Summary
Burada biz yerel ilaç dağıtım iç kulaklarına semisirküler kanal hasarı ile yetişkin ve neonatal farelerin duyma ve vestibüler işlevine izin veren canalostomy açıklayınız. Bu yöntem viral vektörler, eczacılık ve küçük moleküller fare iç kulak aşılamak için kullanılabilir.
Abstract
Tedavi edici ilaç yerel teslimat iç kulak içine iç kulak hastalıkları için umut verici bir tedavi yöntemidir. Sızdırma semisirküler kanallar (canalostomy) yoluyla iç kulak içine yerel ilaç dağıtım için faydalı bir yaklaşım gibi gösterilmiştir. Bu makalenin amacı, ayrıntılı, ameliyat tekniklerinin yetişkin ve neonatal farelerde canalostomy yer tarif etmektir. Hızlı-yeşil boya ve adeno ilişkili virüs serotip 8 yeşil flüoresan protein gen ile belirtilen, canalostomy koklea ve vestibüler uç-organ işitme en az hasarla enjekte reaktifler, geniş ölçekli dağıtım kolaylaştırdı ve Vestibüler fonksiyon. Ameliyat başarılı bir şekilde her iki yetişkin ve neonatal farelerde uygulanmıştır; Gerçekten de, birden çok ameliyat gerekirse gerçekleştirilebilir. Sonuç olarak, canalostomy ilaç dağıtım yetişkin ve neonatal farelerin iç kulaklarına bir etkili ve güvenli yaklaşım ve gelecekte insan iç kulak hastalıkları tedavi etmek için kullanılabilir.
Introduction
Sensorinöral işitme kaybı ve vestibüler disfonksiyon etkileyen önemli bir sayı hastalar ve yakından iç kulak bozuklukları ile ilişkili. İç kulak içine tedavi edici ilaç teslim iç kulak hastalıkları tedavisi için göstermektedir. Sistemik veya yerel bir yaklaşım uyuşturucu iç kulak teslim etmek için kullanılabilir. Bazı iç kulak hastalıkları genellikle sistemik steroid1ile tedavi edilir idyopatik ani işitme kaybı gibi sistemik İlaç İdaresi ile başarılı bir şekilde tedavi edilir. Buna ek olarak, Lentz vd antianlamlı oligonükleotid, sistemik yönetimi işitme geliştirmek ve işlevleri Ush1c mutant fare modeli2dengelemek mümkün olduğunu gösterdi. Ancak, iç kulak hastalıkları büyük bir bölümünü değil etkin bir şekilde tedavi edilir sistemik İlaç İdaresi tarafından iç kulak3,4ilaç erişimi sınırlar kan-labirent engeli nedeniyle. Buna ek olarak, yerel uyuşturucu dağıtım stratejileri daha verimli bir şekilde iç kulak hastalıkları tedavi edebiliriz. Gerçekten de, iç kulak potansiyel olarak ideal bir yerel ilaç dağıtım için hedeftir; Bu ilaç yayılması bir site difüzyon veya enjeksiyon sonra kolaylaştırır, sıvı ile doludur ve yan etkiler5,6sınırlayan komşu organ, nispeten izole edilmiştir.
Yerel uyuşturucu dağıtım stratejileri intratimpanik ve intralabyrinthine yöntemleri içerir. İntratimpanik yolun etkinliğini büyük ölçüde ilaç geçirgenliği yuvarlak pencere membran (RWM) ve uyuşturucu RWM3,4,7,8ikamet süresi kullanır. Bu nedenle, uyuşturucu ya da RWM aşamıyor reaktifler teslimi için uygun değildir. İntralabyrinthine yöntemleri uyuşturucu aşı doğrudan bir yüksek doz ve yaygın dağıtım ile sonuçlanan iç kulak içine dahil. Ancak, intralabyrinthine yöntemleri hassas ameliyatlar gerektirir ve invaziv, iç kulak işleve zarar yol açmaktadır. Şu anda, bu insanlar9kullanmak için yeterince güvenli olması için kanıtlanmıştır değil gibi ilaçların intralabyrinthine enjeksiyon sadece hayvan çalışmalarında kullanılır. Bu nedenle, cerrahi işlemler Basitleştirilmiş ve klinik içine intralabyrinthine yaklaşımlar çevirmek için yaralanma riski azalır.
