Summary
Qui descriviamo un protocollo per eseguire cisterna magna inserimento di una canula (CMc), un modo minimamente invasivo per offrire elementi traccianti, substrati e molecole di segnalazione nel liquido cerebrospinale (CSF). In combinazione con differenti modalità di imaging, CMc permette glifatico sistema e valutazione dinamica di CSF, come pure la consegna di tutto il cervello di vari composti.
Abstract
Incannulamento di cisterna magna (CMc) è una procedura semplice che consente di raggiungere direttamente il liquido cerebrospinale (CSF) senza danneggiamento operativo del cranio o del parenchima cerebrale. In roditori anestetizzati, l'esposizione del mater di dura di scollamento dei muscoli del collo permette l'inserimento di una cannula nella cisterna magna (CM). La cannula, composta da un ago smussato o borosilicato capillare, è collegata tramite un tubo di polietilene (PE) a una siringa. Utilizzando una pompa a siringa, molecole possono quindi essere iniettati al prezzo controllato direttamente in CM, che è in continuità con lo spazio subaracnoideo. Dallo spazio subaracnoideo, si rintracciano CSF flussi di flusso convettivo nello spazio perivascolare intorno penetrante arteriole, dove si verifica scambio di soluti con il fluido interstiziale (ISF). CMc può essere eseguita per iniezioni acute subito dopo l'intervento chirurgico, o per l'impianto cronico, con successiva iniezione in anestetizzato o sveglio, liberi di muoversi roditori. Quantificazione della distribuzione dell'elemento tracciante nel parenchima del cervello può essere eseguita da epifluorescenza, 2-fotone microscopia e la formazione immagine a risonanza magnetica (MRI), a seconda delle proprietà fisico-chimiche delle molecole iniettate. Così, CMc in combinazione con varie tecniche di imaging offre un potente strumento per la valutazione del sistema di glifatico e dinamica di CSF e funzione. Inoltre, CMc può essere utilizzato come un canale per la consegna veloce, tutto il cervello di segnalazione molecole e substrati metabolici che non potrebbero altrimenti attraversare la barriera emato encefalica (BBB).
Introduction
Liquido cerebrospinale (CSF) bagna il sistema nervoso centrale (SNC) in tutto il sistema ventricolare e lungo gli spazi subaracnoidei, un spazio anatomicamente definito nel continuum con i ventricoli, che circonda il cervello e il midollo spinale. Una delle funzioni principali del QCS è quello di fornire un percorso per la liquidazione dei metaboliti e soluti dal parenchima del cervello. Liquidazione è facilitata tramite il glifatico recentemente scoperto sistema1, cervello analogico al sistema linfatico periferico. Qui, descriviamo e discutiamo la cisterna magna inserimento di una canula (CMc), un metodo come minimo dilagante per la consegna diretta di molecole nel CSF. CMc è il metodo principale per studiare la funzione di glifatico. Inoltre, CMc può essere applicato anche per lo studio della dinamica di CSF e per una consegna veloce, tutto il cervello di molecole permeabili di barriera (BBB) non-emato encefalica nel parenchima cerebrale, lungo lo spazio perivascolare.
La CMc sfrutta principi fisiologici di dinamiche di movimento di CSF attraverso snc di consegnare con etichetta tracer molecole o farmaci nello spazio pieno di CSF cisterna magna (CM). Molecole vengono iniettati attraverso una cannula impiantata nel covering dural membrana atlanto-occipital che le molecole CM. sono poi trasportate da flusso di massa di CSF nel parenchima cerebrale tramite il paravenosa spazio1. Agente tracciante o contrasto iniettato tramite la CMc segue il movimento del CSF, che permette la valutazione di movimento di CSF e glifatico afflusso di quantificare i livelli di intensità di molecole con etichettate che entrano il parenchima cerebrale. CMc è compatibile con diverse tecniche di formazione immagine compreso epifluorescenza, 2-fotone microscopia e la formazione immagine a risonanza magnetica (MRI). Inoltre, tale valutazione può essere eseguita sia in vivo o ex vivo. D'importanza, CMc consente la visualizzazione del sistema glifatico sotto anestesia o durante il sonno naturale, così come negli animali svegli, liberamente commoventi.
