Summary
우리는 다 잘 형식 polyacrylamide 기반 분석 결과 부착 세포의 세균성 감염에 기질 경직성의 영향 조사에 대 한 개발 했습니다. 이 분석 결과 cytometry, immunostaining, 그리고 견인 힘 현미경 검사 법, 양적 측정 셀, 그들의 기질, 및 병원 성 박테리아 사이 biomechanical 상호 작용의 수와 호환 됩니다.
Abstract
세포 외 기질 강성 일반적 기능, 세포질 행동과 운명에 영향을 잘 알려진 여러 환경 기계 자극 중 구성 되어 있습니다. 하지만 점점 더 많은 부착 세포 유형 응답 매트릭스 강성, 성격 어떻게 세포의 민감성 세균 감염에 매트릭스 강성에 따라 점착으로 크게 알려진 이다 세균성 감염의 효과에 호스트 세포의 역학입니다. 우리는 세균 감염을 호스트 내 피 세포의 민감성이이 세포 상주 하는 매트릭스의 강성에 따라 달라 집니다 그리고 그들의 역학 변경 됩니다 호스트의 감염 박테리아와 세포 가설. 이러한 두 가지 가설을 테스트 하기 위해 내 피 세포 모델 병원 체로 모델 호스트 및 Listeria monocytogenes 로 사용 되었다. 소설 다 잘 포맷 분석 결과 개발 하 여 우리는 L. monocytogenes 여 내 피 세포의 감염에 매트릭스 강성 효과 양적 cytometry 및 immunostaining 뒤에 현미경 검사 법을 통해 평가 될 수 있다 다는 것을 보여줍니다. 또한, 견인 힘 현미경 검사 법을 사용 하 여 호스트 내 피 세포 역학에 L. monocytogenes 감염의 효과 수 공부 될. 셀, 그들의 기질 간의 biomechanical 상호 이해를 향한 중요 한 단계는 부착 세포의 세균성 감염에 조직 관련 역학의 영향의 분석에 대 한 수 있습니다 제안된 된 방법 및 병원 성 박테리아입니다. 이 메서드는 또한 다양 한 다른 유형의 세포 역학 및 기판 강성에 대 한 응답에 대 한 연구에 적용 가능한 각 실험에 동시에 많은 복제를 수행할 수 있어야 하는 것이 중요 이죠.
Introduction
대부분 동물의 조직에서 세포는 일반적으로 부착 하 고, 이웃 세포와의 세포 외 기질 (ECM) 연결. 그들의 ECM에 세포의 앵커리지 확산 및 생존1,2셀을 셀 운동에서 배열 하는 많은 세포질 과정을 위해 중요 하다. ECM에 세포 앵커리지 ECM 구성과 강성에 따라 달라 집니다. 동적으로 자신의 골격, 차례로 비판적으로 변경할 셀 역학 및 기능3,,45,6 세포-ECM 및 셀 유착을 다시 정렬 하 여 후자에 있는 변화에 응답 하는 셀 . ECM 경직 시간 (즉, 노화), 그리고 pathophysiological 프로세스 (예를 들면, 동맥 경화, 암, 감염, 등) 공간 (즉, 해 부 위치), 달라질 수 있습니다. 예를 들어, 그것은 널리 그 내 피 세포에 엄격한-부드러운 행렬에 비해 그들의 ECM을 서로 게 증가 된 힘을 발휘 하 고 증가 운동 성 및 확산7,8전시. 마찬가지로, fibroblasts 엄격한 행렬에 있는 그들의 ECM 높은 수축 성 힘을 느 꼈 고 증가 확산, 운동 성, 및 ECM 생산9,,1011. 비록 셀 역학 및 ECM 강성에 대 한 응답 연구 광범위 하 게 다양 한 세포 유형, 부착 호스트 셀 사이의 관계에 대 한 그들의 ECM, 그리고 세균 감염의 강성 여전히 크게 불명 하다.
ECM 강성 박테리아 호스트 세포 상호 작용의 역할을 연구 하기 L. monocytogenes (Lm) 모델 병원으로 선정 되었다. Lm은 다양 한 포유류 호스트에서에서 조직의 감염을 일으킬 수 있는 유비 쿼터 스 음식을 매개로 박테리아 이다. 이 facultative 세포내 병원 체는 혈관 endothelia의 다른 종류를 이동 하 여 먼 장기에 장 상피에서 이동할 수 있습니다. 혈액-뇌 장벽을 위반, Lm 수 막 염, 발생할 수 있습니다 하 고 태 반을 십자가, 그것은 자연 유산12,13발생할 수 있습니다. Lm 종류 다른 호스트를 감염 시킬 수 있습니다 그리고 뚜렷한 병원 성 전략을 사용 하 여 이렇게 수 있습니다. Lm 감염 Lm 감염 시킬 수 있는 방법에 대해 훨씬 덜 알려져 있지만 고 혈관14,,1516의 루멘을 일렬로 세우는 바이패스 내 피 세포 상피 세포의 맥락에서 주로 공부 되었습니다 했다. 또한, 그것은 하지 아직 크게 알려진 내 피 세포가 있는 ECM의 강성이 호스트 세포를 침입 하 고 다음 확산 Lm의 능력을 변조 하는 어떻게. Lm 및 몇 가지 추가적인 세균 종 (즉, 리케차 parkeri) 그들은 둘 다 감염 세포 그들의 세포질에 침략 하 고 촉진 셀 보급17 호스트의 말라 골격의 활용 , 18 , 19. 그들은 그들이 호스트 걸 중 합 경로와 방해 하 고 그들의 앞으로 추진16,20를 용이 하 게 말라 혜성 꼬리를 생산 하는 단백질의 표현을 통해 달성. 감염의 결과로 주인 세포의 말라 골격 특징 아직도 완전히, 잠재적으로 그들은 그들의 ECM에 고 각을 발휘 하는 물리적인 힘을 포함 하 여 호스트 셀의 역학에 영향을 미치는 방식으로 동적으로 다시 정렬할 필요가 다른. 이러한 프로세스 검사, 인간의 microvascular 내 피 세포 (HMEC-1) 선택 되었다 모델 호스트 셀 세 가지 이유: 1. 내 피 세포로 그들은 끊임없이 물리적 신호21; 변화에 노출 되는 mechanosensitive을 높은 것으로 알려져 있습니다 2. Lm 내 피 세포를 감염 시키기 위해 사용 하는 전략은 여전히 크게 알 수 없는22; 그리고 3입니다. HMEC-1는 불멸 하 게 셀 라인 고 수, 그러므로, 쉽게 경작 되며 유전자 조작 대상이.
호스트 세포의 세균성 감염 유리 또는 폴리스 티 렌 기판은 대부분 셀12,,1423의 생리 ECM 보다 훨씬 엄격한 셀 시드 여 공부 생체 외에서 주로 왔다. 누구의 강성은 순수 관련 매트릭스에 시드 세포의 감염을 확인 하 고 세균성 병원 체에 의해 세포의 감염에 ECM 강성의 역할을 명료 하, 우리 따라 얇은 조작에 따라 혁신적인 접근 microbead 임베디드 polyacrylamide hydrogels 다 잘 판에 가변 강성의. 제안 된 방법의 참신은 그는 다 잘 포맷으로 동시에 여러 조건을 모니터링 수 호환 기판에 내장 되어 특정 방법에의 한 여러 기술에 있습니다. HMEC-1 세포에이 단백질 코팅 hydrogels 시드 되었고 감염 되 고 국제화에 따라 형광 또는 constitutively 형광은 다른 Lm 긴장 된. 호스트 HMEC-1 세포의 감염 민감성에 ECM 강성 역할 cytometry에 의해 평가 되었다. 또한, immunostaining 및 형광 현미경 고집 하 고 내 면 박테리아를 사용 되었다. 마지막으로, 견인 힘 현미경 검사 법 (TFM) 감염 동안 그들의 행렬에 호스트 내 피 세포 발휘 견인 스트레스에 Lm 감염의 영향을 특성을 성공적으로 수행 되었다. 제시 분석 결과 다른 세포 또는 병원 체를 사용 하 여 부착 세포의 감염 민감성에 ECM 경직성의 영향에 대 한 연구를 더 사용 하도록 쉽게 수정할 수 있습니다.
Protocol
1. 다 잘 판에 얇은 2 층 Polyacrylamide (PA) Hydrogels 제조
- 10 g/mL의 최종 농도 달성 하기 위해 초순 증류수에 염화 persulfate (AP)를 분해. 약 수 고가 단기 사용 (3 주) 4 ° C에서 솔루션.
참고: 위의 솔루션 하이드로 겔 제조에 앞서 준비 될 수 있다. -
24-잘 접시의 유리 활성화
- 실 온에서 잘 당 2 M NaOH의 500 µ L 1 h 24 잘 유리 하단 접시 13 m m 직경 웰 스 ( 재료의 표참조)를 품 어.