Birkaç intralabyrinthine yaklaşım hayvanlarda enjeksiyonla RWM5,10,11 ve scala medya12,13,14, scala tympani değerlendirildi var 15 , 16, scala antre17, semisirküler kanallar16,18,19,20ve21endolymphatic kesesi. Her bu yaklaşımların avantajları ve dezavantajları6vardır. RWM aracılığıyla atravmatik yenidoğan fareler5,22olduğunu. Ancak, hafif işitme kaybı yetişkin fareler RWM enjeksiyon23, büyük olasılıkla orta kulakta efüzyon cerrahi24sonra nedeniyle sonra görülmektedir. Reaktif enjeksiyon doğrudan duyu epiteli içeren endolymphatic alanı içine karıştırmak, Scala medya enjeksiyon hedef uç-organ12,14, bir yüksek reaktif konsantrasyon elde 25 , 26. ancak, bu yaklaşım karmaşık bir prosedür gerektirir ve sonuçları işitme eşiği önemli yükselmesine postnatal gün 5 (P5)'dan sonra gerçekleştirilen uygulama sınırlar25,27,.
Yukarıda belirtilen intralabyrinthine yaklaşımlar için karşılaştırıldığında, canalostomy olan özellikle yetişkin fareler16,18,28,29,30' u, iç kulak, en az hasara neden koruyucu etkileri ve çevirim yönleriyle değerlendirilmesi için önemli. Ayrıca, kemirgen, cerrahi işlemler kolaylaştırır ve ameliyat sırasında orta kulak rahatsızlık önler bulla, ötesinde semisirküler kanallar bulunur. Klinikte, semisirküler kanal ameliyatları canalostomy klinik fizibilite düşündüren zorlu benign paroksismal pozisyonel vertigo31,32,33için kullanılır. Bu yana ilk Kawamoto ve arktarafından tanımlanmıştır. 16 2001 yılında canalostomy viral vektörler, siRNA, kök hücre ve aminoglikosite, gibi çeşitli reaktifler fare iç kulak18,19,28,29 teslim etmek için kullanılan ,34,35,36,37. Aşı adeno ilişkili virüs (AAV) vektörlerin canalostomy tarafından etkinleştirmek overexpression duyu epiteli eksojen genlerin ve birincil neurons koklea ve vestibüler uç-organ18,28, 29,30. Gen terapisi canalostomy tarafından whirlin dengesi fonksiyonu geri yükler ve bir fare modeli bu canalostomy çalışmalar genetik cochleovestibular hastalıklar için gen tedavisi için yararlıdır düşündüren insan Usher sendromu19, duruşmada geliştirir. Canalostomy tarafından mezenkimal kök hücre nakli koklear fibrocytes ve işitme kurtarma akut sensorinöral işitme kaybı35, fare modeli yeniden yapılanma sonuçlanır. Ayrıca, canalostomy aminoglikozitler vestibüler lezyonlar18,34,38kurmak için iç kulak tanıtmak için kullanılabilir ve birden çok enjeksiyonları18 gerekirse gerçekleştirilebilir , 34.
Bugünkü yazıda, biz, ayrıntılı olarak, Yetişkin ve neonatal farelerde canalostomy teknikleri tarif. Biz fast-yeşil boya ve AAV serotip 8 (AAV8), dahil olmak üzere çeşitli reaktifler yeşil flüoresan protein (GFP) gen (AAV8-GFP) ve streptomisin, birlikte canalostomy sonra acil ve uzun vadeli sonuçları değerlendirmek için fare iç kulak içine aşılandı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yordamları ve hayvan ameliyatları hayvan bakım ve kullanım Komitesi sermaye tıp Çin Üniversitesi kurallarına göre yapılmıştır.
1. cihaz hazırlıkları
- Enjeksiyon kanül (Şekil 1A) yapmak, polimid boru bağlamak (iç çapı 114.3 µm, dış çap 139.7 µm, uzunluğu ~ 3 cm) için polietilen boru (iç çap 280 µm, dış çap 640 µm, uzunluğu ~ 40 cm). Yapıştırıcı kullanarak, en az üç uygulama ile bağlantı kapatın. Etilen oksit ile enjeksiyon kanül sterilize.
Not: tüp sızdırmazlık zaman yapıştırıcı kanül tıkanması içinde sonuçlanabilir polimid tüp girmesini önlemek. Gaz sterilizasyon bağlantısında akıntıya neden çünkü boru, en az üç kez, mühür. - 30 G iğne kullanarak, normal tuz içeren 1 cc enjektör için polietilen boru ucunu bağlayın. Kanül ile normal salin enjeksiyonu ile herhangi bir sızıntı ya da tıkanıklık, polimid Boru polietilen boru arasındaki bağlantıyı kontrol etmek için 1-cc şırınga ile doldurun.
Not: bir sızıntı veya bağlantının bir tıkanıklık varsa, aşağıdaki yordamlarda da kanül kullanılamaz. - 10 µL mikro şırınga normal salin ile tahliye ve yukarıda sözü edilen 30 G iğne enjeksiyon kanül ile bağlayın. Mikro şırınga mikroenjeksiyon pompa (Şekil 1B) yükleyin. Enjeksiyon hızı 0.5 µL/dk ve hızlı-yeşil boya ve AAV8-GFP 1 µL birime veya streptomisin için 2 µL ayarlayın.
