Summary
Dit protocol beschrijft fabricage van een celcultuur dat zaaien van de cellen van de stam op een geleidend polymeer steiger voor in vitro elektrische stimulatie en latere in vivo innesteling van de cel van de stam-geplaatste steiger, met behulp van een minimaal invasieve techniek.
Abstract
Stamcel therapie heeft ontpopt als een spannende lijn therapeutische, maar de optimale leveringsmethode blijft onduidelijk. Terwijl de techniek van microinjection hanteert voor het leveren van stamcellen in lijn modellen decennialang, wordt deze techniek beperkt door het gebrek aan vermogen om te manipuleren van de stamcellen vóór injectie. Deze paper detailleert een methode van het gebruik van een elektrisch geleidend polymeer steiger voor levering van de cel van de stam. Elektrische stimulatie van cellen van de stam met behulp van een geleidend polymeer steiger verandert de cel van de stam van genen die betrokken zijn in de overleving van de cel, inflammatoire respons en synaptische remodelleren. Na elektrische voorbehandeling, worden de cellen van de stam op de steiger intracranially in een distale middelste cerebrale slagader occlusie rat model getransplanteerd. Dit protocol beschrijft een krachtige techniek om te manipuleren stamcellen via een geleidend polymeer steiger en maakt een nieuwe tool om de verdere ontwikkeling van stamcel gebaseerde therapie.
Introduction
Beroerte is de tweede belangrijkste doodsoorzaak in de wereld en de vijfde belangrijkste doodsoorzaak in de Verenigde Staten. Ondanks deze hoge sterftecijfers nog behandelingen voor herstel van de beroerte momenteel een uitdaging met geen haalbare medische opties die momenteel beschikbaar1. Er zijn momenteel ongeveer 300 klinische proeven omgaan met ischemische beroerte, waarvan slechts 40 stamcellen gebruiken. Eerdere studies hebben aangetoond dat stamcellen therapieën een gunstig effect hebben op beroerte reparatie2,3. Paracrine factoren zoals hersenen-afgeleide neurotrophic factor (BDNF) en Thrombospondine-1 (THBS-1) uitgebracht van getransplanteerde menselijke neurale voorlopercellen (hNPCs) hebben betere functionele herstel aangetoond door middel van de mechanismen die zijn gekoppeld aan een toename van Synapse formatie, angiogenese, dendritische vertakken en nieuwe axonale prognoses, evenals het moduleren van het immuunsysteem4,5,6. Toch blijven de optimale leveringsmethoden van de stamcellen ongrijpbaar.
De cel van de stam van de succesvolle levering naar de hersenen blijft een uitdaging. Op dit moment zijn injecteerbare hydrogel en polymere steigers systemen ingevoerd om te leveren van stamcellen. Deze methoden voor het afleveren stamcellen tijdens transplantatie beschermen evenals bieden bescherming tegen de barre omgeving van na beroerte met inbegrip van de ontstekingsreactie van de host en hypoxische voorwaarden7,8,9 , 10. echter, de meest gebruikte materialen zijn inert, waardoor het gebruik van continue modulatie (d.w.z., elektrische stimulatie) van de cellen11beperkt. Elektrische stimulatie is een richtsnoer dat invloeden van differentiatie, ion kanaal dichtheid, en neurite uitvloeisel van stamcellen12. Ten opzichte van inerte polymeren, kunnen geleidende polymeren dragen een huidige waardoor elektrische stimulatie en manipulatie van stamcellen2. Het precieze mechanisme waarmee elektrische stimulatie neurotrophic factor release (dat wil zeggen, BDNF en THBS-1 moduleert) wordt echter nog niet volledig onderzocht.
In dit protocol beschrijven we de stappen voor het bouwen van een celcultuur, bestaande uit een geleidend polymeer-steiger, polypyrrole (PPy), dat voorziet in in vitro elektrische stimulatie. Vanwege de wijze waarop de celcultuur wordt vervaardigd, is latere innesteling van de cel van de stam-geplaatste steiger op de peri-infarct cortex mogelijk. Voor dit systeem voorwaarde we elektrisch stamcellen op de steiger voor een korte periode vóór. Na elektrische stimulatie, de uitvoering van de cellen geleidend polymeer-steiger is met succes geïmplanteerd intracranially met behulp van een minimaal-invasieve methode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle stamcel en dierlijke procedures goedgekeurd door Stanfords stamcellen onderzoek Toezichtscomité en van de Universiteit van Stanford administratieve Panel op Laboratory Animal Care (SCRO-616 en APLAC-31909).
