Summary
Aquí se describe un protocolo para realizar la canulación de cisterna magna (CMc), una forma mínimamente invasiva para ofrecer marcadores, sustratos y moléculas de señalización en el líquido cerebroespinal (CFS). Combinado con diferentes modalidades de imágenes, CMc permite sistema de glymphatic y evaluación dinámica de CSF, así como entrega de todo el cerebro de varios compuestos.
Abstract
Canulación de cisterna magna (CMc) es un procedimiento sencillo que permite acceso directo al líquido cefalorraquídeo (LCR) sin daños operativos en el cráneo o el parénquima cerebral. En roedores anestesiados, la exposición de la duramadre por disección Roma de los músculos del cuello permite la inserción de una cánula en la cisterna magna (CM). La cánula, compuesta por una fina aguja biselada o borosilicate capilar, está conectada a través de un tubo de polietileno (PE) a una jeringa. Utilizando una bomba de jeringa, las moléculas pueden entonces inyectar a precios controlados directamente en la CM, que es continuo con el espacio subaracnoideo. Desde el espacio subaracnoideo, podemos rastrear flujos de CSF por flujo convectivo en el espacio perivascular alrededor de las arteriolas penetrantes, donde se produce el intercambio de solutos con el líquido intersticial (ISF). CMc se puede realizar inyecciones agudo inmediatamente después de la cirugía, o para la implantación crónica, con posterior inyección en anestesiados o despierto, moviendo libremente roedores. Cuantificación de la distribución del trazador en el parénquima cerebral se puede realizar por epifluorescencia, 2 fotones microscopía y resonancia magnética (MRI), dependiendo de las propiedades fisico-químicas de las moléculas inyectadas. Así, CMc junto con diversas técnicas de imagen ofrece una poderosa herramienta para la evaluación del sistema de glymphatic y dinámicas de la CFS y la función. Por otra parte, el CMc puede ser utilizada como un conducto para la entrega rápida y todo el cerebro de sustratos metabólicos que de lo contrario no podrían cruzar la barrera hematoencefálica (BBB) y moléculas de señalización.
Introduction
Líquido cefalorraquídeo (LCR) baña el sistema nervioso central (SNC) en todo el sistema ventricular y a lo largo de los espacios subaracoideos, un espacio anatómico definido en continuo con los ventrículos, que rodea el cerebro y la médula espinal. Una de las principales funciones de la CSF debe proporcionar una ruta para la separación de metabolitos y solutos de la parenquimia del cerebro. Separación es facilitada mediante el glymphatic recientemente descubierto sistema1, el cerebro análogo al sistema linfático periférico. Adjunto, describimos y discutimos la cisterna magna la canulación (CMc), un método mínimamente invasivo para la entrega directa de las moléculas en el LCR. El CMc es el método fundamental para estudiar la función glymphatic. Además, CMc puede aplicarse también para el estudio de la dinámica de la CSF y para una entrega rápida y todo el cerebro de moléculas permeables de barrera (BBB) de cerebro sin sangre en el parénquima cerebral, a lo largo del espacio perivascular.
El CMc explota principios fisiológicos de dinámicas de movimiento de la CFS a través del CNS para entregar trazalíneas etiquetados moléculas o fármacos en el espacio lleno de CSF de la cisterna magna (CM). Las moléculas se inyectan a través de una cánula que se implanta en el revestimiento de la membrana dural atlanto-occipital CM. moléculas después son llevadas por el flujo de la CFS a granel en la parenquimia del cerebro mediante el espacio paravascular del1. Agente trazador o contraste inyectado a través de la CMc sigue el movimiento del LCR, que permite la evaluación de la CSF movimiento y afluencia de glymphatic mediante la cuantificación de niveles de intensidad de moléculas marcadas que entran en el parénquima cerebral. CMc es compatible con diferentes técnicas de imagen incluyendo epifluorescencia, 2 fotones microscopía y la proyección de imagen de resonancia magnética (MRI). También, esta evaluación se puede realizar en vivo o ex vivo. Lo importante, CMc permite la visualización del sistema glymphatic bajo anestesia o durante el sueño natural, así como en animales despiertos, libremente móviles.