Not: Enjeksiyon hızı önerilen aralığı 0.1−0.5 µL/dk ve 0.5−2 µL enjeksiyon birimin önerilen aralığıdır. - Mikro şırınga için 1 µL geri çekmek ve enjeksiyon reaktif ayıklayın. Bir hava boşluğu normal salin ve eklenen reaktif (Şekil 1 c) arasında oluşturacak.
- İsteğe bağlı olarak bir işaretleyici kalem kullanarak Polietilen boru gaz-sıvı sınırında konumunu etiketleyin. Bu reaktif akış enjeksiyon sırasında izlemek için kullanılabilir.
2. yetişkin farelerde Canalostomy
- Yetişkin bir fare anestezi (kadın, FVB/N, 5 için 6 - haftalık) ketamin bas HCl (120 mg/kg) mayi enjeksiyonla ve xylazine HCl (7 mg/kg). Hayvan (ayak-çimdik refleks) ağrılı uyaranlara yanıt sergileyen kadar 5−10 min için bekleyin. Hayvan anestezi sonra önceden ısıtılmış bir elektrikli yastık üzerinde bir yer. Bir analjezik, Meloksikam (1 mg/kg), ameliyattan önce subkutan uygulandı.
- Hayvanın gözleri göz merhem ile kapak. Elektrikli bir hayvan kesme makinesi ile sol sonrası kulak çevresi bölge tıraş ve cilt üç kez % 75 etanol ile dezenfekte.
- Hayvan önceden ısıtılmış bir elektrikli yastık üzerinde bir yer. Elektrikli yastık sıcaklık ~ 37 ° C'ye ayarlayın Sol kulak ameliyatına kolaylaştırmak için sağ lateral pozisyonda hayvan yer.
- 1-1.5-cm sonrası kulak çevresi kesi sol retroauricular groove (Şekil 2A) ~ 3 mm'den olun.
- Posterior semisirküler kanal (PSC) ve lateral semisirküler kanal (LSC) konumlandırma: ( Şekil2B kalın nokta) teleklerinin kök kaynağını ve uçak için hasta paralel olarak 3'e 09: 00 olarak tanımlandığında, PSC ve LSC'yi genellikle vardır ~ 3 mm 2 ve 3 ' (Şekil 2B) arasında teleklerinin kökünden yer.
- Açık açık PSC ve kenar boşluklarını temporal kemik (Şekil 2C) karanlık şeritler olarak açıkça izlenebiliyor LSC, ortaya çıkarmak için mikro-forseps ile temporal kemik kapsayan kas incelemek. LSC'yi altındadır bir hasta için paralel uçaktan yaklaşık 30° açı ve PSC LSC (Şekil 2C) dikeydir. Kas mikro-forseps ile küçük bir parça toplamak ve kurumaya bırakın. Aşağıdaki adımda, bu kas deliği kapatmak için kullanılır.
Not: kas yaralanması en aza indirmek için dokuların aşırı yırtılma kaçının. Bitişik geminin PSC (Şekil 2B) açığa zaman zarar vermemek. - 26 G iğne (Şekil 2B) PSC orta kısmında küçük bir delik açmak. Delikten sıvı kaçağı PSC kemik duvarı başarılı penetrasyon gösterir. Uygun bir boyut, polimid boru çapı daha biraz daha büyük deliğe büyütmek.
Not: Matkap ve delik hafifçe ve yavaş yavaş büyütmek PSC kırık önlemek için. - Pamuk Pelet kullanarak PSC delik çevreleyen efüzyon temiz.
- Polimid Boru ucu PSC crus komün derinliğe kadar 1−2 mm (Şekil 2E) doğru yavaşça takın. Enjeksiyon pompası üzerinde "Çalıştır" düğmesine basarak başlatın.
- Sonra enjeksiyon, reaktif yaymak izin vermek için ~ 2 dakika bekleyin. Kas adım 2.6 mikro-makas ile toplanan küçük parçası kırpın. Ardından, enjeksiyon kanül çıkarın ve hemen PSC deliğe kas yerleştirin.
Not: delik delik tamamen mühürlü emin olmak için takma sonra sızıntı herhangi bir sıvı denetleyin. - Ayrılmış kasları ve subkutan doku verir. 5-0 dikiş kullanarak kesik dikiş. Kesi bölge povidone iyot ile dezenfekte.
