Summary
Questo protocollo descrive la realizzazione di un sistema di coltura cellulare per consentire la semina delle cellule staminali su un'impalcatura polimero conduttivo per elettrostimolazione in vitro e successive in vivo l'impianto della cellula formativa-seminato impalcatura utilizzando un tecnica mininvasiva.
Abstract
Terapia con cellule staminali è emerso come un'eccitante corsa terapeutica, ma il metodo di consegna ottimale rimane poco chiaro. Mentre la tecnica di microiniezione è stata utilizzata per decenni per fornire cellule staminali in modelli di ictus, questa tecnica è limitata dalla mancanza di capacità di manipolare le cellule staminali prima dell'iniezione. Questa carta descrive in dettaglio un metodo di utilizzo di un'impalcatura polimero conduttivo per la consegna di cellule staminali. La stimolazione elettrica delle cellule staminali utilizzando un'impalcatura polimero conduttivo altera geni di cellule staminali coinvolti nella sopravvivenza delle cellule, la risposta infiammatoria e rimodellamento sinaptico. Dopo precondizionamento elettrici, le cellule staminali sul patibolo sono trapiantate intracranially in un modello del ratto di occlusione dell'arteria cerebrale centrale distale. Questo protocollo descrive una tecnica potente per manipolare le cellule staminali tramite un'impalcatura polimero conduttivo e crea un nuovo strumento per sviluppare ulteriormente la terapia a base di cellule staminali.
Introduction
Il colpo è la seconda causa di morte nel mondo e la quinta causa di morte negli Stati Uniti. Nonostante questi alti tassi di mortalità, trattamenti per tempi di recupero attualmente rimangono una sfida con nessun valide opzioni mediche attualmente disponibili1. Ci sono attualmente circa 300 test clinici a che fare con colpi ischemici, di cui solo 40 utilizzare cellule staminali. Gli studi precedenti hanno dimostrato che le terapie con cellule staminali hanno un effetto benefico sulla corsa riparazione2,3. Fattori paracrini come fattore neurotrophic cervello-derivato (BDNF) e trombospondina-1 (THBS-1) rilasciati dalle cellule progenitrici neurali umane trapiantate (hNPCs) hanno mostrato una migliore recupero funzionale attraverso meccanismi associati con un aumento Synapse formazione, angiogenesi, ramificazioni dendritiche e nuove proiezioni assonali, come pure di modulazione del sistema immunitario4,5,6. Tuttavia, i metodi di consegna ottimale delle cellule staminali rimangono sfuggenti.
Consegna di successo sulle cellule staminali al cervello rimane una sfida. Attualmente, idrogel iniettabili e sistemi di ponteggio polimerici sono stati introdotti per fornire cellule staminali. Questi metodi di consegna proteggono le cellule staminali durante il trapianto, nonché offrono protezione da ambienti post-ictus tra cui risposta infiammatoria dell'ospite e condizioni ipossiche7,8,9 , 10. Tuttavia, i materiali più comunemente usati sono inerti, che limita l'uso della modulazione continua (cioè, stimolazione elettrica) delle cellule11. La stimolazione elettrica è uno spunto che influenza la differenziazione, densità di canali ionici e neuriti delle cellule staminali12. Rispetto ai polimeri inerti, polimeri conduttivi possono trasportare una corrente che consente per la stimolazione elettrica e la manipolazione di cellule staminali2. Tuttavia, il meccanismo preciso con cui stimolazione elettrica modula il rilascio di fattore neurotrophic (cioè, BDNF e THBS-1) è ancora non completamente esplorato.
In questo protocollo, descriviamo i passaggi per costruire un sistema di coltura cellulare che consiste di uno scaffold polimerici, polipirrolo (PPy), che permette per la stimolazione elettrica in vitro . A causa del modo in cui è realizzato il sistema di coltura cellulare, è possibile impianto successivo dell'impalcatura della cellula formativa-seminato sulla corteccia del peri-infarto. Per questo sistema, abbiamo presupposto elettricamente le cellule staminali sul patibolo per un breve periodo di tempo prima dell'impianto. A seguito di stimolazione elettrica, lo scaffold polimerici che trasportano le cellule è impiantato con successo intracranially utilizzando un metodo come minimo dilagante.
