Summary
כאן נתאר פרוטוקול לבצע cisterna מגנה תעלות (CMc), דרך פולשנית כדי לספק קליעים נותבים, מצעים, מולקולות איתות לתוך נוזל מוחי שדרתי (CSF). CMc בשילוב עם שיטות הדמיה שונות, מאפשרת המערכת glymphatic CSF dynamics הערכה, וכן משלוח המוח ברוחב של תרכובות שונות.
Abstract
Cisterna מגנה תעלות (CMc) היא תהליך פשוט המאפשר גישה ישירה נוזל מוחי שדרתי (CSF) ללא נזק פעיל הגולגולת או parenchyma המוח. בחולדות מרדימים, החשיפה של קרום הדורה ע י ניתוח עמום של שרירי הצוואר מאפשר החדרת הצינורית לתוך המלון cisterna (ס מ). הצינורית, חיבר או על ידי מחט משופע בסדר או בורוסיליקט נימי, מחוברת דרך צינור פוליאתילן (PE) מזרק. באמצעות מזרק משאבה, מולקולות יכול אז להיות מוזרק במחירים מבוקרים ישירות לתוך ס מ, אשר היא רציפה עם תת-עכבישי החלל. מן החלל תת-עכבישי, אפשר לאתר CSF פלקסים על ידי זרימת הולכת חום לחלל perivascular סביב רבים חודר, שבו מתרחשת ממס exchange עם נוזל interstitial (ISF). CMc ניתן לבצע זריקות חריפה מיד לאחר הניתוח, או השרשה כרונית, עם הזרקת מאוחר יותר מרדימים או ער, לנוע בחופשיות מכרסמים. כימות של התפלגות מעקב ב- parenchyma המוח יכול להתבצע על ידי epifluorescence, 2-פוטון מיקרוסקופ, דימות תהודה מגנטית (MRI), בהתאם המאפיינים הכימי פיזיקלי של מולקולות מוזרק. לפיכך, CMc בשילוב עם טכניקות הדמיה שונות מציע כלי רב עוצמה עבור הערכה של מערכת glymphatic ו CSF dynamics ובפונקציה. יתר על כן, CMc יכול להיות מנוצל כמו צינור של משלוח מהיר, המוח-רחב של איתות מולקולות ותערובות מטבולית זאת יכולה אחרת לעבור את מחסום הדם מוח (BBB).
Introduction
נוזל מוחי שדרתי (CSF) מתרחץ מערכת העצבים המרכזית (CNS) ברחבי המערכת חדרית ולאורך את החללים תת-עכבישי, לחלל מוגדר מבחינה אנטומית של רצף עם החדרים, המקיף את המוח ואת חוט השדרה. אחד התפקידים העיקריים של CSF נועד לספק נתיב לאישור של מטבוליטים, מומסים בגבול מ parenchyma המוח. סיווג נעשית באמצעות glymphatic שנתגלתה לאחרונה מערכת1, המוח אנלוגית למערכת הלימפה ההיקפית. במסמך זה, אנו מתארים ולדון cisterna מגנה תעלות (CMc), שיטה פולשנית למסירה ישירה של מולקולות אל תוך שדרתי. CMc היא שיטת המפתח ללמוד את הפונקציה glymphatic. יתר על כן, ניתן גם להחיל CMc עבור חקר הדינמיקה CSF, משלוח מהיר, המוח ברוחב של הלא-דם מוח מחסום (BBB) מולקולות חדיר אל parenchyma המוח, לאורך החלל perivascular.
CMc מנצלת עקרונות פיזיולוגיים של CSF הדינמיקה התנועה דרך מערכת העצבים כדי לספק מעקב שכותרתו מולקולות או סמים לתוך מרחב מלא נוזל מוחי-שדרתי של המלון cisterna (ס מ). מולקולות מוזרקים דרך בצינורית מושתל לתוך כיסוי קרום קרום atlanto-העורף שהמולקולות ס"מ. ואז מתבצעות על ידי נוזל מוחי-שדרתי בצובר מזרימה parenchyma המוח דרך החלל paravascular1. הסוכן נותב או הניגוד מוזרק דרך CMc עוקב אחר תנועת נוזל מוחי-שדרתי, אשר מאפשר את ההערכה של CSF תנועה, זרם glymphatic על ידי לכימות רמות העוצמה של מולקולות שכותרתו מזין parenchyma המוח. CMc הוא תואם עם טכניקות הדמיה שונות, כולל epifluorescence, 2-פוטון מיקרוסקופיה של דימות תהודה מגנטית (MRI). בנוסף, ההערכה ניתן לבצע שני ויוו או ex-vivo. חשוב לציין, CMc מאפשר הפריט החזותי של מערכת glymphatic בהרדמה או במהלך השינה הטבעית, כמו גם בבעלי חיים ערה, נעה בחופשיות.
