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Genetics

Caenorhabditis एलिगेंस में Ploidy का हेरफेर

Published: March 15, 2018 doi: 10.3791/57296
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,3, 1,2,3
1Brooklyn College, Biology Department, City University of New York, 2The Graduate Center, Biology Department, City University of New York, 3Advanced Science Research Center, City University of New York

Summary

यह विधि किसी भी द्विगुणित तनाव से tetraploid और triploid Caenorhabditis सूत्रकृमि की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है । इस विधि द्वारा उत्पंन Polyploid उपभेदों meiotic दौर में गुणसूत्र बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, और इस विधि सेल, विकास, विकासवादी, और कैंसर जीव विज्ञान में महत्वपूर्ण बुनियादी सवालों की जांच के लिए उपयोगी है ।

Abstract

तंत्र है कि पूरे जीनोम polyploidy शामिल विकास में महत्वपूर्ण भूमिकाओं और विकास; इसके अलावा, tetraploid कोशिकाओं की एक असामांय पीढ़ी के दोनों कैंसर की प्रगति और दवा प्रतिरोध के विकास के साथ जुड़ा हुआ है । अब तक, यह संभव नहीं किया गया है आसानी से ज्यादातर बाँझ संतान पैदा करने के बिना एक कोशिकीय जानवर के ploidy में हेरफेर करने के लिए. यहां प्रस्तुत किसी भी द्विगुणित तनाव से tetraploid Caenorhabditis एलिगेंस पशुओं को पैदा करने के लिए एक सरल और तेजी से प्रोटोकॉल है । इस विधि अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान गुणसूत्र अलगाव में एक पूर्वाग्रह बनाने के लिए उपयोगकर्ता की अनुमति देता है, अंततः सी. एलिगेंसमें ploidy बढ़ रही है । यह रणनीति आरईसी-8 जीन की अभिव्यक्ति के क्षणिक कमी को द्विगुणित gametes उत्पंन करने पर निर्भर करता है । एक आरईसी-8 उत्परिवर्ती कि संभावित निषेचन पर tetraploids उत्पादन कर सकते है द्विगुणित gametes पैदा करता है । इस योजना के लिए tetraploid उपभेदों उत्परिवर्तनों और गुणसूत्र पुनर्व्यवस्थाओं ले जाने के लिए गुणसूत्र गतिशीलता और अर्धसूत्रीविभाजन में synapsis के दौरान और बातचीत में अंतर्दृष्टि लाभ उत्पंन किया गया है । इस विधि आनुवंशिक मार्करों के बिना स्थिर tetraploid उपभेदों पैदा करने के लिए कुशल है, किसी भी द्विगुणित तनाव के लिए लागू किया जा सकता है, और triploid सी. एलिगेंसप्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह सरल विधि जीनोम अस्थिरता, जीन खुराक, जैविक स्केलिंग, extracellular संकेतन, तनाव के लिए अनुकूलन, दवाओं के लिए प्रतिरोध के विकास के लिए प्रासंगिक अंय मौलिक जैविक प्रश्नों की जांच के लिए उपयोगी है, और speciation के तंत्र ।

Introduction

पूरे जीनोम polyploidy प्रकृति भर में मौजूद है और अक्सर अनुकूलन, speciation, organogenesis, घाव भरने, और जैविक स्केलिंग में एक आवश्यक कदम है; यह भी ड्रग्स के लिए कैंसर और प्रतिरोध दोनों को बढ़ावा देने के लिए जाना जाता है1,2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12. कृषि और मत्स्य उद्योग रासायनिक उपचार (जैसे, colchicine और orzalin) द्वारा polyploid पौधों, मछली, और शंख उत्पन्न करने के लिए तेजी से वृद्धि दर और bulkier फसलों और पशुधन13प्राप्त करने के लिए, 14,15. tetraploids के प्रायोगिक और अक्षम उत्पादन माउस और zebrafish मॉडल सिस्टम16,17के लिए मौजूद है । हालांकि, सबसे या सभी polyploid कोशिकीय पशुओं उत्पंन भ्रूण घातक या बाँझ है और इस प्रकार एक कोशिकीय जीव में polyploidy के प्रभाव पर प्रयोगशाला अध्ययन के लिए आदर्श नहीं है । नतीजतन, कोशिकीय जीवों में पूरे जीनोम polyploidization की किसी भी समझ को विकासवादी हाल के polyploidization घटनाओं से निकटता से संबंधित प्रजातियों तक ही सीमित कर दिया गया है18,19,20 . polyploidization की जैविक भूमिका या परिणामों की अग्रिम प्रश्नों के लिए एक मार्ग C. एलिगेंस मॉडल सिस्टम का उपयोग है । महत्वपूर्ण बात, सी. एलिगेंस एक परितंत्रीय आनुवंशिक प्रणाली है कि आम तौर पर एक द्विगुणित के रूप में मौजूद है, केवल पांच कुछ (एक) और एक सेक्स गुणसूत्र (जीनोम के प्रति एक्स), पारदर्शी है vivo में जैविक प्रक्रियाओं के अवलोकन के लिए अनुमति शामिल है, और 3-4 दिनों के एक छोटे से जीवन चक्र है (अंडे से यौन परिपक्व वयस्क के लिए) । C. एलिगेंस एक tetraploid, जो प्रकृति में पूरे जीनोम polyploidy का सबसे आम प्रकार है के रूप में पुन: पेश करने में सक्षम होने के लिए दिखाया गया है । Triploid पशुओं को diploids के साथ tetraploids पार करके उत्पन्न किया जा सकता है, लेकिन उनका ploidy स्थिर नहीं होता है, और तनावों से कुछ पीढ़ियों के भीतर द्विगुणित हो जाता है.

पिछले कुछ दशकों में ही व्यवहार्य और उपजाऊ सी एलिगेंस tetraploids उपभेदों के एक मुट्ठी भर प्रयोगशाला में अलग-थलग थे, एक रणनीति है कि श्रमसाध्य है और केवल सीमित प्रकार के उपभेदों उत्पंन का उपयोग कर21,22, 23. यह रणनीति गर्मी-सदमे उपचार, जो संभवतः gametes में गुणसूत्र अलगाव को प्रभावित करता है द्वारा सी. एलिगेंस tetraploids उत्पंन, ख्यात polyploid आनुवंशिक मार्कर का उपयोग पशुओं के लिए एक स्क्रीनिंग के बाद । ये tetraploids की पूछताछ में बेहद उपयोगी थे कि कैसे यह निमेटोड निर्धारित करती है कि पुरुष या द्विलिंग बनने के लिए. बाद में अध्ययन उपलब्ध उपभेदों के विकास, जीन खुराक की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया, और इस निमेटोड में अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान synapsis के विनियमन21,24,25,26। दुर्भाग्य से, इन अध्ययनों से नए tetraploid उपभेदों और पृष्ठभूमि आनुवंशिक मार्करों इन उपभेदों समाहित पैदा करने में कठिनाई द्वारा सीमित थे । यहां दिखाया गया है एक सरल और रैपिड प्रोटोकॉल स्थिर tetraploids, जो अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान synapsis के विनियमन अध्ययन करने के लिए उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है उत्पंन करने के लिए27।