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Protocol
Tutte le cellule staminali e procedure degli animali sono state approvate dal comitato di supervisione di ricerca sulle cellule staminali di Stanford e dal pannello di amministrazione dell'Università di Stanford su Laboratory Animal Care (SCRO-616 e APLAC-31909).
1. incisione del vetro di ITO
- Preparare l'ossido della latta dell'indio (ITO)-vetrino coperto inserendo un agente mascherante sopra il lato conduttivo del vetro.
Nota: Nastri trasparenti più commerciali possono essere utilizzati come un agente mascherante.- Rimuovere la maschera in eccesso utilizzando una lama, lasciando solo la forma desiderata del progetto definitivo ITO coperto sul vetro.
- Combinare il 5% (v/v) di acido nitrico e 45% (v/v) di HCl in un becher di vetro all'interno di una cappa aspirante per preparare la soluzione di incisione.
- Utilizzare un piatto caldo e un termometro per garantire che la temperatura della soluzione di incisione è mantenuta a 70 ° C.
- Una volta che la soluzione di acquaforte raggiunge i 70 ° C, immergere il vetrino mascherato-ITO vetro nella soluzione per 2 minuti per rimuovere lo strato di ITO in eccesso.
Nota: La mascheratura nastro protegge lo strato di ITO dall'esposizione a soluzione acida. - Rimuovere il vetrino dalla soluzione e sciacquare con deionizzata (DI) H2O.
- Rimuovere con cautela la maschera e misura la resistenza utilizzando un multimetro per garantire che il restante ITO è intatto. Letture dell'area desiderata acidato dovrebbero essere circa 0 Ω.
2. preparazione della soluzione di pirrolo
- In una bottiglia di vetro da 1000 mL, sciogliere 70 g di sodio dodecylbenzenesulfonate (NaDBS) in 600 mL DI H2O.
- Una volta che il NaDBS è sciolto, aggiungere 14 mL di 0,2 M pirrolo e 386 mL DI H2O alla soluzione.
- Coprire la soluzione con foglio di alluminio e conservare a 4 ° C.
3. placcatura elettrolitica di polipirrolo su vetro di ITO
- Riscaldare la soluzione di pirrolo a temperatura ambiente fino a quando NaDBS è completamente ridisciolto.
Nota: Questo richiede circa 15-20 minuti. - Versare 25 mL della soluzione di pirrolo in un becher.
- Collegare il vetro acidato ITO di un multimetro e immergere il vetrino nella soluzione di pirrolo.
- Assicurarsi che il lato con 0 resistenza Ω è rivolto verso l'elettrodo di riferimento di mesh platino.
- Applicare una corrente elettrica per avviare Galvanotecnica di PPy sulla superficie ITO utilizzando un multimetro (corrente controllata a 3 mA/cm2 per 4 ore).
- Rimuovere il vetro ITO dal multimetro e lavare elettrolitico-PPy in DI H2O per rimuovere residui dell'agente tensioattivo.
- Staccare delicatamente la piastra elettrolitica-PPy i vetro di ITO con una lama di rasoio.
- Conservare la piastra PPy a temperatura ambiente.
4. preparazione di polidimetilsilossano (PDMS)
- Utilizzando una spatola e un piatto di pesatura, mescolare 18 g di agente base con 2 g di agente indurente e versare il composto in stampi di vetro due 10 x 8 cm.
- Rimuovere le bolle dagli stampi utilizzando una camera a vuoto per 15-20 minuti.
- Posizionare gli stampi in forno a 70 ° C per 3 h.
- Una volta raffreddato, è possibile utilizzare una spatola piatta per rimuovere il PDMS dagli stampi.
5. fabbricazione di vano di stimolazione elettrica In Vitro
- Sterilizzare in autoclave il flusso e piastre di metallo (WxL, 2,5 cm x 12,5 cm) valvole a 120 ° C per 1 ora.
- Utilizzando una diapositiva di camera come un modello, tagliare due pezzi di PDMS.