1. de etsen van ITO glas
- Voorbereiden van het indium tin oxide (ITO)-overdekte glasplaatje door het plaatsen van een agent maskeren de geleidende zijde van het glas.
Opmerking: De meeste commerciële transparante tapes kunnen worden gebruikt als een agent maskeren.- Verwijderen van de overtollige masker met behulp van een mes, zodat alleen de gewenste vorm van het definitieve ontwerp van de ITO bedekt op het glas.
- Het combineren van 5% (v/v) van salpeterzuur en 45% (v/v) van HCl in een bekerglas van glas in een zuurkast te bereiden de etsen-oplossing.
- Een thermometer en een hete plaat gebruiken om ervoor te zorgen dat de temperatuur van de etsen van de oplossing wordt gehandhaafd bij 70 ° C.
- Zodra de etsen-oplossing 70 ° C bereikt, plaats de gemaskeerd-ITO glasplaatje in de oplossing gedurende 2 minuten om te verwijderen van de overtollige ITO laag.
Opmerking: Tape maskeren beschermt de ITO laag tegen de blootstelling aan zure oplossing. - Verwijder de dia uit de oplossing en spoel het af met gedeïoniseerd water (DI) H2O.
- Verwijder voorzichtig de weerstand van het masker en maatregel met behulp van een multimeter om ervoor te zorgen dat de resterende ITO intact is. Uitlezingen van het gewenste geëtste gebied moet ongeveer 0 Ω.
2. bereiding van pyrrool-oplossing
- In een glazen fles van 1000 mL, los 70 g gekristalliseerd Natrium dodecylbenzenesulfonate (NaDBS) in 600 mL DI H2O.
- Zodra de NaDBS wordt ontbonden, 14 mL 0,2 M pyrrool en 386 mL DI H2O aan de oplossing toevoegen.
- Dekking van de oplossing met aluminiumfolie en bewaren bij 4 ° C.
3. galvaniseren van Polypyrrole op ITO glas
- Warm de pyrrool-oplossing tot kamertemperatuur tot NaDBS is volledig redissolved.
Let op: Dit duurt ongeveer 15 tot 20 minuten. - Giet 25 mL van de pyrrool-oplossing in een bekerglas.
- De geëtste glas ITO verbinden met een multimeter en de dia onderdompelen in de pyrrool-oplossing.
- Zorg ervoor dat de kant met 0 Ω weerstand naar de platina mesh referentie-elektrode is gericht.
- Het toepassen van een elektrische stroom om te starten met het galvaniseren van PPy op het oppervlak van de ITO met behulp van een multimeter (huidig gecontroleerd op 3 mA/cm2 voor 4 uur).
- Verwijder het ITO-glas uit de multimeter en wassen galvanische-PPy in DI H2O residuele oppervlakteactieve stof verwijderen.
- Voorzichtig losmaken de galvanische-PPy plaat boven het glas van de ITO met behulp van een scheermesje.
- De plaat van de PPy bij kamertemperatuur worden opgeslagen.
4. voorbereiding van Polydimethylsiloxaan (PDMS)
- Met behulp van een spatel en een weeg-schotel, 18 g voor basis agent meng met 2 g uithardende agent en giet het mengsel in twee 10 x 8 cm glas mallen.
- Verwijder de belletjes uit de mallen met behulp van een vacuuemcel gedurende 15-20 minuten.
- Plaats de mallen in een oven van 70 ° C gedurende 3 uur.
- Eenmaal afgekoeld, gebruik een platte spatel om de PDMS van de mallen.
5. de fabricage van de In Vitro elektrische stimulatie kamer
- Autoclaaf de metalen platen (WxL, 2,5 x 12,5 cm) en de stroom kleppen bij 120 ° C gedurende 1 uur.
- Met behulp van een kamer dia als een sjabloon, Knip twee stukken van PDMS.
