Summary
このプロトコルを記述するように導電性高分子足場の in vitro電気刺激および幹細胞播種の足場を使用しての注入その後体内の幹細胞の播種細胞培養系の作製、低侵襲技術。
Abstract
幹細胞療法が治療、エキサイティングなストロークとして浮上しているが、最適な配信方法は不明のまま。マイクロインジェクション法は脳卒中モデルで幹細胞を提供する何十年も使用されてきましたが、この手法は注入前に幹細胞を操作する能力の欠如によって制限されます。本稿では、幹細胞配信用導電性高分子足場の使用法を詳しく説明します。導電性高分子足場を用いた幹細胞の電気刺激は、細胞の生存、炎症反応とシナプスのリモデリングに関与する幹細胞の遺伝子を変更します。電気前処理後は、足場に幹細胞は遠位の中大脳動脈閉塞ラット モデルで頭蓋内移植されます。このプロトコルは、導電性高分子足場経由で幹細胞を操作するための強力な手法をについて説明し、さらに幹細胞を用いた治療法を開発するための新しいツールを作成します。
Introduction
ストロークは、世界の死の 2 番目の主要な原因とアメリカ合衆国の死の 5 番目の主要な原因です。にもかかわらず、これらの高死亡率、脳卒中の回復のための治療現在無し医療選択肢の現在利用可能な1課題のまま。うちだけ 40 利用幹細胞の虚血性脳卒中を扱う 300 の臨床試験について現在あります。前の研究は、幹細胞治療にストローク修理2,3に有益な効果があることを示しています。脳由来神経栄養因子 (BDNF) やトロンボスポンジン 1 (THBS-1) 移植ひと神経前駆細胞 (hNPCs) から放出されたなどのパラクライン因子の増加に関連付けられているメカニズムを通して機能の回復機能の向上が示されています。シナプス形成、血管新生、樹状突起分岐、新しい軸索投射だけでなく、免疫系4,5,6を調節すること。ただし、幹細胞の最適な配信方法は、とらえどころのないままです。
脳に成功した幹細胞配信課題のまま。現在、幹細胞を提供する注射ハイドロゲルと高分子足場システムが導入されています。移植時に幹細胞を保護し、宿主の炎症反応と低酸素の条件7,8,9を含む過酷な脳卒中後の環境からの保護を提供するこれらの送付方法,10します。 ただし、最も一般的に使用される材料は、不活性細胞11の連続変調方式 (すなわち、電気刺激) の使用を制限します。電気刺激は分化、イオン チャネル密度、および幹細胞12の神経突起伸展に影響を与えるです。不活性ポリマーと比較して、導電性高分子は電気刺激と幹細胞2の操作を現在可能を運ぶことができます。ただし、電気刺激、(すなわち、 BDNF および THBS 1) 神経栄養因子の遊離を調節する正確なメカニズムはまだ完全に検討されます。
このプロトコルでは、導電性高分子の足場は、体外の電気刺激は、ポリピロール (PPy) から成る細胞培養系を構築する手順を示します。細胞培養系を作製方法により遷延皮質に幹細胞シード足場の後続の注入が可能です。このシステムのため我々 電気的前提、裏付け足場に幹細胞注入前に短期間のため。次の電気刺激は、低侵襲による頭蓋内細胞を運ぶ導電性高分子足場は正常に注入しました。
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Protocol
すべての幹細胞と動物の手続きは研究所動物愛護 (SCRO 616、APLAC 31909) のスタンフォード大学の管理パネル、スタンフォード大学の幹細胞研究管理委員会によって承認されました。
1. ガラス基板エッチング
- インジウム錫酸化物 (ITO) の準備-ガラスの導電面にマスキング剤を配置することによって覆われ、ガラスのスライド。
注: ほとんどの市販の透明テープは、マスキング剤として使用できます。- 刃を使用して余分なマスクを削除、ガラスに覆われた目的の最終的な伊藤設計の形状だけを残してします。
- 硝酸の 5% (v/v) と 45% (v/v) エッチング ソリューションを準備するヒューム フード内ガラス ビーカーに塩酸を組み合わせます。
- 70 ° C でエッチング液の温度を維持するのにホット プレートと温度計を使用します。
- エッチング液 70 ° C に達すると、過剰の ITO 層を取除くために 2 分のためのソリューションにマスク ITO ガラス スライドを配置します。
注: テープ マスキングは酸溶液への暴露から ITO 層を保護します。 - スライドをソリューションから削除し、脱イオン (DI) H2o. でそれをすすいでください。
- マルチメータを使用して残りの伊藤が維持されていることを確認するマスクおよび測定抵抗を慎重に取り外します。目的のエッチング領域のリードアウトは、約 0 Ω をする必要があります。
2. ピロール溶液の調製