: Dikkat yukarıdaki cerrahi işlemler yaklaşık 25 dakika. - Hayvan ~ 37 ° C'ye ısıtılmış bir elektrikli yastık getirin Hayvan kurtarma için sağ lateral pozisyonda yerleştirin.
- İşitsel Beyin sapı yanıt (ABR) ölçümleri gerçekleştirmek ve yüzme testleri bir hafta sonra ameliyat18.
- Gerekirse, tekrarlanan enjeksiyon PSC veya LSC farklı bir alanında gerçekleştirin.
3. yenidoğan farelerde Canalostomy
- Hipotermi teşvik ve postnatal gün 1-2 (P1-2), (FVB/H) farelerde neonatal sedasyon güncelleştirmek için kullanın. Yavru fok plastik wrap kaplı yatak ~ 4 min için ezilmiş buz koyun. Ardından, yavru fok buz dolu bir platformda yatıyordu. Cerrahi alan üç kez % 75 etanol ile dezenfekte.
Not: yavru fok Başkanı buzdan olduğundan emin olun. Tüm yavru fok ile buz dolu bir platformda ameliyatı. - Aşağıdaki adımları için yetişkin fareler karşılaştırıldığında kardiyolojik farklıdır.
- ~ 2 mm'den ~ 3 mm postauricular kesik kulak çevresi giderilmesi için posterior yapmak (Şekil 3A -B).
- Yavaşça 26 G iğne kullanarak yumuşak PSC bir açılış yapmak. Açılış büyütme olmadan kanül PSC takın (Şekil 3 c -E).
- Enjeksiyon sonra kapağı yerine takın, açılış olarak yumuşak PSC (Şekil 3F) bir kırık için ikinci yol için kas bir parçası kullanın.
- Deri 6-0 dikiş kullanarak kapatın.
- ABR ölçümleri gerçekleştirmek ve yüzme testleri P3030'.
- Ebeveyn yamyamlık yenidoğan ameliyattan sonra yaygın bir sorundur. Aşağıdaki adımları ebeveyn yamyamlık olasılığını azaltmak.
- Ameliyattan sonra alkol mendil ile belgili tanımlık kesme çevreleyen kan temizlemek.
- Kardiyolojik serbestçe baraj için dönmeden önce hareket emin olun.
- Yenidoğan bebeklerin anne kafes ve çöp ortasında ventilasyon geri yer kirli yatak takımları ile smear.
- Cerrahi tabi olmayan herhangi bir benzer postauricular kesi ve dikiş almanız gerekir.
- Erkek üreme kafes üzerinden ayırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hızlı-yeşil boya iç kulak hemen onun dağılımın PSC yetişkin ve neonatal farelerin içine enjekte ettiler. Boya koklea, antre ve semisirküler kanallar hemen ameliyat sonrası (Şekil 4) tespit edilmiştir.
Güvenlik ve verimliliği canalostomy iç kulak gen teslim için değerlendirmek için AAV8-GFP yetişkin ve neonatal fareler iç kulak enjekte ettiler. Tüm hayvanların normal ABR eşikleri ve test puanları AAV8-GFP enjeksiyon18,30sonra yüzme sergiledi. Immunohistology, işitsel duyu epiteli içinde iç saç hücreleri (IHCs) ve birkaç dış saç (OHCs) sağlam GFP ifade30gösterdi bazal çevirmek hücreleri ortaya koydu. Vestibüler duyu epiteli GFP ifade utricle, saccule ve ampullae30' tespit edildi. Vestibüler saç hücreleri (Şekil 5) ve destek hücreleri ile yüksek verim18,30transduced.
Streptomisin canalostomy tarafından infüzyonu utricle18,34,38ciddi saç hücre kaybına neden olmaktadır. Canalostomy üzerinden birden çok enjeksiyonları fizibilite sınamak için fareler streptomisin 7 gün sonra AAV8-GFP süspansiyonlar PSC aracılığıyla takip LSC aracılığıyla verildi. Bu deneme de HC kaybı18sonra gen terapisi çalışmaları bozuk iç kulak için yararlı olduğu lesioned utricle içinde AAV8-GFP iletim özelliklerini değerlendirmek için tasarlanmıştır. GFP lesioned utricle (Şekil 6) dağıtımı yapıldı. Çok sayıda GFP pozitif hücreler myosin için transduced belirten VIIA, negatif SCs. Birkaç HCs (myosin VIIa pozitif hücreleri) olgunlaşmamış Saç demetleri ile de GFP ifade.