Nota: Un pezzo di PDMS serve come il perimetro della camera cellulare con ritagli di due piazze contigue all'interno della camera di cella. L'altro pezzo PDMS è un contorno del perimetro della camera.- Tagliare l'interno camera di cella che è quadrato a forma di e corrisponde alla forma dell'alloggiamento delle cellule. Assicurarsi che la forma complessiva di entrambe le parti di PDMS è rettangolare e corrisponde a quello della diapositiva da camera.
- I materiali di strato come segue dal basso verso l'alto: (1) metallo piatto, (2) PDMS (senza aperture), (3) PPy piastra (perpendicolare alla PDMS), (4) PDMS (con ritagli) e camera (5) delle cellule.
- Bloccare l'apparato insieme una volta che completamente è allineato.
- Tagliare due pezzi di 60 cm di un filo metallico e utilizzare pasta d'argento per collegare un filo ad ogni estremità della piastra PPy che sporge dalla parte esterna della camera. Assicurarsi che i cavi siano abbastanza a lungo per estendere dall'apparecchio verso l'esterno di un incubatore.
- Una volta che la pasta d'argento è guarita, rafforzare e sigillare il collegamento del filo con resina epossidica.
- Registrare la resistenza utilizzando un multimetro per assicurarsi che il campo applicato è lo stesso in ogni camera.
- Per l'impianto, rimuovere i fili; sbloccare gli alloggiamenti di cella e PDMS e poi li separano dal patibolo conduttivo. La dimensione delle impalcature impiantate è circa 1 x 3 x 0,25 mm.
6. cellule progenitrici neurali umane (hNPCs) su PPy di placcatura
- Sterilizzare gli alloggiamenti assemblati sotto luce UV per 2 ore.
- Dopo 1 ora, ruotare l'assemblato chambers 90°.
- Dopo la sterilizzazione, rivestire la superficie di PPy nella parte inferiore della camera con 800 µ l di un substrato di rivestimento e consentire il substrato solidificare il PPy piastra in un incubatore a 37 ° C 5% CO2 per 1 h.
- Dopo 1 ora, rimuovere il surnatante dalle camere e risciacquare delicatamente con 1 mL di DPBS + Ca + Mg per bene.
Nota: Evitare di lavare la superficie di PPy con forza come questo farà sì che il distacco del substrato rivestimento. - Utilizzando supporti di cellule fresche, meccanicamente dissociare le cellule coltivate per uso con gli alloggiamenti da una piastra di coltura del tessuto con delicato pipettaggio.
Nota: Le cellule dovrebbero essere 90-100% confluenti sulla dissociazione. - Raccogliere hNPC pellet utilizzando una centrifuga a 8000 x g per 5 minuti.
- Utilizzando un emocitometro, contare e risospendere le cellule in un volume di 100.000 cellule/cm2.
- Piastra di 100.000 cellule in ogni camera ben (100.000 cellule/cm2 in 1 mL di media).
- Tornare chambers incubatore a 37 ° C 5% CO2.
7. elettrostimolazione del hNPCs
- Un giorno dopo la semina le cellule su chambers, utilizzare un generatore di forme d'onda per applicare la stimolazione elettrica alle celle.
- Prima stimolazione, rimuovere i vecchi media da ogni camera ben e saziatevi con 800 µ l di media fresco.
- Dopo avere modificato i media, inserire nuovamente gli alloggiamenti dell'incubatrice, estendere i cavi dall'incubatrice e allegarli a un generatore di forme d'onda
- Applicare la stimolazione delle cellule con un segnale ad onda quadra a ± 400 mV con 100 Hz per 1 h.
- Dopo la stimolazione, rimuovere i fili e incubare gli alloggiamenti per un altro giorno in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2.
- Eseguire successiva analisi biologiche tra cui la vitalità cellulare e reazione a catena della polimerasi in tempo reale quantitativa (qRT-PCR) seguendo il protocollo del produttore.
8. in Vivo PPy impianto
- Eseguire modelli di ictus di occlusione dell'arteria cerebrale centrale distale (dMCA) su T cellula-carenti ratti nudi maschio adulto (NIH-RNU 230 ± 30g) come descritto in precedenza2. Eseguire l'occlusione l'impianto una settimana post-dMCA.