- 우물 1 린스 초순 x 2% (3-Aminopropyl) triethoxysilane의 500 µ L 추가 ( 재료의 표참조) 각 95% 에탄올에 5 분 동안 잘.
- 린스 물으로 다시 x 1 우물과 30 분 린스 우물 1 동안 각 잘에 0.5%도 500 µ L를 추가 물으로 x 뚜껑 60 ˚C에서 그들을 건조.
그림 1 : 다양 한 경직의 얇은 2 층 형광 구슬 포함 polyacrylamide (PA) hydrogels에 호스트 세포의 분석 결과 세균 감염. A. 유리 coverslips 화학적 히드로 첨부 파일을 사용 하도록 수정 됩니다. B. PA 혼합물의 3.6 µ L 유리 바닥에 입금 됩니다. C. 혼합물 중 합 수 있도록 12 m m 원형 유리 coverslip 덮여 있다. D.는 coverslip 바늘 주사기와 함께 제거 됩니다. E. microbeads PA 솔루션의 2.4 µ L 하단 레이어 위에 추가 되 고 원형 유리 coverslip 났 고요. F. 버퍼에 잘 추가 되 고는 coverslip 제거 됩니다. G. 1 시간에 대 한 UV 방사선 살 균을 보장. H. Sulfo SANPAH 포함 된 솔루션 젤, 다음 10 분 나에 대 한 자외선 아래에 배치 됩니다에 추가 됩니다. hydrogels 버퍼와 세척 되며 다음 콜라겐 I. J밤새 껏 알을 품. 히드로 셀 미디어 equilibrated입니다. K. 호스트 셀 시드. L. Lm 박테리아 솔루션에 추가 되 고 감염 원심 분리를 통해 동기화 됩니다. M. 1 시간 후 감염 박테리아 솔루션에 멀리 세척 된다 고 미디어 항생제와 보충 추가 됩니다. N.에서 4 h 후 감염, Lm (JAT985) fluorescing 시작. O. HMEC-1 세포는 그들의 매트릭스에서 분리 및 솔루션 흐름 cytometry 측정을 수행 관에 전송 됩니다. 참고 일 및 분석 결과의 각 단계에 대 한 대략적인 시간 표시도 됩니다. 이 그림은 Bastounis 및 Theriot59에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Polyacrylamide 하이드로 겔 제조
: 참고 그림 1.- 40% 재고 아크릴 솔루션의 3-10%를 포함 하는 수성 솔루션을 준비 ( 재료의 표참조)와 0.06-0.6%의 2% 재고 두번째 아크릴 솔루션 ( 재료의 표참조) 0.6에서 배열 하는 가변 강성 hydrogels 제조 70 kPa에 인민군입니다. 표 1을 참조 하십시오.
- 0.6 kPa hydrogels 0.045% 두번째-아크릴과 3% 아크릴 아 미드를 섞는다. 3 kPa hydrogels 0.074% 두번째-아크릴과 5% 아크릴 아 미드를 섞는다. 10 kPa hydrogels 0.075% 두번째-아크릴과 10% 아크릴 아 미드를 섞는다. 20 kPa hydrogels 0.195% 두번째-아크릴과 8% 아크릴 아 미드를 섞는다. 70 kPa hydrogels에 대 한 10% 아크릴 0.45% 두번째-아크릴 믹스.
참고: 바람직한 PA 하이드로 겔 강성을 달성 하는 대 한 자세한 내용은 찾을 수 있습니다 다른24,25,,2627.
- 0.6 kPa hydrogels 0.045% 두번째-아크릴과 3% 아크릴 아 미드를 섞는다. 3 kPa hydrogels 0.074% 두번째-아크릴과 5% 아크릴 아 미드를 섞는다. 10 kPa hydrogels 0.075% 두번째-아크릴과 10% 아크릴 아 미드를 섞는다. 20 kPa hydrogels 0.195% 두번째-아크릴과 8% 아크릴 아 미드를 섞는다. 70 kPa hydrogels에 대 한 10% 아크릴 0.45% 두번째-아크릴 믹스.
- 각 바람직한 하이드로 겔 강성에 대 한 두 개의 수성 솔루션을 준비 합니다. 솔루션 1 준비 구슬 무료 솔루션 2 0.03 %0.1 µ m 직경 형광 마이크로-비즈 ( 재료의 표참조)를 포함 하 고.
- 드가 솔루션 1과 솔루션의 중 합을 억제 하는 산소를 제거 15 분 동안 진공에 의해 2.
- 중 합 개시 수 있도록 솔루션 1 10 g/mL 재고 APS 솔루션 및 0.43 %tetramethylethylenediamine (TEMED)의 0.6%를 추가 합니다. 빨리 행동.
- 솔루션 1의 3.6 µ L 24-잘 접시의 각 우물의 센터에 추가 ( 단계 1.2 준비 참조).
- 즉시 12 m m 치료 원형 coverslips와 우물을 커버 하 고 솔루션 1을 완전히 polymerizes 20 분 동안 앉아 보자.
- 부드럽게는 coverslips의 제거를 촉진 하기 위하여 그것의 끝에 작은 걸이를 만드는 표면에 주사기 바늘을 누릅니다. 주사기 바늘을 사용 하 여 coverslips를 들어올립니다.
- 10 g/mL 재고 APS 솔루션의 0.6% 및 0.43% 추가 TEMED 솔루션 2. 24-잘 접시의 각 우물에서 첫 번째 레이어 위에 혼합물의 2.4 µ L를 입금.
- 12 m m 원형 유리 coverslips 솔루션 2 커버, 부드럽게 눌러 아래쪽으로 집게의 쌍을 사용 하 여 두 번째 층의 두께 보장 하기 위해 최소한의. 20 분에 대 한 유해 솔루션 2를 보자.
- 각 우물의 50 mM HEPES pH 7.5의 500 µ L을 추가 하 고 주사기 바늘과 포 셉으로 유리 coverslips 제거.
- 40% 재고 아크릴 솔루션의 3-10%를 포함 하는 수성 솔루션을 준비 ( 재료의 표참조)와 0.06-0.6%의 2% 재고 두번째 아크릴 솔루션 ( 재료의 표참조) 0.6에서 배열 하는 가변 강성 hydrogels 제조 70 kPa에 인민군입니다. 표 1을 참조 하십시오.
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살 균, 콜라겐 코팅 및 polyacrylamide hydrogels의 평형
- UV-노출 조직 문화 후드에서 1 h hydrogels 살 균 수 있도록 합니다.
- 0.5% 무게/볼륨 sulfosuccinimidyl 6-(4 '-azido-2-nitrophenylamino) hexanoate의 혼합물 준비 (Sulfo SANPAH 테이블의 자료를 참조) 1 %DMSO 및 50 mM HEPES pH = 7.5.
- hydrogels의 상부 표면에이 솔루션의 200 µ L를 추가 합니다. UV에 그들을 노출, 행동 (302 nm) 10 분 그들을 활성화.
- 50 mM HEPES pH의 1 mL로 두 번 hydrogels 세척 = 7.5. 반복 모든 초과 crosslinker 되도록 필요한 경우 제거 됩니다.
- 단백질 코트 0.25 mg/mL 쥐의 200 µ L로 hydrogels 콜라겐 꼬리 나 ( 재료의 표참조) 50 mm HEPES의. 하룻밤 실 온에서 위에 콜라겐 솔루션 hydrogels 품 어.
참고: 탈수/증발을 방지 하기 위해, 다 잘 판 보조 제약에 놓고 실험실 청소 조직 견제의 내부 주변에 물에 젖 었을 추가 합니다. - hydrogels의 두께 측정 하는 epifluorescence 또는 confocal 현미경 40 X 목적으로 사용 합니다. (유리 표면이) 아래쪽의 z 위치를 찾는 여 고 (형광 구슬의 강도 최대) 하이드로 겔의 비행기를 탑. 다음 높이 결정 하는 z 위치를 뺍니다.
참고: 우리가 사용 거꾸로 epifluorescence 현미경과 40 X 목표 숫자 조리개 0.65는 hydrogels의 두께 측정 하. 원자 힘 현미경 측정 (AFM) 또한 hydrogels ( 그림 2참조)의 정확한 강성을 확인 하려면이 시점에서 수행할 수 있습니다. - hydrogels에 관심사의 세포를 뿌리기 전에 hydrogels에 미디어의 1 mL을 추가 하 고 평형 되도록 1 시간 30 분 37 ˚C에 그들을 품 어.
참고: 우리가 있기 때문에 미디어 모델 호스트 셀 (HMEC-1) (참조 단계 2.1 자세한)에서 경작 했다 MCDB 131 전체 미디어 추가.