Şekil 1: aygıt hazırlama. (A) polimid boru (ı) ve Polietilen boru (II) bir enjeksiyon kanül (III) yapmak için kapalı. (B) kanül 10 µL mikro-enjektör için 30 G iğne ile bağlı ve pompa yüklü. Ok kanül ucu gösterir. (C) enjeksiyon reaktif ve normal salin bir hava boşluğu tarafından ayrılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Canalostomy yetişkin bir fare. (A) sonrası kulak çevresi kesi (ok). (B) kasları temporal kemik kapsayan maruz kalır. Biz kök (kalın nokta) teleklerinin kökeni ve uçak tanımlarsanız, hasta için 3/9 saat yönünde, posterior semisirküler kanal (PSC) paralel ve lateral semisirküler kanal (LSC) genellikle 2 ve 3 ' (pentagram) arasındaki bölgede bulunan , kaynağını mm'den ~ 3. İç metin: alt-büyütme resim yönlendirmesini. Noktalı çizgi hasta düzlemi belirtir. (C) PSC ve LSC maruz kalan (noktalı çizgiler) vardır. İç metin: LSC altındadır bir hasta için paralel uçaktan yaklaşık 30° açı ve PSC için LSC dikeydir. (D) küçük bir delik PSC içinde yapılır. (E) kanül ucu PSC eklenir ve reaktif enjekte edilir. (F) delik kas küçük bir parça ile kilitlendi. A ölçek çubuktur 5 mm, B 1 b iç metin içinde 1 cm ise buna ilave c 5 mm. mm (B) B-F için olan Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 3: bir yenidoğan Mouse Canalostomy. (A) bir sonrası kulak çevresi kesi (ok). (B) kasları temporal kemik kapsayan sunulur ve posterior semisirküler kanal (PSC) ~ 2 mm teleklerinin (kalın nokta), 2-3 saat (pentagram) kökünden. Yönlendirmeyi yetişkin fareler (Şekil 2B) için aynıdır. (C) PSC ve lateral semisirküler kanal (LSC) maruz kalan (noktalı çizgiler) vardır. (D) PSC içinde küçük bir açılış yapılır. (E kanül PSC eklenir. (F) kas küçük bir parça açtıktan sonra enjeksiyon karşılamak için kullanılır. Ölçek çubukları a ve B iç metin 5 mm, 1 mm olan, b ve C 1 mm (C-F C) olduğunu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: yetişkin iç kulak Stereo mikroskobik görüntüleri (A-A') ve neonatal fareler (B-B') hızlı-yeşil boya canalostomy ile yönetilen. Örnekleri hemen ameliyat sonrası toplanmıştır. (A ve B) Extracranial yüzey. (A' ve B') Kafa içi yüzey. Hızlı-yeşil boya koklea, antre ve semisirküler kanallar dağıtır. Ölçek çubukları vardır 1 mm (A' için bir 've B'b-b'). PSC, posterior semisirküler kanal. LSC, lateral semisirküler kanal. SSC, üst semisirküler kanal. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: koklea (A-A") ve utricle (B-B") Yetişkin farelerin bütün bağlar temsilcisi confocal görüntüleri hazırlanan 30 gün sonra AAV8-GFP enjeksiyon yolu ile canalostomy. Örnekleri ile antikor GFP (yeşil) ve myosin VIIa için (kırmızı) lekeli. (A-A ") GFP en iç saç hücreleri (IHC) ifade edilir. (B-B ") Utricle cuticular tabak odak düzlemi, çok sayıda saç hücreleri GFP (oklar) hızlı. GFP, yeşil flüoresan protein. OHC, dış saç hücreleri. Ölçek çubukları vardır 25 µm (A"için A-A", B "B-b"). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: travma geçirmiş bir utricle temsilcisi confocal görüntüleri elde edilen 30 gün sonra AAV8-GFP enjeksiyon yolu ile canalostomy. Yetişkin bir fare streptomisin yolu ile lateral semisirküler kanal ve 7 gün sonra AAV8-GFP ile posterior semisirküler kanal enjekte ile enjekte ettiler. GFP (yeşil), myosin VIIa (kırmızı) ve aktin (mavi). Ok uçları belirtmek AAV8-GFP ile transduced temsilcisi destek hücreleri (GFP +/ myosin VIIa-hücreleri), ve oklar, AAV8-GFP ile transduced temsilcisi saç hücreleri gösterir (GFP +/ myosin VIIa + hücreler) olgunlaşmamış Saç demetleri ile. Ölçek çubuğu 20 µm (A-D D) olduğunu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, ilaç dağıtım canalostomy tarafından reaktif koklea ve vestibüler uç-organ boyunca yaygın dağıtım sonuçlandı gösterdi. Bir iç kulak gen Teslimat yöntemi olarak canalostomy en az hasar ile yetişkin ve neonatal farelerin GFP ifade iç kulak işitme ve vestibüler işleve sonuçlandı. Ayrıca, birden çok enjeksiyonları aynı hayvan kolayca gerçekleştirilebilir.