- Un giorno prima dell'intervento, dare ampicillina (1 mg/mL) per i ratti in loro acqua di gabbia.
- Anestetizzare il ratto in una camera di induzione utilizzando 0,5 - 3% mg/kg di isoflurane somministrata tramite inalazione.
- Confermare amputate del ratto da una mancanza di risposta riflessa di punta pizzico.
- Mentre l'animale è sotto anestesia, continuare a monitorare la sua membrana colore, pattern respiratorio e temperatura rettale ogni 15 minuti.
- Una volta confermata la amputate, applicare le lacrime artificiali su occhi di topo per prevenire la secchezza.
- Assicurare che una tecnica asettica è mantenuta durante questa procedura utilizzando guanti sterili e un telo chirurgico sterile13. Mantenere gli strumenti chirurgici sterili all'interno di un campo sterile.
- Mentre il ratto è sotto anestesia, praticare un craniectomy sopra la corteccia sinistra. Aprire la dura madre.
- Rimuovere il mater di dura dal cervello utilizzando un ago chirurgico micro-sottile.
- Impiantare le impalcature conduttive da sistema in vitro sulla corteccia del ratto.
Nota: Per i nostri esperimenti, abbiamo impiantato impalcature da in vitro giorno 3 dopo il placcaggio di hNPC.- Inserire l'impianto principalmente sulla corteccia penombra mediale alla lesione di colpo.
- Dopo la messa il patibolo, è posto surgicel sopra l'impianto per impedire il movimento con la chiusura della pelle.
- Suturare la ferita chiusa e iniettare per via sottocutanea i ratti con buprenorfina SR ad un dosaggio di 1 mg/kg per gestire il dolore associato con la chirurgia stereotassica e occlusione dMCA.
- Posizionare il ratto in una gabbia di recupero come riprende conoscenza.
- Non lasciare mai l'animale incustodito mentre è incosciente.
- Non lasciare mai l'animale con gli altri fino a quando non si è pienamente guadagnato coscienza.
- Monitorare gli animali ogni giorno per segni di dolore, compreso perdita di peso corporeo, assunzione di cibo/acqua in diminuzione, ridotta cappotto governare/spettinati, diminuito/aumentato attività spontanea, postura anormale, disidratazione/pelle tenting, gli occhi infossati, nascondersi, automutilazioni, respirazione rapida, respirazione a bocca aperta, spasmi muscolari, tremore, tremito e vocalizzazione.
- Monitorare gli animali ogni giorno fino a quando sembra che essi sono mangiare, bere, toelettatura e aumento di peso; e poi settimanalmente dopo aumento di peso.
- Euthanization precoce tramite inalazione di CO2 e una conferma secondaria di euthanization (tale da garantire l'animale non farà rivivere a causa di inalazione di ossigeno normale alimentazione post CO2 ) si verificherà per qualsiasi animale che sembra essere non mangiare, bere e aumentare di peso dopo l'intervento chirurgico iniziale; appare nel dolore; o appare impossibile completare i test comportamentali a causa di un maggiore del previsto disavanzo corteccia motoria.
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Representative Results
Lo schema illustrato nella Figura 1 rappresenta il flusso di lavoro complessivo della stimolazione elettrica dei hNPCs e potenziali applicazioni a valle. Una limitazione corrente nella terapia con cellule staminali è che le cellule staminali sono esposti a un ambiente di post-trapianto duro tra cui l'infiammazione e condizioni ischemiche. Queste difficili condizioni probabilmente limitano la loro efficacia terapeutica14,15. L'uso di un ponteggio conduttivo per proteggere hNPCs da questo ambiente può aumentare la hNPCs benefici terapeutici attraverso precondizionamento elettrici. Il primo passo in questa tecnica di consegna della cellula formativa è lo sviluppo di un'impalcatura conduttivo utilizzando un Galvanotecnica approccio2,16. Abbiamo caratterizzato la biocompatibilità di impalcature e ottimizzato le caratteristiche elettriche di precondizionamento con hNPCs. I controlli sono stati definiti come non stimolate cellule staminali cresciute su una piastra di coltura del tessuto.
