasmid DNA (0,1 µg, 1 µg, 5 µg og 20 µg) blev testet for optimal transformation effektivitet af sojabønner unifoliate protoplasts (figur 3A-D). 20 µg plasmid DNA viste de højeste transformation effektivitet med mere end 50% omdannelse sats (figur 3D), mens 0,1 µg viste den laveste (mindre end 1%) (Figur 3A). Vi opnåede sammenlignelige transformation effektivitet ved hjælp af forskellige DNA oprensning kits fra tre producenter. Dette resultat tyder på, at større mængder af plasmid DNA høj grad vil bidrage til at øge transformation effektivitet.
Figur 4 er Konfokal billeder af sojabønner protoplasts omdannet med konstruere p2GWF7-E1, som udtryk for normal god landbrugspraksis smeltet til bælgplanter-specifikke gen E1 (Glyma.06G207800), drevet af CaMV 35S -promotoren i vektor p2GWF7 39. E1-normal god landbrugspraksis fusion protein viser nukleare lokalisering i sojabønner protoplasts, som er i overensstemmelse med en tidligere undersøgelse ved hjælp af Arabidopsis protoplast system40. E1 er en bælgplante-specifikke gen, indeholder vores resultat ved hjælp af sojabønner protoplast system en afgørende indsigt i subcellulært lokaliseringen af E1 protein.
Figur 1. Illustration, der viser organer af en sojabønne sætteplante, der testes for protoplast forberedelse i denne undersøgelse, herunder rod, hypocotyl, Kimblad, epicotyl og unifoliate. Efter et par unifoliate blade udvikle sojabønner planter trifoliate blade. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Protoplast celler fremstillet af forskellige organer og udviklingsstadier af sojabønner frøplanter. (A-D) Celler fremstillet af forskellige organer i 10 - dage gamle sojabønner stiklinger: root (A), hypocotyl (B), epicotyl (C), Kimblad (D). (E-G) Protoplast celler fremstillet af unifoliate blade på forskellige udviklingsstadier: uudvidede (E), netop udvidet (F), og fuldt udvidet (G) unifoliate, svarende til sojabønner stiklinger i (H) venstre, midterste og højre, henholdsvis. Skalalinjen er 25 µm (A-G) eller 25 mm (H). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Konfokal billeder viser transformation effektivitet af sojabønner unifoliate protoplasts med forskellige mængder af plasmid DNA. Billeder af normal god landbrugspraksis (repræsenteret i grønt) og lyse felt (grå) flettes. Protoplasts blev omdannet med forskellige mængder af plasmidet p2GWF7-E1: 0,1 µg (A), 1 µg (B), 5 µg c og 20 µg (D). Fluorescens signal af normal god landbrugspraksis var overvåget 24 timer efter transformation under mikroskopi. Sort skalalinjen er 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Konfokal billeder viser den subcellulært lokalisering af E1-normal god landbrugspraksis i kernen af sojabønner unifoliate protoplasts. Plasmidet p2GWF7-E1 blev brugt til transformation. Billeder af normal god landbrugspraksis (repræsenteret i grønt) og lyse felt (grå) flettes. Fluorescens signal af normal god landbrugspraksis var overvåget 24 timer efter transformation. Sort skalalinjen er 5 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Enzym løsning (frisklavet) | |
| MES, pH 5.7 | 20mM |
| Cellulase CELF | 2% (w/v) |
| Pectolyase Y-23 | 0,1% (w/v) |
| Mannitol | 0,75 M |
| CaCl2 | 0.2 mM |
| BSA | 0,1% (w/v) |
| DTT | 0,5 mM |
| W5 løsning | |
| NaCl | 154 mM |
| CaCl2 | 125 mM |
| KCl | 5 mM |
| MES, pH 5.7 | 2 mM |
| MMg løsning | |
| MES, pH 5.7 | 4 mM |
| Mannitol | 400 mM |
| MgCl2 | 15 mM |
| PIND løsning (frisklavet) | |
| PEG4000 | 20% (w/v) |
| Mannitol | 200 mM |
| CaCl2 | 100 mM |
| WI løsning | |
| MES, pH 5.7 | 4 mM |
| Mannitol | 0,5 M |
| KCl | 20 mM |
Tabel 1. Løsninger anvendes til sojabønner protoplast isolation og transformation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol til isolering af sojabønner protoplasts og programmet til forbigående udtryk undersøgelser er blevet grundigt testet og virker meget godt i vores laboratorium. Procedurerne, der er enkel og let og kræver almindelige udstyr og minimale omkostninger. Vores protokol giver store mængder af ensartet, høj kvalitet protoplasts i forhold til tidligere rapporteret metoder34,35,36,37,38. Da der er mange faktorer, der påvirker protoplast udbytter og transformation satser, anbefales det dog kraftigt for forskere at optimere betingelserne efter deres forsøgsbetingelser, ønskelig resultater og anvendte materialer. Dette system er meget nyttige for undersøgelsen af øjeblikkelige lovgivningsmæssige og biokemiske begivenheder i plantecellerne, men det er ikke egnet til observation af langsigtede cellulære processer og hændelser, der opstår i væv eller kropsligt niveauer.