La tecnica di CMc può essere utilizzata per studiare i diversi aspetti della dinamica dei fluidi nel CSF, ma ha dimostrato di essere particolarmente utile per studiare il sistema di glifatico. Glifatico attività aziona il flusso convettivo di CSF dallo spazio periarterial tramite canali d'acqua Acquaporina-4 (AQP-4), che sono legati nella membrana di astrocytic vascolare a capo endfeet. Il flusso convettivo permette l'interscambio di CSF e di liquido interstiziale (ISF) all'interno del parenchima cerebrale. CSF/ISF contenenti soluti e scorie metaboliche viene quindi rimosso dal parenchima cerebrale tramite il perivenous spazio2,3. In definitiva, CSF/ISF raggiunge la periferia attraverso i vasi linfatici dural recentemente descritto4,5. Il sistema di glifatico ha dimostrato cruciale per la liquidazione dei metaboliti nocivi dei rifiuti come amiloide-β2. Ulteriormente, glifatico liquidazione è compromessa nell'invecchiamento6, dopo la ferita di cervello traumatica7e in modelli animali di diabete8 e9di morbo di Alzheimer. In particolare, attività di glifatico è stato dipendente, mostrando attività significativamente più alto durante il sonno o anestesia in confronto a Veglia1. Infatti, giovani animali anestetizzati esibiscono il più alta attività di glifatico. Così, quantificazione sperimentale dell'attività di glifatico è fondamentale quando si studia il suo ruolo nella salute e nella malattia.
Diversi studi hanno affrontato dinamica di CSF e suo interscambio con liquido interstiziale (ISF) nel parenchima del cervello. Tuttavia, i metodi con cui vengono consegnati con etichettate molecole sono piuttosto invasivi, innescando il danno del parenchima cerebrale e variazioni della pressione intracranica (ICP) (vedere recensione10). Alcuni esempi sono intraventricolare o iniezioni di intraparenchymal che coinvolgono craniotomia o foratura di una bava con foro nel cranio. Queste procedure sono state indicate per alterare ICP, interrompendo così la glifatico funzione2. Inoltre, tali metodi invasivi inducono astrogliosi e aumentano il immunoreactivity AQP-4 nella zona di parenchima danneggiato del cervello e suoi dintorni11,12. Come astrociti e AQP-4 sono elementi chiave del sistema glifatico, il CMc è il metodo di scelta per i suoi studi. I principali vantaggi di CMc in confronto ad altre procedure invasive sono il mantenimento di un parenchima di cranio e cervello intatto, evitando alterazioni ICP e astrogliosis, rispettivamente. CMc in combinazione con diversi strumenti di imaging si apre così, per una vasta gamma di possibilità di studiare non solo il sistema di glifatico, ma anche le dinamiche e i meccanismi di flusso del fluido nell'omeostasi, così come nei modelli animali di malattie neurologiche.
La procedura di inserimento di una canula (CMc) cisterna magna permette un accesso facile e diretto per il liquido cerebrospinale (CSF). Iniettando diverse molecole (es. traccianti fluorescenti, agenti di contrasto MRI) lo sperimentatore può monitorare i loro movimenti all'interno del compartimento di CSF e valutare l'attività del sistema glifatico. Il seguente protocollo descrive entrambi la CMc acuta, per iniezioni immediatamente dopo la chirurgia e l'impianto cronico della cannula, in cui l'animale recupera dalla procedura chirurgica per una successiva iniezione. La differenza più importante tra l'impianto acuto e cronico è che l'impianto cronico permette lo studio dell'attività glifatico in topi svegli.
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Protocol
Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con la direttiva 2010/63/UE europea per la ricerca sugli animali e sono state approvate dal Consiglio di esperimenti animali sotto il Ministero danese dell'ambiente e cibo (2015-15-0201-00535).
1. procedura di inserimento di una canula
- Preparazione di cannula
Nota: Evitare di toccare la cannula con i guanti non sterili.- Rompere la punta di metallo smussata di un ago dentale 30g utilizzando un porta-aghi.
- Utilizzando un porta-aghi, preparare la cannula inserendo la punta di metallo smussata (circa 0,3 cm) in una lunghezza di 30 cm di PE10 tubi (tubi in polietilene 0,024" OD x 0,011" ID) riempito con aCSF (126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4 , 2 mM MgSO4, 2mm CaCl2, glucosio di 10 mM, 26 mM NaHCO3; pH 7.4 quando gassificato con 95% O2 e 5% CO2).