Varie tensioni sono stati valutati per determinare la sicurezza di stimolazione elettrica e massimizzare l'efficacia di precondizionamento. Per garantire che il campo applicato è lo stesso in ogni camera, la resistività dell'alloggiamento montato è stata misurata utilizzando un multimetro (resistenze (Ohm, Ω) delle camere erano circa 10 kΩ e resistivity≈3 Ωm). Secondo il fornitore commerciale, il hNPCs usato non hanno dimostrato nessuna significativa citotossicità in sistemi di coltura normale. hNPCs con o senza esposizione a stimolazione elettrica sono stati macchiati con saggi di vitalità cellulare (Live: verde; Morti: rosso) (Figura 2). Questi risultati indicano che i hNPCs erano vitali dopo la stimolazione elettrica (± 400 mV, 100 Hz per 1 h). Per convalidare l'analisi di attuabilità delle cellule, abbiamo effettuato il test di vitalità cellulare mediante un saggio di resazurin. I risultati non dimostrano anche nessuna citotossicità significativa dell'elettrostimolazione su hNPCs.
Nostri dati precedenti in vivo hanno dimostrato che fattori paracrini rilasciati da hNPCs (SD56, NPCs derivate da cellule staminali embrionali) con un'esposizione a stimolazione elettrica migliorano il recupero dopo ictus2. Per esplorare ulteriormente fattori candidati conosciuti per essere importante in tempi di recupero che vengono rilasciati da hNPC (biomedicale Aruna, NPCs derivate da cellule staminali embrionali), BDNF e THBS-1 sono stati valutati. Questi fattori sono stati studiati estesamente per il loro ruolo in conseguenza di un neurone e aumentano in interazioni cellula--cellula17,18. Per studiare l'efficacia della stimolazione elettrica il trascrittoma modifiche per BDNF e THBS-1, qRT-PCR è stato effettuato compreso BDNF e THBS-1 geni con GAPDH come un gene housekeeping. Circa 1 µ g di RNA totale è stato retrotrascritto in cDNA secondo il protocollo del produttore. Piega-modifica normalizzata coefficienti sono stati calcolati dal metodo ΔΔCt confrontando l'espressione genica in hNPCs su PPy e hNPCs su PPy con un'esposizione allo stimolo elettrico. L'analisi statistica ha mostrato upregulations significativa nell'espressione genica del BDNF e THBS-1 tra gruppi che erano elettricamente stimolazione dipendente (p ≤ 0,01) (Figura 3). Questi dati suggeriscono che l'ottimizzazione è possibile massimizzare l'efficacia di hNPC senza morte cellulare significativo.
Figura 1 . In vitro sistema di ponteggio polimero conduttivo per la stimolazione elettrica. (A) una camera di diapositiva è disposto in cima PPy piastra. (B) lo schema mostra la fabbricazione della camera in vitro la stimolazione elettrica con hNPCs placcato sulla superficie del PPy. Valvole di flusso vengono utilizzati per tenere la camera di diapositiva, PDMS, PPy e insieme di piastra metallica. (C) immagine della camera. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Analisi di attuabilità delle cellule in hNPCs con o senza stimolazione elettrica. (A) grafico a barre dimostrazione dal vivo delle cellule colorate con calceina-am. I dati presentati sono media ± S.D.; n = 4. (B) cella analisi di attuabilità utilizzando resazurin. Grafico a barre mostra che non c'era nessuna citotossicità dell'elettrostimolazione su hNPCs; n = 4. (C) immagini di attuabilità delle cellule analisi prima e dopo il trattamento di stimolazione elettrica. Segnale verde indica cellule vive (calceina-am), mentre un segnale rosso indica le cellule morte (EtHD-1). ES indica la stimolazione elettrica. ES + o - indica la presenza o l'assenza di stimolo elettrico sulle cellule. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Cambiamenti di espressione genica con stimolazione elettrica. Grafico a barre dimostrando piegare le modifiche in espressioni geniche di BDNF (A) e THBS1 (B) in hNPCs (* * indica statisticamente significativa tra i gruppi elettricamente precondizionati e tutti gli altri, p < 0.01, Visualizza barre di errore S.D.; n = 4, One-way ANOVA ). Negativo indica il controllo dove le cellule sono state coltivate su una piastra di coltura del tessuto normale. ES + o - indica la presenza o l'assenza di stimolo elettrico sulle cellule. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Crescenti evidenze ha dimostrato la promessa delle cellule staminali come terapia romanzo tratto. Questa promessa ha provocato un grande sforzo per avanzare terapeutica delle cellule staminali al capezzale con almeno 40 studi clinici in corso o completati. Patologia di corsa offre un unico disturbo neurologico che si presta a terapia con cellule staminali, perché dopo l'insulto acuto, non c'è nessun processo neurodegenerativo, impedendo così il recupero. Il meccanismo esatto di cellule staminali-aumentata tempi di recupero rimane poco chiaro. L'angiogenesi, sinaptogenesi e rimodellamento sinaptico hanno tutti dimostrati di essere importante. Quando le molecole importanti per la formazione di sinapsi come BDNF e THBS-1 vengono rimossi, tempi di recupero sono alterata6,19. hNPCs hanno migliorato il recupero funzionale dopo l'ictus in numerosi modelli animali20,21. I meccanismi del hNPCs effetto resti non pienamente compresi, e il metodo di consegna ideale per queste cellule è sconosciuto. Attraverso lo sviluppo di un sistema che permette di manipolare le molecole importanti rilasciate da hNPCs, uno può aiutare a differenziare i meccanismi di recupero integrale e ottimizzare la terapia con cellule staminali.
Consegna di successo delle cellule al cervello rimane una sfida. Attualmente, diverse tecnologie è state sviluppate utilizzando sistemi di ponteggio di diversi biomateriali per fornire cellule staminali per migliorare la sopravvivenza e l'integrazione di cellule staminali9,10. Tuttavia, a causa delle caratteristiche inerti di questi materiali, è difficile modulare le cellule staminali dopo il loro trapianto.
Questo articolo viene descritto un metodo che utilizza un ponteggio PPy elettricamente manipolare il trascrittoma di hNPCs, come mostrato dal upregulation di BDNF e THBS-1 nei nostri dati qRT-PCR. Il nostro studio precedente ha rivelato che un aumento nell'espressione di VEGFA il hNPCs dopo l'esposizione a stimolazione elettrica migliorato il recupero funzionale dopo ictus2. Qui dimostriamo che neurotrophic ulteriori fattori come BDNF e THBS-1 sono modulati anche dopo l'esposizione a stimolazione elettrica in una linea cellulare di diversi hNPC, mostrando che il nostro sistema può essere utilizzato con numerose linee cellulari.
Durante la realizzazione della sezione di stimolazione elettrica in vitro , è fondamentale che il filo metallico è completamente collegato alla piastra PPy con resina epossidica e vernice argento. Se questa connessione non è suono, provoca diversi campi elettrici anche con gli stessi parametri. Inoltre, a volte media potrebbe perdite dopo il montaggio del ponteggio. Per risolvere questo problema, grasso per vuoto può essere applicato per sigillare lo spazio tra il PDMS e la piastra di PPy con cura di non applicare sulla superficie delle cellule-semina. Una limitazione a causa della natura non trasparente della piastra PPy è che controllando la confluenza delle cellule con microscopia chiara standard è limitata.
Il vantaggio del metodo descritto in questo protocollo permette per la modulazione dei hNPCs per aiutare a determinare le modifiche meccanicistiche delle cellule. Attualmente, modulazione elettrica non è stato affrontato utilizzando idrogel convenzionale o sistemi di ponteggio inerte. Dopo stimolazione elettrica utilizzando l'impalcatura PPy, i hNPCs possono essere consegnati senza rimozione dalla superficie del polimero a un modello in vivo . Lo sviluppo di metodi per approfondire ulteriormente i modelli di malattia delle cellule staminali applicazioni ci permette di progettare al meglio applicazioni traslazionale. L'approccio di precondizionamento elettrico, reso possibile dal sistema polimero conduttivo, può essere applicato a diversi tipi di cellule e permette per una migliore comprensione dell'impatto della stimolazione elettrica in una cella. La possibilità di ottimizzare le cellule in vitro e quindi senza ulteriore manipolazione (ad esempio passaggio o rimozione) consente per il test di queste manipolazioni in vitro negli Stati di malattia in vivo come l'ictus. L'obiettivo finale è quello di utilizzare nuove tecniche come l'impalcatura polimero conduttivo descritto, ad avanzare terapeutica ictus e migliorare la comprensione dei meccanismi di recupero del colpo.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse di dichiarare con questo lavoro.