Vi fandt, at udvælgelsen af kraftigt voksende plantematerialer på en ideel udviklingsstadiet var den mest afgørende faktor i sojabønner protoplast forberedelse. Det bestemmer ikke kun udbyttet af protoplasts, men kvaliteten, der påvirker den efterfølgende DNA transformation. Det er vigtigt at altid dyrke sojabønner planter i en konstant miljø væk fra stress, såsom tørke, oversvømmelser, ekstreme temperaturer eller skadedyr. Den højeste protoplast udbytte og transformation effektivitet kan opnås ved hjælp af bare udvidet unifoliate blade fra unge frøplanter. For begyndere, er det foreslået at bruge unifoliate blade på forskellige udviklingsstadier og gøre en sammenligning til at opnå de bedste resultater.
Protoplast/DNA-forholdet er en vigtig faktor for optimal transformation effektivitet. Det er normalt bedst at starte med forholdet mellem 2 x 104 protoplasts/10-20 µg DNA, men optimering af ratio for individuelle konstruktioner anbefales25. Brug af høj kvalitet DNA fremkommer ved en DNA rensning kit anbefales kraftigt.
For valg af vektorer for forbigående udtryk i protoplasts er high-kopi nummer og små vektorer generelt foretrækkes. Selv om binær vektorer for Agrobacterium tumefaciens-medieret transformation af planter kan anvendes til protoplast transformation, den store størrelse af disse vektorer kan resultere i mindre optimal transformation effektivitet. For normal god landbrugspraksis-fusion protein udtryk, vi plejer at bruge vektorer, som ikke besidder udvalg markør for planter og er således forholdsvis små (6-7kb), såsom p2GWF7 og p2FGW739 (https://gateway.psb.ugent.be).