הטכניקה CMc יכול להיות מנוצל כדי לחקור היבטים שונים של דינמיקה של נוזלים ב- CSF, אבל הוכיחה להיות שימושי במיוחד ללמוד את המערכת glymphatic. Glymphatic פעילות כוננים הזרימה הולכת חום של CSF מן המרחב periarterial דרך תעלות מים aquaporin-4 (AQP-4), אשר הם בסככות הקרום של endfeet וסקולרית גלישת astrocytic. הזרם הולכת חום מאפשרת למחלף של CSF, נוזל בין-תאי (הקרן) בתוך parenchyma המוח. CSF/הקרן המכיל פסולת מטבולית, מומסים בגבול ואז הוסר parenchyma המוח דרך2,שטח perivenous3. בסופו של דבר, CSF/הקרן מגיע הפריפריה דרך כלי הלימפה קרום תיאר לאחרונה4,5. מערכת glymphatic הוכח חיונית עבור פינוי של מטבוליטים פסולת מזיקים כגון עמילואיד-β2. בהמשך, glymphatic סיווג נמצא לקוי הזדקנות6, לאחר פגיעה מוחית טראומטית7, ו במודלים חייתיים של סוכרת8 ו מחלת אלצהיימר9. ראוי לציין, glymphatic פעילות היא מדינה התלויים, מציג פעילות גבוה משמעותית במהלך שינה או הרדמה בהשוואה ערות1. אכן, אפרוחי ומורדמת להפגין את הפעילות glymphatic הגבוהה ביותר. לפיכך, כימות ניסיוני של פעילות glymphatic חיוני כשלמדתי תפקידה מחלה ובריאות.
מספר מחקרים עסקו CSF dynamics ולהחלפה שלה עם נוזל בין-תאי (הקרן) ב- parenchyma המוח. עם זאת, השיטות באמצעותו מועברות שכותרתו מולקולות הן פולשני למדי, מפעילה נזק מוחי parenchyma ושינויים בלחץ תוך גולגולתי (ICP) (ראה סקירת10). כמה דוגמאות הן ע או זריקות intraparenchymal אשר כרוכות גולגולת או קידוח של צמח קוצני חור בגולגולת. הליכים אלה הוכחו לשנות ICP, ובכך לשבש את פעולת הפונקציה glymphatic2. כמו כן, שיטות פולשניות כאלה זירוז astrogliosis ולהגדיל את immunoreactivity AQP-4 בשטח parenchyma פגום המוח,11,שלה הסביבה12. כמו האסטרוציטים ו- AQP-4 הם רכיבי מפתח של מערכת glymphatic, CMc היא השיטה של בחירה ללימודים שלה. היתרונות הגדולים של CMc בהשוואה הליכים פולשניים יותר הם קיום שלם הגולגולת והמוח parenchyma, הימנעות ICP שינויים astrogliosis, בהתאמה. לפיכך, CMc בשילוב עם כלי הדמיה שונים פותח עבור מגוון רחב של אפשרויות ללמוד לא רק את מערכת glymphatic, אלא גם את הדינמיקה ואת מנגנוני זרימה הומאוסטזיס, כמו גם מודלים חייתיים של מחלות נוירולוגיות.
ההליך תעלות (CMc) מגנה cisterna מאפשר גישה קלה וישירה נוזל מוחי שדרתי (CSF). על ידי הזרקת מולקולות שונות (למשל פלורסנט המשדרים, סוכנים בניגוד MRI) הנסיין ניתן לעקוב אחר תנועתם בתוך תא CSF, להעריך את הפעילות של מערכת glymphatic. הפרוטוקול הבא מתאר שני CMc חריפה של, לזריקות מיד לאחר ניתוח ולאחר כרונית השרשת הצינורית, שבו החיה והשיחזור הליך כירורגי זריקה מאוחר יותר. ההבדל החשוב ביותר בין השתלה אקוטי וכרוני הוא ההשתלה כרונית מאפשרת לצורך המחקר של פעילות glymphatic בעכברים ער.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בוצעו בהתאם האירופית דירקטיבה 2010/63/האיחוד האירופי לחקר בעלי חיים, אושרו על ידי המועצה לניסויים חיה תחת דני שר הסביבה ומזון (2015-15-0201-00535).
1. נוהל תעלות
- בצינורית הכנה
הערה: להימנע מלגעת את הצינורית עם כפפות שאינו סטרילי.- לשבור את קצה מחט 30G שיניים באמצעות בעל מחט מתכת משופע.
- באמצעות בעל מחט, להכין את הצינורית על-ידי הוספת קצה משופע מתכת (כ 0.3 ס מ) באורך 30 ס מ של PE10 אבובים (צינורות פוליאתילן 0.024" יתר x 0.011" ID) מלא עם כלנית חדד (126 מ מ NaCl, 2.5 מ מ. אשלגן כלורי, 1.25 מ מ2PO NaH4 , MgSO 2 מ מ4מ מ 2 CaCl2, גלוקוז 10 מ מ, 26 מ מ NaHCO3; pH 7.4 כאשר בגז עם 95% O2 ו- 5% CO2).
- לשטוף את הצינורית עם חנה המבר באמצעות מזרק 1 מ"ל מצויד עם מחט 30 גרם (30 G x ½" 0.3 x 12).