प्रकृति के रूप में, polyploidization अगुणित gametes के बजाय द्विगुणित के गठन से पैदा कर सकते हैं । हमारी खोज है कि एक अर्धसूत्रीविभाजन-विशिष्ट cohesin घटक उत्परिवर्ती आरईसी-8 द्विगुणित शुक्राणु उत्पन्न करता है और अंडाणुओं संकेत दिया कि नीचे दस्तक आरईसी-8 जीन tetraploid संतति के उत्पादन में परिणाम होगा (चित्रा 1)27, 28,29. सृजन tetraploid उपभेदों बस नीचे दस्तक आरईसी-8 आरएनए हस्तक्षेप (RNAi) द्वारा दो पीढ़ियों के लिए आरईसी-8 उत्परिवर्ती द्विगुणित gametes phenocopy करने के लिए शामिल है । ख्यात polyploids आसानी से उनके सामांय शरीर के आकार से अधिक की पहचान की जा सकती है । Polyploids नाभिक प्रति गुणसूत्रों की संख्या एक बार स्थिर लाइनें स्थापित कर रहे है गिनती द्वारा पूर्ण या आंशिक tetraploids के रूप में पुष्टि कर रहे हैं ।

यहां बताई गई रणनीति आनुवंशिक मार्कर के उपयोग के बिना किसी भी आरंभिक द्विगुणित आनुवंशिक पृष्ठभूमि या कैरयोटाइप से स्थिर tetraploid Caenorhabditis निमेटोड उपभेदों की पीढ़ी को सक्षम बनाती है । चूंकि इस प्रोटोकॉल और अधिक कुशल, बहुमुखी है, और पहले से इस्तेमाल किया योजना से सरल, यह विकास, जीनोम स्थिरता, और विकास की मौलिक प्रक्रियाओं में polyploidization की भूमिकाओं क्वेरी करने के लिए आवश्यक उपकरणों का विस्तार होगा कोशिकीय जीवों. इस प्रोटोकॉल के उपयोग में केवल निकट सीमा आनुवंशिक RNAi के लिए प्रतिरोधी पृष्ठभूमि में है ।

Protocol

1. आरईसी की स्थापना -8 RNAi ( चित्रा 2में दिवस 1-3)

इस प्रोटोकॉल को कामथ और Ahringer30से संशोधित किया गया है ।

  1. ई कोलाईमें आरईसी-8 dsRNA अभिव्यक्ति की प्रेरण के लिए, तैयार निमेटोड विकास मध्यम (NGM) आगर प्लेटें31 1 मिमी isopropyl की एक अंतिम एकाग्रता के साथ पूरक-β-डी-2-thiogalactopyranoside (IPTG) और 100 µ जी/ एम्पीसिलीन. 4 से 4 सप्ताह के लिए उपयोग करते हैं, जब तक चार डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर ।
  2. लकीर HT115 बैक्टीरिया ले जाने आरईसी-8 (w02a 2.6) क्लोन Ahringer प्रयोगशाला पुस्तकालय से30 आरईसी-8 क्लोन पर Luria शोरबा (पौंड) के साथ पूरक प्लेट 100 µ g/एमएल एम्पीसिलीन और 50 µ g/एमएल टेट्रासाइक्लिन । 37 डिग्री सेल्सियस पर एक शेखर में रात भर हो जाना ।
  3. 1 दिन पर, inoculate HT115 ई. कोलाई बैक्टीरिया के हौसले से लकीर एकल कालोनियों से 4 मिलीलीटर पौंड युक्त में आरईसी-8 RNAi क्लोन 100 µ जी/एमएल एम्पीसिलीन और 50 µ जी/एमएल टेट्रासाइक्लिन । एक शेखर में रातोंरात बैक्टीरिया संस्कृति हो जाना या 37 डिग्री सेल्सियस पर एक रोलर ड्रम.
  4. अगली सुबह (2 दिन), आरईसी के लिए डबल कतरा (डी एस) आरएनए का उत्पादन -8 w02a 2.6 HT115 बैक्टीरियल संस्कृति में 1 मिमी IPTG की एक अंतिम एकाग्रता जोड़कर और 37 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट के लिए मिलाते हुए प्रेरित ।
  5. प्रेरण के बाद, बीज NGM/IPTG प्लेटें के साथ 100-200 µ एल के HT115 आरईसी-8 बैक्टीरिया और स्टोर प्लेट रात भर अंधेरे में कमरे के तापमान पर (3 दिन).
  6. अगली सुबह (4 दिन), प्रेरित HT115 आरईसी-8 बैक्टीरिया प्लेटों के लिए वांछित निमेटोड तनाव जोड़ने के रूप में कदम 2.1 नीचे में वर्णित है ।

2. सृजन और अलग Tetraploids ( चित्रा 2में दिन 4-16)

  1. 4 दिन, प्लेस 3-4 युवा L4 (चौथा लार्वा) NMG पर वांछित द्विगुणित तनाव के चरण hermaphrodites/ IPTG आरईसी -8 बैक्टीरिया है कि पहले दिन प्रेरित किया गया था के साथ वरीयता प्राप्त (चरण 1.5, ऊपर) । अंधेरे में 15 डिग्री सेल्सियस पर सूत्रकृमि बढ़ाएँ.
  2. दोहराएँ कदम 1.3 और 1.4 चरण 2.1 के बाद 3 दिनों के शुरू, जो तीन दिन पहले किया जाएगा कि कदम से पहली संतान (F1s) L4s हो. इस कदम के समय कितनी तेजी से एक निमेटोड तनाव 15 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ता पर निर्भर करेगा । कुछ द्विगुणित उत्परिवर्ती उपभेदों धीमी उत्पादकों रहे हैं, और इस समय के लिए tetraploids को अलग करने के लिए ठीक ट्यूनिंग की आवश्यकता होगी ।
  3. 8 दिन पर ( आरईसी-8 RNAi खिला इलाज के 4 दिनों के बाद), हस्तांतरण 20 (2 hermaphrodites/F1 के पेट्री डिश) (पहली filial जनरेशन) L4 hermaphrodites में उगाया HT115 आरईसी-8 बैक्टीरिया हौसले से प्रेरित HT115 आरईसी-8 RNAi पर और अनुमति उंहें स्वयं को निषेचन के लिए ।
    1. वैकल्पिक रूप से, F1 L4 hermaphrodites के 20 हस्तांतरण पर HT115 आरईसी-8 बैक्टीरिया हौसले से प्रेरित HT115 आरईसी पर-8 RNAi बैक्टीरिया एक साथ एक ही तनाव के अनुपचारित पुरुषों के साथ (2 4-6 पुरुषों के साथ hermaphrodites/
  4. 13 दिन, F2 (सेकंड filial जनरेशन) संतति है कि लंबे समय (लंदन) या समग्र जंगली प्रकार से बड़ा दिखाई के लिए स्क्रीनिंग शुरू; तो नियमित OP50 या ई. कोलाई बैक्टीरिया के HB101 उपभेदों पर व्यक्तिगत लंदन जानवरों हस्तांतरण । स्क्रीनिंग F3 (तृतीय filial) संतति जारी रखें; हालांकि, एक ही थाली से F3 संतान अगर वे स्थापित हो जाते हैं, क्योंकि वे एक ही पहले से ही स्थापित F2 मां से भाई बहन हो सकता है स्वतंत्र उपभेदों नहीं माना जा सकता है ।
    नोट: ख्यात tetraploids आसानी से पहचाने जाते हैं क्योंकि ये diploids से स्पष्ट रूप से लंबे होते हैं । जंगली प्रकार hermaphrodites दो तिहाई tetraploids से कम कर रहे हैं । क्योंकि यह लंबे समय तक है, एक tetraploid शरीर एक अतिरिक्त मोड़ बनाता है के रूप में यह सिर से पूंछ को sinusoidal शरीर-झुकने तरंगों पैदा करके आगे चलता है (चित्रा 3) ।
  5. खुद को लंदन कीड़े की अनुमति-निषेचन और केवल लंदन संतान तक लंदन संतान उठा द्वारा प्रचार आरईसी-8 RNAi उपचार के अभाव में sired हैं । इसमें दो से तीन अतिरिक्त पीढ़ियों का समय लग सकता है । लंदन के कीड़े अक्सर बाँझ होते हैं और संतान की उपज नहीं है.