- 1000 mL のガラス瓶の中・ ディ ・ H2o. の 600 mL のドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム (NaDBS) の 70 g を溶かす
- NaDBS が解散した後 14 mL 0.2 M ピロールと・ ディ ・ H2O の mL の 386 をソリューションに追加します。
- アルミ箔とソリューションをカバーし、4 ° C で保管
3. めっきガラス基板上ヘのポリピロール
- NaDBS は完全に再溶解されるまでは、部屋の温度にピロール解決を暖めます。
注: これは、約 15 〜 20 分かかります。 - ピロール溶液 25 mL をビーカーに注ぐ。
- マルチメータにエッチングのガラス基板を接続し、ピロール ソリューションにスライドが水没します。
- 0 Ω 抵抗側がプラチナ メッシュ参照電極に向かって直面していることを確認します。
- PPy マルチメータ (電流 3 mA/cm2で 4 時間制御) を用いた ITO 表面にめっきを開始する電流を適用します。
- デジタルマルチメータと洗って電気めっき-PPy ・ ディ ・ H2O 残留界面活性剤を削除するから ITO ガラスを削除します。
- かみそりの刃を使用して ITO ガラスからめっき PPy プレートを注意深く取り外します。
- 常温 PPy プレートを格納します。
4. ポリジメチルシロキサン (PDMS) の準備
- ヘラと計量皿を使用して、基本エージェントの 18 g を混ぜて硬化剤 2 g と 2 つ 10 cm × 8 cm ガラス金型に流し込みます。
- 15 〜 20 分の真空チャンバーを使用して金型から泡を削除します。
- 3 h の 70 ° C のオーブンで金型を配置します。
- いったん冷却、金型から、PDMS を削除するのに平らなヘラを使用します。
5.体外刺激チャンバーの作製
- オートクレーブ 1 時間 120 ° C で金属板 (WxL、2.5 cm × 12.5 cm) とフロー バルブします。
- チェンバー スライドをテンプレートとして使用して、PDMS の 2 つの部分をカットします。
注: PDMS のワンピースは、セル室の細胞部屋から 2 つの隣接する正方形の排気切替器との境界として機能します。もうひとつ、PDMS 商工会議所の境界の概要であります。- カット内部をセル商工会議所、それは正方形形、セル室の図形と一致します。PDMS の両方の部分の全体の形状は長方形、チェンバー スライドのと一致することを確認します。
- 層材料のトップに下から次のよう: (1) メタル プレート、 (切り抜き)、なし (2) PDMS (3) PPy プレート (PDMS に垂直)、 (切り欠き) PDMS (4) と (5) セルの商工会議所。
- 一度完全に整列装置を一緒にクランプします。
- 金属線の 2 つの 60 cm 部分をカットし、商工会議所の外側から突き出ている PPy 板の両端に 1 本のワイヤーを接続する銀ペーストを使用します。その線がインキュベーターの外側に装置を拡張するのに十分な長さを確認します。
- 銀ペーストの硬化後、強化し、エポキシとワイヤーの接続をシールします。
- 応用分野は、各商工会議所で同じであることを確認するテスターを使用して抵抗を記録します。
- 注入、削除線;細胞培養チャンバーをアンクランプし、PDMS し、それらを導電性の足場から分離します。注入された足場の寸法は、約 1 × 3 × 0.25 mm です。
6. ひと神経前駆細胞 (hNPCs) PPy 上のめっき
- 2 時間の紫外線の下で組み立て室を滅菌します。
- 1 時間後回転組み立て室 90 °。
- 滅菌後、PPy コーティング基板の 800 μ L でチャンバーの下部の表面をコート、1 h の 5% CO2で 37 ° C でインキュベーターで PPy プレート上を固めるため基板を許可します。
- 1 時間後の部屋から上澄みを除去し、ウェルあたり DPBS + Ca、Mg の 1 mL で優しくすすいでください。
メモ: は、基材の剥離の原因になります、力強く PPy の表面を洗浄しないでください。 - 新鮮な携帯メディアを使用して、機械的に穏やかなピペッティングで組織培養プレートからチャンバー用培養細胞を切り離して考えます。
注: セルは 90-100% 解離に合流をする必要があります。 - 8000 × g で 5 分間遠心分離を用いた hNPC ペレットを収集します。
- 診断を使用して、カウント、100,000 セル/cm2のボリュームに細胞を再懸濁します。
- 各商工会議所よく (100,000 セル/cm2メディアの 1 ml) に 100,000 細胞をプレートします。