-
הליך כירורגי
הערה: תעלות ס מ כרונית מאפשר החיות להתאושש הליך כירורגי. ס מ זריקות מתבצעים ביום שלאחר ההשתלה בצינורית ו, וחשוב, ניתן לבצע בבעלי חיים או מורדם או ער. מאז זה ניתוח שחזור, נהלים צריכה להתבצע בתנאים סטריליים.- שוקל את העכבר (C57BL/6JRj, משני המינים, 8 שבועות), עזים ומתנגד זה עם תערובת של קטמין חריגות השירותים הווטרינריים (100 מ ג/ק ג; 10 מ"ג/ק"ג, בהתאמה) באמצעות הזרקת בקרום הבטן (i.p.). במידת הצורך, redose את העכבר עם מנה וחצי של קטאמין (50 מ"ג/ק"ג) במהלך הליך כירורגי. לחלופין, עבור תעלות כרונית, עזים ומתנגד עכבר על-ידי הצבת אותו לתוך תא אינדוקציה איזופלוריין-2.5-3% איזופלוריין, בבסביבות 1 ליטר/דקה O2. במקרה זה, השתמש קונוס האף כדי לקיים את איזופלוריין הרדמה ב- 1.5-2% במהלך הניתוח.
- כאשר הבוהן קמצוץ רפלקסים חדל, הנשימה הופכת לאט ובזהירות, מקם את החיה בתוך מסגרת stereotaxic מעל כרית החימום.
- להחיל משחה אופטלמולוגיות. חזור במהלך הניתוח במידת הצורך.
- לגלח את הראש והצוואר של העכבר, להסיר פרווה, לחטא את העור החשוף קודם עם ספוגית אלכוהול ולאחר מכן פעמיים עם chlorhexidine (0.5%) או פתרון יוד (2%). חזור על עיקור עוד פעמיים.
הערה: לשנות את הכיסוי ותאבטחי ניתוח להסרת שיער, פסולת לאחר הגילוח. ואז לעטוף את החיה כדי להגן על השדה סטרילי. - עבור תעלות כרונית, לנהל 0.5 - 1 מ ל לידוקאין/נמשך (1 מ"ג/מ"ל ו 0.25 מ"ג/מ"ל, בהתאמה) subcutaneously (ש) באתר החתך. לנהל הבופרנורפין (0.05 מ"ג/ק"ג; ספורטינג) על שיכוך כאבים לאחר ניתוח.
- לתקן את העכבר במסגרת stereotaxic. לאחר הבטחת יציבות, או intraural, או על-ידי הקשת הלחי, להטות את הראש מעט כך היא יוצרת זווית של 120 מעלות לגוף (איור 1E).
- למצוא את החלק של הגולגולת בולט מיד מעל שרירי הצוואר - הרכס העורפית. להרים את המכסים העור בעזרת זוג מספריים, ולחתוך השקד בצורת פיסת עור של 1 ס מ לאורך הקו האמצעי. השתמש ספוגיות כותנה או עין ספירס לשלוט. מדממת תוצאות.
- באמצעות הפסגה העורפית כנקודת התייחסות, להפריד רקמת החיבור השטחית. לחשוף את שרירי הצוואר להלן.
- הפרד את השרירים בקו האמצע על-ידי הפעלת בקפידה המלקחיים באמצע מקום החתך ציר קדמי-אל-את ישבנה. עם זוג מלקחיים מעוקלים בכל יד, לצרף את הטיפים באמצע ליד החלק התחתון של הגולגולת ומשוך את השרירים בצד.
הערה: זה צריך לחשוף את ס מ, וזה נראה כמו משולש הפוך קטן, שתואר על ידי המוח הקטן מעל לשד להלן, מאחורי קרום קרום שקוף (איור 1B וג 1). - באמצעות מקלון חנית או כותנה העין כירורגי, נגב את הקרום. קרום המכסה את ס מ.
-
החדרת הצינורית לתוך ס מ
- הסר את הצינורית המזרק מלא כלנית חדד, להשאיר את המחט 30G המצורפת לקצה האחורי של הצנרת.
- לצרף את המחט 30G מזוקקים מלא מים 100 µL מזרק המחובר מזרק משאבה.
- הכנס בועת אוויר של 1 ס מ הצינורית על ידי נסיגה אוויר בעזרת מזרק משאבה.
- באמצעות מזרק משאבה, לסגת μL 12 של מעקב CSF הרצוי לתוך הצינורית.
- לתפוס את הצינורית, מלא את רכיב המעקב CSF, ליד המחט מכוסי צינור עם זוג מספריים מעוגלים להחזיקו ביד הדומיננטית. הנחת האצבע השלישית של היד-הדומיננטי בסרגל האוזן של הצד הנגדי, תחזיק את זה יציב לשימוש מאוחר יותר כמו מנוחה הצינורית.