La técnica de CMc puede ser utilizada para estudiar diferentes aspectos de la dinámica de fluidos en el LCR, pero ha demostrado para ser particularmente útiles para estudiar el sistema de glymphatic. Glymphatic actividad conduce el flujo convectivo de LCR desde el espacio periarterial mediante canales de agua Acuaporina-4 (AQP-4), que están anclados en la membrana de astrocytic envoltura vascular endfeet. El flujo convectivo permite el intercambio de LCR y líquido intersticial (ISF) dentro de la parenquimia del cerebro. CSF/ISF que contiene solutos y desechos metabólicos se elimina entonces de la parenquimia del cerebro vía los perivenous espacio2,3. En última instancia, CSF/ISF llega a la periferia a través de los vasos linfáticos dural recientemente descrito4,5. El sistema glymphatic se ha demostrado fundamental para la separación de metabolitos residuales nocivos como amiloide-β2. Además, separación de glymphatic se deteriora en envejecimiento6, después de lesión de cerebro traumática7y en modelos animales de diabetes8 y9de la enfermedad de Alzheimer. En particular, glymphatic actividad es estado dependiente, que muestra significativamente mayor actividad durante el sueño o la anestesia en comparación con la vigilia1. De hecho, anestesiados los animales jóvenes presentan mayor actividad glymphatic. Así, cuantificación experimental de glymphatic actividad es crítica cuando se está estudiando su papel en la salud y la enfermedad.
Varios estudios han abordado su intercambio con el líquido intersticial (ISF) en el parénquima cerebral y dinámicas de la CFS. Sin embargo, los métodos por el cual se entregan etiquetadas moléculas son bastante invasivos, provocando daño de parénquima cerebral y cambios en la presión intracraneal (ICP) (ver comentario10). Algunos ejemplos son intraventriculares o inyecciones de intraparenchymal que implican craneotomía o perforación de las rebabas del agujero en el cráneo. Estos procedimientos han demostrado modificar el ICP, interrumpiendo así glymphatic función2. También, estos métodos invasivos inducen astrogliosis y aumentan el immunoreactivity de la AQP-4 en la zona de parénquima dañado del cerebro y sus alrededores11,12. Como astrocitos y AQP-4 son elementos clave del sistema glymphatic, el CMc es el método de elección para sus estudios. Las principales ventajas del CMc en comparación con procedimientos más invasivos son el mantenimiento de un parénquima cráneo y el cerebro intacto, evitando alteraciones de ICP y astrogliosis, respectivamente. Así, CMc junto con diferentes herramientas de imagen se abre una amplia gama de posibilidades para estudiar no sólo el sistema de glymphatic, sino también la dinámica y mecanismos de flujo de fluidos en la homeostasis, así como en modelos animales de enfermedades neurológicas.
El procedimiento de canulación (CMc) de cisterna magna permite acceso fácil y directo para el líquido cerebroespinal (CFS). Mediante la inyección de moléculas diferentes (por ejemplo, marcadores fluorescentes, agentes de contraste MRI) el experimentador puede seguir su movimiento dentro del compartimiento del CSF y evaluar la actividad del sistema glymphatic. El siguiente protocolo describe tanto la CMc aguda, inyecciones inmediatamente después de la cirugía y crónica implantación de la cánula, en el que el animal se recupera de la intervención quirúrgica para una inyección más adelante. La diferencia más importante entre la implantación aguda y crónica es que la implantación crónica permite el estudio de la actividad glymphatic en ratones despiertos.
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Protocol
Todos los procedimientos fueron realizados según la Directiva 2010/63/UE Europea para la investigación animal y fueron aprobados por el Consejo de experimentos animales bajo el Ministerio danés de medio ambiente y la comida (2015-15-0201-00535).
1. procedimiento para la canulación
- Preparación de la cánula
Nota: Evite tocar la cánula con guantes no estériles.- Rompa la punta metal biselada de la aguja dental 30G con un sostenedor de la aguja.
- Un sostenedor de la aguja, preparar la cánula introduciendo la punta de metal biselada (aproximadamente 0,3 cm) en una longitud de 30 cm de PE10 tubería (tubería de polietileno 0,024" OD x ID 0,011") llenada de aCSF 126 mM NaCl, 2,5 mM (KCl, 1.25 mM NaH2PO4 , 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, glucosa 10 mM, 26 mM NaHCO3; pH 7.4 cuando gaseados con 95% O2 y 5% CO2).