- Sciacquare la cannula con aCSF utilizzando una siringa da 1 mL con ago 30g (30 x ½" 0,3 x 12).
-
Procedura chirurgica
Nota: L'inserimento di una canula CM cronica permette agli animali di recuperare dalla procedura chirurgica. CM iniezioni vengono effettuate il giorno dopo impianto di cannula e, soprattutto, possono essere eseguite in animali anestetizzati o svegli. Poiché si tratta di un intervento di recupero, le procedure devono essere eseguite in condizioni sterili.- Pesare il mouse (C57BL/6JRj, entrambi i sessi, 8 settimane) e anestetizzare esso con una miscela di ketamina e xilazina (100 mg/kg; 10 mg/kg, rispettivamente) via l'iniezione intraperitoneale (i.p.). Se necessario, ritrattare il mouse con una mezza dose di chetamina (50 mg/kg) durante la procedura chirurgica. In alternativa, per inserimento di una canula cronica, anestetizzare mouse collocandolo in una camera di induzione di isoflurano a 2,5-3% isoflurane, in circa 1 L/min O2. In questo caso, utilizzare un cono di naso per sostenere isoflurano anestesia a 1,5-2% durante l'intervento chirurgico.
- Quando pizzico di punta riflessi cessate e la respirazione diventa lento e costante, è possibile inserire l'animale in una cornice stereotassica sopra un rilievo di riscaldamento.
- Applicare la pomata oftalmica. Ripetere durante l'intervento chirurgico quando necessario.
- Radere la testa e il collo del mouse, rimuovere pelliccia e sterilizzare la pelle esposta prima con un batuffolo imbevuto di alcool e poi due volte con clorexidina (0,5%) o di soluzione di iodio (2%). Ripetere la sterilizzazione altre due volte.
Nota: Cambiare il telo chirurgico per rimuovere i detriti e i capelli dopo la rasatura. Quindi mettete l'animale per proteggere il campo sterile. - Per l'inserimento di una canula cronica, somministrare 0,5 - 1 ml di lidocaina/bupivacaina (1 mg/ml e 0,25 mg/ml, rispettivamente) per via sottocutanea (s.c.) al sito di incisione. Amministrare la buprenorfina (0,05 mg/kg; s.c.) per analgesia post-chirurgica.
- Difficoltà il mouse nella cornice stereotassica. Dopo aver verificato la fissazione, entrambi intraural o dall'arco zigomatico, inclinare la testa leggermente in modo che forma un angolo di 120° per il corpo (Figura 1E).
- Trovare la parte del cranio sporgente immediatamente sopra i muscoli del collo - l'apofisi occipitale. Sollevare la pelle sovrastante utilizzando un paio di pinzette e tagliare un pezzo Mandorlo a forma di pelle di circa 1 cm lungo la linea mediana. Utilizzare tamponi di cotone o occhio spears per controllare qualsiasi sanguinamento risultante.
- Utilizzando l'apofisi occipitale come punto di riferimento, tirare il tessuto connettivo superficiale per esporre i muscoli del collo qui sotto.
- Separare i muscoli al midline eseguendo attentamente il forcipe giù la metà del sito di incisione nell'asse anteriore--posteriore. Con un paio di pinze curve in ogni mano, unire le punte al centro nella parte inferiore del cranio e tirare i muscoli da parte.
Nota: Questo dovrebbe esporre il CM, che appare come un piccolo triangolo invertito, delineato dal cervelletto sopra e midollo sotto, dietro la membrana dural traslucido (Figura 1B e 1C). - Utilizzando un tampone chirurgico occhio di lancia o cotone, pulire la membrana dural che ricopre i CM.
-
Inserimento della cannula nella CM
- Rimuovere la cannula dalla siringa aCSF, mantenendo l'ago 30g inserito all'estremità posteriore del tubo.
- Montare l'ago 30g distillata acqua 100 µ l nella siringa collegata ad una pompa a siringa.
- Inserire una bolla d'aria di circa 1 cm nella cannula ritirando aria con l'ausilio di una pompa a siringa.