3. पुष्टि Tetraploid उपभेदों (मूवी 1 और चित्रा 3ए, बी)

नोट: उनके निषेचित अंडाणुओं में गुणसूत्रों की संख्या की गिनती करके Tetraploid उपभेदों को मान्य किया जा सकता है । फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी को निषेचित द्विगुणित अंडाणुओं में गुणसूत्र जोड़े की संख्या के लिए स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (meiotic डिवीजनों से पहले), अगर तनाव गुणसूत्रों के लिए एक फ्लोरोसेंट मार्कर है । फ्लोरोसेंट गुणसूत्र मार्कर के अभाव में, tetraploid सूत्रकृमि सूत्रकृमि फिक्सिंग और एक डीएनए डाई के साथ धुंधला द्वारा जांच की जा सकती है; इथेनॉल फिक्सिंग और पूरे के लिए एक प्रोटोकॉल के लिए नीचे देखें-पशु 4 ', 6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) धुंधला ।

  1. पूरे पशु DAPI धुंधला
    नोट: Tetraploid उपभेदों 12 जुड़े गुणसूत्र जोड़े को ले जाने DAPI द्वारा मान्य किया जा सकता है इन जानवरों धुंधला और इसके unनिषेचित अंडाणुओं में DAPI निकायों की संख्या की गिनती.
    1. जगह 5 से 10 µ l का M9 बफर31 को एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर, फिर 6-10 सूत्रकृमि को ड्राप पर ट्रांसफर करें ।
    2. एक एक प्रकार का वृक्ष-मुक्त ऊतक के साथ सूत्रकृमि को हटाने के बिना ड्रॉप से M9 के अधिकांश आकर्षित एक विदारक खुर्दबीन के नीचे । फिर, तुरंत कीड़े पर 90% इथेनॉल के एक 10 µ एल ड्रॉप जोड़ें । कीड़े पूरी तरह से शुष्क करने के लिए अनुमति देते हैं, लेकिन सेकंड के एक जोड़े से अधिक नहीं के लिए ।
    3. जैसे ही इथेनॉल के रूप में लुप्त हो जाती है (यह देखा जा सकता है के रूप में यह विदारक माइक्रोस्कोप के तहत होता है), कीड़े पर 90% इथेनॉल के एक अतिरिक्त 10 µ एल जोड़ें ।
    4. दोहराएं कदम 3.1.3 तीन बार ।
    5. एक बार इथेनॉल की आखिरी बूंद काफूर हो गई है, पसंद के बढ़ते मीडिया में अनुशंसित अंतिम एकाग्रता में DAPI या Hoechst डाई के 6 µ एल जोड़ने के लिए (उदाहरण के लिए, एक 1:1000 कमजोर पड़ने के एक 2 एनजी/µ एल DAPI शेयर एकाग्रता में M9) । स्लाइड के दीर्घकालिक भंडारण के लिए, 0.5% पी-phenylenediamine 20 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच 8.8 में भंग, 90% ग्लिसरॉल में एक antifade समाधान के रूप में, केवल M9 के बजाय, इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    6. एक coverslip के साथ स्लाइड पर कीड़े कवर और नेल पॉलिश के साथ coverslip के किनारों सील । एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप में स्कोर (step 3.1.7) coverslip को जोड़ने के बाद कम से 10 min. antifade के बिना स्लाइड स्कोरिंग से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर कुछ दिनों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है, लेकिन प्रतिदीप्ति की गुणवत्ता कुछ दिनों के बाद गिरावट शुरू होता है ।
    7. 100X आवर्धन पर एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का प्रयोग, स्कोर एकल DAPI निकायों की संख्या (संभवतः एकल गुणसूत्र जोड़े) सबसे परिपक्व में निषेचित oocyte, जो तुरंत spermatheca के निकट है और अभी तक spermatheca में प्रवेश नहीं किया है या गर्भाशय ।
      1. एक oocyte नाभिक के भीतर व्यक्तिगत DAPI निकायों स्कोर करने के लिए, माइक्रोस्कोप के ठीक ध्यान oocyte नाभिक के ऊपर से नीचे करने के लिए गिनती के दौरान नीचे से स्थानांतरित करने के लिए उपयोग करें । फिर, एक ही नाभिक की गणना करते हुए विपरीत दिशा में ध्यान केंद्रित करते हुए (यानी, नीचे से नाभिक के ऊपर तक) DAPI निकायों की गिनती की संख्या की पुष्टि करने के लिए ।
    8. दो gonads में से प्रत्येक में सबसे अधिक परिपक्व oocyte स्थिर लंदन तनाव प्रति कम से दस hermaphrodites में स्कोर । जंगली प्रकार अंडाणुओं औसत पर 6 DAPI निकायों है, 5 कुछ जोड़े, और सेक्स गुणसूत्र जोड़ी । स्थिर लंदन उपभेदों के oocyte में 12 DAPI निकायों की उपस्थिति इंगित करता है कि इस तनाव में पशुओं या तो आंशिक रहे है (कुछ, 3 एक्स गुणसूत्रों के 4 सेट) या पूर्ण (कुछ, 4 एक्स गुणसूत्रों के 4 सेट) tetraploids ।
    9. DAPI से मनाया निकायों की औसत संख्या की गणना एकाधिक (से कम 10) अंडाणुओं प्रति तनाव । कुछ गुणसूत्र जोड़े छू जाएगा या सही एक दूसरे के शीर्ष पर है, तो एक oocyte में DAPI निकायों की संख्या अक्सर गुणसूत्र जोड़े की वास्तविक संख्या से छोटी है ।
    10. वैकल्पिक) इसके अलावा स्थिर लंदन उपभेदों जहां DAPI निकायों की औसत संख्या 12 है परीक्षण के लिए कि क्या वे (4a, 4x) या आंशिक (4a, 3x) HTP-332जैसे गुणसूत्र अक्ष प्रोटीन के खिलाफ दाग इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा tetraploids है मांय । यह दाग एक cruciform पैटर्न आंशिक tetraploid में मौजूद एकल unconnected गुणसूत्रों से दिखाकर गुणसूत्र जोड़े भेद जाएगा ।

Representative Results

आरईसी-8 Meiotic Cohesin घटक समारोह के परिणाम में द्विगुणित Gametes:

cohesin घटक उत्परिवर्ती आरईसी के meiotic डिवीजनों की इमेजिंग -8 शुक्राणु और अंडाणुओं tetraploid पशुओं पैदा करने के लिए संभव तंत्र से पता चला (चित्रा 1)27,29,33। Mechanistically, आरईसी के meiotic विभाजन दोष -8 उत्परिवर्ती शुक्राणु और oocyte अलग हैं; हालांकि, पुरुष और महिला दोनों द्विगुणित gametes आरईसी-8 उत्परिवर्ती द्वारा उत्पादित कर रहे हैं ।