그림 2: PA 하이드로 겔 강성과 구슬 유통의 AFM 측정. A. 데이터 표시 예상된 영의 계수 (뻣 뻣 함의 측정) PA의 아크릴 아 미드의 양을 주어진 hydrogels 두번째-아크릴 AFM 통해 측정 하는 영의 계수 대 사용 (N = 5-6). 가로 바 평균 묘사. hydrogels 매우 부드럽고 AFM 팁을 준수 때문에 0.6 kPa hydrogels의 강성을 측정할 수 없습니다. B. confluent HMEC-1 셀의 위상 이미지 이며 부드러운 3 kPa PA 하이드로 겔의 최고 표면에 포함 된 구슬의 해당 이미지. HMEC-1 잘 당 4 x 105 셀의 농도에 24 h에 대 한 시드 했다. C.이 이미지는 동일한 그림 2B 하지만 뻣 뻣 한 70 kPa PA 히드로에 있는 셀에 대 한. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
2. 인간의 Microvascular 내 피 세포 배양 및 Hydrogels에 시드
- HMEC-1 문화 (인간, microvascular 내 피) 셀 MCDB 131 전체 MCDB 131 미디어 10% 태아 둔감 한 혈 청, 상피 증가율의 10 ng/mL, 1 µ g/mL 날린, 2 m m L-글루타민 (참조 테이블의 자료의 보충을 포함 하는 미디어 ).
- 분할 confluent 문화 1:6 3-4 일 마다 고 통과 40까지 셀을 계속.
- 실험에 앞서 1 일 0.25 %trypsin / EDTA를 사용 하 여 그들의 문화 그릇에서 세포를 분리 합니다. 먼저 씻고 셀과 그들의 문화 그릇 1 x와 무 균 성 식 염 수 (PBS), 버퍼링 및 다음 5-10 분 동안 37 ° C에서 플라스 크 배양 0.25 %trypsin / 100 mm 접시 또는 75 cm 플라스 크, 60 mm 접시 또는 플라스 크 25 cm 당 1 mL 당 (2 mL), EDTA의 적절 한 금액을 추가 그들의 기질에서 세포의 분리 허용
- MCDB 131 전체 미디어를 피펫으로 세포의 대단히 짧은 시간을 휴식 하 고 다음 솔루션 원뿔 원심 분리기 튜브를 부드럽게 원하는 볼륨을 추가 하 여는 트립 신을 무력화.
- 부드럽게 셀은 고르게 분포 하 고 솔루션의 20 µ L를 꺼내 셀의 솔루션 소용돌이 고 매우 부드럽게 유리 hemocytometer의 coverslip 아래 두 챔버 입력.
- 500 x g에서 10 분 동안 원심 분리를 사용 하 여 원뿔 원심 분리기 튜브에 들어 있는 셀의 솔루션 아래로 작은.
- 10 분 대기 기간 동안는 hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 현미경을 사용 하 여, 10 X 목표 hemocytometer의 눈금선에 집중 하 고 손을 집계 카운터를 사용 하 여 한 1mm x 1mm 광장에 있는 세포의 수를 계산 하.
- hemocytometer 다른 1mm x 1mm 광장, 거기 셀 이동한 다음 두 번 더 프로세스를 반복 합니다. 4 개의 측정의 평균을 계산 하 고 다음 10을 곱하면 평균4. 최종 값은 가능한 셀/mL centrifuged 되 고 세포 현 탁 액에서.
- 하면서 셀 펠 렛을 방해 하지는 원뿔 원심 분리기 튜브 액체를 제거 합니다. 4 x 105 셀/mL의 농도에서 MCDB 131 전체 미디어에 셀 resuspend
- 씨에 먼저 제거 되는 hydrogels incubated 했다 미디어 각 히드로에 세포 현 탁 액 1 mL를 추가 하 여 hydrogels에 셀.
3. L. monocytogenes 와 인간의 Microvascular 내 피 세포의 감염
- 사전 준비
참고: 다음 솔루션을 사전에 준비 합니다.-
스, 페니, 및 gentamicin 주식
- 스 황산 0.5 g의 무게와 완전히 초순의 10 mL에 용 해 하 여 50 mg/mL 스의 재고 솔루션을 준비 합니다.
- 페니의 75 밀리 그램의 무게와 완전히 100% 에탄올 10 mL에 용 해 하 여 7.5 mg/mL의 페니 재고 솔루션을 준비 합니다.
- Gentamicin 황산의 0.2 g의 무게와 완전히 초순의 10 mL에 용 해 하 여 20 mg/mL gentamicin의 재고 솔루션을 준비 합니다.
- 0.2 µ m 주사기 필터 모든 재고 솔루션 필터 소독 하 고 장기간 사용 (1-2 개월)-20 ° C에서 그들을 저장 합니다.
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두뇌 심 혼 주입 (BHI) 미디어와 한 천 플레이트
- 2 1 L 플라스 크를 찾아서 각 플라스 크 안에 자기 볶음 바 추가.
- BHI 미디어 한 플라스 크에 BHI 가루 37 g을 추가 하 고 추가 1 L. 믹스까지 초순 솔루션 적극적으로 분말 해산 될 때까지 자기 저 어 접시에 플라스 크를 배치 하 여.
- BHI agar 번호판에 대 한 추가 BHI 분말 및과 립된 한 천 15 g 37 g ( 재료의 표참조) 두 번째 플라스 크에 추가 1 L. 믹스까지 초순 솔루션 적극적으로 분말 해산 될 때까지 자기 저 어 접시에 플라스 크를 배치 하 여.
- 너무 밀접 하 게는 플라스 크의 뚜껑을 나사와 압력솥 설정 또는 압력솥의 사양에 따라 액체를 사용 하 여 솔루션.
- 압력솥에서 솔루션을 제거 후 진정 55 ° c agar BHI 솔루션 BHI 미디어 1 L 플라스 크에 살 균 보관, 경우 그것에 대 한 사용할 수 있습니다 한 달.
- 박테리아 agar-BHI 접시를 준비 하려면 BHI과 한 천 (에 따라 성장 수에 세균성 긴장)를 포함 하는 플라스 크에 해당 되는 경우 먼저 항생제를 추가 합니다. 짧게 빠른 혼합 수 있도록 자기 저 어 접시에 플라스 크를 넣어.
참고: 여기에 사용 되는 항생제 사용, Lm 긴장에 있지만 BHI-한 천 배지에서 모든 필요한 항생제를 사용할 수 있습니다. 우리 200 µ g/mL와 7.5 µ g/mL의 농도에 페니의 농도 때문에 10403S Lm 긴장은 스 스 추가. 이 긴장 되어 저항을 페니 페니 acetyltransferase 열려있는 독서 프레임, 따라서를 포함 하는 플라스 미드와 활용. - 붓고 혼합물 10 cm 폴리스 티 렌 박테리아 문화 접시 (접시 당 약 20 mL). 거품의 제거, 하 판 상부 표면을 짧게 불꽃. 실 온에서 하룻밤 멋진 접시입니다.
- 다음 날, 건조 번호판 봉인 및 4 ° c.에서 그들을 저장합니다
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스, 페니, 및 gentamicin 주식
- L. monocytogenes 와 인간의 microvascular 내 피 세포의 감염
- 3 일 감염, 전에 Lm 밖으로 행진 페니의 7.5 µ g/mL와 200 µ g/mL 스, 필요한 경우 포함 된 BHI 천 배지에 글리세롤 재고 (-80 ° C에 저장)에서 사용할 수 스트레인.
참고: 밖으로 줄무늬를 스트레인 수 야생-타입 또는 돌연변이, constitutively (immunostaining JAT1045 사용)에 대 한 형광을 표현 하거나 표현 (교류 cytometry 또는 견인 힘 현미경 JAT983 또는 JAT985에 대 한 액 타 발기인에서 형광 사용 된)22. - 개별 식민지 형성 (1-2 일) 때까지 37 ° C에서 접시를 품 어.
- 감염, 전날 성장 원하는 스트레인 하룻밤, BHI 미디어 페니 (적절 한 경우)의 7.5 µ g/mL에서에서 30 ° C에서 150 rpm에서 그것을 동요.
- 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에서 BHI 미디어의 장소 5 mL의 페니 (적절 한 경우), 7.5 µ g/mL를 추가 하 고 접종 균 10 µ L 팁을 사용 하 여 한 천 배지에서 단일 식민지.
- 다음 날, 감염, 직전 600 박테리아 솔루션의 광학 밀도 측정 샘플 1:5; diluting 하 여 nm (OD600) 포함 된 BHI 베트를 사용 하 여 빈 역할을 혼자.
- 0.1의 OD600에 숙박 문화를 희석 하 고 도달 로그 단계 성장 박테리아 수 있도록 BHI 미디어 페니 (적절 한 경우)의 7.5 µ g/mL에서에서 30 ° C에서 2 h 동안 흔들어,에 품 어.
- 0.2-주위에 있을 것으로 예상 된다 세균성 솔루션의 OD600를 측정 0.3. OD600 높은 경우 0.2-희석 BHI 혼자와 0.3.
- Microcentrifuge 튜브에 세균성 솔루션의 1 mL를 가져가 라. 상 온에서 원심 분리를 사용 하 여 2000 x g에서 4 분 아래로 회전 합니다. 상쾌한을 제거 하 고 조직 문화-학년 PBS, 조직 문화 후드에서의 1 mL에서 세균 펠 릿 resuspend. 두 번 4 분 실 온에서 2000 x g에서 그들을 회전 하 여 더 많은 박테리아를 씻으십시오. 상쾌한을 제거 하 고 PBS의 1 mL에 박테리아를 resuspend.