- Utilizzando una pompa a siringa, aspirare μL 12 dell'elemento tracciante di CSF desiderata con la cannula.
- Afferrare la cannula, riempita con il tracciante di CSF, vicino l'ago tubo-coperto con un paio di Pinzette curve tenute nella mano dominante. Appoggiare il dito medio della mano non dominante sulla barra dell'orecchio del lato opposto e tenerla ferma per l'uso successivo come un periodo di riposo per la cannula.
- Inserire la cannula ad un angolo di 45° rispetto alla testa del mouse, passando nel centro della CM, identificato dal suo aspetto triangolare visto attraverso la dura madre. Evitare qualsiasi penetrazione del cervelletto o del midollo. Assicurarsi che l'ago viene inserito soltanto ad una profondità di 1-2 mm, cioè al punto dove la smussatura è interamente sotto la dura madre. Rilasciare le pinzette che tiene la cannula e appoggiare la cannula sulla mano non dominante.
Nota: L'estremità smussata degli aghi dentali richiederà l'applicazione di qualche forza di perforare la membrana dural che ricopre i CM. - Se necessario, asciugare qualsiasi perdita di CSF al momento la penetrazione utilizzando tamponi di lancia o cotone un occhio chirurgico.
- Goccia 2-3 gocce di colla cianoacrilica sulla membrana dural che circonda la cannula. Aggiungere una goccia di acceleratore di colla per curare immediatamente la colla. Coprire il cranio e l'ago con una miscela di cemento dentale (circa 0,5 mg) e colla del cianoacrilato (3-5 gocce). Subito dopo, applicare una goccia di acceleratore di colla per curare.
- Per inserimento di una canula cronica, tagliare il tubo (lasciando circa 2-3 cm attaccate al cannula) e sigillare con una saldatura chirurgica per mantenere i livelli di pressione intracranica (ICP), impedendo la perdita di CSF attraverso la tubazione.
- Per inserimento di una canula cronica, amministrare carprofen (5 mg/kg; s.c.)
- Per inserimento di una canula cronica, posizionare il mouse in una gabbia, tenendolo sopra un rilievo di riscaldamento per mantenere la temperatura corporea fino a quando l'animale è completamente recuperato dall'anestesia.
Nota: Gli animali dovrebbero essere alloggiati singolarmente nelle loro gabbie per assicurare che la cannula rimanga intatta. Assicurarsi che il naso sia libero di biancheria da letto posizionando il mouse su un tovagliolo di carta o altro substrato solido.
Nota: Il giorno seguente, quando gli animali vengono recuperati dalla procedura chirurgica eseguita per l'inserimento della cannula, essi possono essere iniettati con traccianti di CSF. Per iniezione sotto anestesia, amministrare una miscela di chetamina/xilazina (100 mg/kg; 10 mg/kg, rispettivamente; i.p.) e procedere ai passaggi descritti nella sezione 2. Per iniezione in animali svegli, procedere alla sezione 3.
2. iniezione di traccianti di CSF via acuto Cannula CM impiantati in animali anestetizzati
Nota: Per l'iniezione di traccianti di CSF tramite cannula CM impiantato acuta in animali anestetizzati, immediatamente dopo il passaggio 8 nella sezione precedente, procedere alla iniezione dell'elemento tracciante di CSF, come descritto di seguito.
- Usando una pompa a siringa, iniziare l'iniezione nei traccianti CM di CSF a un tasso di 1 μL/min per 5 o 10 min, risultante in un volume totale di 5 µ l o 10 µ l, rispettivamente. Al termine dell'iniezione, consentire il tracciante di CSF a circolare in tutto il cervello per 30 min con la cannula indisturbata.
- Dopo 30 min, tagliare il tubo collegato alla cannula (circa 4 cm di distanza dalla punta dell'ago) e la guarnizione relativa estremità utilizzando una saldatura chirurgica.
- Sotto anestesia profonda, eutanasia animale per decapitazione. Rapidamente il cervello di sezionare e difficoltà il tessuto mediante immersione in paraformaldeide al 4% (PFA) diluito in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS; 0.01M; pH 7.4) durante la notte (o/n) a 4 ° C.
3. iniezione di CSF traccianti tramite cannula CM cronicamente impiantati in animali svegli
- Utilizzando una pompa a siringa, aspirare con 7 µ l o 12 µ l dell'elemento tracciante di CSF desiderato una cannula composta di circa 30 cm di tubo PE10 con una punta smussata ago dentale di 0,5 cm.