Canalostomy en büyük güçlerinden biri onun için önemli olan özellikle yetişkin fareler16,18,28,29,30, iç kulak işlevi, en az hasara neden değerlendirme koruyucu etkileri ve çevirim yönleri için. Çeşitli gruplar canalostomy viral vektörler, siRNA, kök hücre ve aminoglikosite, gibi çeşitli reaktifler ve fare iç kulak18,19,28,29teslim etmek için kullandık, 34,35,36,37. Mevcut çalışmada, Yetişkin ve neonatal farelerde canalostomy adım adım, ayrıntılı cerrahi teknikleri nitelendirdi. Önceki çalışmalara göre bizim çalışma ek ayrıntılar semisirküler kanallar, konumlandırma üzerinde olan başarılı ameliyat için anahtar bir yordam sağlar. Şekil 2B ve C, gösterildiği gibi PSC ve LSC genellikle bulunduğu ~ 3 mm, 2-3 saat teleklerinin kökünden idi. LSC'yi yapıldı bir hasta için paralel uçaktan yaklaşık 30° açı ve PSC LSC'yi için dikey. Ayrıca, cerrahi işlemler Basitleştirilmiş ve yaklaşık 25 min karşılaştırılabilir sonuçlar29ile cerrahi süresi kısalır.
Canalostomy sırasında enjeksiyon yeri ve kanül tıkanması kaçağı önlemek için zorunludur. Pompa geçiş yapmadan önce kanül ucu semisirküler kanal eklenir ve kanül bükülmüş bloke veya değil emin olmak önemlidir. Kuru kas semisirküler kanal sıvı, huzurunda genişletir ve delik takılan çünkü yetişkin fareler semisirküler kanal delik mühürleme sırasında kullanılacak önerilir (2.6 ve 2.10 adımlara bakın). Yenidoğan farelerin semisirküler kanal duvar yumuşak ve kırılgan olduğundan, açılış kapsayan otojen kas veya tıbbi tutkal30tarafından kapalı olmalıdır. Biz de kanül açılması ile kas kapsayan olmadan kaldırıldı; sonuçları ortaya karşılaştırılabilir AAV iletim verimliliği iç kulak (veri) gösterilmez, PSC yenidoğan farelerin açılış tatmin edici kapalı olduğunu gösteren.
Başka bir canalostomy aynı veya farklı reaktifleri (Şekil 6), tekrarlayan uygulamalar sağlayan birden çok işlemleri, fizibilite avantajdır. Çünkü fibrotik ve granülasyon dokuları sık sık önceki cerrahi sitelerinde bulunan ve semisirküler kanal cerrahi34sonra engel, lateral farklı bir alanda tekrarlanan ameliyat sırasında enjeksiyonları gerçekleştirmek için tavsiye ve/veya posterior semisirküler kanallar18.
Ana canalostomy enjeksiyon kanül perilymphatic veya endolymphatic uzaya takılı olup olmadığını belirlemenin zor kısıtlamasıdır. Adenoviral vektörel çizimler içine canalostomy via iç kulak16 yönetim sonra en transduced hücreleri o bölgede gerçekleştirilen enjeksiyon olasılığı olduğunu mu ima perilymphatic uzayda bulunmaktaydı. Düşük moleküler ağırlıklı bileşikler (örneğin, AAV, streptomisin ve siRNA) perilymph ve endolymph bariyeri geçmek ve sonra perilymphatic veya endolymphatic alanı18,19 içine enjeksiyon duyu epiteli ulaşmak ,34. Perilymph ve endolymph16,39,40arasındaki bariyeri geçemez ancak, perilymph içine enjeksiyon sonra reaktifler perilymphatic uzayda kalabilir. Bu nedenle, enjekte reaktifler geçirgenliği canalostomy kullanmadan önce düşünülmelidir.
Sonuç olarak, canalostomy reaktifleri antre ve koklea içinde geniş ölçekli bir dağıtım en az rahatsızlık duyma ve vestibüler fonksiyon ile sonuçlanır. Ameliyatı kolayca yetişkin ve neonatal farelerde uygulanır ve gerekirse birden çok işlemleri gerçekleştirilebilir. Canalostomy böylece kemirgenler iç kulak içine ilaç dağıtım için etkili ve güvenli bir yaklaşım olduğunu ve gelecekte, klinik olarak insan cochleovestibular hastalıkları tedavi etmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbir çıkar çatışmaları bildirilir.