- הכנס את הצינורית בזווית של 45 מעלות ביחס לראש העכבר, עובר למרכז של ס מ, המזוהה על-ידי שלה היבט משולש ראה דרך השכבה הקשה של המוח. הימנע כל חדירה של המוח הקטן או לשד. ודא כי המחט מוחדרת רק עד לעומק של 1-2 מ מ, קרי עד לנקודה איפה שיקוע לגמרי תחת השכבה הקשה של המוח. לשחרר את הפינצטה מחזיק את הצינורית, והנח את הצינורית לנוח על היד האחרת.
הערה: בסוף המחטים שיניים משופעים ידרוש את היישום של כוח מסוים, כדי לחדור את הקרום. קרום המכסה את ס מ. - במידת הצורך, לייבש כל דליפת נוזל מוחי-שדרתי על חדירה באמצעות מטליות חנית או כותנה ניתוחי עיניים.
- ירידה 2-3 טיפות של דבק מגע דבק על גבי קרום קרום המקיפים את הצינורית. להוסיף טיפה של דבק מאיץ כדי לרפא את הדבק מיד. מכסים את הגולגולת ואת המחט בתערובת של מלט שיניים (כ 0.5 מ ג) ודבק cyanoacrylate (3-5 טיפות). מיד לאחר מכן, החל טיפה של דבק מאיץ לרפא.
- תעלות כרונית, גזור לאורך צינור (בהשאירכם כ 2-3 ס מ המצורפת את הצינורית), לאטום אותו עם ולד כירורגי כדי לשמור על רמות לחץ תוך-גולגולתי (ICP), על ידי מניעת דליפת נוזל מוחי-שדרתי דרך הצנרת.
- עבור תעלות כרונית, לנהל carprofen (5 מ"ג/ק"ג; ספורטינג)
- עבור תעלות כרונית, מקם את העכבר בכלוב, לשמור את זה על כרית החימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף עד החיה הוא התאושש לחלוטין מן ההרדמה.
הערה: בעלי החיים צריך ביחידים ישוכנו בכלובים שלהם כדי להבטיח הצינורית נשאר שלם. ודא כי האף ברורה של מצעים על ידי הנחת העכבר על מגבת נייר או אחרים מצע מוצק.
הערה: למחרת, כאשר בעלי חיים הם התאוששו הליך כירורגי שבוצעה להכנסה בצינורית, הם יכול להיות מוזרק עם נוזל מוחי-שדרתי המשדרים. עבור הזרקה תחת הרדמה, לנהל את תערובת של קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים (100 מ ג/ק ג; 10 מ"ג/ק"ג, בהתאמה; i.p.) והמשך אל השלבים המתוארים בסעיף 2. להזרקה בבעלי חיים ערה, המשך בסעיף 3.
2. הזרקה של CSF המשדרים באמצעות חריפה בצינורית ס"מ מושתל בבעלי חיים מורדם
הערה: עבור הזרקה של CSF המשדרים באמצעות חריפה בצינורית ס"מ מושתל בבעלי מרדימים, מיד לאחר שלב 8 מהסעיף הקודם, להמשיך הזרקת מעקב CSF כמתואר להלן.
- באמצעות מזרק משאבה, להתחיל את הזריקה לתוך המשדרים ס מ של CSF בקצב של 1 μL דקות למשך 5 או 10 דקות, וכתוצאה מכך הנפח הכולל של 5 µL או 10 µL, בהתאמה. בקצה של הזריקה, לאפשר את רכיב המעקב CSF להפיץ ברחבי המוח במשך 30 דקות עם הצינורית ללא הפרעה.
- לאחר 30 דקות, חותכים לאורך צינור מחובר את הצינורית (בערך 4 ס מ מרחק מהקצה מחט), לסגור את סופו באמצעות ריתוך כירורגי.
- תחת הרדמה עמוקה, להרדימו ע י עריפת ראשו. במהירות לנתח את המוח ולתקן את הרקמה על ידי טבילה paraformaldehyde 4% (PFA) מדולל בתוך תמיסת מלח פוספט buffered (PBS; 0.01M; pH 7.4) לילה (o/n) ב 4 º C.
3. הזרקה של CSF המשדרים באמצעות בצינורית ס"מ מושתל באופן כרוני בחיות ער
- באמצעות מזרק משאבה, לסגת 7 µL או 12 µl של מעקב CSF הרצוי לתוך בצינורית המורכב של 30 ס מ PE10 צינורות עם טיפ משופע המחט שיניים של 0.5 ס מ.
- בעדינות לרסן את החיה חתך של 1 ס מ של הצנרת המצורפת את הצינורית.
- עדיין תחת עדין הרחקה, לחבר במהירות את הצינורית מלאים CSF מעקב הצינורית ס"מ מושתל.
- באמצעות מזרק משאבה, ההזרקה לתוך המשדרים ס מ של CSF בקצב של 1 µL 7 להזריק µL לדקה או µL 12, כדי להשיג נפח סופי של CSF מוזרק מעקב של 5 µL או 10 µL, ובכך מפצה את חנה המבר שנותרו הצינורית מושתל. בקצה של הזריקה, לאפשר את רכיב המעקב CSF להפיץ ברחבי המוח במשך 30 דקות עם הצינורית ללא הפרעה. ודא כי הצנרת נשאר צמוד בתקופות הזרקת ואת זרימת הדם.