जंगली प्रकार अर्धसूत्रीविभाजन में, मुताबिक़ गुणसूत्रों अस्थाई रूप से अंतरराष्ट्रीय पुनर्संयोजन द्वारा एक दूसरे से जुड़ा हुआ है और एक इकाई या bivalent (आंकड़ा 1a)34के रूप में पहली meiotic विभाजन दर्ज करें । पहली श्रेणी के दौरान, मुताबिक़ गुणसूत्रों (homologs) एक दूसरे से दूर अलग है, जबकि एक homolog में बहन chromatids दूसरे विभाजन तक एक साथ रहना । हालांकि गुणसूत्र अलगाव के पैटर्न महिला और पुरुष gametes में एक ही है, oocyte डिवीजनों असममित हैं, जबकि spermatocyte विभाजन सममित है और एक विशेष cytokinesis से गुजरना । प्रत्येक प्रभाग में, oocyte एक छोटे ध्रुवीय शरीर में विभाजन उत्पाद के आधे त्याग । इस प्रकार, प्रत्येक oocyte अग्रदूत एक एकल अगुणित oocyte और दो ध्रुवीय निकायों को जन्म देता है (चित्र 1b, C)35. इसके विपरीत, एक एकल spermatocyte अग्रदूत दो सममित विभाजन के दौर से गुजर चार कार्यात्मक spermatids को जंम देता है । दूसरी डिवीजन चार एक अवशिष्ट शरीर से दूर नवोदित spermatids के साथ समापन । यह cytokinesis है कि पैटर्न और spermatids की संख्या centrosomes36द्वारा निर्धारित किया जाता है में विशेष है ।

आरईसी-8 उत्परिवर्ती gametes के अग्रदूत में, मुताबिक़ गुणसूत्रों के बीच अंतरराष्ट्रीय पुनर्संयोजन जगह नहीं लेता है और homologs पहली meiotic डिवीजन29,34की शुरुआत में एक bivalent के रूप में जुड़े नहीं हैं । बहन प्रत्येक homolog के chromatids के बजाय एक दूसरे विभाजन तक शेष के पहले विभाजन में एक दूसरे से दूर अलग, के रूप में वे जंगली प्रकार gametes में है । दिलचस्प है, आरईसी-8 उत्परिवर्ती phenotype दूसरे विभाजन के दौरान पुरुष और महिला gametes में अलग है कि अंडाणुओं में cytokinesis जबकि spermatocytes एक अपेक्षाकृत सामांय cytokinesis से गुजरना करने में विफल (आंकड़ा 1b- च) 27 , 28 , 29. द्विगुणित अंडाणुओं उठता है क्योंकि दूसरी डिवीजन में वे दोनों गुणसूत्र अलगाव और cytokinesis विफल, इसलिए वे दूसरे ध्रुवीय शरीर (आंकड़ा 1b, सी) बाहर निकालना नहीं है । Spermatocytes में आरईसी-8 germlines spermatid नवोदित या cytokinesis से गुजरना है, लेकिन अक्सर एक spermatids उपज के लिए गुणसूत्रों के दोनों सेट अलग से एक द्विगुणित spermatid और एक spermatid कमी क्रोमेटिन (चित्रा 1 डी- च)27. आरईसी के अनुपात की ठहराव -8 शुक्राणु कमी क्रोमेटिन चित्रा 1Fमें दिखाया गया है ।

आरईसी-8 म्यूटेंट में महिला और पुरुष द्विगुणित gametes के गठन का सुझाव दिया है कि इस उत्परिवर्ती phenotype संभावित पूर्ण जीनोम tetraploid उपभेदों उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Tetraploid C. एलिगेंस उपभेदों की पीढ़ी:

सभी जनित tetraploid उपभेदों में आरईसी-8 जीन में उत्परिवर्तन की उपस्थिति RNAi29,37द्वारा क्षणिक आरईसी-8 दस्तक द्वारा बचा जा सकता है । यह मानता है कि आरईसी-8 समारोह की कमी RNAi द्वारा द्विगुणित gametes कि संभवतः पूरे जीनोम tetraploid पशुओं को जंम दे सकता है उत्पंन होता है, के रूप में आरईसी-8 म्यूटेंट29,37। इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक है कि आरईसी-8 म्यूटेंट दोनों को द्विगुणित gametes को जंम दे और युवा की एक हद तक बड़ी संख्या में, अंय meiotic म्यूटेंट, जो aneuploid gametes को जंम देने के विपरीत है और ज्यादातर बाँझ या भ्रूण है/लार्वा घातक ।

एकाधिक tetraploid उपभेदों खिला सी एलिगेंस बैक्टीरिया आरईसी-8 dsRNA व्यक्त दो रणनीतियों में से एक का उपयोग कर ( प्रोटोकॉल, चित्रा 2, और तालिका 1)27को देखने के द्वारा उत्पंन किया गया । Tetraploids आरईसी-8 dsRNA व्यक्त बैक्टीरिया के साथ पेट्री व्यंजन में दो से तीन पीढ़ियों के लिए स्व-निषेचन hermaphrodites द्वारा उत्पंन किया जा सकता है । इस रणनीति के द्वारा एक द्विलिंग हौसले से बनाया आरईसी-8 RNAi प्लेटों में रखा गया है और अपनी संतानों को नए सिरे से प्रेरित आरईसी-8 RNAi एक्सप्रेस बैक्टीरिया के साथ नई प्लेटों पर कुछ दिनों बाद स्थानांतरित कर रहा है ( प्रोटोकॉलदेखें) । इसके अलावा, tetraploids hermaphrodites खिलाया बैक्टीरिया की पहली पीढ़ी को पार करने के माध्यम से उत्पन्न किया जा सकता है आरईसी-8 dsRNA व्यक्त बैक्टीरिया के साथ पेट्री व्यंजन में एक ही जीनोटाइप के अनुपचारित पुरुषों के साथ आरईसी-8 dsRNA ( चित्रा 2) । इस मामले में, पुरुषों के पार में आरईसी-8 RNAi बैक्टीरिया L4 चरण के बाद से, संभोग के दौरान सामने आ रहे हैं । दोनों योजनाएं tetraploid पशुओं को जन्म देती हैं27. तालिका 1 यहां प्रस्तुत योजना का उपयोग कर प्राप्त tetraploid उपभेदों से पता चलता है । Triploid और tetraploid ग. एलिगेंस diploids से आकार में बड़े हैं, लेकिन Triploid उपभेदों अस्थिर कर रहे है और एक या दो पीढ़ियों में द्विगुणित हो जाते हैं, जबकि tetraploid उपभेदों अपेक्षाकृत स्थिर है22,23। ख्यात tetraploid उपभेदों मूल तनाव (लंदन) hermaphrodites से भी बड़ा के रूप में पहचान की है कि sired केवल लंदन संतान (चित्रा 3) । लंदन जानवरों को आसानी से पहचाने जाते हैं-जंगली प्रकार द्विगुणित जानवरों tetraploids की लंबाई के दो तिहाई हैं और उनके शरीर एक अतिरिक्त मोड़ नहीं है, जो अपने आगे sinusoidal आंदोलन (चित्रा 3) के दौरान देखा जा सकता है.