Acknowledgments
Bu eser Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin tarafından (grant numaraları 81570912, 81771016, 81100717) destek verdi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polymide Tubing | A-M Systems | 823400 | |
| Polyethylene Tubing | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/1 | |
| 10μl Microsyringe | Hamilton Company | 80001 | |
| Xylazine HCL | Sigma-Aldrich Co. Llc. | X-1251 | |
| Operating Miroscope | Carl Zeiss Optical LLC. | Pico | |
| Micro Forceps | Dumont Dumostar | 10576 | |
| Fast-green Dye | Sigma-Aldrich Co. Llc. | F7252 | |
| AAV8-GFP | BioMiao Biological Technology Co. Ltd (Beijing, China) | 20161101 | Titer: 2×10e12 vg/mL |
| Streptomycin Sulfate | Sigma-Aldrich Co. Llc. | S9137 | |
| Microinjection Pump | Stoelting Co. | 789100S | |
| Electric Pad | Pet Fun | 11072931136 | |
| 1 cc Syringe | Mishawa Medical Industries Ltd. (Shanghai, China) | 2011-3151258 | |
| Ketamine HCL | Gutian Pharmaceutical Co., Ltd. (Fujian, China) | H35020148 | |
| Electric Animal Clipper | Codos Electrical Appliances Co., Ltd. (Guangdong, China) | CP-8000 | |
| Cotton Pellet | Yatai Healthcare Ltd. (Henan, China) | Yu-2008-1640081 | |
| Suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. (Shanghai, China) | Hu-2013-2650207 | |
| Eye Ointment | Beijing Shuangji Pharmaceutical Ltd. (Beijng China) | H11021270 |
References
- Stachler, R. J., et al. Clinical practice guideline: sudden hearing loss. Otolaryngol Head Neck Surg. 146 (3 Suppl), S1-S35 (2012).
- Lentz, J. J., et al. Rescue of hearing and vestibular function by antisense oligonucleotides in a mouse model of human deafness. Nat Med. 19 (3), 345-350 (2013).
- Rivera, T., Sanz, L., Camarero, G., Varela-Nieto, I. Drug delivery to the inner ear: strategies and their therapeutic implications for sensorineural hearing loss. Curr Drug Deliv. 9 (3), 231-242 (2012).
- El Kechai, N., et al. Recent advances in local drug delivery to the inner ear. Int J Pharm. 494 (1), 83-101 (2015).
- Akil, O., Rouse, S. L., Chan, D. K., Lustig, L. R. Surgical method for virally mediated gene delivery to the mouse inner ear through the round window membrane. J Vis Exp. (97), e52187 (2015).
- Ahmed, H., Shubina-Oleinik, O., Holt, J. R. Emerging Gene Therapies for Genetic Hearing Loss. J Assoc Res Otolaryngol. 18 (5), 649-670 (2017).
- Murillo-Cuesta, S., et al. A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection. J Vis Exp. (121), e54951 (2017).
- Stevens, S. M., Brown, L. N., Ezell, P. C., Lang, H. The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration. J Vis Exp. (105), e53131 (2015).
- Salt, A. N., Plontke, S. K. Principles of local drug delivery to the inner ear. Audiol Neurootol. 14 (6), 350-360 (2009).
- Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).
- Pan, B., et al. Gene therapy restores auditory and vestibular function in a mouse model of Usher syndrome type 1c. Nat Biotechnol. 35 (3), 264-272 (2017).
- Kilpatrick, L. A., et al. Adeno-associated virus-mediated gene delivery into the scala media of the normal and deafened adult mouse ear. Gene Ther. 18 (6), 569-578 (2011).
- Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat Med. 11 (3), 271-276 (2005).
- Chang, Q., et al. Virally mediated Kcnq1 gene replacement therapy in the immature scala media restores hearing in a mouse model of human Jervell and Lange-Nielsen deafness syndrome. EMBO Mol Med. 7 (8), 1077-1086 (2015).
- Chen, Z., Mikulec, A. A., McKenna, M. J., Sewell, W. F., Kujawa, S. G. A method for intracochlear drug delivery in the mouse. J Neurosci Methods. 150 (1), 67-73 (2006).
- Kawamoto, K., Oh, S. H., Kanzaki, S., Brown, N., Raphael, Y. The functional and structural outcome of inner ear gene transfer via the vestibular and cochlear fluids in mice. Mol Ther. 4 (6), 575-585 (2001).
- Bowers, W. J., et al. Neurotrophin-3 transduction attenuates cisplatin spiral ganglion neuron ototoxicity in the cochlea. Mol Ther. 6 (1), 12-18 (2002).
- Wang, G. P., et al. Adeno-associated virus-mediated gene transfer targeting normal and traumatized mouse utricle. Gene Ther. 21 (11), 958-966 (2014).
- Isgrig, K., et al. Therapy Restores Balance and Auditory Functions in a Mouse Model of Usher Syndrome. Mol Ther. 25 (3), 780-791 (2017).