- Enjuague la cánula con aCSF utilizando una jeringa de 1 mL con una aguja de 30G (30 x ½" 0,3 x 12).
-
Procedimiento quirúrgico
Nota: La canulación crónica de CM permite a los animales para recuperarse de la intervención quirúrgica. CM inyecciones se realizan el día después de la implantación de la cánula y, sobre todo, se pueden realizar en animales anestesiados o despiertos. Ya que esta es una cirugía de recuperación, procedimientos deben llevarse a cabo en condiciones estériles.- Peso ratón (C57BL/6JRj, ambos sexos, 8 semanas) y anestesiar con una mezcla de ketamina y xilacina (100 mg/kg; 10 mg/kg, respectivamente) mediante inyección intraperitoneal (i.p.). Si es necesario, redose el ratón con una mitad de la dosis de ketamina (50 mg/kg) durante el procedimiento quirúrgico. Por otra parte, para la canulación crónica, anestesiar ratón colocándolo en una cámara de inducción de isoflurano en 2.5-3% de isoflurano, en alrededor de 1 L/min O2. En este caso, use un cono de nariz para mantener la anestesia isoflurano en 1.5-2% a lo largo de la cirugía.
- Cuando pellizco del dedo del pie reflejos cese, y la respiración se vuelve lenta y constante, coloque el animal en un marco estereotáxicas sobre una almohadilla de calefacción.
- Aplicar el ungüento oftálmico. Repetir durante la cirugía siempre que sea necesario.
- Afeitarse la cabeza y el cuello del ratón, quitar piel y esterilizar la piel expuesta primero con un algodón embebido en alcohol y luego dos veces con solución de yodo (2%) o clorhexidina (0.5%). Repita la esterilización dos veces más.
Nota: Cambiar el paño quirúrgico para eliminar los residuos y el cabello después del afeitado. Luego cuelgue el animal para proteger al campo estéril. - Para la canulación crónica administrar 0.5 - 1 ml lidocaína/bupivacaína (1 mg/ml y 0,25 mg/ml, respectivamente) por vía subcutánea (s.c.) en el sitio de la incisión. Administre buprenorfina (0,05 mg/kg, s.c.) para la analgesia posquirúrgica.
- Fijar el ratón en el fotograma estereotáxicas. Después de asegurarse de la fijación, sea intraural o por el arco cigomático, inclinar la cabeza ligeramente para que forme un ángulo de 120° con el cuerpo (Figura 1E).
- Encontrar la parte del cráneo que sobresale inmediatamente por encima de los músculos del cuello - la cresta occipital. Levantar la piel usando un par de pinzas y cortar una pieza en forma de almendra de piel de aproximadamente 1 cm a lo largo de la línea media. Usar hisopos de algodón o lanzas para controlar el sangrado resultante del ojo.
- Con la cresta occipital como punto de referencia, separe el tejido conectivo superficial para exponer los músculos del cuello abajo.
- Separar los músculos en la línea media ejecutando el fórceps con cuidado por el medio de la zona de la incisión en el eje antero-posterior. Con un par de fórceps curvos en cada mano, Únete a las puntas en el centro cerca de la base del cráneo y tirar de los músculos a un lado.
Nota: Esto debe exponer los CM, que aparece como un pequeño triángulo invertido, por el cerebelo arriba y médula por debajo de, detrás de la membrana dural translúcida (figura 1B y 1C). - Con un hisopo quirúrgico ojo lanza o algodón, limpie la membrana dural que cubre el CM.
-
Inserción de la cánula en la CM
- Retire la cánula de la jeringa llena de aCSF, manteniendo la aguja de 30G conectada a la parte trasera del tubo.
- Conecte la aguja de 30G en un destilado lleno de agua 100 μl jeringa conectada a una bomba de jeringa.
- Inserte una burbuja de aire de aproximadamente 1 cm en la cánula retirando el aire con la ayuda de una bomba de jeringa.
- Utilizando una bomba de jeringa, retirar 12 μL de trazador de CSF deseada en la cánula.