Tetraploid उपभेदों के अंडाणुओं में 12 गुणसूत्र जोड़े की उपस्थिति के लिए स्क्रीनिंग द्वारा पुष्टि की गई Tetraploid hermaphrodites के अंडाणुओं में छह गुणसूत्र जोड़े की तुलना में द्विगुणित hermaphrodites (चित्र 3 बी, सी, और फिल्म 1) ।

Tetraploid कक्षाएं:

tetraploid hermaphrodites के दो प्रकार की पहचान की गई: एक sired पुरुषों के रूप में समान आवृत्तियों पर द्विगुणित hermaphrodites और अन्य sired पुरुषों में बहुत अधिक आवृत्तियों (तालिका 1). इन दो प्रकार के tetraploid hermaphrodites में अलग करने के लिए दिखाया गया है कि वर्ग का उत्पादन उन द्विगुणित पुरुषों के समान आवृत्तियों अपने सभी गुणसूत्रों के लिए tetraploid रहे हैं (4a, 4x), जबकि पुरुषों की उच्च आवृत्तियों के उत्पादन वर्ग hermaphrodites कि tetraploid के लिए कुछ लेकिन triploid सेक्स गुणसूत्र (4, 3x) के लिए कर रहे हैं । tetraploids के बाद वर्ग स्थिर और 4a, 3x hermaphrodites और 4a, 2x पुरुषों का उत्पादन कर रहे हैं ।

Tetraploid उपभेदों धीमी हो जाना और कम चिंता आकार का उत्पादन diploids वे से व्युत्पंन थे, के रूप में पिछले विधि22,23के साथ उत्पंन उपभेदों के लिए देखा । Madl और हरमन22 का सुझाव दिया है कि tetraploid उपभेदों में मृत भ्रूण के अनुपात में वृद्धि oocyte में aneuploidy के कारण हो सकता है, लेकिन tetraploid उपभेदों के सतही निरीक्षण aneuploid के पर्याप्त संख्या ऊंचा खुलासा नहीं किया अंडाणुओं और न ही असामांय oocyte या spermatocyte डिवीजनों चिंता आकार में मनाया कमी के लिए खाते में (फिल्म 2, और आंकड़ा 3सी, डी) ।

Figure 1
चित्रा 1: आरईसी में Gametogenesis -8 उत्परिवर्ती स्थिर polyploid दाग पैदा करने के लिए संभव तंत्र से तात्पर्य है । (एक) गुणसूत्र संगठन और जंगली प्रकार और आरईसी-8 उत्परिवर्ती meiotic डिवीजनों में अलगाव पैटर्न के आरेख । जंगली प्रकार अर्धसूत्रीविभाजन में, मुताबिक़ गुणसूत्रों पहले meiotic विभाजन में अलग । एक ही धुरी ध्रुव की ओर एक homolog ओरिएंट में बहन chromatids और दूसरे विभाजन तक एक साथ रहते हैं । आरईसी-8 म्यूटेंट में, homologs क्रॉसओवर फार्म नहीं है, और इस तरह जुड़े नहीं हैं । जंगली प्रकार के विपरीत, आरईसी-8 बहन chromatids एक दूसरे से दूर ओरिएंट और पहले meiotic विभाजन में अलग । (ख) जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती अंडाणुओं महिला नाभिक और बाहर निकाला ध्रुवीय निकायों दिखा के आरेख (पुरुष नाभिक चित्रित नहीं है) । जंगली प्रकार अंडाणुओं में, दो असममित meiotic भागों दो ध्रुवीय निकायों के बाहर निकालना में परिणाम । आरईसी-8 म्यूटेंट में हालांकि, दूसरा ध्रुवीय शरीर बाहर निकालना एक द्विगुणित oocyte में जिसके परिणामस्वरूप विफल रहता है । (ग) जंगली प्रकार और आरईसी की छवियां -8 उत्परिवर्ती अंडाणुओं व्यक्त mCherry:: हिस्टोन H2B । तीर जंगली प्रकार oocyte में दो ध्रुवीय निकायों और आरईसी-8 उत्परिवर्ती में से एक संकेत मिलता है । स्केल बार 5 µm है । (डी और ई) जंगली प्रकार और आरईसी-8 उत्परिवर्ती पशुओं mCherry व्यक्त से spermatids के लाइव छवियों:: हिस्टोन H2B (रानी) । ऐरोहेड संकेत anucleate spermatids । स्केल बार 2 µm है । (D) जंगली प्रकार और आरईसी-8 उत्परिवर्ती में दूसरा (नवोदित) विभाजन के दौर से गुजर Spermatocytes । जंगली प्रकार spermatocytes चार नवोदित spermatids में जिसके परिणामस्वरूप सममित डिवीजनों से गुजरना, एक अगुणित गुणसूत्र पूरक के साथ प्रत्येक । आरईसी-8 उत्परिवर्ती spermatocytes में, गुणसूत्र अलगाव दूसरे विभाजन में ख़राब है । अक्सर क्रोमेटिन के एक बड़े पैमाने पर अवशिष्ट शरीर में रहता है (आरबी) या दो में से एक में बहन spermatids दूसरे meiotic विभाजन । यह anucleate आरईसी-8 उत्परिवर्ती शुक्राणु को जंम देता है (ऐरोहेड द्वारा संकेत) या द्विगुणित शुक्राणु । (ई) जंगली प्रकार और आरईसी में पोस्ट-नवोदित spermatids के लाइव छवियों -8 म्यूटेंट विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट (उद्योग) और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर visualized । जंगली प्रकार spermatids सभी समान chromatid जनता है । आरईसी-8 उत्परिवर्ती spermatids फार्म anucleate शुक्राणु । (च) जंगली प्रकार के ठहराव और आरईसी-8 उत्परिवर्ती anucleate शुक्राणु । आरईसी-8 म्यूटेंट जंगली प्रकार में से कम 1.6% की तुलना में anucleate शुक्राणु के ३८.५% का उत्पादन किया । है फिशर सटीक परीक्षण इंगित करता है कि एक आरईसी-8 उत्परिवर्ती anucleate शुक्राणु की काफी अधिक घटना है (पी ≤ ०.०००१) जंगली प्रकार की तुलना में । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: किसी भी तनाव से tetraploid C. एलिगेंस पैदा करने और अलग करने की योजना । सही पर तीर 1 दिन से शुरू प्रोटोकॉल की समयरेखा का प्रतिनिधित्व करता है और 17 दिन के लिए प्रगति । इसी तरह के परिणाम 9 दिन पर अनुपचारित पुरुषों के लिए hermaphrodites पार करके प्राप्त किया जा सकता है । कोष्ठक किसी चरण के चित्रण को समयरेखा से कनेक्ट करते हैं । अनुपचारित जानवरों नारंगी हैं, इलाज जानवरों लाल कर रहे हैं, लंदन जानवरों के आकार में बड़ा कर रहे हैं, आरईसी-8 dsRNA एक्सप्रेस बैक्टीरिया पारदर्शी लाल पृष्ठभूमि और नियमित रूप से OP50 बैक्टीरिया पारदर्शी ग्रे पर चित्रित किया गया है के साथ पारदर्शी प्लेट के रूप में दर्शाया गया है पृष्ठभूमि प्लेटें । प्रक्रिया 15 डिग्री सेल्सियस पर किया जब तक अंयथा कहा जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: Tetraploid उदाहरण. (क) एक tetraploid (MSC2) जानवर और द्विगुणित तनाव यह (AV740) से व्युत्पंन किया गया था की उज्ज्वल क्षेत्र छवि । Tetraploid C. एलिगेंस द्विगुणित की तुलना में कुल बड़े और लंबे समय (लंदन) रहे हैं । शरीर के आकार में यह अंतर बढ़ tetraploid के शरीर के एक अतिरिक्त sinusoidal वक्र में परिणाम और tetraploid डेरिवेटिव के लिए स्क्रीन करने के लिए एक कसौटी के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । स्केल बार 0.1 mm है । (B, C) प्रतिदीप्ति की छवियां द्विगुणित (AV740) और tetraploid (MSC1) सबसे परिपक्व अननिषेचित oocyte nulcei, meiotic डिवीजनों से पहले । माध्यमिक स्क्रीनिंग स्थापित लंदन उपभेदों की unनिषेचित अंडाणुओं में गुणसूत्र जोड़े की संख्या देख द्वारा किया जाता है, के रूप में एक MSC1 तनाव व्यक्त Mcherry के लिए फिल्म 1 में दिखाया गया है:: H2B और GFP:: β-Tubulin germline में । स्केल बार 5 µm है । (D) छवियों को एक समय चूक (मूवी 2) से tetraploid oocyte meiotic विभाजन की एक आम तौर पर सामांय अर्धसूत्रीविभाजन चित्रण । एरो प्रमुखों मार्क ध्रुवीय निकायों और एक बिंदीदार रेखा spermatheca के अंदर oocyte के प्रांतस्था और शुक्राणुओं से घिरा के निशान; t = मिनटों में समय िही । स्केल बार 10 µm है । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