- בקצה של CSF מעקב מחזור זמן, המשך המתת חסד ע י עריפת ראשו, שמבטיח כי החיה. הוא מורדם עמוקות. במהירות לנתח את המוח ולתקן את הרקמה על ידי טבילה paraformaldehyde 4% (PFA) מדולל בתוך תמיסת מלח פוספט buffered (PBS; 0.01M; pH 7.4) לילה (o/n) ב 4 º C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
על קיבוע של עכברים או חולדות בתוך מסגרת stereotaxic, שרירי הצוואר באזור קרסט העורפית בלשון בוטה גזור כדי לחשוף את מגנה cisterna (ס מ). מבנה משולש ס מ יזוהה בקלות בין החלק סימטרית של הצרבלום לשד (איור 1Aג-1). הצינורית מוכנס 1-2 מ מ לתוך ס מ על ידי בעדינות פירסינג קרום atlanto-העורף (איור 1D). קרום דורא הוא מבנה קשה, החדרת הצינורית משופרת על ידי הטיית הראש בבעלי חיים על ידי 120° ביחס לגוף. בעזרת משאבת הזרקה, מולקולות שכותרתו באופן שונה לאחר מכן מוזרק לתוך המלון cisterna במחירים מבוקרים (איור 1E). לאחר מרווח זמן כדי לאפשר CSF נותב ההשאלה, בעלי החיים מורדמים. המוח הוא גזור ובזהירות קבוע על ידי טבילה 4% PFA o/n ב 4 º C. מאקרוסקופית נוף הגבי של המוח שנקטפו מכרסמים המוזרק ס מ להראות את חלוקת המשדרים CSF בבורות תת-עכבישי של הצרבלום, בתוך הנורה הריח, במרחב paravascular לאורך העורקים במוח האמצעי (MCAs) (איור 1F ). בחלק הגחוני של המוח, נופים מאקרוסקופית להראות CSF מעקב להפצה לאורך מעגל ויליס (איור 1 ג'י). קטעים היסטולוגית של המוח המוזרק ס מ נוספים לחשוף את paravascular חלוקת המשדרים בתוך parenchyma המוח. עכברים מוזרק בהרדמה (איור 1 H) (או במהלך השינה הטבעית, ראה1) מציגים גידול יוצא דופן בחלוקת מעקב אל parenchyma המוח לעומת עכברים מוזרק בעוד ער, נעה בחופשיות בכלוב שלהם הביתה (איור 1I).
איור 1: הזרקה של המשדרים לתוך המלון cisterna. (א) סקירה סכמטי של עכבר ראש המוח מראה את המיקום של המלון cisterna (ס מ) ביחס המוח ואת המבנים הגולגולת. Photomicrograph (B) חשוף ס מ לאחר שרירי הצוואר שמסביב יש כבר בלשון בוטה גזור ודחף את הצדדים. (ג) הגדלה גבוהה יותר של האזור מצטיירת B (מלבן שחור), מציג את מבנה משולש הפוך את ס מ (קו מקווקו) ואת מיקומו ביחס שמסביב מבנים, כלומר בעצם העורף קרסט, המוח הקטן, ושל לשד. (ד) Photomicrography של הצינורית מוכנס לתוך ס"מ. (E) הערכה של התצוגה לרוחב הראש קבוע העכבר, מעט מוטה בזווית של ° 120 ביחס לגוף. שיבוץ של מלבן מקווקו מופרדים מראה אזור התכנית של ערכת תצוגה parasagittal של השקפה parasagittal של המוח העכבר באמצעות הצינורית מוכנס לתוך ס"מ, כפי שמתואר בספר אי מזרק, אשר הוא מצמידים משאבת הזרקה, משמש כדי לספק קליעים נותבים CSF או סוכנים בניגוד לתוך ס דרך צינור מחובר מחט 30G משובחים. תמונות נציג של מוח העכבר כל ב 30 דקות לאחר תום הזרקת ס מ עם מכשיר מעקב פלורסנט ראה מן הגבי (F) היבטים הגחון (G) . (ה',) נציג המוח הילתית מקטעים counterstained עם דאפי (4', 6-diamidino-2-phenylindole; µg/mL 1 ב- PBS) של עכברים מוזרק עם נוזל מוחי-שדרתי המשדרים ס תחת המטלה (I), 30 דקות לאחר סיום הזרקה ס מ, מרדימים (H) בקצב של 1 µL דקות של µL 5 נפח של תערובת של אובלבומין-AF647 המספר המשלים (OA, 45kDa; 2% בכלנית חדד) המספר המשלים לתוספי-FITC (דקס, 3kDa; 2% בכלנית חדד). גודל ברים, 5 מ מ B, C, F, G; 2 מ מ D, מיקרומטר 500 H, אני Cb, המוח הקטן; ס מ, מגנה cisterna; אקס, קליפת המוח; OB, הריח הנורה ו.... אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הציגו לנו פרוטוקול המתאר הליך מפורט של תעלות מגנה cisterna (CMc), אשר מציעה שיטה פשוטה כדי לספק מולקולות שכותרתו תא CSF. CMc מאפשר את החזיית העוקבים CSF דינמיקה, גם אין ויוו וגם ex-vivo, באמצעות שיטות הדמיה שונות או היסטולוגיה.