Opmerking: Ééndelig van PDMS fungeert als de omtrek van de cel kamer met knipsels van twee aangrenzende vierkanten van binnen de cel kamer. De andere PDMS stuk is een schets van de omtrek van de kamer.- Knip uit de binnenkant cel kamer zodat er vierkante vorm en overeenkomt met de vorm van de kamer van de cel. Ervoor zorgen dat de algehele vorm van beide stukken van PDMS rechthoekig is en overeenkomt met die van de dia van de kamer.
- Laag van de materialen als volgt van bodem tot bovenkant: (1) metalen plaat, (2) PDMS (zonder knipsels), (3) PPy plaat (loodrecht op PDMS), (4) PDMS (met knipsels) en (5) cel kamer.
- Klem het apparaat samen zodra het volledig wordt uitgelijnd.
- Knip twee 60 cm stukken van een metaaldraad en zilveren plakken gebruiken om één draad aan elk uiteinde van de PPy plaat die aan de buitenkant van de kamer uitsteekt. Zorg ervoor dat de draden lang genoeg uit te breiden van het apparaat aan de buitenkant van een incubator.
- Zodra de zilveren plak is genezen, versterken en verzegel de draadaansluiting met epoxy.
- Record de weerstand met behulp van een multimeter om ervoor te zorgen dat het veld Vereffend hetzelfde in elke kamer is.
- Voor implantatie, verwijder de draden; unclamp van de cel kamers en PDMS waarna ze scheiden van de geleidende steiger. De dimensie van de geïmplanteerde steigers is ongeveer 1 x 3 x 0,25 mm.
6. plating menselijke neurale voorlopercellen (hNPCs) op PPy
- Het steriliseren van de geassembleerde kamers onder UV-licht gedurende 2 uur.
- Na 1 uur, draaien de geassembleerde chambers van 90°.
- Na sterilisatie, coat het oppervlak van PPy bij de bodem van de kamer met 800 µL van een coating substraat en laat het substraat te stollen op de plaat van de PPy in een incubator bij 37 ° C bij 5% CO2 voor 1 h.
- Na 1 uur, verwijder de bovendrijvende substantie uit kamers en voorzichtig spoelen met DPBS + Ca + Mg 1 mL per putje.
Opmerking: Vermijd wassen van het oppervlak van PPy krachtig, zoals dit leiden het detachement van de coating-coating tot zal. - Gebruik verse cel media, mechanisch distantiëren gekweekte cellen voor gebruik met de kamers van een weefselkweek plaat met zachte pipetteren.
Opmerking: De cellen moeten 90-100% heuvels op dissociatie. - Verzamelen hNPC pellets met behulp van centrifugeren op 8000 x g gedurende 5 minuten.
- Met behulp van een hemocytometer, tellen en resuspendeer de cellen bij een volume van 100.000 cellen/cm2.
- Plaat 100.000 cellen in elke kamer goed (100.000 cellen/cm2 in 1 mL van de media).
- Chambers terug naar incubator bij 37 ° C bij 5% CO2.
7. elektrische stimulatie van hNPCs
- Een dag na het zaaien van de cellen op de kamers, gebruik een golfvorm generator elektrische stimulatie toepassen op de cellen.
- Voorafgaand aan stimulatie, verwijderen van oude media vanuit elke kamer goed en vullen met 800 µL van nieuwe media.
- Nadat de media is gewijzigd, de kamers plaats terug in de incubator, de uitbreiding van de draden uit de incubator, en deze koppelen aan een golfvorm generator
- De stimulatie toepassen op de cellen met een signaal van de blokgolf op ±400 mV met 100 Hz gedurende 1 uur.
- Na de stimulatie, verwijder de draden en Incubeer de kamers voor een andere dag in een incubator ingesteld bij 37 ° C met 5% CO2.
- Latere biologische analyses, met inbegrip van de levensvatbaarheid van de cellen en kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qRT-PCR) volgens de fabrikant protocol uit te voeren.
8. in Vivo PPy implantatie
- Distale middelste cerebrale slagader (dMCA) occlusie beroerte modellen uitvoeren op T-cel-deficiënte volwassen mannelijke naakt ratten (NIH-RNU 230 ± 30 g) als eerder beschreven2. Uitvoeren van implantatie één week post-dMCA occlusie.