जीनोटाइप Tetraploid व्युत्पंन
(कुछ के सेट: एक्स-गुणसूत्रों के #) *		 माता पिता का तनाव
द्विगुणित)
meIs16 [पाइ-1p:: mCherry:: his-58 + unc-119 (+)]; MSC1 (4a: 4x) MSC0
ruIs57 [पाय-1p:: GFP::b-tubulin + unc-119 (+)] MSC2 (4a: 3x)
MSC3 (4a: 4x)
MSC5 (4a: 3x)
MSC6 (4a: 4x)
MSC8 (4a: 4x)
unc-119 (ed3) III; ddIs6; ddIs6 [tbg-1:: GFP + unc-119 (+)]; ltIs37; ltIs37 [pAA64; पाइ-1p:: mCherry:: HIS-58 + unc-119 (+)] IV MSC14 (4a: 3x) TMR17
MSC15 (4a: 3x)
MSC16 (4a: 4x)
एसपीओ-11 (me44)/nT1 IV; +/nT1 [qIs51 [myo-2:: gfp Ppes-10:: gfp, pf22b 7.9:: gfp]] V AV800व AV776
meIs8 [पाइ-1p:: gfp:: cosa-1 + unc-119 (+)] II; AV809व AV727
ltIs37 [पाइ-1p:: mCherry:: his-58 + unc-119 (+)] IV;
ltIs38 [पाय-1p:: gfp::p h (PLC1delta1) + unc-119 (+)]
meIs8 [पाइ-1p:: gfp:: cosa-1 + unc-119 (+)] II; mnT12 (X; चतुर्थ) AV826व AV695
mIn1 [dpy-10 (e128) mIs14 [myo-2:: gfp पी इ एस-10:: gfp]]/ AV810व DR2078
bli-2 (e768) unc-4 (e120) II

ruIs32 [पाइ-1:: GFP:: H2B + unc-119 (+)] III
 AV822व AZ212
AV823व
C. briggsae-mfIs42 [Cel-sid-2 + Cel-myo-2::D sred] AV824व JU1018

तालिका 1: Tetraploid उपभेदों जनरेट किया गया. * मुजे अंडाणुओं के अनुपात के अलावा bivalents (कनेक्टेड मुताबिक़ जोड़े) और meiotic में univalents (डिब् homologs) की संख्या को स्कोरिंग करके, नर sired

Movie 1
फिल्म 1: पुष्टि करने के लिए कि स्थिर लंदन उपभेदों पूर्ण या आंशिक tetraploids है स्क्रीनिंग । फिल्म एक जंगली प्रकार के चित्र के साथ शुरू होता है (unनिषेचित अंडाणुओं) क्षेत्र पर प्रकाश डाला द्विलिंग को गुणसूत्र जोड़े गिनती द्वारा tetraploids की पहचान । चित्र के बाद, Z-stack फिल्मों और अनुमानों की एक श्रृंखला द्विगुणित और tetraploid पशुओं के gonads दिखाने के स्थिर और DAPI दाग या Mcherry व्यक्त उपभेदों के लाइव छवियों:: H2B हिस्टोन । स्क्रीनिंग निषेचित अंडाणुओं में जुड़े मुताबिक़ गुणसूत्र जोड़े की संख्या गिनती द्वारा किया जाता है । या तो MCherry या DAPI दाग निकायों की गिनती के शुक्राणु spermatheca भंडारण ("-1 oocyte") के निकटतम unनिषेचित oocyte में किया जाता है । इस oocyte में गुणसूत्रों सबसे गाढ़ा और एक दूसरे से अलग हैं, और अधिक सटीक homolog जोड़े गिनती के लिए अनुमति देता है । प्रति तनाव 10 से अधिक जानवरों को सुनिश्चित करने के लिए जांच की गई-1 oocyte गुणसूत्र गिनती सही थे । स्टैक मोटाई 0.2 µm है । कृपया यहां क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Movie 2
चलचित्र 2: Tetraploid oocyte विभाजन सामान्य दिखाई देता है. विभाजन के समय चूक एक tetraploid तनाव व्यक्त Mcherry के oocyte:: H2B हिस्टोन और GFP:: β-Tubulin. समय और विभाजन के पैटर्न सामांय दिखाई देते हैं । छवियां हर 2.5 मिनट लिया. कृपया यहां क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Discussion

अगुणित का उत्पादन (n) gametes निषेचन में एक द्विगुणित (2n) युग्मनज पैदा करने के लिए महत्वपूर्ण है । जीनोम की यह कमी एक एकल जीनोम दोहराव के बाद लगातार दो सेल डिवीजनों के साथ अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान पूरा किया है । अगुणित gametes, सी. एलिगेंसउत्पंन करने के लिए, के रूप में सबसे अंय metazoans के साथ, मातृ और अलग-पहले विभाजन में homologs-व्युत्पंन, जबकि बहन chromatids प्रत्येक homolog दूसरे विभाजन में अलग से । एक ही रास्ता है कि पूरे जीनोम polyploidy प्रकृति में उठता है gametes की पीढ़ी के माध्यम से है कि अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान आधे उनके जीनोम आकार में विफल ।

यह 50 से अधिक वर्षों के लिए ज्ञात किया गया है कि tetraploid सी एलिगेंस सूत्रकृमि व्यवहार्य और उपजाऊ हैं । Nigon23, और बाद में Madl और हरमन22, उत्पन्न और meiotic गुणसूत्र अलगाव गर्मी शॉक उपचार का उपयोग कर और आनुवंशिक मार्कर का उपयोग कर, क्रमशः बाधित द्वारा सी. एलिगेंस tetraploids की एक मुट्ठी भर की पहचान की । एक एकल अतिरिक्त सी. briggsae tetraploid तनाव 30 साल बाद24पर इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर व्युत्पंन किया गया । इन tetraploids की जांच करने के लिए उपयोग किया गया था कि कैसे सी एलिगेंस पुरुष या द्विलिंग, कैसे ploidy विकास और आकार को नियंत्रित करता है, और बाँधना और synapsis में अर्धसूत्रीविभाजन25,26का विश्लेषण करने के लिए, 38 , 39 , 40. फिर भी इन और अंय विशिष्ट tetraploids या triploid उपभेदों के उपयोग की आवश्यकता के अध्ययन इस विधि द्वारा tetraploid उपभेदों पैदा करने में कठिनाई द्वारा सीमित थे ।