אחד היתרונות העיקריים של הטכניקה CMc טמון שלה גישה ישירה אל המרחב תת-עכבישי ללא צורך לחשוף את המוח על ידי גולגולת. על-ידי לא דרישת חלון גולגולתי או חדירה של parenchyma המוח עם טיפ מחט, CMc מאפשרת המסירה של מולקולות אל תוך התא CSF והערכה של מערכת glymphatic על ידי פרוצדורה פולשנית, עם הפרעה קצרה בלבד של לחץ תוך-גולגולתי (ICP).
ראוי לציין, ההזרקה לתוך ס מ הוא הזרם המקורות העיקריים של CSF, הפלקיסגלאס דמית העין ממוקם במערכת חדרית (לרוחב, החדרים השלישי והרביעי). מן החדרים הצדדיים, זורם CSF כדי לחדר השלישי באמצעות foramina ע (נקב של מונרו), מן החדרים השלישי לרביעי דרך האמה מוחין (אמת המים של Sylvius) גזע המוח, חוט השדרה (שבתוך3 ). CSF מגיע תת-עכבישי החלל דרך ס מ על ידי זורם דרך הפתח החציוני (או את נקב של פאנלים), ובכך CMc זריקות לעקוף את כל המערכת חדרית. עם זאת, בעוד שיכול להיות בעייתיים כמה דגמים של CSF/הקרן דינמיקה דרך החדרים, הזרקה ישירה של המשדרים לתוך מתגלה דורש ניתוחים פולשניים כגון קידוח בגולגולת החלונות הגולגולת, היישום של זריקות חדרית לשבש באופן משמעותי ICP13. באופן דומה, הזרקה בלחץ של המשדרים לתוך13,חלל תת-עכבישי14 בידיים שלנו מבטל השטף של CSF המשדרים לאורך החלל paravascular. לעומת זאת, אף-על-פי CMc כרוך ניקוב של הקרום. קרום, ICP הוא רק מודאג transiently והוא משוחזר במהירות2.
שימוש של CMc, glymphatic פעילות ניתן למדוד מרדימים בעלי חיים לאחר CMc חריפה, וכן חיות ער, התבוננות תקופת התאוששות 24 שעות ביממה על בצינורית השרשה. CMc חריפה מתאים לשילוב עם 2 פוטון הדמיה, המספק מידע מפורט אודות פעילות glymphatic בתוך קליפת עד לעומק של 200 מיקרומטר1,2. חשוב לציין, CMc חריפה גם מאפשרת את היתרון של תמיכה מחקרים MRI לא משוחד, איפה מעקב להפצה מלווה באופן דינמי, ביחס תמונה בסיסית בודדים רכשה לפני אתחול של CSF מעקב הזרקת15, 16 , 17. עבור MRI, המחט שיניים המשמש CMc יוחלפו בורוסיליקט נימי (כ 1 ס מ אורך, עצה בקוטר של 20 מיקרומטר) קשור לאורך צינור PE.
בניגוד תעלות אקוטית, כרונית CMc מאפשר הנסיין לבצע הזרקת מעקב CSF בבעלי חיים בזמן השינה הטבעית או בהרדמה, כמו גם ב ער, לנוע בחופשיות חיות. זהו גורם קריטי מאז פעילות glymphatic הוא מאוד תלוי המדינה; מעקב זרם אל parenchyma הוא הרבה יותר בעלי החיים הוזרקו בהרדמה או ישנים יותר בעלי החיים הוזרקו המדינה ער1. בנוסף, בעלי חיים בצינורית מושתל באופן כרוני יכולים לקבל מעקב CSF בכלוב בבית שלהם, ובכך לחסוך גורמים מבלבלים בשל תופעות של מתח עוררות על פעילות glymphatic. לזריקות כרונית תחת הרדמה, תערובת של קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים (100 מ ג/ק ג; 10 מ"ג/ק"ג, בהתאמה) מומלץ. איזופלוריין בריכוזים מעל 1.5% גורם נפיחות במוח, אינו משפר פעילות glymphatic בהשוואה של המדינה ער1. שימו לב כי לאחר ההשתלה CMc, בעלי חיים צריך להיות יחיד שוכן, על מנת להבטיח כי חיות CMc מושתל לא יפגע את הצינורית אחד את השני. גם, מאז ההשתלה כרונית CMc היא הליך כירורגי השחזור, זה צריך להתבצע בתנאים סטריליים, חיות אמור לקבל post-operational משככי כאבים.