- Frenare dolcemente l'animale e taglio di circa 1 cm di tubo collegato alla cannula.
- Ancora sotto dolce trattenente, rapidamente collegare la cannula riempita con tracciante di CSF al cannula CM impiantato.
- Utilizzando una pompa a siringa, avviare l'iniezione nei traccianti CM di CSF a un tasso di 1 µ l di iniettare 7 µ l/min o 12 µ l, per ottenere un volume finale di CSF iniettato tracciante di 5 µ l o 10 µ l, compensando così la aCSF restanti nella cannula impiantata. Al termine dell'iniezione, consentire il tracciante di CSF a circolare in tutto il cervello per 30 min con la cannula indisturbata. Assicurarsi che il tubo rimanga collegato durante i periodi di iniezione e la circolazione.
- Alla fine del tempo di circolazione del tracciante di CSF, procedere all'eutanasia per decapitazione, assicurando che l'animale è anestetizzato. Rapidamente il cervello di sezionare e difficoltà il tessuto mediante immersione in paraformaldeide al 4% (PFA) diluito in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS; 0.01M; pH 7.4) durante la notte (o/n) a 4 ° C.
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Representative Results
Al momento della fissazione di topi o ratti in una cornice stereotassica, muscoli del collo, intorno alla regione di apofisi occipitale senza mezzi termini vengono sezionati per esporre la cisterna magna (CM). La struttura triangolare del CM è prontamente riconosciuta tra la porzione caudale del cervelletto e del midollo (Figura 1A-1 C). La cannula viene inserita 1-2 mm nella CM forando delicatamente la membrana atlanto-occipitale (Figura 1). La membrana dura è una struttura dura e l'inserimento della cannula è migliorata inclinando la testa dell'animale di un 120° rispetto al corpo. Con l'ausilio di una pompa di iniezione, diversamente etichettati molecole vengono quindi iniettati della cisterna al prezzo controllato (Figura 1E). Dopo un intervallo per consentire la circolazione di CSF tracciante, animali sono euthanized. Il cervello è accuratamente dissecato e fissato mediante immersione in 4% PFA o/n a 4 ° C. Macroscopica vista dorsale dei cervelli raccolte dai roditori CM-iniettato Mostra la distribuzione dei rivelatori di CSF in cisterne subaracnoidea del cervelletto, nel bulbo olfattivo e nello spazio extravascolare lungo le arterie cerebrali centrali (MCAs) (Figura 1F ). Nella porzione ventrale del cervello, vista macroscopico Mostra CSF tracciante distribuzione lungo il cerchio di Willis (Figura 1). Le sezioni istologiche della CM-iniettato cervelli ulteriormente rivelano la distribuzione paravenosa di rivelatori all'interno del parenchima cerebrale. Topi iniettati sotto anestesia (Figura 1 H) (o durante il sonno naturale, Vedi1) mostrano un aumento notevole nella distribuzione dell'elemento tracciante nel parenchima cerebrale rispetto ai topi iniettati mentre sveglio e liberamente commovente nella loro gabbia a casa (Figura 1I).