- 박테리아 감염 (MOI;의 다양성에 대 한 전체 미디어 MCDB-131의 1 mL와 함께 PBS에 resuspended의 10 또는 50 µ L를 혼합 하 여 감염 믹스를 준비 즉, 호스트 셀 당 박테리아 수) 호스트 셀 또는 호스트 셀 당 10 박테리아 당 약 50 박테리아의.
- 24-잘 접시는 hydrogels 또는 셀을 방해 하지 않도록 주의의 우물에서 미디어를 제거 합니다. 1 세포를 씻어 MCDB-131의 1 mL x 미디어 고 다음 각 우물에 박테리아의 1 mL를 추가.
- 나의 결정에 대 한 일부 감염 믹스 (적어도 100 µ L) 유지 ( 단계 3.3참조).
- 접시의 뚜껑을 커버 하 고 번호판을 누설을 피하기 위해 폴 리 에틸렌 식품 포장 포장. 원심 분리기에 접시를 놓고 동기화 침공을 200 x g에서 10 분에 대 한 샘플을 회전 합니다. 조직 문화 인큐베이터에 접시를 이동 하 고 37 ° c.에 30 분 동안 그들을 품 어
- 샘플 4 워시 MCDB 131 x 미디어 고 조직 문화 인큐베이터로 이동. 추가 30 분 후 gentamicin의 20 µ g/mL와 함께 보충 하는 미디어와 미디어를 교체 합니다.
- 3 일 감염, 전에 Lm 밖으로 행진 페니의 7.5 µ g/mL와 200 µ g/mL 스, 필요한 경우 포함 된 BHI 천 배지에 글리세롤 재고 (-80 ° C에 저장)에서 사용할 수 스트레인.
- 감염 (MOI)의 다양성의 결정
- 박테리아와 호스트 세포의 초기 30 분 인큐베이션 기간 동안 감염 혼합 결정은 나의 10 연속 희석을 준비 합니다. 1 x PBS (10-1 희석)의 900 µ L로 감염 믹스 100 µ L를 혼합 하 여 10 희석을 확인 합니다. 그런 다음 900 µ L의 PBS (10-2 희석)와 10-1 희석의 100 µ L를 혼합.
- 10-5 희석 얻을 때까지 계속 합니다.
참고: 모든 솔루션, 그들을 희석 하기 전에 잘 혼합 될 필요가 있고 각 단계에서 신선한 깨끗 한 피 펫 팁을 사용 해야 합니다. - 일단은 희석 만들어집니다, 100 µ L를 10-2 -BHI/한 천/페니/스 판 (적절 한 경우)의 중심에 10-5 희석의 장소.
- 후크를 만들을 피 펫을 구 부 화재를 사용 하 여 유리 피 펫에서 분산기를 확인 합니다. 살 균에 대 한 100% 에탄올에 피펫으로 다음 에탄올 불꽃을 태워.
- 일단 스프레더 냉각은, 10-5 희석에서 시작 하 고 더 집중된 믹스 이동 접시에 균질 세균 희석 확산. 2 일 동안 37 ° C에서 거꾸로 접시를 품 어.
- 식민지 밀도 따라 10-3 , 10-4 또는 10-4 및 10-5 희석 플레이트의 식민지의 수를 결정 합니다. 나는 다음과 같이 계산.
식민지 × 희석 비율 ÷ 볼륨의 초기 추가 번호 = µ L 당 CFU의 수
잘 당 박테리아 믹스의 µ L × 볼륨 당 CFU의 수 = 잘 당 CFU의 수
잘 당 세포의 잘 × 볼륨 당 CFU의 수 = 셀당 박테리아의 수
참고: CFU 식민지 형성 의미 단위. - 마지막 개월을 두 접시에서 개월 평균.
4. 감염 호스트 세포의 세포 외 매트릭스 강성 종속 민감성 척도 Cytometry
- 콜라의 5 밀리 그램의 무게를 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 넣습니다. 0.25 %trypsin-EDTA의 10 mL을 추가 하 고 그들을 잘 섞는다.
- 8 h 감염 된 후, 24-잘 접시의 우물에서 미디어를 제거 하 고 세척 우물 1 조직 문화 PBS와 x. 우물에서 PBS를 제거 하 고 각 우물에 트립 신-EDTA/콜라 믹스의 200 µ L를 추가 합니다. 이 셀의 완전 분리를 허용 하도록 10 분 동안 조직 문화 인큐베이터에 배치 합니다.
- 신선한 피 펫을 사용 하 여 각 음을 피펫으로 8 x 위아래로 믹스. 셀을 손상 하지 있도록 부드러운 수 있습니다. 각 잘 중화는 트립 신에 전체 미디어의 200 µ L를 추가 합니다.
- 35 µ m 셀 스 트레이너 캡 5 mL 폴리스 티 렌 튜브에의 각 400 µ L 셀 솔루션을 전송 ( 재료의 표참조).
- 샘플 당 10000-20000 셀 cytometry 분석. Cytometry 통해 데이터 수집을 수행 하 고 관련 상용 소프트웨어를 사용 하 여 잘 당 감염 된 세포의 백분율을 결정 합니다. 측 점도 대 앞으로 분산형을 사용 하 여 셀 수의 분포의 게이트.
참고:이 단일 세포의 분석을 확인 하 고 파편 또는 셀 남자 세 쌍둥이 제거 것입니다.- 제어 감염 되지 않은 세포에서 형광 신호를 측정 하 고 게이트 autofluorescence를 제외 하 고 감염 된 세포의 인구.
5. Immunostaining Extracellular 박테리아, 현미경 및 이미지 처리
참고:이 방법은 호스트 내에서 세균 국제화 (침공) 대 호스트 세포 표면에 ECM 강성 종속 세균성 접착을 구분 하는 것 따라 이다.
그림 4 : Lm 감염 HMEC-1 Immunostaining 세포 침공 대 세균성 접착을 차별화 하는 다양 한 경직의 hydrogels에. 이러한 이미지는 차동 immunostaining A를 보여주는 대표적인 예를 표시 합니다. 세포 핵 (DAPI), B. 모든 박테리아 (GFP), 그리고 C. 외부 박테리아 (알 렉 사-546)입니다. HMEC-1 셀 소프트 3-kPa 하이드로 겔에 거주 했다. 화살표만 녹색 채널에 표시 됩니다 그래서 내 되는 박테리아를 가리키면 됩니다. D-데이터 NF 참조 = 20 이미지 부드러운 3-kPa와 뻣 뻣 한 70 kPa hydrogels와 D를표시 에 있는 감염 된 HMEC-1 셀에 대 한 점령. 핵; 당 총 박테리아 E. 핵; 당 내 면된 박테리아 그리고 F. 침공 효율 (총 박테리아 내 면된 박테리아의 비율). 가로 막대가 데이터의 평균을 묘사. P-값 계산 비패라메트릭 Wilcoxon 순위 합계 테스트와 함께. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
- 30 분 후 감염, 세척 HMEC 1 셀 JAT1045 감염 (constitutively 녹색 형광 단백질 (GFP)를 표현 하는 Lm) 4x 미디어와 함께.
- 4 세척 후 MCDB 131 전체 미디어의 1 mL와 1 mg/mL의 1 µ L Hoechst 염료를 혼합 하 고 각 잘 얼룩 세포의 핵에 추가 합니다. 10 분 동안 조직 문화 인큐베이터에 셀을 놓습니다.
- 1 세포를 씻어 PBS와 x. 실내 온도28에서 20 분에 대 한 차동 immunostaining에 대 한 비 permeabilizing 정착 액으로 그들을 수정.
참고:는 정착 액에는 0.32 M 자당을, 10mm MES pH 6.1, 138 mM KCl, 3 m m MgCl2, 2mm EGTA, 및 4% 포름알데히드 (전자 현미경 학년)이 포함 되어 있습니다. - 1 세포를 씻어 PBS와 x. 5% 소 혈 청 알 부 민으로 30 분에 대 한 샘플을 차단 ( 재료의 표참조) PBS에.
- 안티-Lm와 1 시간에 대 한 샘플을 품 어1 차적인 항 체 (참조 테이블의 자료) 2 %BSA 포함 하는 PBS에서 1: 100 희석.
- 워시 샘플 PBS 3 x 다음 AlexaFluor-546 1 h에 대 한 그들을 품 어와 염소-안티-토끼 이차 항 체는 1: 250 2 %BSA 포함 하는 PBS에 희석 ( 재료의 표참조). 워시 샘플 3 PBS에 x. 이미징에 대 한 PBS의 1 mL에 샘플을 저장 합니다.
- 이미지 및 조건 당 1000 개 이상의 세포를 분석.