חשוב, CMc יכול לשמש כשיטה לספק CSF המשדרים בעכברים, כמו גם בחולדות, עם שינויים מינימליים לפרוטוקול. צריך להינתן במינון המתאים הרדמה, הנפח המרבי של CSF מעקב זה מוזרק בחולדות µL 30, בשל ההבדלים בגודל של הרווחים חדרית ו תת-עכבישי בין שני המינים.
למרות פשטותו פרוצדורלי, קצת אימון ותרגול נדרש עבור הנסיין לבצע בהצלחה CMc. מאז ס מ משתנה בין המינים לבין חיות בודדות, רצוי לתרגל את זיהוי המבנה שלו. לתרגל את ההליך באמצעות אוונס כחול (2% בכלנית חדד) מאפשר הנסיין לאשר ההכנסה המחט הנכון. לעתים, קיבול יהיה ממוקם ישירות בקו האמצע של ס מ, ואז המחט צריך להיות מוכנס סמוך לכלי השיט, אך קרוב ככל האפשר אל האמצע. במקרים אלה יש לציין, לאישור מאוחר יותר כי המשדרים הם מופץ באופן שווה, למרות המיקום מחוץ למרכז של קצה המחט. חשוב, atlanto-העורף קרום המכסה את ס מ מכנית, ולא צריך להיות מיושם לחץ כדי להוסיף את מחט משופע. עם זאת, קריטי כי הלחץ שהופעל לא תגרום צולל קצה המחט לתוך לשד או המוח הקטן. כדי להקל על הכניסה מחט לתוך ס מ, ראשו של בעלי חיים צריך להיות מוטה כלפי מטה בזווית של ° 120 ביחס הגוף, אשר משתרע הקרום. חשוב לציין, זהירות יש לנקוט לא להפריע הנשימה על ידי כיפוף הראש הזה. אם קצה המחט צריך להזין את המוח הקטן, המשדרים יישמרו ברקמה ולא להיכשל להפיץ ברחבי החלל תת-עכבישי. נזק לשד הוא לעתים קרובות קטלנית, ואילו המוח הקטן נזק cannulations כרונית יכולה לגרום השתטחות ואת כללי חריגות בהתנהגות של בעלי החיים. כדי למזער את הסיכון השיפוטי, מחטים באורך שיקוע קטנים יותר יכולים לשמש.
דימום יכול להתרחש בעת העברת את השרירים באזור הצוואר שמכסה את הממברנה דורא כדי להכניס את הצינורית ס מ. לחלופין, ניתן להחיל פתרון כלוריד הברזל ותחמוצת ספוגיות כותנה יכול לשמש כדי לספוג את הדימום. הברזל ותחמוצת כלוריד יש אפקט hemostatic של18, והוא גם מפעילה את התקשות של שרירי הצוואר סביב באזור הניתוח, ובכך מסייעת להשגת הנכון החדרת המחט לתוך ס מ. הברזל ותחמוצת כלוריד גם מייבשת את הגולגולת ואת קרום קרום, הצגת יותר משטחים הדבקה של הצינורית. עבור CMc, להחיל 1-2 טיפות של פתרון הברזל ותחמוצת כלוריד (10%) (כ- 1 מ"ל) לתוך כותנה דגימה, כי אמחה קלות את שרירי הצוואר ואת ציצת-הנוצות בעצם העורף. עם זאת, כלוריד הברזל ותחמוצת אקטואלי ייתכן ואולי מחלחלים דרך הקרום CSF, עם השפעות לא ידוע על הומאוסטזיס המוח. אם השימוש הברזל ותחמוצת כלוריד הוא עניין של דאגה, אחד באפשרותך להשתמש במקום זאת הפצע רטרקטורים שתפקח את הוילונות. הסרת זהיר של הפצע רטרקטורים לאחר החלת הדבק דבק מגע מונע מצורף בהיסח הדעת החתך.