- 5% で 37 ° C でインキュベーターに部屋を戻る CO2.
7. hNPCs の刺激
- 1 日播種後、チャンバーに細胞は、細胞に電気刺激を適用するのに波形発生器を使用します。
- 刺激の前に各商工会議所からも古いメディアを削除し、新鮮なメディアの 800 μ L で補充します。
- メディアが変更された後チャンバーをインキュベーターに配置、インキュベーター、外ワイヤーを拡張し、波形発生器に接続
- 注 mV、100 Hz と 1 h で方形波信号を細胞に刺激を適用されます。
- 、刺激後ワイヤーを取り外して 5% CO2と 37 ° C で設定インキュベーターの別の日の両院を孵化させなさい。
- セル実行可能性および量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (qRT PCR) 次の製造元のプロトコルを含む後続の生物学的解析を実行します。
8. PPy体内注入
- T 細胞欠損の遠位中大脳動脈 (dMCA) 閉塞ストローク モデルを実行として成人男性裸ラット (NIH RNU 230 ± 30 g) は前述2。注入 1 週間ポスト dMCA オクルー ジョンを実行します。
- 手術の前日は、ケージ水ラットにアンピシリン (1 mg/mL) を与えます。
- 使用して誘導室にラットを麻酔イソフルラン吸入による投与の 0.5 - 3 %mg/kg。
- つま先ピンチ反射応答の欠如によって、ラットの anesthetization を確認してください。
- 動物は、麻酔下では、その膜の色、呼吸パターン、および直腸温 15 分毎に監視を継続します。
- Anesthetization を確認した後は、乾燥を防ぐためにラットの目に人工涙液を適用します。
- 無菌が滅菌手袋、滅菌手術用ドレープ13を使用して、この手順の間維持されることを確認します。滅菌フィールド内で無菌手術器械を保ちます。
- 麻酔下ラットですが、左の皮質上頭をドリルします。硬膜を開きます。
- マイクロ薄い手術用の針を使用して脳から硬膜を削除します。
- インプラント システムの in vitroラット大脳皮質から導電性足場。
注: 実験の日 3 hNPC めっき後体外から足場を注入しました。- 脳卒中病変の内側半影野で主にインプラントを配置します。
- 足場を配置すると後、は、皮膚縫合の動きを防ぐためにインプラントの上 surgicel を置きます。
- 縫合傷がシャット ダウンし、ブプレノルフィン SR 定位手術と dMCA の閉塞に伴う痛みを管理するための 1 mg/kg の用量でラット皮下注入します。
- 意識を取り戻すと、回復ケージにラットを配置します。
- 動物が離れないで意識ではありません。
- それは完全に意識を得ているまでは、他の人と動物を置かないでください。
- 体重減少、減少食品/水の摂取量、削減グルーミング/ボサボサ コート、自発運動の減少/増加、異常姿勢、脱水/スキン ・ テンティング、くぼんだ目、隠れ、自傷などの痛みの兆候を毎日動物を監視します。急速な呼吸、開いて口呼吸、けいれん、震え、震えと発声。
- 食べる、飲む、グルーミング、体重; 表示されるまで毎日動物を監視します。毎週体重増加の後。
- 飲んで食べてない、表示される任意の動物に CO2吸入と (のような動物が正常な酸素供給のポスト CO2吸入による復活しないようにする) euthanization の二次確認を介して初期の euthanization が発生して初期手術後の体重苦痛に表示されます。または運動皮質の赤字を予想よりも大きいため行動のテストを完了することができませんが表示されます。
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Representative Results
図 1に示す回路図は、hNPCs および潜在的なダウン ストリーム アプリケーションの電気刺激の全体的なワークフローを表します。幹細胞治療で現在の制限は、幹細胞が炎症や虚血性の条件を含む厳しい移植後環境にさらされていることです。そうこれらの困難な条件は、その治療効果14,15を制限します。この環境から hNPCs を保護する導電性足場の使用可能性があります電気的前処理による hNPCs 治療効果を増大させます。この幹細胞技術の最初のステップは電気めっきのアプローチ2,16を使用して導電性足場材料を開発。我々 の足場の生体適合性を特徴し、hNPCs と電気的前処理特性を最適化します。コントロールは、組織培養プレート上に成長した物質の幹細胞として定義されました。