- 영상, CCD 카메라와는 거꾸로 epifluorescence 현미경 사용 ( 재료의 표참조)와 공기 계획 형 석 공기 목표 0.6 수 가늠 구멍 (NA) X 40.
참고: 힘 25%로 설정 하 고 100 양을 노출 시간 mCherry에 사용 되는 현미경 필터는 470/525 nm, GFP 530/645 nm, 그리고 여기 및 방출 DAPI 395/460 nm, 각각. 우리가 사용 하는 현미경은 오픈 소스 현미경 소프트웨어 패키지29에 의해 통제 되었다. - 차동 immunostaining에 대 한 모든 '녹색' 박테리아 부착으로 개별 셀과 관련 된 계산. 박테리아에 '녹색'과 '레드' (때문에 항 체 바인딩)로 내 면 비를 계산 합니다.
참고: 우리는 주문 품 스크립트 및 CellC 소프트웨어를 실행 하 여 핵 수 확인 ( 재료의 표참조) 박테리아30의 열거에 대 한.
- 영상, CCD 카메라와는 거꾸로 epifluorescence 현미경 사용 ( 재료의 표참조)와 공기 계획 형 석 공기 목표 0.6 수 가늠 구멍 (NA) X 40.
6. 다 잘 견인 힘 현미경 검사 법 그리고 단층 스트레스 현미경 검사 법
그림 5: 그들은 그들의 ECM 감염 동안에 발휘 하는 견인 힘의 크기를 감소 하는 Lm 감염 HMEC-1 셀. 패널 A 단계 이미지 B 변형 필드 표시, C 표시는 견인 스트레스 필드, 및 D 쇼 20 kPa 히드로에 감염 되지 않은 HMEC-1 세포의 세포내 긴장 분야. 변형 색상 막대 지도 (µ m), 견인의 스트레스 (Pa), 지도 그리고 세포내 긴장의 지도 (nNµm-1) 열 지도의 상단 부분에 표시 됩니다. 열 세 가지 대표적인 시간 점 표시: 3, 8, 18 h 후 감염. E-H. 같은 패널 A-D 하지만 셀 300의 나에서 Lm 감염. 박테리아 (빨강 채널)의 이미지는 셀의 위상 이미지에 겹쳐 있다. TFM 녹음 동시에 여러 우물을 이미징 하 여 실시 했다. PIV에 대 한 창 크기는 16의 중복 32 픽셀 했다. 눈금 막대는 32 µ m. 이 그림은 Bastounis 및 Theriot59에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
- 24-잘 접시에 PA hydrogels 준비 ( 1 단계참조). 씨 HMEC-1 ( 2 단계참조) 셀과 그들을 감염 설명 대로 JAT983와 위의 ( 3 단계참조).
- 10% 태아 둔감 한 혈 청, 표 피 성장 인자의 10 ng/mL 및 1 μ g/mL 날린 Leibovitz의 L-15 보완 하 여 라이브 현미경 매체를 준비 합니다.
참고:는 L-15 이미 포함 2 m m L-글루타민, 그래서 MCDB 131 미디어의 경우 추가 추가할 필요는 없습니다. - 4 h 후 감염 (내 면된 JAT983 fluorescing 시작) 될 때, L-15 전체 미디어의 1 mL을 1 mg/mL의 1 μ Hoechst 염료를 혼합 하 고 각 잘 얼룩 세포의 핵에 추가. 10 분 동안 조직 문화 인큐베이터에 셀을 놓고 바꿉니다 각 잘에서 L-15 전체 미디어 L-15 전체 미디어 20 µ g/mL gentamicin의 보충의 1 mL.
- 그 뚜껑 및 현미경의 환경 챔버에 37 ˚C에 equilibrated ( 재료의 표참조)와 플레이트 커버.
참고: 이미지 사용 거꾸로 epifluorescence 현미경 CCD 카메라와 함께 ( 재료의 표참조)와 0.6 공기 계획 형 석 공기 목표 X 40 없음. - 형광 구슬 및 형광 박테리아의 다중 채널 시간 경과 이미지 및 위상 이미지 호스트 셀, 4 ~ 12 시간 10 분 마다 습득.
참고: 영상, 전원 설정 되었습니다 25%와 노출 시간 100 양을 mCherry 및 GFP 사용 현미경 필터 (여기/방출)는 470/525 nm 및 530/645 nm 각각. - 녹음의 끝에, 각 우물의 물에 10% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS)의 500 µ L를 추가 합니다.
참고: 세포는 하이드로 겔에서 분리 될 고 탄성 때문에 히드로 초기 undeformed 상태로 반환 됩니다. - 참조 undeformed 이미지로 사용 하는 히드로의 이미지.
- 결정 입자 이미지 velocimetry (PIV)31, undeformed 하이드로 겔의 참조 이미지와 함께 시간 경과 시리즈의 각 이미지 비교를 사용 하 여 시간의 각 순간에는 히드로의 2 차원 변형 합니다. 적절 한 창 크기를 사용 하 고 실험에 따라 중복.
참고: 우리는 16 픽셀 오버랩 32 픽셀의 윈도 사용. - 셀 하이드로 겔32,33설명 되어 있는 대로에 발휘 2D 견인 스트레스를 계산 합니다.
- 견인 긴장에서 단층 긴장으로 설명한34 PA 하이드로 겔의 단층에 의해 만들어진 반응 힘에 따라 얇은 탄성 판에 대 한 기계적 평형의 방정식을 해결 하 여 계산 된 기호 측정된 견인 스트레스를 반대.
주: 보충 자료 1참조.
7. 양적 시간 경과 현미경 평가 Extracellular 모 체 뻣 뻣 함 종속 L. monocytogenes 보급을 통해 내 피 세포에
그림 6: HMEC-1 monolayers 통해 Lm 보급의 시간 경과 양적 현미경 데이터 3-kPa와 70 kPa 강성과 기판에 시드. A. 이 패널 보여줍니다 여전히 0, 200, 400, 600 분에서 두 대표 감염 foci에서. 단계 채널 묘사 HMEC-1 셀 monolayers, 그리고 빨강 채널 묘사 세포내 Lm (프로토콜의 7 단계 참조). B.이 패널 볼록 선체 포괄 시간의 기능으로 음모를 꾸민 감염 초점의 영역을 표시. 3-kPa 조건 (빨간색)의 초점 영역 (녹색) 70 kPa의 그것 보다 더 빨리 성장합니다. C. 이 패널 감염 foci에서에서 성장 하 고 HMEC-1 monolayers 3-kPa의 PA 기판에 시드 (빨간색)와 70 kPa (녹색) 강성 감염 초점의 가장자리에 중심에서 방사형 거리 대표에 대 한 시간의 기능으로 플롯을 표시 합니다. 방사형 속도 (dr/dt) 하지만 70 kPa 조건에 대 한 복 형 3-kPa 조건에 대 한 상수 이다. D. 이러한 데이터 표시 10 독립 감염 foci의 첫 번째 200 분에 대 한 방사형 속도. 레드 (3-kPa) 및 녹색 (70 kPa) 데이터 포인트 이전 패널에서 설명 하는 두 개의 foci의 묘사. 가로 막대가 데이터의 평균을 묘사. P-값 계산 비패라메트릭 Wilcoxon 순위 합계 테스트와 함께. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
- 24-잘 접시에 PA hydrogels 준비 ( 1 단계참조), HMEC-1 셀 ( 단계 2참조), 씨앗의 성장과 하룻밤 JAT983 문화 (참조 3 단계) 위에서 설명한 대로.
- 감염의 하루 MCDB 131 전체 미디어의 mL 당 세균성 펠 릿의 10 µ L를 혼합 하 여 감염 믹스를 준비 합니다. 조심 스럽게 24-잘 접시의 우물에서 미디어를 제거 하 고 각 우물에 1.9 mL MCDB 131 전체 미디어와 세균 혼합의 0.1 mL를 추가 합니다.
참고: 낮은 나가이 시험에 사용 되는 호스트 세포를 침입 한 박테리아에서 시작 하는 보급 이벤트를 분석 하는 데 필요한. - 접시의 뚜껑을 커버 하 고 누설을 피하기 위하여 비닐 포장으로 밀봉. 원심 분리기에 접시를 놓고 동기화 침공을 200 x g에서 10 분에 대 한 샘플을 회전 합니다.
- 조직 문화 인큐베이터에 접시를 이동 하 고 5 분 동안 그들을 품 어.
- 워시 샘플 4 x 미디어 조직 문화 인큐베이터에 그들을 이동 하 고. 추가 5-7 분 후 gentamicin의 20 µ g/mL와 함께 보충 하는 미디어와 미디어를 교체 합니다.
- 설정 하 고 열려있는 독서 프레임35는 mTagRFP의 식 드라이브 액 타 발기인을 허용 하는 추가 5 h 인큐베이터에 접시를 품 어.
- 10% 태아 둔감 한 혈 청, 표 피 성장 인자의 10 ng/mL와 1 µ g/mL 날린 Leibovitz의 L-15 보완 하 여 라이브 현미경 매체를 준비 합니다.