Acknowledgments
Ringraziamo il dottor Kati Andreasson (dipartimento di neurologia e scienze neurologiche, Università di Stanford) per l'uso della macchina qRT-PCR. Il lavoro è stato supportato da nazionale istituti di salute sovvenzioni K08NS098876 (alla P.M.G) e Postdoctoral Fellowship di Stanford School of Medicine Dean (a B.O.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FGF-Basic | Invitrogen | CTP0261 | 20 ng/mL for working media |
| Matrigel | Corning | cb40234a | 1:200 dilution |
| LIF Protein, Recom. Hum. (10 µg/mL) | EMD Millipore | LIF1010 | 10 ng/mL for working media |
| Sylgard 184 silicone 3.9 kg | Fisherbrand | NC0162601 | |
| Hydrochloric acid | Fisherbrand | SA56-4 | |
| Nitric Acid Concentrate (Certified) ACS, Fisher Chemical | Fisherbrand | SA95 | |
| ITO Glass | Delta Technologies | CG-40IN-0115 | |
| Sodium dodecylbenzenesulfonate | Sigma | 289957-1KG | |
| Pyrrole | Sigma | 131709-500ML | Protect pyrrole solution from light and room temperature |
| 8 well glass slide chambers | Thermo Sci Nuc | 125658 | Detach the cell chamber and keep it under sterilized conditions |
| Flat-Surface Bracket, 3"x1" | McMaster-Carr | 1030A4 | |
| TWO PART SILVER PAINT 14G | Electron Microscopy Sciences | 1264214 | Mix two parts (1:1) in plastic plate |
| DPBS, 1x, with Ca and Mg, No Phenol Red | Genesse | 25-508C | |
| AB2 ArunA Neural Cell Culture Media Kit | Aruna Biomedical | ABNS7013.2 | |
| hNP1 Human Neural Progenitor Expansion Kit | Aruna Biomedical | hNP7013.1 | |
| Noncontact Flow-Adjustment Valve, Nickel-Plated Brass, for 3/32" to 5/8" Tube OD | McMaster-Carr | 5330K22 | |
| Multimeter | Keysight | E3641A | |
| Wavefoam generator | Keysight | 33210A-10MHz | |
| Pt meshes | Sigma-Aldrich | 298107-425MG | Reference electrode with dimensions, 1x1 cm |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| BDNF | Thermo Fisher Scientific | Hs02718934_s1 | |
| THBS1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00962908_m1 | |
| GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs02758991_g1 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen | 74106 | |
| QIAshredder (250) | Qiagen | 79656 | |
| RNase-Free DNase Set (50) | QIAGEN | 79254 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit, 100 x 20 µL rxns | BIORAD | 1708891 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4369510 | |
| 7-8 Week Old, male, RNU Rats | NCI-Frederick | ||
| 4-0 Ethicon Silk Suture | eSutures.com | 683G | |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip | 901806 | |
| Surgicel Original Absorbable Hemostat | Ethicon | 1952 | |
| Lab Standard Stereotaxic Instrument, Rat | Stoelting | 51600 | |
| Kimberly-Clark Professional Safeskin Purple Nitrile Sterile Exam Gloves | Fisherbrand | 19-063-130 | |
| Sterile Drape | Medline | DYNJSD1092 | |
| Thermo Scientific Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle, Holds No. 20-25 Blades | Fisherbrand | 53-34 | |
| Walter Stern Scalpel Blade Series 300 | Fisherbrand | 17-654-456 | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4484642 | |
| Frazier Micro Dissecting Hook | Harvard Apparatus | 52-2706 |
References
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