- Gassner, D., Durham, D., Pfannenstiel, S. C., Brough, D. E., Staecker, H. Canalostomy as a surgical approach for cochlear gene therapy in the rat. Anat Rec (Hoboken). 295 (11), 1830-1836 (2012).
- Yamasoba, T., Yagi, M., Roessler, B. J., Miller, J. M., Raphael, Y. Inner ear transgene expression after adenoviral vector inoculation in the endolymphatic sac. Hum Gene Ther. 10 (5), 769-774 (1999).
- Xia, L., Yin, S., Wang, J. Inner ear gene transfection in neonatal mice using adeno-associated viral vector: a comparison of two approaches. PLoS One. 7 (8), e43218 (2012).
- Chien, W. W., McDougald, D. S., Roy, S., Fitzgerald, T. S., Cunningham, L. L. Cochlear gene transfer mediated by adeno-associated virus: Comparison of two surgical approaches. Laryngoscope. 125 (11), 2557-2564 (2015).
- Zhu, B. Z., Saleh, J., Isgrig, K. T., Cunningham, L. L., Chien, W. W. Hearing Loss after Round Window Surgery in Mice Is due to Middle Ear Effusion. Audiol Neurootol. 21 (6), 356-364 (2017).
- Wang, Y., et al. Early postnatal virus inoculation into the scala media achieved extensive expression of exogenous green fluorescent protein in the inner ear and preserved auditory brainstem response thresholds. J Gene Med. 15 (3-4), 123-133 (2013).
- Lee, M. Y., et al. Survival of human embryonic stem cells implanted in the guinea pig auditory epithelium. Sci Rep. 7, 46058 (2017).
- Ishimoto, S., Kawamoto, K., Kanzaki, S., Raphael, Y. Gene transfer into supporting cells of the organ of Corti. Hear Res. 173 (1-2), 187-197 (2002).
- Okada, H., et al. Gene transfer targeting mouse vestibule using adenovirus and adeno-associated virus vectors. Otol Neurotol. 33 (4), 655-659 (2012).
- Suzuki, J., Hashimoto, K., Xiao, R., Vandenberghe, L. H., Liberman, M. C. Cochlear gene therapy with ancestral AAV in adult mice: complete transduction of inner hair cells without cochlear dysfunction. Sci Rep. 7, 45524 (2017).
- Guo, J. Y., et al. Cochleovestibular gene transfer in neonatal mice by canalostomy. Neuroreport. 28 (11), 682-688 (2017).
- Beyea, J. A., Agrawal, S. K., Parnes, L. S. Transmastoid semicircular canal occlusion: a safe and highly effective treatment for benign paroxysmal positional vertigo and superior canal dehiscence. Laryngoscope. 122 (8), 1862-1866 (2012).
- Naples, J. G., Eisen, M. D. The History and Evolution of Surgery on the Vestibular Labyrinth. Otolaryngol Head Neck Surg. 155 (5), 816-819 (2016).
- Hamilton, L., Keh, S., Spielmann, P. M., Hussain, S. S. How we do it: locating the posterior semicircular canal in occlusion surgery for refractory benign paroxysmal positional vertigo: a cadaveric temporal bone study. Clinical Otolaryngology. 41 (2), 190-193 (2016).
- Jung, J. Y., et al. siRNA targeting Hes5 augments hair cell regeneration in aminoglycoside-damaged mouse utricle. Mol Ther. 21 (4), 834-841 (2013).
- Kamiya, K., et al. Mesenchymal stem cell transplantation accelerates hearing recovery through the repair of injured cochlear fibrocytes. Am J Pathol. 171 (1), 214-226 (2007).
- Pfannenstiel, S. C., Praetorius, M., Plinkert, P. K., Brough, D. E., Staecker, H. Bcl-2 gene therapy prevents aminoglycoside-induced degeneration of auditory and vestibular hair cells. Audiol Neurootol. 14 (4), 254-266 (2009).
- Kawamoto, K., Izumikawa, M., Beyer, L. A., Atkin, G. M., Raphael, Y. Spontaneous hair cell regeneration in the mouse utricle following gentamicin ototoxicity. Hear Res. 247 (1), 17-26 (2009).
- Wang, G. P., et al. Notch signaling and Atoh1 expression during hair cell regeneration in the mouse utricle. Hear Res. 267 (1-2), 61-70 (2010).
- Pietola, L., et al. HOX-GFP and WOX-GFP lentivirus vectors for inner ear gene transfer. Acta Otolaryngol. 128 (6), 613-620 (2008).
- Han, J. J., et al. Transgene expression in the guinea pig cochlea mediated by a lentivirus-derived gene transfer vector. Hum Gene Ther. 10 (11), 1867-1873 (1999).