Flere vektorer kan bruges til at transformere protoplasts samtidigt. Vi havde succes i at udtrykke BiFC vektorer for afprøvning protein-protein interaktioner, samt flere fluorescerende proteiner for organelle og subcellulært mærkning i sojabønner protoplasts. Desuden, enkelhed og stort udbytte af vores metode tilbyder et ideelt system til undersøgelse af lovgivningsmæssige og biokemiske begivenheder, gen-targeting vektor design, isolation af forbigående udtrykte proteiner og protein kompleks, og rensning af specifikke organelle som kerner, så yderligere applikationer til at opstå genomisk og proteom tilgange.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af plante Genome Research Program fra National Science Foundation (NSF-PGRP-IOS-1339388).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES | Sigma Aldrich | M8250-100G | |
| Cellulase CELF | Worthington Biological Corporation | LS002611 | |
| Pectolyase Y-23 | BioWorld | 9033-35-6 | |
| CELLULASE "ONOZUKA" R-10 | yakult | 10g | |
| MACEROZYME R-10 | yakult | 10g | |
| Mannitol | ICN Biomedicals | 152540 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500g | |
| BSA | NEB | R3535S | |
| DTT | Sigma Aldrich | D5545-5G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653-1kg | |
| KCl | Fisher | P217-500g | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100g | |
| PEG4000 | Fluka | 81240 | |
| nylon mesh | carolina | 652222N | |
| Tissue Culture Plates | USA Scientific | CC7682-7506 | |
| Razor Blades | Fisher | 12-640 | |
| hemacytometer | hausserscientific | 1483 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| EZNA plasmid miniprep kit | Omega | D6942-01 | |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Thermo Scientific | K0502 | |
| Centrifuge 5810 | eppendorf | 5811000827 | |
| Centrifuge 5424 | eppendorf | 22620401 | |
| Jencons Powerpette Plus Pipet Controller | Jencons | 14526-202 | |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | N/A | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12450 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1018-P | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1060-P | |
| Newborn Calf Serum | Thermo Scientific | 16010159 | |
| Soil | Ingram's Nursery | ||
| perlite | Vigoro | 100521091 | |
| Torpedo Sand | JKS Ventures | ||
| LB Broth, Lennox (Powder) | Fisher | BP1427-500 |
References
- Melchers, G., Labib, G. Somatic hybridisation of plants by fusion of protoplasts. Mol. Gen. Genet. 135 (4), 277-294 (1974).
- Gresshoff, P. M. In vitro culture of white clover: callus, suspension, protoplast culture, and plant regeneration. Bot. Gaz. 141 (2), 157-164 (1980).
- Lörz, H., Baker, B., Schell, J. Gene transfer to cereal cells mediated by protoplast transformation. Mol. Gen. Genet. 199 (2), 178-182 (1985).
- Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants. Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).
- Koop, H. -U., et al. Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation. Planta. 199 (2), 193-201 (1996).
- Hrazdina, G., Wagner, G. J., Siegelman, H. W. Subcellular localization of enzymes of anthocyanin biosynthesis in protoplasts. Phytochemistry. 17 (1), 53-56 (1978).
- Lin, W., Wittenbach, V. A. Subcellular localization of proteases in wheat and corn mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 67 (5), 969-972 (1981).
- Vögeli-Lange, R., Wagner, G. J. Subcellular localization of cadmium and cadmium-binding peptides in tobacco leaves. Plant Physiol. 92 (4), 1086-1093 (1990).
- Chen, S., et al. A highly efficient transient protoplast system for analyzing defence gene expression and protein-protein interactions in rice. Mol. Plant Pathol. 7 (5), 417-427 (2006).
- Wu, F. -H., et al. Tape-Arabidopsis Sandwich-a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant methods. 5 (1), 16 (2009).
- Christensen, A. H., Sharrock, R. A., Quail, P. H. Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation. Plant Mol. Biol. 18 (4), 675-689 (1992).
- Marcotte, W. R., Bayley, C. C., Quatrano, R. S. Regulation of a wheat promoter by abscisic acid in rice protoplasts. Nature. 335 (6189), 454-457 (1988).
- Dron, M., Clouse, S. D., Dixon, R. A., Lawton, M. A., Lamb, C. J. Glutathione and fungal elicitor regulation of a plant defense gene promoter in electroporated protoplasts. P. Natl. A. Sci. USA. 85 (18), 6738-6742 (1988).
- Cocking, E. A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles. Nature. 187 (4741), 962-963 (1960).
- Zhang, H., et al. Transgenic rice plants produced by electroporation-mediated plasmid uptake into protoplasts. Plant Cell Rep. 7 (6), 379-384 (1988).
- Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation. P. Natl. A. Sci. USA. 82 (17), 5824-5828 (1985).
- Crossway, A., et al. Integration of foreign DNA following microinjection of tobacco mesophyll protoplasts. Mol. Gen. Genet. 202 (2), 179-185 (1986).
- Holm, P. B., Olsen, O., Schnorf, M., Brinch-Pedersen, H., Knudsen, S. Transformation of barley by microinjection into isolated zygote protoplasts. Transgenic Res. 9 (1), 21-32 (2000).