様々 な電圧は、電気刺激の安全性を判断し、前処理の効果を最大限に評価しました。各商工会議所で応用フィールドが同じであるためには、組み立て室の比抵抗を測定したマルチメータを使用して (抵抗 (ω、Ω) の部屋だった約 10 kΩ および resistivity≈3 Ωm)。商用ベンダーによると使用 hNPCs ない重要な細胞毒性で示した通常培養システム。hNPCs 電気刺激への暴露の有無はセル実行可能性の試金に染まっていた (Live: 緑;死者: 赤) (図 2)。これらの結果は、(注 mV、1 h の 100 Hz) の電気の刺激の後、hNPCs が実行可能だったことを示します。セル実行可能性の試金を検証するには、レサズリン アッセイを用いた細胞生存率試験を行った。結果は、また、hNPCs 電気刺激の重要な細胞毒性を示さない。
私たち以前の体内データを示した電気刺激への暴露と hNPCs (SD56、胚性幹細胞から派生した Npc) から解放パラクライン因子がストローク2の後回復を改善します。HNPC (アルナ生物医学、胚性幹細胞から派生した Npc) からリリースされている脳卒中の回復に重要であると知られている候補者要因を詳しく、BDNF および THBS 1 を検討しました。これらの要因は神経伸長での役割のため広く研究されているし、細胞間相互作用17,18の増加します。BDNF の THBS 1 トランスクリプトーム変更電気刺激の有効性を調べるためには、BDNF および THBS 1 ハウスキーピング遺伝子として GAPDH 遺伝子を含む qRT PCR を行った。総 RNA の約 1 μ g は、製造元のプロトコルに従って cDNA に逆転写さだった。PPy の hNPCs と電気刺激への暴露と PPy の hNPCs の遺伝子発現を比較する ΔΔCt 法による正規化された倍変化率を求めた。統計分析がされた電気刺激依存 (p ≤0.01) グループ間における BDNF および THBS 1 遺伝子発現の重要な upregulations を示した (図 3)。このデータでは、最適化は重要な細胞死がなければ hNPC の有効性を最大化することを示唆しています。
図 1.体外導電性高分子足場システム電気刺激。(A)スライド室 PPy 板の上に配置されます。(B)回路図は、hNPCs PPy の表面にメッキと体外刺激チャンバーの作製を示しています。流量弁、PPy、PDMS、スライド室を保持し、メタル プレートを一緒に使用されます。(C)部屋のイメージ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.HNPCs 電気刺激の有無でセル実行可能性の試金。(A)カルセイン am で生きているセルを示す棒グラフがステンド グラスします。表示されるデータは、平均 ± 標準偏差;n = 4。(B)セル実行可能性の試金レサズリンを使用して。バーを示しています hNPCs; 電気刺激の細胞毒性はありませんでした。n = 4。セル実行可能性の試金電気刺激治療前後の画像を((C)) 。緑色の信号は、赤信号を示す死んだ細胞 (EtHD-1) に対し生きているセル (カルセイン am) を示します。ES は、電気刺激を示します。ES + または - 細胞の電気刺激の有無を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.電気刺激による遺伝子発現変動。BDNF (A)と THBS1 の遺伝子発現の変化を折るバー グラフを示す(B) hNPCs (* * 電気的前処理と他のすべてのグループ、p 間有意を示す < エラー バーが表示標準偏差 0.01; n = 4、一方向の分散分析).負は規則的なティッシュ文化皿で培養、コントロールを示します。ES + または - 細胞の電気刺激の有無を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
成長の証拠として新規ストローク療法幹細胞の約束を実証しています。この約束は、少なくとも 40 進行中または完了した臨床試験とベッドサイドに幹細胞治療を進めるための主要な努力になりました。ストローク病理学では、幹細胞療法に向いている急性侮辱後回復を防止する神経変性プロセスがないためユニークな神経疾患を提供しています。幹細胞が強化された脳卒中の回復の正確なメカニズムは不明のまま。血管新生、シナプス形成、シナプスの改造はすべて重要であることに示されています。BDNF など THBS 1 シナプス形成に重要な分子が削除されると、脳卒中の回復は障害6,19です。hNPCs は、多数の動物モデル20,21脳卒中後の機能回復を改善しています。メカニズム、hNPCs の効果のまま完全に理解し、これらの細胞の最適な配信方法が知られています。HNPCs からリリースされた重要な分子を操作することができますシステムを開発することによって積分の回復メカニズムを区別し、幹細胞治療の最適化を助けることができる 1 つ。