참고:는 L-15 이미 포함 2 m m L-글루타민, 그래서 MCDB 131 미디어의 경우 추가 추가할 필요는 없습니다. - 1 mg/mL Hoechst의 믹스 1 μ L-15 전체 미디어의 1 mL와 염색 하 고 각 잘 얼룩 세포의 핵에 추가. 10 분 동안 조직 문화 인큐베이터에 셀을 놓고 바꿉니다 각 잘에서 L-15 전체 미디어 L-15 전체 미디어 20 µ g/mL gentamicin의 보충의 1 mL. 그 뚜껑 및 현미경의 환경 챔버에 37 ˚C에 equilibrated ( 재료의 표참조)와 플레이트 커버.
참고: 이미징, 거꾸로 epifluorescence 현미경 사용 된 CCD 카메라와 함께 ( 재료의 표참조)와 공기 계획 형 석 공기 목표 X 0.75 20 없음. 힘은 50%로 설정 되며 50 양 노출 시간이 mCherry에 사용 되는 현미경 필터 470/525 nm 여기 및 방출에 대 한 각각. - 이미지 여러 위치 마다 5 분 Lm HMEC-1 monolayers를 통해 확산 하는 방법을 모니터링 하는 자동 초점 기능을 사용 하 여 시드 강성 hydrogels 변화에.
참고: L-15 버퍼링 됩니다와 HEPES, 그래서는 이미징 동안 CO2 를 사용할 필요는 없습니다.
Representative Results
ECM 강성 종속 민감성 HMEC-1 셀의 Lm 감염:
다양 한 경직의 PA hydrogels, 모든 표면 코팅 콜라겐과 나, 프로토콜의 1 단계 에 설명 된 대로 다 잘 유리 하단 플레이트에 건설 되었다 ( 그림 1참조). AFM 측정26,27 위에서 설명한 대로 hydrogels의 정확한 강성을 확인 수행 했다 ( 그림 2참조). 과거 연구는 내 피 세포의 지하실 멤브레인의 로컬 준수 범위 1 kPa (예를 들어, 뇌 조직)에서 70 kPa (예, 대동맥)36,,3738, 39 , 40. 따라서, 우리는 HMEC-1 세포와 다음 강성 행렬에의 감염을 테스트 하기로: 0.6 kPa, 3 kPa, 20 kPa, 및 70 kPa. 각 하이드로 겔 강성에 대 한 6 hydrogels 결과의 재현성을 평가 하기 위해 조작 했다.
Cytometry ECM 강성 종속의 자화 율 HMEC-1 셀 Lm 감염을 평가 하는 데 사용 되었다 ( 그림 3참조). HMEC-1 세포는 세포내 박테리아만 (참조 그림 1 L - 1N)의 탐지를 허용 국제화 (actAp::mTagRFP), 후 형광 마커를 표현 하는 Lm 스트레인 (JAT985) 감염 되었습니다. JAT985는 또한 ActA를, ActA 말라 혜성 꼬리와 연속적인 세균성 보급의 형성에 필요한 이므로 셀을 확산 박테리아 억제를 결여 된다. 7-감염 된 후 8 h, HMEC-1 세포의 감염 cytometry 사용 하 여 평가 했다. 단일 셀의 분석을 위해, 셀 카운트의 분포의 대량 측 점도 대 앞으로 사용 하 여 문이 했다 고 두 번째 제어 단계 autofluorescence를 전시 하는 셀을 제외 하 수행한 다음 ( 그림 3A - 3 C 참조 ). 예비 결과 그림 3 에 표시 된 표시 HMEC-1 감염 Lm는 약 두 배 HMEC-1 셀 소프트 0.6 kPa hydrogels에 있는 세포에 비해 뻣 뻣 한 70 kPa hydrogels에 있는 더 큰 (참조 그림 3B - 3D). 부드러운 행렬에 비해 뻣 뻣 한에 HMEC-1 세포의 증가 Lm 감염 민감성으로 인해 수: 1. HMEC-1;에 Lm 접착 증가 2. 증가 된 Lm 침공 HMEC-1; 또는 3입니다. 모두 위의 공동 발생입니다. 테스트는 가설 보유, HMEC-1 셀 소프트 (3 kPa)에 뻣 뻣 한 (70 kPa) hydrogels 시드 되었고 감염 constitutively GFP Lm 표현 된 ( 그림 4A - 4 C참조). 감염 직후 샘플 고정 하 고 외부 (접착) 박테리아 항 체로 얼룩진 했다. 양적 현미경을 사용 하 여, 우리는 호스트 셀 (참조 그림 4D) 소프트 젤에 비해 뻣 뻣 한에 있는 때 HMEC-1을 준수 하는 훨씬 더 많은 박테리아는 발견. 교류 cytometry 데이터와 일치, 거기는 훨씬 더 많은 세균 때 호스트 세포 ( 그림 4E참조) 소프트 젤에 비해 뻣 뻣 한에 있는 HMEC-1 내 면. 그러나, HMEC-1 셀에 Lm의 침공 효율성 (박테리아의 박테리아 내 면/총 수)은 기판 강성에 관계 없이 비슷한 (참조 그림 4F).
HMEC-1 Lm에 감염 된 세포의 견인 힘 현미경:
HMEC-1 세포의 Lm 감염 첨부 파일 그들의 ECM 또는 서로 게 그들의 방 벽 완전성에 영향을 미치는의 강도 포함 하 여 감염 된 호스트 셀의 역학을 변경할 수 있습니다. 우리 세포-ECM 견인 힘 및 단층 스트레스 현미경41 세포내 긴장 힘을 계산 하기 위해 계산을 견인 힘 현미경32 를 사용 하 여 경우 될 수 있는 여부를 평가 하고자 했다. 그림 5 는 변형 필드, 견인 스트레스 필드, 및 HMEC-1에 감염 된 후 다른 시간 포인트에서 20 kPa hydrogels 세포의 세포내 긴장 분야의 지도 묘사 한다. 그림 5A - 5 D 그림 5E 동안 감염된 제어 HMEC-1 셀 참조- 5 H 300 박테리아/셀 크거나 감염의 다양성에서 Lm 감염 HMEC-1 셀 참조. 이 예비 작업 반면 그 감염 되지 않은 컨트롤 셀에 대 한 관찰 하지 감염된 HMEC-1 셀 Lm, 감염의 과정에서 그들의 세포-ECM 및 세포내 스트레스의 크기를 줄이기 위해 제안 합니다.
HMEC-1 monolayers에 걸쳐 ECM 강성 종속 Lm 보급:
시간 경과 현미경 효과 조사 하는 데 사용 되었다 HMEC-1 monolayers 통해 Lm 보급에 매트릭스 강성. Lm는 단층을 통해 확산, 박테리아 감염 (참조 그림 6A 및 비디오 그림 1 과 2) 시간의 기능으로 성장의 초점을 만들. 감염 초점 영역 볼록 선체, 작은 볼록 다각형 박테리아42주위 점의 집합을 포함 하 여 측정 했다. 호스트 세포의 단층을 통해 L. monocytogenes 세포-세포의 효율성을 측정 하는 필드에는 아무 표준 통계가입니다. 확산 효율 평가, 일부는 감염 초점41, 호스트 세포의 수를 계산 했습니다 그리고 다른 사람이 수동으로 감염 호스트 세포43의 그룹 주위에 그려진된 경계. 우리는 박테리아, 주위 볼록 다각형을 그리는 L. monocytogenes 확산의 효율성을 측정 하는 자동화 된, 일관성, 그리고 계산 저렴 한 과정 이기 때문에 선택 했습니다. 이렇게 함으로써, 우리는 70 kPa hydrogels 3 kPa 매트릭스 ( 그림 6B 및 비디오 그림 1 및 2참조)에 씨앗을 품고 그에 비해에 시드 HMEC-1 셀에 감염 초점 영역에서 약간의 감소를 발견. 감염 초점의 성장의 속도 확인 하려면 방사형 거리 감염 초점 영역의 제곱근 pi를 나눈이 여 시간의 기능으로 구성 했다. 이 수학적 변환 감염 초점의 모양을 대략 원형44가정 합니다. 초점 성장 속도 측정 하 두 3-70 kPa 행렬에 대 한 방사형 거리의 변화 (즉, 기울기)의 속도 측정 했다. 이 방법은 감염 초점 성장 3-kPa 행렬에 시드 HMEC-1 셀에 신속 하 고 단순하게는 해명. 그러나, 초점에서에서 성장 했다 상당히 느린 (첫 200 분)와 약간 느린 (200 ~ 600 분) 70 kPa 매트릭스 ( 그림 6C참조)에 시드 셀. 추가 데이터의 분석 그 감염 초점 성장, 평균, 2 배 느리게 70 kPa 행렬에 특히 첫 번째 200 분 동안 확인 하는 사실, ( 그림 6D참조).