- Een dag voorafgaand aan de operatie, geven de ratten in hun kooi water ampicilline (1 mg/mL).
- Anesthetize van de rat in een inductie kamer met behulp van 0,5 - 3% mg/kg Isofluraan via inhalatie toegediend.
- Bevestig afstomping van de rat door een gebrek aan teen snuifje reflex respons.
- Terwijl het dier onder narcose, en blijven volgen de membraan kleur, patroon van de ademhaling, rectale temperatuur elke 15 minuten.
- Zodra afstomping is bevestigd, gelden kunsttranen op ogen van rat om te voorkomen dat droogte.
- Ervoor zorgen dat aseptische techniek wordt gehandhaafd tijdens deze procedure met behulp van steriele handschoenen en een steriele chirurgische draperen13. Steriele chirurgische instrumenten binnen een steriel veld blijven.
- Hoewel de rat onder verdoving is, boren een craniectomy boven de linker cortex. Open de dura.
- Verwijder de dura mater uit de hersenen met behulp van een chirurgische micro-dunne naald.
- Implantaat de geleidende steigers van in vitro -systeem op de rat cortex.
Opmerking: Voor onze experimenten geïmplanteerd we steigers van in vitro overmorgen 3 hNPC beplating.- Plaats het implantaat voornamelijk op de penumbral cortex mediale aan de beroerte laesie.
- Nadat de steiger is geplaatst, plaatst u de surgicel op het implantaat om beweging met huid sluiting te voorkomen.
- Sutuur (geologie) de wond dicht en subcutaan injecteren de ratten met buprenorfine SR bij een dosering van 1 mg/kg om de pijn die gekoppeld stereotaxic chirurgie en dMCA occlusie te beheren.
- Plaats de rat in de kooi van een herstel, zoals het bewustzijn herwint.
- Laat het dier nooit onbeheerd achter terwijl het onbewuste.
- Plaats het dier met anderen niet tot het volledig bewustzijn heeft opgedaan.
- Dieren dagelijks op tekenen van pijn met inbegrip van lichaam gewichtsverlies, verminderde voedsel/water inname, verminderde verzorgen/onverzorgde vacht, daalde/verhoogde spontane activiteit, abnormale houding, uitdroging/huid tenting, ingevallen ogen, verbergen, zelfverminking, controleren snelle ademhaling, open mond ademen, spiertrekkingen, trillen, tremor en vocalisatie.
- De dieren dagelijks volgen totdat blijkt dat ze zijn eten, drinken, verzorging en verkrijgen van het gewicht; en dan wekelijks na gewichtstoename.
- Vroege euthanization via inhalatie van CO2 en een secundaire bevestiging van euthanization (om te zorgen voor het dier zal niet doen herleven als gevolg van normale zuurstof levering bericht CO2 inademing) zal optreden om alle dieren die lijkt te worden niet eten, drinken en verkrijgen van het gewicht na de eerste chirurgische ingreep; verschijnt in pijn; of lijkt niet in staat om te voltooien de gedrags tests als gevolg van een groter dan verwachte motorische cortex tekort.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het schema in Figuur 1 afgebeeld vertegenwoordigt de algemene workflow van de elektrische stimulatie van hNPCs en mogelijke downstream toepassingen. Een huidige beperking in stamcel therapie is dat stamcellen worden blootgesteld aan een harde na transplantatie milieu met inbegrip van ontsteking en ischemische voorwaarden. Deze moeilijke omstandigheden waarschijnlijk beperken hun therapeutische werking14,15. Het gebruik van een geleidende steiger te beschermen van hNPCs tegen deze omgeving kan vergroten hNPCs therapeutische voordelen door middel van elektrische conditionering. De eerste stap in deze cel van de stam levering techniek is de ontwikkeling van een geleidende steiger met behulp van een galvaniseren aanpak2,16. We gekenmerkt de steigers biocompatibiliteit en geoptimaliseerd elektrische conditioneringscycli kenmerken met hNPCs. Besturingselementen werden gedefinieerd als ongestimuleerde stamcellen gekweekt op een plaat van weefselkweek.