脳に成功した細胞配信課題のまま。現在、いくつかの技術は、生存と幹細胞9,10の統合を改善するために幹細胞を提供する異なる足場システムを使用して開発されています。ただし、これらの材料の不活性の性質は、その移植後幹細胞を調節することは困難です。
この資料では、PPy 足場を使用して、我々 の qRT PCR のデータにより BDNF および THBS 1 の示すように、電気 hNPCs のトランスクリプトームを操作する方法について説明します。私たちの以前の研究では、hNPCs の電気刺激への暴露後の VEGFA 式の増加がストローク2後機能回復を改善することを明らかにしました。ここに示すその他の神経栄養因子 BDNF THBS 1 がまた変調と異なる hNPC 細胞株における電気刺激への暴露後体制を多数の細胞で使用できることを示すようです。
体外刺激チャンバーの製作中に金属線は PPy プレート シルバー塗装とエポキシを使用してに完全に接続されていることが重要です。この接続は音で、同じパラメーターでも、さまざまな電場が発生します。さらに、時メディアは足場システムの組立後リーク可能性があります。この問題を解決するには真空用グリースは、PDMS とケア PPy プレート細胞播種面に隙間をシールに適用できます。PPy 板の非透過的な性質による制限の 1 つは標準的な光学顕微鏡で細胞の密度をチェックが限定です。
このプロトコルで記述されている方法の利点は、hNPCs の調節、細胞の力学的変化を決定するため現在、電気変調は、従来のハイドロゲルまたは不活性の足場システムを使用して、近づかれてはないです。PPy 足場を利用した電気刺激後、hNPCs は生体内でモデルにポリマー表面から取り外すことがなく配信できます。幹細胞アプリケーションの疾患モデルをさらに研究する手法を開発することができます私たちより良いデザイン並進アプリケーション。導電性高分子を用いたを可能にした電気の前処理方法は異なる種類の細胞に適用できるし、セルに電気刺激の影響の理解を深めることができます。生体外で細胞を最適化し、なし (継または削除) などの操作をさらに脳卒中など体内の病気の状態でこれらの培養操作のテストできます。究極の目的は、脳卒中治療を促進し、脳卒中回復メカニズムの理解を深める、説明されている導電性高分子足場等の新技術を活用することです。
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Disclosures
著者はこの仕事を宣言する利害の対立があります。
Acknowledgments
QRT PCR 機の使用ありがとう博士カティ andreasson 間違いなく天才 (神経内科・脳神経科学、スタンフォード大学)。仕事は (P.M.G.) に健康補助金 K08NS098876 の国立研究所およびスタンフォード大学医学部学部長員 (体臭) にによって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FGF-Basic | Invitrogen | CTP0261 | 20 ng/mL for working media |
| Matrigel | Corning | cb40234a | 1:200 dilution |
| LIF Protein, Recom. Hum. (10 µg/mL) | EMD Millipore | LIF1010 | 10 ng/mL for working media |
| Sylgard 184 silicone 3.9 kg | Fisherbrand | NC0162601 | |
| Hydrochloric acid | Fisherbrand | SA56-4 | |
| Nitric Acid Concentrate (Certified) ACS, Fisher Chemical | Fisherbrand | SA95 | |
| ITO Glass | Delta Technologies | CG-40IN-0115 | |
| Sodium dodecylbenzenesulfonate | Sigma | 289957-1KG | |
| Pyrrole | Sigma | 131709-500ML | Protect pyrrole solution from light and room temperature |
| 8 well glass slide chambers | Thermo Sci Nuc | 125658 | Detach the cell chamber and keep it under sterilized conditions |