Figura 1: iniezione di traccianti in cisterna liquorale. (A) descrizione schematica del mouse testa e del cervello che mostra la posizione della cisterna magna (CM) in relazione al cervello e strutture craniche. (B) microfotografia di CM esposta dopo i muscoli circostanti del collo sono stati sezionati e spinti ai lati senza mezzi termini. (C) maggiore ingrandimento della zona raffigurata in B (rettangolo nero), mostrando la struttura triangolare invertita di CM (linea tratteggiata) e la sua posizione in relazione le strutture circostanti, cioè l'apofisi occipitale, del cervelletto e midollo. (D) fotomicrografia della cannula inserita nel regime di (E) di CM. della vista laterale della testa fissa del mouse, leggermente inclinato di un angolo di 120 ° rispetto al corpo. Inserto di rettangolo tratteggiato delimitata area spettacoli lo schema di un sistema di visualizzazione parasagittal parasagittal vista del cervello del mouse con la cannula inserita nella CM, come descritto in E. Una siringa, che è accoppiata a una pompa di iniezione, viene usata per fornire elementi traccianti CSF o agenti di contrasto nella CM attraverso un tubo collegato ad un ago 30g sottile. Immagini rappresentative di un cervello di topo intero a 30 min dopo la fine dell'iniezione di CM con un tracciante fluorescente visto dalla dorsale (F) e ventrale (G) aspetti. (H, I,) Sezioni rappresentative della corona del cervello controcolorati con DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole; 1 µ g/mL in PBS) dei topi iniettati con traccianti CSF CM sotto anestetizzati (H) e Veglia (I), 30 min dopo la fine dell'iniezione CM ad un tasso di 1 µ l/min di un 5 µ l volume di una miscela di coniugato ovoalbumina-AF647 (OA, 45kDa; 2% in aCSF) ed il dextrano-FITC coniugato (DEX, 3kDa; 2% in aCSF). Barre della scala, 5 mm per B, C, F, G; 2 mm per D e 500 µm per H, I. Cb, cervelletto; CM, cisterna magna; CTX, corteccia; e OB, bulbo olfattivo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Abbiamo presentato un protocollo che descrive una procedura dettagliata per cisterna magna inserimento di una canula (CMc), che offre un metodo semplice per trasportare molecole con etichettate nel vano di CSF. CMc consente la visualizzazione successiva di dinamica di CSF, sia in vivo ed ex vivo, utilizzando diverse modalità di imaging o istologia.
Uno dei principali vantaggi della tecnica CMc si trova nel relativo accesso diretto allo spazio subaracnoideo senza la necessità di esporre il cervello dal craniotomy. Non richiedendo una finestra cranica o penetrazione del parenchima cerebrale con una punta ad ago, CMc consente il rilascio di molecole nel vano di CSF e la valutazione del sistema glifatico di una procedura minimamente invasiva, con solo breve dispersione della pressione intracranica (ICP).
In particolare, l'iniezione nella CM è a valle delle fonti principali di CSF, il plexi coroidico situato nel sistema ventricolare (laterale, terzi e quarto ventricoli). Dai ventricoli laterali, flussi di CSF per il terzo ventricolo tramite gli orifizi intraventricolari (il forame di Monro) e dal terzo al quarto ventricoli attraverso l'acquedotto cerebrale (acquedotto di Silvio) per il tronco cerebrale e del midollo spinale (rivisto in3 ). CSF raggiunge lo spazio subaracnoideo tramite il CM di fluire attraverso il diaframma mediano (o il forame di Magendie), e quindi CMc iniezioni ignorano l'intero sistema ventricolare. Tuttavia, mentre questo può essere problematico in alcuni modelli di dinamica di CSF/ISF attraverso i ventricoli, iniezione diretta di traccianti nei ventricoli richiede procedure chirurgiche invasive come la perforazione di fori della bava in windows il cranio e l'applicazione di iniezioni di ventricolare sostanzialmente perturbare l' ICP13. Allo stesso modo, iniezione a pressione di traccianti in spazio subaracnoideo13,14 nelle nostre mani abolisce il flusso dei rivelatori di CSF lungo lo spazio extravascolare. Al contrario, anche se CMc implica la puntura della membrana dural, ICP è solo transitoriamente perturbato ed è rapidamente restaurato2.
Utilizzando la CMc, attività di glifatico può essere misurata in animali anestetizzati dopo CMc acuto, così come negli animali svegli, osservando un periodo di recupero di 24 ore dopo l'impianto di cannula. CMc acuta è adatto per combinazione con 2-fotone di imaging, che fornisce informazioni dettagliate sulle attività di glifatico all'interno di corteccia per una profondità di circa 200 µm1,2. D'importanza, acuta CMc offre anche il vantaggio di supportare gli studi di MRI imparziali, dove distribuzione elemento tracciante è seguita in modo dinamico, rispetto a un'immagine di riferimento individuale acquistata prima dell'inizializzazione del CSF tracciante iniezione15, 16 , 17. per MRI, l'ago dentale usato per CMc può essere sostituito da un borosilicato capillare (circa 1 cm di lunghezza, diametro di punta di circa 20 µm) collegato al tubo di PE.