그림 3 : Lm 침공에 HMEC-1 셀의 ECM 강성 종속 민감성 cytometry 사용 하 여 측정 . HMEC-1 셀 Lm (JAT985)에 감염 되었다 하 고 감염 cytometry에 의해 분석 되었다. A.이 패널 하나의 우물에서 오는 대표 HMEC-1 셀에 대 한 앞으로 점도 대 측면을 보여줍니다. 셀의 대량 배포 파편 (왼쪽)를 제외 하 고 세포 남자 또는 세 쌍둥이 (오른쪽) 게이팅을 통해 선정 됐다. B.이 그래프로 Lm 형광 강렬의 로그의 히스토그램 셀 당 HMEC-1 도금 부드러운 0.6 인민군에 대 한. C.이 그래프로 Lm 형광 강렬의 로그의 히스토그램 셀 당 HMEC-1 뻣 뻣 한 70 kPa hydrogels에 도금. N에 대 한 히스토그램 = 4-6 복제는 서로 다른 색상으로 표시 됩니다. 제어 감염 되지 않은 세포의 히스토그램은 보라색입니다. 어떤 감염을 정의 하는 데 사용 하는 게이트는 빨간색으로 표시 됩니다. 나는 100 이며 감염 된 감염 된 후 평가 8 h. D. 데이터 표시 하이드로 겔 강성 대 HMEC-1 세포 감염된의 비율 (N = 5). 가로 막대가 데이터의 평균을 묘사. P-값 계산 비패라메트릭 Wilcoxon 순위 합계 테스트와 함께. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
비디오 그림 1: HMEC-1 셀 단층 (단계)를 통해 세포내 Lm (빨강 채널)의 보급 3-kPa 기판에 시드. 셀 Leibovitz의 L-15 미디어에서 촬영 했다 (10 %FBS, gentamicin의 20 µ g/mL) 환경 챔버를 37 ˚C에 equilibrated 내부. 이미지 마다 5 분을 수집 했다. 동영상 속도 15 프레임/s. 하십시오가이 비디오를 보려면 여기를 클릭 하십시오. (다운로드 오른쪽 클릭.)
비디오 그림 2: HMEC-1 셀 단층 (단계)를 통해 세포내 Lm (빨강 채널)의 보급 70 kPa 기판에 시드. 셀 Leibovitz의 L-15 미디어에서 촬영 했다 (10 %FBS, gentamicin의 20 µ g/mL) 내부 환경 챔버를 equilibrated 37 ° c 이미지 마다 5 분을 수집 했다. 동영상 속도 15 프레임/s. 하십시오가이 비디오를 보려면 여기를 클릭 하십시오. (다운로드 오른쪽 클릭.)
| 탄성 계수 (E, kPa) | (40% 재고)에서 아크릴 아 미드 % | (2% 재고)에서 Bisacrylamide % |
| 0.6 | 3 | 0.045 |
| 3 | 5 | 0.075 |
| 10 | 10 | 0.075 |
| 20 | 8 | 0.195 |
| 70 | 10 | 0.45 |
표 1입니다. 다양 한 경직의 polyacrylamide (PA) hydrogels의 구성. 이 테이블에서 재고 40% 아크릴 솔루션의 비율과 비율의 재고 2% 두번째-아크릴 솔루션 주어진된 강성 (탄성 계수, E)를 달성 하기 위해 서로 다른 열에 표시 됩니다.
보충 자료 1입니다. 계산 계산 된 견인 긴장에서 세포내 긴장의. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
세포는 다양 한 세포의 형태 뿐만 아니라 그들의 유전자 표현과 단백질 활동, 따라서 영향을 미치는 중요 한 세포 기능 및 동작45,46에 영향을 미칠 수 있는 물리적 환경 신호를 느낄 수 있다. 셀의 ECM의 강성은 점점 세포 운동 성, 차별화, 확산, 그리고 궁극적으로 세포 운명47,,4849의 중요 한 변조기로 평가 됩니다. 비록 많은 최근 발전 셀과 그들의 ECM 간의 복잡 한 biomechanical 상호 작용 이해에 왔다, 거의 어떻게 환경 강성에 대 한 세균 감염에 세포의 민감성에 영향을 하는 것이 알려져 있습니다. 이러한 연구를 촉진 하기 위하여 우리는이 소설 다 잘 분석 결과 감염 분석50와 호환 되는 가변 강성의 polyacrylamide hydrogels의 기초가 튼튼한 제조에 따라 개발. 전통적으로, 조직 문화에 있는 세포의 세균성 감염 유리 또는 폴리스 티 렌 표면에 약 1-3 배나 가장 부착 세포8,51의 자연 ECM 보다 엄격한 공부 되었습니다 했다. 여기서 설명 하는 분석 결과 순수 관련 환경 강성 정권에서 박테리아-호스트 상호 작용의 연구를 활성화 하 여 새로운 고속도로 엽니다.
분석 결과 제시의 개념 증명에 대 한 HMEC-1 셀 모델 부착 호스트 세포와 Lm 모델 세균성 병원 체로 선택 되었다. 그러나, 적절 하 게 수정 하는 경우 분석 결과 추가 연구에 대 한 확장할 수 있습니다. 이러한 연구는 박테리아와 바이러스를 포함 하 여 다른 병원 균에 의해 다른 포유류 부착 호스트 세포 유형의 감염을 포함할 수 있다. 이 특정 분석 결과 대 한 젤은 단백질 코팅 콜라겐, 하지만 호스트 세포 유형에 따라 laminin 등 fibronectin, 다른 ECM 단백질-코팅는 하이드로 겔에 대 한 관심의 호스트 세포의 부착을 용이 하 게 사용 하는 52. 호스트 셀 형식에 따라 추가 고려 공부 하이드로 겔 강성 범위입니다. 경직성의 범위는 특정 호스트 셀 형식에 대 한 순수와 관련 되 고 얼마나 잘 그 호스트 첨부 주어진된 강성 히드로. 에 단층을 형성에 의존 해야 마찬가지로, 검사를 원하는 모델 병원 체에 따라 약간의 수정 여기에 설명 된 감염 분석 결과에 구현 해야 할 수 있습니다.
제조 polyacrylamide hydrogels24,,5053 특정 독특한 기능에서 속 인 다에 대 한 이전 방법에 비교 하 여 분석 결과의 혁신 제안된 감염 분석 결과에 통합. 먼저,는 hydrogels 특정 절차의 자동화 뿐 아니라 동시에 여러 조건의 심사를 가능 하 게 다 잘 유리 하단 접시에 만들어집니다. 자주 변경 동시 또는 이러한 접근의 결과 박테리아 감염 호스트에 추가의 정확한 수 호스트 셀 통로 같은 요인에 의해 영향을 받을 수 있습니다 이후 여러 복제는 중요 한 검토에서 여러 조건을 모니터링, 사이 독립 실험. 이 분석 결과의 추가 독특한 기능이입니다는 hydrogels 약 40 µ m, 높이 기존의 현미경을 사용 하 여 이미지를 충분히 얇은. 우리는 우리가 수 성공적으로 수행 하는 라이브 셀 현미경 셀 고정, 그리고 immunostaining 없이 높은 배경 형광 이미징, 다음 것을 보였다. 마지막으로,는 hydrogels 형광 microbeads, 단일 초점 평면에 포함 된 데 위쪽으로 두 개의 레이어로 만들어집니다. 이 특성은 이미징 동안 방해 밖으로의 초점 빛 있을 것입니다 보장 합니다. 구슬의 존재는 균일 하 고 TFM 및 MSM24,,3241의 성능을 향상 하 젤의 표면 지형 모두 시험을 수 있습니다. TFM 및 MSM, 셀 강성 행렬을 변화에 있는 각각의 세포-ECM 및 셀 힘을 계산 가능 하다. 이 새로운 분석 결과 사용 하 여, 그것은 모두 기여 환경 강성 및 감염을 동시에 비교 하 여 물리적 힘의 그런 측정을 만들 수 있습니다. 이러한 접근 방식은, 다음 효과 감염 역학 그것의 과정을 통해 결정 될 수 있다 주인 세포에 있다. 또한, 세포의 세포내 스트레스의 진화는 MSM을 사용 하 여 산출 될 수 있다 고는 단층의 방 벽 완전성의 측정으로 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 분석 결과의 멀티 잘 성격을 감안할 때, 동시에 세균 감염, 호스트 세포 역학과 감염 사이 복잡 한 상호 작용을 더 깊이 조사와 약리학 및 유전자 섭 소개 가능 하다.