Verschillende spanningen werden geëvalueerd om de veiligheid van elektrische stimulatie vast te stellen en te maximaliseren de conditioneringscycli werkzaamheid. Om ervoor te zorgen dat het veld Vereffend hetzelfde in elke kamer is, de soortelijke weerstand van geassembleerde kamer werd gemeten met behulp van een multimeter (weerstand (Ohm, Ω) van kamers waren ongeveer 10 kΩ, en resistivity≈3 Ωm). Volgens de commerciële leverancier, hebben de hNPCs gebruikt geen significante cytotoxiciteit aangetoond in normale cultuur systemen. hNPCs met of zonder blootstelling aan elektrische stimulatie werden gekleurd met cel levensvatbaarheid assays (Live: groen; Doden: rood) (Figuur 2). Deze resultaten wijzen erop dat de hNPCs levensvatbaar na de elektrische stimulatie (±400 mV, 100 Hz gedurende 1 h waren). Om te controleren de cel levensvatbaarheid assay, we uitgevoerd levensvatbaarheid celmethode met behulp van een resazurin bepaling. De resultaten tonen ook aan geen belangrijke cytotoxiciteit van elektrische stimulatie op hNPCs.
Onze vorige gegevens in vivo aangetoond dat paracrine factoren vrijgelaten uit de hNPCs (SD56, NPC's afgeleid van embryonale stamcellen) met een blootstelling aan elektrische stimulatie het herstel na beroerte2 verbeteren. Om te verkennen verder kandidaat-factoren waarvan bekend is dat belangrijk voor herstel van de beroerte die zijn vrijgegeven uit hNPC (biomedische Aruna, NPC's afgeleid van embryonale stamcellen), werden BDNF en THBS-1 geëvalueerd. Deze factoren zijn uitvoerig bestudeerd vanwege hun rol in neuronale uitgroei en toename van cel naar cel interacties17,18. Voor het onderzoek naar de werkzaamheid van elektrische stimulatie op transcriptome wijzigingen voor BDNF en THBS-1, werd qRT-PCR uitgevoerd met inbegrip van BDNF en THBS-1 genen met GAPDH als een schoonmaak-gen. Ongeveer 1 microgram van totale RNA was omgekeerde-omgezet in cDNA volgens protocol van de fabrikant. Genormaliseerde vouw-change-ratio's werden berekend door ΔΔCt methode vergelijken genexpressie in hNPCs op PPy en hNPCs op PPy met een blootstelling aan elektrische stimulatie. Statistische analyse toonde significante upregulations in genexpressie van BDNF en THBS-1 tussen groepen die elektrisch stimulatie afhankelijk (p ≤0.01 werden) (Figuur 3). Deze gegevens blijkt dat optimalisatie is het mogelijk om het maximaliseren van de doeltreffendheid van de hNPC zonder aanzienlijke celdood.
Figuur 1 . In vitro geleidend polymeer steiger systeem voor elektrische stimulatie. (A) een dia kamer wordt geplaatst op de top van PPy plaat. (B) het schema toont de fabricage van de in vitro elektrische stimulatie kamer met hNPCs verzinkt op het oppervlak van PPy. Stroming ventielen worden gebruikt om te houden van de zaal van de dia, PDMS, PPy, en metalen plaat samen. (C) beeld van de kamer. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Cel levensvatbaarheid assay in hNPCs met of zonder elektrische stimulatie. (A) staafdiagram aantonen van levende cellen gekleurd met calceïne-am. Gepresenteerde gegevens zijn gemiddelde ± S.D.; n = 4. (B) cel levensvatbaarheid assay met behulp van resazurin. Staafdiagram toont dat er was geen cytotoxiciteit van elektrische stimulatie op hNPCs; n = 4. (C) beelden van de levensvatbaarheid van de cellen assay voor en na behandeling van de elektrische stimulatie. Groene signaal geeft aan dat levende cellen (calceïne-am), overwegende dat rood signaal geeft aan dode cellen (EtHD-1). ES geeft elektrische stimulatie. ES + of - geeft aan dat de aanwezigheid of afwezigheid van elektrische stimulatie op cellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Gen expressie veranderingen met elektrische stimulatie. Staafdiagram demonstreren vouwen wijzigingen in gen uitingen van BDNF (A) en THBS1 (B) in hNPCs (** geeft statistisch significant tussen elektrisch geconditioneerde en alle andere groepen, p < 0,01, fout balken duiden S.D.; n = 4, one-way ANOVA ). Negatieve geeft aan dat het besturingselement waar cellen werden gekweekt op een regelmatige weefselkweek plaat. ES + of - geeft aan dat de aanwezigheid of afwezigheid van elektrische stimulatie op cellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Steeds meer aanwijzingen heeft aangetoond dat de belofte van stamcellen als een nieuwe lijn-therapie. Deze belofte heeft geresulteerd in een grote inspanning om de therapeutiek van de stamcel naar het bed met ten minste 40 lopende of afgeronde klinische proeven. Beroerte pathologie biedt een unieke neurologische aandoening die zich voor stamcel therapie, leent omdat na de acute belediging, is er geen neurodegeneratieve-proces voorkomen van herstel. Het exacte mechanisme van stamcel-enhanced beroerte herstel blijft onduidelijk. Angiogenese synaptogenese en synaptische remodelleren is alle gebleken te zijn belangrijk. Wanneer belangrijke moleculen voor de synapse formatie zoals BDNF en THBS-1 worden verwijderd, is herstel van de beroerte verminderde6,19. hNPCs hebben functionele herstel na beroerte in talrijke diermodellen20,21verbeterd. De mechanismen van het hNPCs effect blijft niet volledig begrepen, en de ideale leveringsmethode van deze cellen is onbekend. Door het ontwikkelen van een systeem dat maakt het mogelijk om het manipuleren van de belangrijke moleculen vrijgelaten uit de hNPCs, kan een helpen differentiëren van de mechanismen van het integrale herstel en stamcel therapie optimaliseren.
Succesvolle cel levering naar de hersenen blijft een uitdaging. Op dit moment zijn een aantal technologieën ontwikkeld met behulp van verschillende biomaterial steigers systemen te leveren van de cellen van de stam om de overleving en integratie van stamcellen9,10te verbeteren. Als gevolg van de inerte kenmerken van deze materialen is het echter moeilijk te moduleren stamcellen na de transplantatie.
Dit artikel beschrijft een methode met behulp van een PPy steiger te manipuleren elektrisch transcriptome van hNPCs, zoals blijkt uit de opregulatie van BDNF en THBS-1 in onze qRT-PCR-gegevens. Onze vorige onderzoek is gebleken dat een stijging van de uitdrukking van het VEGFA op hNPCs na blootstelling aan elektrische stimulatie functionele herstel na beroerte2verbeterd. Hier tonen we dat extra neurotrophic factoren zoals BDNF en THBS-1 ook gemoduleerd worden na blootstelling aan elektrische stimulatie in een cellijn van verschillende hNPC, waaruit blijkt dat ons systeem kan worden gebruikt met talrijke cellijnen.
Tijdens de fabricage van de in vitro elektrische stimulatie kamer is het cruciaal dat de metalen draad volledig is aangesloten op de PPy plaat met behulp van zilver verf en epoxy. Als deze verbinding niet goed is, veroorzaakt het verschillende elektrische velden zelfs met dezelfde parameters. Bovendien soms media kunnen gaan lekken na de montage van het systeem voor steigers. U kunt dit probleem oplossen, kan vacuüm vet worden toegepast om het zegel van de ruimte tussen de PDMS en de PPy plaat met zorg niet toe te passen op het oppervlak van cel-zaaien. Een beperking als gevolg van de ondoorzichtige aard van de PPy plaat is dat controleren cellen confluentie met de lichte microscopie van standaard beperkt is.