In contrasto con l'inserimento di una canula acuta, cronica CMc consente lo sperimentatore eseguire l'iniezione dell'elemento tracciante di CSF in animali durante il sonno naturale o in anestesia, come pure in sveglio, animali liberi di muoversi. Questo è un fattore cruciale poiché glifatico attività è altamente dipendenti dallo stato; afflusso di tracciante al parenchima è molto maggiore in animali che sono stati iniettati sotto anestesia o addormentato che in animali che sono stati iniettati in stato sveglio1. Inoltre, gli animali con una cannula cronicamente impiantato possono ricevere tracciante di CSF nella loro gabbia a casa, riducendo così al minimo i fattori di confusione dovuto gli effetti dello stress e l'eccitazione sull'attività glifatico. Per preparazioni iniettabili croniche nell'ambito dell'anestesia, una miscela di chetamina/xilazina (100 mg/kg; 10 mg/kg, rispettivamente) è raccomandato. Isoflurano alle concentrazioni superiore a 1,5% induce il gonfiamento del cervello e non migliorare l'attività di glifatico rispetto alla stato sveglio1. Nota che dopo l'impianto di CMc, gli animali dovrebbero essere unico ospitato, al fine di assicurare che gli animali CMc impiantato non danneggi la cannula di a vicenda. Inoltre, poiché l'impianto cronico di CMc è una procedura chirurgica di recupero, dovrebbe essere eseguita in condizioni di sterilità e gli animali devono ricevere analgesici postoperativa.
D'importanza, CMc utilizzabile come un metodo per fornire elementi traccianti CSF nei topi e nei ratti, con minime modifiche al protocollo. Anestetici appropriata dose deve essere somministrata e il volume massimo dell'elemento tracciante di CSF che viene iniettato nei ratti è di 30 µ l, a causa delle differenze nella dimensione degli spazi ventricolari e subaracnoidei fra le due specie.
Nonostante la sua semplicità procedurale, alcuni formazione e la pratica è necessaria per lo sperimentatore eseguire correttamente la CMc. Poiché il CM varia in dimensione tra specie e singoli animali, si consiglia di praticare il riconoscimento della sua struttura. Svolgere la procedura utilizzando blu di Evans (2% in aCSF) permette lo sperimentatore confermare l'inserimento dell'ago corretta. Occasionalmente, una nave sarà situata direttamente presso la linea mediana della CM, dopo di che l'ago deve essere inserito adiacente al vaso, ma più vicino possibile alla linea mediana. Questi casi dovrebbero essere notati, per la successiva conferma che traccianti sono distribuiti uniformemente, nonostante il posizionamento decentrato della punta dell'ago. D'importanza, la membrana atlanto-occipital che copre il CM è meccanicamente resistente, e deve essere applicata una pressione sufficiente per inserire la punta dell'ago smussato. Tuttavia, è fondamentale che la pressione applicata non si traduca in precipitare la punta dell'ago nel midollo o del cervelletto. Per facilitare l'inserimento dell'ago nella CM, la testa degli animali dovrebbe essere inclinata verso il basso con un angolo di 120° rispetto al corpo, che si estende la membrana. Soprattutto, deve usare cautela per non ostruire la respirazione di questa flessione testa. Se la punta dell'ago dovrebbe entrare il cervelletto, traccianti verranno trattenuti nel tessuto e non riescono a distribuire in tutto lo spazio subaracnoideo. Danni al midollo sono frequentemente mortali, mentre danni del cervelletto in inserimenti di una canula croniche possono causare prostrazione e anomalie generali nel comportamento degli animali. Per ridurre al minimo il rischio di questa eventualità, aghi con una più piccola lunghezza smusso può essere utilizzato.
Quando si spostano i muscoli nella regione del collo che copre la membrana dura per inserire la cannula nella CM, sanguinamento può verificarsi. Tamponi di cotone possono essere utilizzati per assorbire l'emorragia, ma in alternativa, la soluzione di cloruro ferrico può essere applicata. Cloruro ferrico ha un effetto emostatico18e attiva anche l'irrigidimento dei muscoli del collo, intorno al sito di incisione, contribuendo così ad per ottenere il corretto inserimento dell'ago nel CM. ferrico cloruro anche asciuga il cranio e la membrana dural, che presentano superfici meglio per adesione della cannula. Per CMc, applicare 1-2 gocce di soluzione di cloruro ferrico (10%) (circa 1 mL) in un cotone tampone e tamponare i muscoli del collo e l'apofisi occipitale. Tuttavia, cloruro ferrico d'attualità può eventualmente penetrare attraverso la membrana CSF, con effetti sconosciuti sull'omeostasi del cervello. Se l'uso di cloruro ferrico è un motivo di preoccupazione, si possono usare invece ferita Divaricatori per mantenere aperto il sito di incisione. Rimozione accurata di riavvolgitori con dispositivo di ferita dopo aver applicato la colla del cianoacrilato evita eventuale allegato al sito di incisione.