기술의 고유한 제한 효과 기판 강성에 있다 하나 세포의 확산 속도에 할 수도 있습니다. 일반적으로, 감염 분석에서 우리가 다른 조건 하에서 호스트 세포 밀도 동일 확인 해야 합니다. 그건 셀 밀도 자체 호스트 감염의 민감성에 영향을 미칠 수 있기 때문에. 호스트 셀으로 사용 된 HMEC-1 세포는 hydrogels에 24 h에 대 한 시드 때 그들의 수에 큰 차이가 표시 되지 않습니다. 그러나, 다른 세포 유형 감염 연구 편견 수 있는 하이드로 겔 강성에 따라 차동 확산을 전시 수 있습니다. 마찬가지로, 감염 바이어스 셀 monolayers를 형성 하지 않는다 또는 hydrogels, 특정 세포 유형 (예를들면, 인간 탯 줄 내 피 세포 또는 Madin-다 비 개 신장 매우 부드러운 행렬에 시드는 때 발생에 첨부 하지 않습니다 때 발생할 수 있습니다. 상피 세포 시드 0.6-kPa hydrogels54,55에). 병원 균을 걱정 하는 만큼 특정 박테리아 (예를 들어, 보렐 리아 burdgorferi)에 연결할 수 호스트 세포와 그들을 침공 하지만 수 있습니다 또한 그들을 통해 transmigrate56. 우리는 아직 테스트 하지 경우이 분석 결과 병원 체 환생 연구 일 것 이다 호 중구 transmigrating PA hydrogels에 시드 내 피 세포에 대 한 이전 연구57성공적으로 작동 하도록 문서화 되었습니다 이후 가능한 것 같다. 연구 실시 polyacrylamide hydrogels 주어진된 탄성 계수의 아크릴 아 미드와 비스 아크릴 아 미드24,25,26의 적절 한 농도 혼합 하 여 제조 하는 방법을 보여 주는 많은 되었습니다. ,27. 그러나, 하나 다양 한 경직의 hydrogels에 세포에 TFM 실험을 수행 하고자, 특히 때 그것은 hydrogels AFM 또는 다른 들여쓰기 기법58의 예상된 강성을 확인 하는 중요 한. 예상 값에서 약간의 편차는 다른 용 매 사용 또는 세 아크릴 재고 솔루션을 발생할 수 있습니다 또는 방법 AFM으로 측정 수행 (예를 들어AFM 팁의 모양). 마지막으로, 여기에 소개 하는 접근은 더 현실적이 고 순수 관련 3D 시나리오에 따라 다를 수 있는 2D 매트릭스에 호스트 셀 시드에 기반 하 고 있다. 그러나, 가변 강성과 3D 젤을 제조, 호스트 세포와 그들을 시드 및 병원 체, 그들을 감염 아직도 포함 하는 특정 기술적인 어려움. 그럼에도 불구 하 고, 우리는 가까운 장래에 우리 수 있을 것입니다 3D 설정에서 감염을 공부에 대 한 현재 분석 결과 확장 하는 예상.
정리해 보면, 예비 결과 함께 설명된 프로토콜이 소설 분석 결과 공부 양적 방식에서 및 훨씬 더에서 병원 성 박테리아 부착 호스트 세포의 감염에 대 한 매우 유용한 도구가 될 수 있다는 증거를 제공 이전 시험 보다 생리 적으로 관련 환경입니다. Polyacrylamide 제안 설정에서 hydrogels 거짓말 분석 결과 여러 기법 cytometry, immunostaining 등의 성능 호환에 날조의 뒤에 가벼운 현미경 검사 법, 그리고 견인 힘 현미경 검사 법. 분석 결과 다른 부착 호스트 세포 유형의 감염을 포함 하는 연구에 모두 탈피는 병원 체 감염 호스트 전략의 개발 촉진에 큰 영향을 미칠 것입니다 기대 하는 병원 체에 의해 사용할 수 있습니다. 감염에 대 한 치료 적 중재
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
M. 우리의 감사 합니다 바닥글, R. Lamason, M. Rengaranjan, 및 그들의 토론 및 실험적인 지원에 대 한 Theriot 연구소의 멤버. 이 작품은 고급 연구 (F.E.O.)에 스탠포드 대학원 친교 (F.E.O.), 및 미국 심장 협회 (E.E.B.)에 대 한 NIH R01AI036929 (J.A.T.), HHMI (J.A.T.), HHMI 길 리엄 친목에 의해 지원 되었다. Cytometry는 스탠포드 공유 FACS 시설에서 수행 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Sodium hydroxide pellets | Fisher | S318-500 | |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma | A3648 | |
| 25% gluteraldehyde | Sigma | G6257-100ML | |
| 40% Acrylamide | Sigma | A4058-100ML | |
| Bis-acrylamide solution (2%w/v) | Fisher Scientific | BP1404-250 | |
| Fluorospheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F8803 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher | BP17925 | |
| TEMED | Sigma | T9281-25ML | |
| Sulfo-SANPAH | Proteochem | c1111-100mg | |
| Collagen, Type I Solution from rat | Sigma | C3867-1VL | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | J.T. Baker | 9224-01 | |
| HEPES, Free acid | J.T. Baker | 4018-04 | |
| Leibovitz's L-15 medium, no phenol red | Thermofischer | 21083027 | |
| MCDB 131 Medium, no glutamine | Life technologies | 10372019 | |
| Foundation Fetal Bovine Serum, Lot: A37C48A | Gemini Bio-Prod | 900108 500ml | |
| Epidermal Growth Factor, EGF | Sigma | E9644 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | |
| L-Glutamine 200mM | Fisher | SH3003401 | |
| DPBS 1X | Fisher | SH30028FS | |
| Gentamicin sulfate | MP biomedicals | 194530 | |
| Cloramphenicol | Sigma | C0378-5G | |
| DifcoTM Agar, Granulated | BD | 214530 | |
| BBL TM Brain-heart infusion | BD | 211059 | |
| Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate - 10 mg/ul solution in water | Invitrogen | H3570 | |
| Formaldehyde 16% EM grade | Electron microscopy | 15710-S | |
| Anti-Listeria monocytogenes antibody | Abcam | ab35132 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 546 conjugate | Thermofischer | A-11035 | |
| 0.25% trypsin-EDTA , phenol red | Thermofischer | 25200056 | |
| COLLAGENASE FROM CLOSTRIDIUM HISTOLYTIC | Sigma | C8051 | |
| Streptomycin sulfate | Fisher Scientific | 3810-74-0 | |
| Sucrose | Calbiochem | 8510 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Thermofischer | 28364 | |
| MES powder | Sigma | M3885 | |
| KCl | J.T. Baker | 3040-05 | |
| MgCl2 | J.T. Baker | 2444-1 | |
| EGTA | Acros | 40991 | |
| Disposable lab equipment | |||
| 12 mm circular glass coverslips | Fisherbrand | 12-545-81 | No. 1.5 Coverslip | 10 mm Glass Diameter | Uncoated |
| Glass bottom 24 well plates | Mattek | P24G-1.5-13-F | |
| 5 ml polystyrene tubes with a 35 μm cell strainer cap | Falcon | 352235 | |
| T-25 flasks | Falcon | 353118 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
| 15 ml conicals tubes | Falcon | 352196 | |
| Disposable Serological Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml) | Falcon | 357551 | |
| Pasteur Glass Pipettes | VWR | 14672-380 | |
| Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl) | Denville | P1122, P1126 | |
| Powder Free Examination Gloves | Microflex | XC-310 | |
| Cuvettes bacteria | Sarstedt | 67.746 | |
| Razors | VWR | 55411-050 | |
| Syringe needle | BD | 305167 | |
| 0.2um sterilizng bottles | Thermo Scientific | 566-0020 | |
| 20 ml syringes | BD | 302830 | |
| 0.2um filters | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| wooden sticks | Grainger | 42181501 | |
| Saran wrap | Santa Cruz Biotechnologies | sc-3687 | |
| Plates bacteria | Falcon | 351029 | |
| Large/non-disposable lab equipment | |||
| Tissue Culture Hood | Baker | SG504 | |
| Hemacytometer | Sigma | Z359629 | |
| Bacteria incubator | Thermo Scientific | IGS180 | |
| Tissue culture Incubator | NuAire | NU-8700 | |
| Inverted Nikon Diaphot 200 epifluorescence microscope | Nikon | NIKON-DIAPHOT-200 | |
| Cage Incubator | Haison | Custom | |
| Scanford FACScan analyzer | Stanford and Cytek upgraded FACScan | Custom | |
| Pipette Aid | Drummond | 4-000-110 | |
| Pipettors (10 μl, 200 μl, 1000ul) | Gilson | F144802, F123601, F123602 | |
| pH meter | Mettler Toledo | 30019028 | |
| forceps | FST | 11000-12 | |
| 1 L flask | Fisherbrand | FB5011000 | |
| Autoclave machine | Amsco | 3021 | |
| Stir magnet plate | Bellco | 7760-06000 | |
| Magnet stirring bars | Bellco | 1975-00100 | |
| Spectrophotometer | Beckman | DU 640 | |
| Scanford FACScan analyzer | Cytek Biosciences | Custom Stanford and Cytek upgraded FACScan | |
| Software | |||
| Microscope Software (μManager) | Open Imaging | ||
| Matlab | Matlab Inc | ||
| Flowjo | FlowJo, LLC | ||
| Automated image analysis software, CellC | https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ | The software is freely available. Eexecutable files and MATLAB source codes can be obtained at https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ |
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