Het voordeel van de methode beschreven in dit protocol zorgt voor modulatie van de hNPCs om te helpen bepalen de mechanistische veranderingen van de cellen. Op dit moment, is elektrische modulatie niet benaderd met behulp van conventionele hydrogel of inerte steigers systemen. Na de elektrische stimulatie met behulp van de PPy steiger, kan de hNPCs worden geleverd zonder verwijdering van het polymeer oppervlak naar een model in vivo . Ontwikkeling van methoden om de ziekte modellen van stamcel toepassingen verder te bestuderen kunt ons beter ontwerp translationeel toepassingen. De elektrische conditioneringscycli aanpak, mogelijk gemaakt door de geleidende polymeren systeem, kan worden toegepast op verschillende soorten cellen en zorgt voor een beter begrip van het effect van elektrische stimulatie op een cel. De mogelijkheid om de cellen in vitro optimaliseren en vervolgens zonder verdere manipulatie (zoals passaging of verwijdering) zorgt voor het testen van deze manipulaties in vitro in in vivo ziekte staten zoals beroerte. Het uiteindelijke doel is om het gebruik van nieuwe technieken, zoals de beschreven geleidend polymeer steiger, verder beroerte therapeutics en verbetering van het inzicht van beroerte herstel mechanismen te.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten van belang te verklaren met dit werk.
Acknowledgments
Wij danken Dr. Kati Andreasson (afdeling Neurologie en neurologische wetenschap, Stanford University) voor gebruik van de machine qRT-PCR. Het werk werd gesteund door de nationale instituten van gezondheid-subsidies K08NS098876 (naar P.M.G.) en Stanford School of Medicine Dean's Postdoctoral Fellowship (aan Bo).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FGF-Basic | Invitrogen | CTP0261 | 20 ng/mL for working media |
| Matrigel | Corning | cb40234a | 1:200 dilution |
| LIF Protein, Recom. Hum. (10 µg/mL) | EMD Millipore | LIF1010 | 10 ng/mL for working media |
| Sylgard 184 silicone 3.9 kg | Fisherbrand | NC0162601 | |
| Hydrochloric acid | Fisherbrand | SA56-4 | |
| Nitric Acid Concentrate (Certified) ACS, Fisher Chemical | Fisherbrand | SA95 | |
| ITO Glass | Delta Technologies | CG-40IN-0115 | |
| Sodium dodecylbenzenesulfonate | Sigma | 289957-1KG | |
| Pyrrole | Sigma | 131709-500ML | Protect pyrrole solution from light and room temperature |
| 8 well glass slide chambers | Thermo Sci Nuc | 125658 | Detach the cell chamber and keep it under sterilized conditions |
| Flat-Surface Bracket, 3"x1" | McMaster-Carr | 1030A4 | |
| TWO PART SILVER PAINT 14G | Electron Microscopy Sciences | 1264214 | Mix two parts (1:1) in plastic plate |
| DPBS, 1x, with Ca and Mg, No Phenol Red | Genesse | 25-508C | |
| AB2 ArunA Neural Cell Culture Media Kit | Aruna Biomedical | ABNS7013.2 | |
| hNP1 Human Neural Progenitor Expansion Kit | Aruna Biomedical | hNP7013.1 | |
| Noncontact Flow-Adjustment Valve, Nickel-Plated Brass, for 3/32" to 5/8" Tube OD | McMaster-Carr | 5330K22 | |
| Multimeter | Keysight | E3641A | |
| Wavefoam generator | Keysight | 33210A-10MHz | |
| Pt meshes | Sigma-Aldrich | 298107-425MG | Reference electrode with dimensions, 1x1 cm |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| BDNF | Thermo Fisher Scientific | Hs02718934_s1 | |
| THBS1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00962908_m1 | |
| GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs02758991_g1 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen | 74106 | |
| QIAshredder (250) | Qiagen | 79656 | |
| RNase-Free DNase Set (50) | QIAGEN | 79254 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit, 100 x 20 µL rxns | BIORAD | 1708891 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4369510 | |
| 7-8 Week Old, male, RNU Rats | NCI-Frederick | ||
| 4-0 Ethicon Silk Suture | eSutures.com | 683G | |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip | 901806 | |
| Surgicel Original Absorbable Hemostat | Ethicon | 1952 | |
| Lab Standard Stereotaxic Instrument, Rat | Stoelting | 51600 | |
| Kimberly-Clark Professional Safeskin Purple Nitrile Sterile Exam Gloves | Fisherbrand | 19-063-130 | |
| Sterile Drape | Medline | DYNJSD1092 | |
| Thermo Scientific Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle, Holds No. 20-25 Blades | Fisherbrand | 53-34 | |
| Walter Stern Scalpel Blade Series 300 | Fisherbrand | 17-654-456 | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4484642 | |
| Frazier Micro Dissecting Hook | Harvard Apparatus | 52-2706 |
References
- Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The Science of Stroke: Mechanisms in Search of Treatments. Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).