- Sujete la cánula, con el palpador de la CSF, cerca de la aguja cubierta de tubo con un par de pinzas curvas la mano dominante. Descansar el dedo de la mano no dominante en la barra de la oreja del lado opuesto y mantenerla firme para el uso posterior como un descanso para la cánula.
- Inserte la cánula en un ángulo de 45° con respecto a la cabeza de ratón, pasando en el centro de la CM, identificado por su aspecto triangular, visto a través de la duramadre. Evitar cualquier penetración del cerebelo o médula. Asegúrese de que sólo se inserta la aguja a una profundidad de 1-2 mm, es decir, hasta el punto donde bisel está enteramente bajo la duramadre. Suelte la pinza que sostiene la cánula y deje que la cánula descanse sobre la mano no dominante.
Nota: El extremo biselado de las agujas dentales requieren de la aplicación de alguna fuerza para perforar la membrana dural que cubre el CM. - Si es necesario, seque cualquier escape de la CFS a la penetración mediante un frotis de ojo quirúrgico lanza o algodón.
- 2-3 gotas de pegamento de cianocrilato en la membrana dural que rodea la cánula de la gota. Añada una gota del acelerador de pegamento para curar el pegamento inmediatamente. Cubre el cráneo y la aguja con una mezcla de cemento dental (aproximadamente 0,5 mg) y pegamento de cianoacrilato (3-5 gotas). Inmediatamente después, aplique una gota de acelerador de pegamento para curar.
- Para la canulación crónica, corte el tubo (dejando unos 2-3 cm conectado a la cánula) y sellar con una soldadura quirúrgica para mantener los niveles de la presión intracraneal (PIC), mediante la prevención de pérdida de LCR a través del tubo.
- Para la canulación crónica, administrar carprofen (5 mg/kg, s.c.)
- Para la canulación crónica, coloque el ratón en una jaula, mantener sobre una almohada para mantener la temperatura corporal hasta que el animal está totalmente recuperado de la anestesia.
Nota: Los animales deben ser solo ocupa sus jaulas para asegurar que la cánula se mantiene intacta. Asegúrese de que la nariz está clara del lecho colocando el ratón sobre una toalla de papel u otro sustrato sólido.
Nota: Al día siguiente, cuando los animales se recuperan desde el procedimiento quirúrgico realizado para la inserción de la cánula, puede inyectar con rastreadores de CSF. Para la inyección con anestesia, administrar una mezcla de ketamina/xilacina (100 mg/kg; 10 mg/kg, respectivamente; i.p.) y continúe con los pasos descritos en la sección 2. Para la inyección en animales despiertos, prosiga a la sección 3.
2. inyección de trazadores de LCR a través de cánula de CM implantado aguda en animales anestesiados
Nota: Para la inyección de trazadores de la CSF a través de cánula de CM implantado aguda en animales anestesiados, inmediatamente después del paso 8 de la sección anterior, proceder a la inyección de trazador de LCR como se describe a continuación.
- Utilizando una bomba de jeringa, iniciar la inyección en los trazadores CM de LCR a un ritmo de 1 μL/min durante 5 o 10 min, dando por resultado un volumen total de 5 μl o 10 μl, respectivamente. Al final de la inyección, deje que el palpador de la CSF circular a través del cerebro por 30 min con la cánula.
- Después de 30 min, corte el tubo conectado a la cánula (aproximadamente 4 cm de distancia de la punta de la aguja) y sellar su extremo usando una soldadura quirúrgica.
- Bajo anestesia profunda, eutanasia al animal por decapitación. Diseccionar el cerebro rápidamente y fijar los tejidos mediante inmersión en paraformaldehído al 4% (PFA) diluida en tampón fosfato salino (PBS, 0.01M, pH 7.4) durante la noche (o/n) a 4 ° C.
3. inyección de trazadores de LCR a través de cánula de CM crónicamente implantados en animales despiertos
- Utilizando una bomba de jeringa, retire μl 7 o 12 μl de trazador de CSF deseada en una cánula que se compone de aproximadamente 30 cm de tubería PE10 con una punta de aguja dental biselado de 0.5 cm.
- Frenar suavemente al animal y cortar de aproximadamente 1 cm de la tubería conectada a la cánula.
- Todavía bajo restricción suave, rápidamente conectar la cánula con trazador de la CSF a la cánula CM implantado.