| Flat-Surface Bracket, 3"x1" | McMaster-Carr | 1030A4 | |
| TWO PART SILVER PAINT 14G | Electron Microscopy Sciences | 1264214 | Mix two parts (1:1) in plastic plate |
| DPBS, 1x, with Ca and Mg, No Phenol Red | Genesse | 25-508C | |
| AB2 ArunA Neural Cell Culture Media Kit | Aruna Biomedical | ABNS7013.2 | |
| hNP1 Human Neural Progenitor Expansion Kit | Aruna Biomedical | hNP7013.1 | |
| Noncontact Flow-Adjustment Valve, Nickel-Plated Brass, for 3/32" to 5/8" Tube OD | McMaster-Carr | 5330K22 | |
| Multimeter | Keysight | E3641A | |
| Wavefoam generator | Keysight | 33210A-10MHz | |
| Pt meshes | Sigma-Aldrich | 298107-425MG | Reference electrode with dimensions, 1x1 cm |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| BDNF | Thermo Fisher Scientific | Hs02718934_s1 | |
| THBS1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00962908_m1 | |
| GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs02758991_g1 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen | 74106 | |
| QIAshredder (250) | Qiagen | 79656 | |
| RNase-Free DNase Set (50) | QIAGEN | 79254 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit, 100 x 20 µL rxns | BIORAD | 1708891 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4369510 | |
| 7-8 Week Old, male, RNU Rats | NCI-Frederick | ||
| 4-0 Ethicon Silk Suture | eSutures.com | 683G | |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip | 901806 | |
| Surgicel Original Absorbable Hemostat | Ethicon | 1952 | |
| Lab Standard Stereotaxic Instrument, Rat | Stoelting | 51600 | |
| Kimberly-Clark Professional Safeskin Purple Nitrile Sterile Exam Gloves | Fisherbrand | 19-063-130 | |
| Sterile Drape | Medline | DYNJSD1092 | |
| Thermo Scientific Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle, Holds No. 20-25 Blades | Fisherbrand | 53-34 | |
| Walter Stern Scalpel Blade Series 300 | Fisherbrand | 17-654-456 | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4484642 | |
| Frazier Micro Dissecting Hook | Harvard Apparatus | 52-2706 |
References
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