प्रोटोकॉल यहां वर्णित स्थिर पूर्ण 4a, 4x और आंशिक 4a, 3x tetraploid Caenorhabditis किसी भी प्रारंभिक द्विगुणित आनुवंशिक पृष्ठभूमि या आनुवंशिक मार्करों के उपयोग के बिना कैरयोटाइप से निमेटोड उपभेदों की पीढ़ी में सक्षम बनाता है ।

Tetraploidy C. एलिगेंसमें एक से अधिक तंत्र द्वारा उत्पंन हो सकता है:

Madl और हरमन सुझाव दिया कि tetraploid उपभेदों वे एक triploid मध्यवर्ती राज्य से व्युत्पंन की संभावना उत्पंन । उनके उपभेदों एकाधिक पीढ़ियों से अधिक चयन के माध्यम से प्राप्त किया गया था या द्विगुणित नर22के साथ ख्यात triploid मध्यवर्ती पार करके । आरईसी-8 म्यूटेंट में गुणसूत्र विभाजन में दोष है कि द्विगुणित अंडाणुओं और शुक्राणु को जन्म देता है एक और संभव प्रणाली है जिसके द्वारा tetraploid जानवरों के आरईसी-8 RNAi योजना27के साथ पैदा हो सकता है सुझाव देते हैं ।

आरईसी-8 RNAi इलाज hermaphrodites द्विगुणित अंडाणुओं और spermatocytes है, जो निषेचन पर tetraploid पशुओं को जंम देना होगा उपज सकता है । इस संभावना के अनुरूप तथ्य यह है कि क्लोन f2 hermaphrodites के कुछ अगली पीढ़ी में स्थिर लंदन उपभेदों को जंम दिया है, जो पता चलता है कि क्लोन लंदन F2 hermaphrodites जहां पहले से ही tetraploid । पार योजना में, आरईसी-8 RNAi इलाज hermaphrodites की पहली पीढ़ी अनुपचारित पुरुषों के साथ पार कर रहा है । द्विगुणित spermatocytes अभी भी पुरुषों में पैदा हो सकता है क्योंकि क्रॉस आरईसी-8 dsRNA व्यक्त बैक्टीरिया की उपस्थिति में किया जाता है और इस प्रकार, पुरुषों आरईसी-8 RNAi के लिए संभोग के दौरान उजागर कर रहे है कम 3 दिनों के लिए । इसलिए, इस पार में लंदन polyploids-निषेचन योजना भी द्विगुणित शुक्राणु द्वारा द्विगुणित अंडाणुओं के निषेचन से गठन किया जा सकता है । स्थिर tetraploid उपभेदों या तो gametes के बीच निषेचन से या triploid ploidy शुक्राणु उत्पादन द्विगुणित पशुओं के साथ चर अगुणित के अंडाणुओं युक्त जानवरों को पार करने से उत्पंन हो सकती है ।

महत्वपूर्ण विचार:

स्व-बनाम क्रॉस-निषेचन योजनाएं:

स्व निषेचन की योजना आरईसी-8 RNAi इलाज F1 hermaphrodites और अनुपचारित पुरुषों के साथ इलाज hermaphrodites के पार शामिल योजना दोनों 4a, 4x और 4a, 3x tetraploid उपभेदों को जंम दिया । हालांकि अधिक polyploids शुरू में स्व-निषेचन योजना से अलग थे, इन polyploid पशुओं के और अधिक बाँझ थे और इस तरह दोनों योजनाओं को इसी तरह tetraploid स्थिर उपभेदों के उत्पादन में कुशल हैं । स्व-निषेचन योजना में बढ़ी हुई सफलता और बांझपन का कारण अज्ञात है । यद्यपि दोनों योजनाएँ इसी प्रकार दक्ष हैं, अतः स्व-निषेचन योजना आसान है क्योंकि इसमें सहवास के लिए पुरुषों के अलगाव की आवश्यकता नहीं है. इसके अलावा, जब ब्याज की तनाव संभोग में अक्षम या दोषपूर्ण है, स्व-निषेचन योजना बेहतर होगा । क्रॉस-निषेचन योजना एक एकल गुणसूत्र के दो से अधिक संस्करणों से युक्त जटिल tetraploids पैदा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

संशोधन और सीमाएं:

वर्तमान में, इस प्रोटोकॉल आरईसी-8 जीन के लिए dsRNA व्यक्त बैक्टीरिया खिलाने के द्वारा आरईसी-8 RNAi उपचार शामिल है । इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल में काम नहीं करता है Caenorhabditis प्रजातियों को खिलाने, या म्यूटेंट में दोषपूर्ण या पर्यावरणीय या ऊतकों के बीच RNAi के प्रणालीगत प्रसार के द्वारा RNAi के लिए अप्रतिसादी में41,42,43। इस समस्या का संभावित germline में सीधे ब्याज की dsRNA के प्रत्यक्ष इंजेक्शन द्वारा RNAi उपचार शुरू करने से हल किया जा सकता है ।

Triploid पशुओं को एक tetraploid को पार करके एक द्विगुणित जानवर जो इसे प्राप्त किया गया था द्वारा उत्पंन किया जाना चाहिए, क्योंकि यह योजना स्थिर Triploid उपभेदों44,45उत्पंन नहीं करता है । triploids हैच द्वारा sired अंडे का केवल 15%, और उनकी संतति aneuploidy के कारण अधिकांशतः बाँझ संतति होती हैं. इसके अलावा, कुछ जीवित उपजाऊ संतान के लिए पूरी तरह या diploids के पास पीढ़ियों के एक जोड़े के भीतर हो जाते हैं । यह संभावना है, कम से भाग में, क्योंकि अंडाणुओं आंशिक रूप से पहले meiotic विभाजन में ध्रुवीय शरीर में तीसरे गुणसूत्र अलग करके trisomy सुधार कर रहे हैं ।

इस प्रोटोकॉल की एक अति कमी यह है कि यह म्यूटेंट के tetraploids बनाने कि RNAi मशीनरी के घटकों को प्रभावित क्योंकि वे RNAi उपचार के लिए प्रतिरोधी रहे है के लिए काम नहीं करता है46।

निवारण:

आरईसी-8 RNAi:

कुछ विचार इस प्रोटोकॉल सफल होने के लिए महत्वपूर्ण हैं । पहला आरईसी-8 (HT115 2.6) क्लोन ले जाने वाले बैक्टीरिया w02a बैक्टीरिया में आरईसी-8 dsRNA उत्पादन के प्रेरण के लिए ताजा IPTG और हौसले से बना IPTG NMG प्लेट का उपयोग करने के लिए है । IPTG प्रकाश संवेदनशील है और यह प्लेटों के लिए प्रकाश जोखिम को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है । IPTG प्लेट्स को अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर एक महीने तक स्टोर किया जा सकता है । दूसरा, आरईसी-8 (w02a 2.6) Ahringer लाइब्रेरी (कामथ और Ahringer 2003) से RNAi बैक्टीरियल HT115 उपभेदों अन्य उपलब्ध आरईसी-8 phenotype क्लोन की तुलना में एक मजबूत आरईसी-8 HT115 उपज ।

Tetraploid तनाव रखरखाव:

Tetraploid उपभेदों बहुत धीरे से बढ़ती है और उत्पादन के प्रति सबसे अधिक 50 जिन्नियों में47उपज । सभी की पहचान की tetraploid उपभेदों अपेक्षाकृत स्थिर हैं, लेकिन वे टूट सकता है और द्विगुणित हो जब (जोनाथन Hodgkin व्यक्तिगत संचार और हमारे अप्रकाशित टिप्पणियों) पर बल दिया । इसलिए, यह ध्यान रखें कि जब tetraploid उपभेदों 25 डिग्री सेल्सियस, गर्मी सदमे में हो रहे हैं, भूखे, या जमे हुए और स्थिर, वे तेजी से diploidy को वापस कर सकते हैं, तो यह महत्वपूर्ण है के लिए लंदन जानवरों लेने जब इन उपभेदों या जब ठंढ तनावपूर्ण स्थिति है कि उंहें वापस करने के लिए कारण हो सकता है इन उपभेदों को उजागर ।

संभावित अनुप्रयोग:

प्रभाव या विकास में पूरे जीनोम polyploidization की भूमिका की जांच, कोशिका चक्र, जीन अभिव्यक्ति, और कोशिकीय जीवों में विकास के बीच तुलना पर भरोसा किया है: एक जीव है कि विभिंन ploidy होते है में कोशिकाओं, एक ही सेल विभिंन ploidy, या प्रजातियों है कि evolutionarily हाल ही में polyploidization घटनाओं और शारीरिक अलगाव3,5,6,78 ,11,18,19,20,48,49,50. हालांकि tetraploids zebrafish और माउस मॉडल प्रणालियों से प्राप्त किया जा सकता है, उनकी संतान बाँझ या भ्रूण घातक हैं16,17. इसके अलावा, इन मॉडल सिस्टम सी. एलिगेंस की तुलना में लंबे जीवन चक्र है, और polyploid पशुओं उत्पंन करने के लिए उपलब्ध तरीकों जटिल और अक्षम हैं। इसलिए, इस विधि द्वारा व्युत्पंन सी एलिगेंस उपभेदों कोशिकीय जीवों में पूरे जीनोम polyploidy के प्रभाव और भूमिकाओं पर किसी भी जांच को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई होगी ।

के बाद से एक triploid मूल द्विगुणित करने के लिए tetraploid पार करके एक tetraploid से प्राप्त किया जा सकता है, diploids, triploids के बीच एक तुलना, और tetraploids है कि केवल जीनोम प्रतियां की संख्या में अलग, एक अनूठा और अभूतपूर्व अवसर प्रदान करता है अलग जीनोम आकार (या जीन खुराक) के साथ समकक्ष जानवरों का मूल्यांकन/ यहाँ वर्णित योजना में लचीलापन और सुगमता ने हमें विभिन्न आनुवांशिक द्विगुणित पृष्ठभूमियों या karyotypes से tetraploid उपभेदों के दर्जनों उत्पन्न करने की अनुमति दी है. इनमें से कुछ उपभेदों पहले से ही मुताबिक़ गुणसूत्र बाँधना और synapsis के अर्धसूत्रीविभाजन27के दौरान क्वेरी तंत्र के लिए इस्तेमाल किया गया था ।

जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती tetraploid फ्लोरोसेंट मार्करों ले जाने उपभेदों जांच के नए रास्ते जीनोम आकार और परमाणु/cytosol अनुपात के बीच संबंधों को समझने के लिए प्रदान करेगा intracellular/सेलुलर/अंग पर और पूरे पशु स्केलिंग, पूरे जीनोम अनुकूलन, speciation, जीन खुराक और अभिव्यक्ति पर polyploidization, और ऊतक और अंग विकास । जैविक स्केलिंग के अध्ययन के अलावा, tetraploid उपभेदों की पीढ़ी काफी आगे extracellular संकेतन, जीनोम अस्थिरता, endoreduplication, पूरे जीनोम के लिए प्रासंगिक मौलिक जैविक प्रश्नों के प्रश्नों होगा दोहराव, जीन खुराक, तनाव के लिए अनुकूलन, दवाओं के लिए प्रतिरोध के विकास, और तंत्र speciation ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम Caenorhabditis आनुवंशिकी केंद्र (स्वास्थ्य संस्थान (NIH) अनुसंधान अवसंरचना कार्यक्रम P40 OD010440 के कार्यालय द्वारा वित्त पोषित) उपभेदों के लिए धंयवाद । लेखकों को बपतिस्मा देनेवाला Roelens और एली Lessman शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, हमें रचनात्मक प्रतिक्रिया और CCNY में मनो लैब, फिल्म के भाग के लिए अपनी प्रयोगशाला के उपयोग के लिए और उनकी सहायता के लिए CUNY के साथ उपलब्ध कराने के लिए । इस कार्य को पीएससी-CUNY अवार्ड TRADB-46-113 और NIH ग्रांट 1SC2GM118275-01 के सहयोग से किया गया । M.S. आंशिक रूप से एक कनाडाई स्वास्थ्य संस्थान (CIHR) postdoctoral फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था, और E.K. NIH/NIGMS वृद्धि अनुदान GM062981 द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissecting Microscope Motic Microscopy SMZ171
Name Company Catalog Number Comments
NGM agar plates
60 mm x 15 mm Petri Dishes, Sterile Tritech Research T3305
35 mm x 15 mm Petri Dishes, Sterile Tritech Research T3500
Bacteriological Agar, 5 kg VWR 89140-850
Sodium Chloride, Biotechnology Grade VWR 97061-278
Peptone, BD Bacto VWR 90000-368
Ampicillin Trihydrate VWR 97062-300
IPTG, dioxane-free Thermo Scientific R0391
Name Company Catalog Number Comments
Growth Culture
LB Lennox Broth IBI Scientific 89126-176
Name Company Catalog Number Comments
LB Agar plates
LB Agar Lennox IBI Scientific 89126-182
Name Company Catalog Number Comments
Antibiotics
Ampicillin Trihydrate VWR 97062-300
Tetracycline Hydrochloride Fisher Scientific BP912-100
Name Company Catalog Number Comments
Staining
Hoechst 33258, Pentahydrate Biotium 40045
DAPI Biotium 40011
Name Company Catalog Number Comments
Ethanol Fixation
Ethanol, Pure, 190 Proof (95%), USP Koptec, VWR 89125-166
Name Company Catalog Number Comments
M9 Buffer
Sodium chloride, Biotechnology Grade VWR 97061-278
Potassium phosphate, Monobasic Anhydrous Grade VWR 97062-346
Sodium phosphate, monobasic dihydrate Fisher Scientific AC271750025
Name Company Catalog Number Comments
RNAi Clones
HT115 bacteria expressing rec-8 dsRNA Source Bioscience W02A2.6
HT115 bacteria expressing rec-8 dsRNA Dharmacon RCE1182-202299820

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References

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आनुवंशिकी अंक 133 Polyploidy Caenorhabditis एलिगेंस आरईसी-8 RNAi अर्धसूत्रीविभाजन endoreduplication पूरे जीनोम दोहराव जीनोम आकार जीन खुराक जैविक स्केलिंग जीनोमिक अस्थिरता
<em>Caenorhabditis एलिगेंस</em> में Ploidy का हेरफेर
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Clarke, E. K., Rivera Gomez, K. A.,… More

Clarke, E. K., Rivera Gomez, K. A., Mustachi, Z., Murph, M. C., Schvarzstein, M. Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (133), e57296, doi:10.3791/57296 (2018).

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