CMc היא הליך פשוטות וברורות לשחזור להעברת מולקולות ישירות לתוך תא CSF. מאז CMc היא פולשנית, היא השיטה המועדפת עבור הפריט החזותי של מערכת glymphatic, יכול להיות בשילוב עם שיטות הדמיה שונות כגון epifluorescence ו- 2-פוטון מיקרוסקופ או MRI. לפיכך, CMc מייצג כלי נהדר ללימודי דינמיקה של נוזלים, כלומר CSF והקרן, וגם הסיווג נוזל המוח. בשל הכיסוי מאקרוסקופית של מערכת glymphatic, CMc יש פוטנציאל לשמש כדי לספק מולקולות המוח כולו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי קרן נובו נורדיסק, המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות ושבץ, NINDS/NIH (M.N.). A.L.R.X. ו- S.H-R הם מקבלי מלגת פוסט-דוקטורט, מלגת דוקטורט מטעם קרן לונדבק, בהתאמה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SOPIRA Carpule 30G 0.3 x 12mm | Kulzer | AA001 | |
| Polyethylene Tubing 0.024” OD x 0.011” ID | Scandidact | PE10-CL-500 | |
| 30G x ½” 0.3 x 12 mm Luer-Lock | Chirana T. Injecta | CHINS01 | |
| Chlorhexidine 0.5% (chlorhexidine digluconate) | Meda AS | no catalogue number, see link in comments | http://www.meda.dk/behandlingsomrader/desinfektion/desinfektion-af-hud/klorhexidin-sprit-medic-05/ |
| Alcohol Swab 70% Isopropyl Alcohol 30 x 60mm | Vitrex Medical A/S | 520213 | |
| Viskoese Oejendraeber Ophtha | Ophtha | 145250 | |
| Wooden applicator, Double cotton bud (Ø appr. 4 - 5 mm, length appr. 12 mm) | Heinz Herenz | 1032018 | |
| Eye spears | Medicom | A18005 | |
| Ferric chloride 10% solution | Algeos | NV0382 | |
| Kimtech Science Precision Wipes Tissue Wipers | Kimberly Clark Professional | 05511 | |
| Loctite Super Glue Precision 5g | Loctite | no catalogue number, see link in comments | http://www.loctite-consumer.dk/da/produkter/superglue-liquid.html |
| Insta-Set CA Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-152 | |
| Dental Cement Powder | A-M Systems | 525000 | |
| Surgical weld | Kent Scientific Corporation | INS750391 | |
| Hamilton syringe GASTIGHT® , 1700 series, 1710TLL, volume 100 μL, PTFE Luer lock | Hamilton syringes | 1710TLL | |
| LEGATO 130 Syringe pump | KD Scientific | 788130 | |
| Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS; 0.01M; pH 7.4) | Sigma Aldrich | P3813 | |
| Ovalbumin, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | O34784 | |
DAPI (diamidino-2-phenylindole) Solution (1 mg/mL) |
Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Dextran, Fluorescein, 3000 MW, Anionic | Thermo Fisher Scientific | D3305 | |
| E-Z Anesthesia EZ-7000 Classic System | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Attane Isofluran 1000 mg/g | ScanVet | 55226 | |
| Euthanimal 200mg/mL (sodium pentobarbital) | ScanVet | 545349 | |
| Ketaminol Vet 100 mg/mL (ketamine) | Intervet International BV | 511519 | |
| Rompin Vet 20 mg/mL (xylazin) | KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH | 148999 | |
| Xylocain 20 mg/mL (lidocain) | AstraZeneca | 158543 | |
| Marcain 2.5 mg/mL (bupivacain) | AstraZeneca | 123918 | |
| Bupaq Vet 0.3 mg/mL (buprenorphine) | Richter Pharma AG | 185159 |
References
- Xie, L., et al. Sleep Drives Metabolite Clearance from the Adult Brain. Science. , 373-377 (2013).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid β. Sci. Transl. Med. 4, 147ra111 (2012).
- Jessen, N. A., Munk, A. S. F., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner's Guide. Neurochem. Res. 40, 2583-2599 (2015).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. , (2015).
- Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. J. Exp. Med. 212, 991-999 (2015).
- Kress, B. T., et al. Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain. Ann. Neurol. 76, 845-861 (2014).
- Plog, B. A., et al. Biomarkers of Traumatic Injury Are Transported from Brain to Blood via the Glymphatic System. J. Neurosci. 35, 518-526 (2015).
- Jiang, Q., et al. Impairment of glymphatic system after diabetes. J. Cereb. Blood Flow Metab. , Under Revi (2016).
- Peng, W., et al. Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiol. Dis. 93, 215-225 (2016).
- Orešković, D., Klarica, M. The formation of cerebrospinal fluid: Nearly a hundred years of interpretations and misinterpretations. Brain Res. Rev. 64, 241-262 (2010).
- Dusart, I., Schwab, M. E. Secondary Cell Death and the Inflammatory Reaction After Dorsal Hemisection of the Rat Spinal Cord. Eur. J. Neurosci. 6, 712-724 (1994).
- Eide, K., Eidsvaag, V. A., Nagelhus, E. A., Hansson, H. -A. Cortical astrogliosis and increased perivascular aquaporin-4 in idiopathic intracranial hypertension. Brain Res. , (2016).
- Pullen, R. G., DePasquale, M., Cserr, H. F. Bulk flow of cerebrospinal fluid into brain in response to acute hyperosmolality. Am. J. Physiol. 253, F538-F545 (1987).
- Ichimura, T., Fraser, P. A., Cserr, H. F. Distribution of extracellular tracers in perivascular spaces of the rat brain. Brain Res. 545, 103-113 (1991).
- Iliff, J. J., et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. J. Clin. Invest. 123, 1299-1309 (2013).
- Ratner, V., et al. Optimal-mass-transfer-based estimation of glymphatic transport in living brain. Proc. SPIE--the Int. Soc. Opt. Eng. 9413, (2015).
- Lee, H., et al. The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport. J. Neurosci. 35, 11034-11044 (2015).
- Nouri, S., Sharif, M. R., Sahba, S. The effect of ferric chloride on superficial bleeding. Trauma Mon. 20, e18042 (2015).