- George, P. M., et al. Electrical Preconditioning of Stem Cells with a Conductive Polymer Scaffold Enhances Stroke Recovery. Biomaterials. 142, 31-40 (2017).
- Steinberg, G. K., et al. Clinical Outcomes of Transplanted Modified Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells in Stroke: A Phase 1/2a Study. Stroke. 47 (7), 1817-1824 (2016).
- George, P. M., Steinberg, G. K. Novel Stroke Therapeutics: Unraveling Stroke Pathophysiology and Its Impact on Clinical Treatments. Neuron. 87 (2), 297-309 (2015).
- Schabitz, W. R., et al. Intravenous Brain-Derived Neurotrophic Factor Enhances Poststroke Sensorimotor Recovery and Stimulates Neurogenesis. Stroke. 38 (7), 2165-2172 (2007).
- Liauw, J., et al. Thrombospondins 1 and 2 Are Necessary For Synaptic Plasticity and Functional Recovery After Stroke. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (10), 1722-1732 (2008).
- Cantu, D. A., Hematti, P., Kao, W. J. Cell Encapsulating Biomaterial Regulates Mesenchymal Stromal/Stem Cell Differentiation and Macrophage Immunophenotype. Stem Cells Translational Medicine. 1 (10), 740-749 (2012).
- Chaudhuri, O., et al. Hydrogels with Tunable Stress Relaxation Regulate Stem Cell Fate and Activity. Nat Mater. 15 (3), 326-334 (2016).
- Ballios, B. G., et al. A Hyaluronan-Based Injectable Hydrogel Improves the Survival and Integration of Stem Cell Progeny following Transplantation. Stem Cell Reports. 4 (6), 1031-1045 (2015).
- Mothe, A. J., Tam, R. Y., Zahir, T., Tator, C. H., Shoichet, M. S. Repair of the Injured Spinal Cord by Transplantation of Neural Stem Cells in a hyaluronan-based hydrogel. Biomaterials. 34 (15), 3775-3783 (2013).
- Saini, M., Singh, Y., Arora, P., Arora, V., Jain, K. Implant Biomaterials: A Comprehensive Review. World J Clin Cases. 3 (1), 52-57 (2015).
- Huang, Y., Li, Y., Chen, J., Zhou, H., Tan, S. Electrical Stimulation Elicits Neural Stem Cells Activation: New Perspectives in CNS Repair. Front Hum Neurosci. 9, (2015).
- Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J Vis Exp. (47), (2011).
- Abdelwahid, E., et al. Stem Cell Death and Survival in Heart Regeneration and Repair. Apoptosis. 21 (3), 252-268 (2016).
- Wang, X., et al. The Clinical Status of Stem Cell Therapy for Ischemic Cardiomyopathy. Stem Cells Int. 2015, (2015).
- George, P. M., et al. Fabrication and Biocompatibility of Polypyrrole Implants Suitable for Neural Prosthetics. Biomaterials. 26 (17), 3511-3519 (2005).
- Aravamudan, B., Thompson, M., Pabelick, C., Prakash, Y. S. Brain-Derived Neurotrophic Factor Induces Proliferation of Human Airway Smooth Muscle Cells. J Cell Mol Med. 16 (4), 812-823 (2012).
- Lopes, N., et al. Thrombospondin 2 Regulates Cell Proliferation Induced by Rac1 Redox-Dependent Signaling. Mol Cell Biol. 23 (15), 5401-5408 (2003).
- Ploughman, M., et al. Brain-Derived Neurotrophic Factor Contributes to Recovery of Skilled Reaching After Focal Ischemia in Rats. Stroke. 40 (4), 1490-1495 (2009).
- Baker, E. W., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Stem Cell Therapy Enhances Recovery in an Ischemic Stroke Pig Model. Sci Rep. 7 (1), 10075 (2017).
- Bacigaluppi, M., et al. Neural Stem Cell Transplantation Induces Stroke Recovery by Upregulating Glutamate Transporter GLT-1 in Astrocytes. J Neurosci. 36 (41), 10529-10544 (2016).