- Utilizando una bomba de jeringa, iniciar la inyección en los trazadores CM de LCR a un ritmo de 1 μl de inyectar 7 μl/min o 12 μl, para alcanzar un volumen final de CSF inyectados tracer 5 μl o 10 μl, compensando así la aCSF queda en la cánula implantada. Al final de la inyección, deje que el palpador de la CSF circular a través del cerebro por 30 min con la cánula. Asegúrese de que la tubería permanezca adherida durante periodos de inyección y circulación.
- Al final del tiempo de circulación de trazador de CSF, proceder a la eutanasia por decapitación, asegurando que el animal está anestesiado profundamente. Diseccionar el cerebro rápidamente y fijar los tejidos mediante inmersión en paraformaldehído al 4% (PFA) diluida en tampón fosfato salino (PBS, 0.01M, pH 7.4) durante la noche (o/n) a 4 ° C.
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Representative Results
Sobre fijación de ratones o ratas en un marco estereotáxicas, los músculos del cuello alrededor de la región de la cresta occipital son disecados sin rodeos para exponer la cisterna magna (CM). La estructura triangular de la CM es fácilmente reconocibles entre la porción caudal del cerebelo y la médula (figura 1A-1 C). La cánula se inserta 1-2 mm en el CM por la perforación suavemente la membrana atlanto-occipital (figura 1). La dura membrana es una estructura resistente y la inserción de la cánula se mejora por la inclinación de la cabeza del animal por un 120° con respecto al cuerpo. Con la ayuda de una bomba de inyección, diferentemente etiquetadas las moléculas entonces se inyectan en la cisterna magna a precios controlados (Figura 1E). Después de un intervalo para permitir la circulación del trazalíneas de CSF, los animales son sacrificados. El cerebro es cuidadosamente disecado y fijo por inmersión en el 4% o PFA/n a 4 ° C. Vistas dorsales macroscópicas de los cerebros de roedores inyectado CM Mostrar la distribución de trazadores de la CSF en la cisterna subaracnoidea del cerebelo, del bulbo olfatorio y en el espacio paravascular a lo largo de las arterias cerebrales medias (MCAs) (Figura 1F ). En la porción ventral del cerebro, vistas macroscópicos demuestran CSF tracer distribución a lo largo del círculo de Willis (figura 1). Las secciones histológicas del cerebro CM inyectado más revelan la distribución paravascular de marcadores dentro de la parenquimia del cerebro. Ratones inyectados bajo anestesia (figura 1 H) (o durante el sueño natural, véase1.) muestran un aumento notable en la distribución del trazador en el parénquima cerebral en comparación con ratones inyectados y despierto como libremente móvil en su jaula casera (figura 1I).
Figura 1: inyección de trazadores en la cisterna magna. (A) Descripción esquemática de la cabeza de ratón y cerebro mostrando la ubicación de la cisterna magna (CM) en relación con las estructuras craneales y cerebro. (B) microfotografía de CM expuesta después de que los músculos alrededor del cuello han sido claramente disecados y empujó a los lados. (C) aumento mayor de la zona representada en B (rectángulo negro), que muestra la estructura triangular invertida de la CM (línea discontinua) y su ubicación en relación con las estructuras circundantes, es decir, la cresta occipital, cerebelo y médula. (D) microfotografía de la cánula insertada en el sistema CM. (E) de la vista lateral de la cabeza de ratón fijo, ligeramente inclinado en un ángulo de 120 ° con respecto al cuerpo. Recuadro del rectángulo discontinuo delimitado por área muestra el esquema de un esquema de vista parasagital de una visión parasagital de cerebro de ratón con la cánula insertada en el CM, como se indica en E. Se utiliza una jeringa, que se acopla a una bomba de inyección, a administrar marcadores de CSF o agentes de contraste en la CM a través de un tubo conectado a una aguja fina de 30G. Imágenes representativas de un cerebro de ratón todo a los 30 min después del final de la inyección de CM con un trazador fluorescente de la dorsal (F) y ventral (G) aspectos. (H, I,) Secciones del cerebro coronales representativos contratinción con DAPI (4' 6-diamidino-2-phenylindole; 1 μg/mL en PBS) de los ratones inyectados con trazadores de CSF cm bajo anestesia (H) y la vigilia (I), 30 min después del final de la inyección de CM a razón de 1 μl/min de 5 μl volumen de una mezcla de ovoalbúmina-AF647 conjugado (OA, 45kDa; 2% en la aCSF) y dextrano-FITC conjugado (DEX, 3kDa, 2% en la aCSF). Barras de escala, 5 mm para B, C, F, G; 2 mm para D y 500 μm para H, I. Cb, cerebelo; CM, cisterna magna; CTX, corteza; y OB, bulbo olfatorio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hemos presentado un protocolo que describe un procedimiento detallado para la canulación de cisterna magna (CMc), que ofrece un método sencillo para entregar las moléculas marcadas en el compartimiento de la CSF. CMc permite la visualización posterior de la dinámica de la CSF, en vivo y ex vivo, con diferentes modalidades de imagen o histología.