- Schapire, A. L., Lois, L. M. A simplified and rapid method for the isolation and transfection of Arabidopsis leaf mesophyll protoplasts for large-scale applications. Plant Signal Transduction: Methods and Protocols. 1363, 79-88 (2016).
- Niedz, R. P. Regeneration of somatic embryos from sweet orange (C. sinensis) protoplasts using semi-permeable membranes. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 84 (3), 353-357 (2006).
- Sheng, X., et al. Protoplast isolation and plant regeneration of different doubled haploid lines of cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis). Plant Cell Tiss. Org. 107 (3), 513-520 (2011).
- Grun, P., Chu, L. -J. Development of plants from protoplasts of Solanum (Solanaceae). Am. J. Bot. 65 (5), 538-543 (1978).
- Davey, M. R., Anthony, P., Power, J. B., Lowe, K. C. Plant protoplasts: status and biotechnological perspectives. Biotechnol. Adv. 23 (2), 131-171 (2005).
- Pitzschke, A., Persak, H. Poinsettia protoplasts-a simple, robust and efficient system for transient gene expression studies. Plant methods. 8 (1), 14 (2012).
- Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565 (2007).
- Sedivy, E. J., Wu, F., Hanzawa, Y. Soybean domestication: the origin, genetic architecture and molecular bases. New Phytol. 214 (2), 539-553 (2017).
- Yang, Y., Li, R., Qi, M. In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinfiltration of tobacco leaves. Plant J. 22 (6), 543-551 (2000).
- Marion, J., et al. Systematic analysis of protein subcellular localization and interaction using high-throughput transient transformation of Arabidopsis seedlings. Plant J. 56 (1), 169-179 (2008).
- Wu, H. -Y., et al. AGROBEST: an efficient Agrobacterium-mediated transient expression method for versatile gene function analyses in Arabidopsis seedlings. Plant methods. 10 (1), 19 (2014).
- Govindarajulu, M., Elmore, J. M., Fester, T., Taylor, C. G. Evaluation of constitutive viral promoters in transgenic soybean roots and nodules. Mol Plant Pathol. 21 (8), 1027-1035 (2008).
- Nagamatsu, A., et al. Functional analysis of soybean genes involved in flavonoid biosynthesis by virus-induced gene silencing. Plant Biotechnol. J. 5 (6), 778-790 (2007).
- Juvale, P. S., et al. Temporal and spatial Bean pod mottle virus-induced gene silencing in soybean. Mol. Plant Pathol. 13 (9), 1140-1148 (2012).
- Zhang, C., Bradshaw, J. D., Whitham, S. A., Hill, J. H. The development of an efficient multipurpose bean pod mottle virus viral vector set for foreign gene expression and RNA silencing. Plant Physiol. 153 (1), 52-65 (2010).
- Lin, W. Isolation of mesophyll protoplasts from mature leaves of soybeans. Plant Physiol. 73 (4), 1067-1069 (1983).
- Yi, J., et al. A single-repeat MYB transcription factor, GmMYB176, regulates CHS8 gene expression and affects isoflavonoid biosynthesis in soybean. Plant J. 62 (6), 1019-1034 (2010).
- Faria, J. A., et al. The NAC domain-containing protein, GmNAC6, is a downstream component of the ER stress-and osmotic stress-induced NRP-mediated cell-death signaling pathway. BMC Plant Biol. 11 (1), 129 (2011).
- Kidokoro, S., et al. Soybean DREB1/CBF-type transcription factors function in heat and drought as well as cold stress-responsive gene expression. Plant J. 81 (3), 505-518 (2015).
- Sun, X., et al. Targeted mutagenesis in soybean using the CRISPR-Cas9 system. Sci Rep-UK. 5, 10342 (2015).
- Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. GATEWAY™ vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).
- Xia, Z., et al. Positional cloning and characterization reveal the molecular basis for soybean maturity locus E1 that regulates photoperiodic flowering. P. Natl. A. Sci. USA. 109 (32), E2155-E2164 (2012).