CMc è una procedura semplice e riproducibile per trasportare molecole direttamente nel vano di CSF. Poiché CMc è minimamente invasiva, è il metodo preferito per la visualizzazione del sistema glifatico e possono essere combinato con diverse modalità di imaging quali epifluorescenza e microscopia 2-fotone o MRI. Quindi, CMc rappresenta un ottimo strumento per studi di fluidodinamica, vale a dire CSF e ISF e anche dello spazio fluido del cervello. A causa della copertura macroscopica del sistema glifatico, CMc ha il potenziale per essere usato per trasportare molecole a livello cerebrale.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla Novo Nordisk Foundation e Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo, NINDS/NIH (M.N.). A.L.R.X. e Sangiorgio-R sono destinatari di una borsa di studio post-dottorato e una borsa di studio di dottorato di ricerca della Fondazione di Lundbeck, rispettivamente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SOPIRA Carpule 30G 0.3 x 12mm | Kulzer | AA001 | |
| Polyethylene Tubing 0.024” OD x 0.011” ID | Scandidact | PE10-CL-500 | |
| 30G x ½” 0.3 x 12 mm Luer-Lock | Chirana T. Injecta | CHINS01 | |
| Chlorhexidine 0.5% (chlorhexidine digluconate) | Meda AS | no catalogue number, see link in comments | http://www.meda.dk/behandlingsomrader/desinfektion/desinfektion-af-hud/klorhexidin-sprit-medic-05/ |
| Alcohol Swab 70% Isopropyl Alcohol 30 x 60mm | Vitrex Medical A/S | 520213 | |
| Viskoese Oejendraeber Ophtha | Ophtha | 145250 | |
| Wooden applicator, Double cotton bud (Ø appr. 4 - 5 mm, length appr. 12 mm) | Heinz Herenz | 1032018 | |
| Eye spears | Medicom | A18005 | |
| Ferric chloride 10% solution | Algeos | NV0382 | |
| Kimtech Science Precision Wipes Tissue Wipers | Kimberly Clark Professional | 05511 | |
| Loctite Super Glue Precision 5g | Loctite | no catalogue number, see link in comments | http://www.loctite-consumer.dk/da/produkter/superglue-liquid.html |
| Insta-Set CA Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-152 | |
| Dental Cement Powder | A-M Systems | 525000 | |
| Surgical weld | Kent Scientific Corporation | INS750391 | |
| Hamilton syringe GASTIGHT® , 1700 series, 1710TLL, volume 100 μL, PTFE Luer lock | Hamilton syringes | 1710TLL | |
| LEGATO 130 Syringe pump | KD Scientific | 788130 | |
| Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS; 0.01M; pH 7.4) | Sigma Aldrich | P3813 | |
| Ovalbumin, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | O34784 | |
DAPI (diamidino-2-phenylindole) Solution (1 mg/mL) |
Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Dextran, Fluorescein, 3000 MW, Anionic | Thermo Fisher Scientific | D3305 | |
| E-Z Anesthesia EZ-7000 Classic System | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Attane Isofluran 1000 mg/g | ScanVet | 55226 | |
| Euthanimal 200mg/mL (sodium pentobarbital) | ScanVet | 545349 | |
| Ketaminol Vet 100 mg/mL (ketamine) | Intervet International BV | 511519 | |
| Rompin Vet 20 mg/mL (xylazin) | KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH | 148999 | |
| Xylocain 20 mg/mL (lidocain) | AstraZeneca | 158543 | |
| Marcain 2.5 mg/mL (bupivacain) | AstraZeneca | 123918 | |
| Bupaq Vet 0.3 mg/mL (buprenorphine) | Richter Pharma AG | 185159 |
References
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