Una de las principales ventajas de la técnica de CMc radica en su acceso directo al espacio subaracnoideo sin necesidad de exponer el cerebro por la craneotomía. Al no requerir una ventana craneal o penetración de la parenquimia del cerebro con la punta de una aguja, CMc permite la entrega de las moléculas en el compartimiento de la CSF y la evaluación del sistema de glymphatic por un procedimiento mínimamente invasivo, con sólo breve disturbio de presión intracraneal (PIC).
En particular, la inyección en el CM es aguas abajo de las principales fuentes de la CSF, el plexi coroideo en el sistema ventricular (laterales, terceros y cuarto ventrículos). De los ventrículos laterales, flujos de la CSF el tercer ventrículo mediante los agujeros intraventriculares (agujero de Monro) y de los ventrículos tercero al cuarto mediante el acueducto cerebral (acueducto de Sylvius) para el vástago de cerebro y médula espinal (revisado en3 ). CSF alcanza el espacio subaracnoideo a través de la CM por que fluye a través de la abertura mediana (o agujero de Magendie), y así las inyecciones CMc puente todo el sistema ventricular. Sin embargo, aunque esto puede ser problemático en algunos modelos de dinámica de CSF/ISF a través de los ventrículos, la inyección directa de marcadores en los ventrículos requiere procedimientos quirúrgicos invasivos tales como la perforación de los agujeros de las rebabas en las ventanas del cráneo y la aplicación de ventriculares inyecciones alteran sustancialmente el ICP13. Asimismo, inyección a presión de marcadores en el espacio subaracnoideo13,14 en nuestras manos suprime el flujo de marcadores de la CSF a lo largo del espacio paravascular. Por el contrario, aunque CMc implica punción de la membrana dural, ICP es sólo transitoriamente perturbado y es rápidamente restaurada2.
Uso de la CMc, puede medirse glymphatic actividad en animales anestesiados después CMc aguda, así como en animales despiertos, observando un período de recuperación de 24 horas sobre la implantación de la cánula. CMc aguda es ideal para la combinación con 2-photon imaging, que proporciona información detallada acerca de la actividad glymphatic dentro de la corteza hasta una profundidad de aproximadamente 200 μm1,2. Lo importante, CMc aguda también ofrece la ventaja de apoyar estudios de MRI imparciales, donde distribución del trazador sigue dinámicamente, en relación con una imagen de referencia individuales adquirida antes de la iniciación de la CSF trazador inyección15, 16 , 17. para una resonancia magnética, la aguja dental utilizada para CMc debe ser sustituido por un borosilicate capilar (aproximadamente 1 cm de longitud, diámetro de la punta de aproximadamente 20 μm) conectado a la tubería de PE.
En contraste con la canulación de la aguda, crónica CMc permite al experimentador realizar inyección de trazador en LCR en los animales durante el sueño natural o bajo anestesia, así como en despertar, mover libremente animales. Este es un factor crucial ya que glymphatic actividad es altamente dependiente del estado; afluencia de trazador a la parenquimia es mucho mayor en los animales que fueron inyectados bajo anestesia o dormido que en los animales que fueron inyectados en el estado despierto1. Además, animales con cánula crónicamente implantado pueden recibir tracer de CSF en su jaula casera, minimizando así los factores de confusión debido a los efectos del estrés y la excitación en la actividad glymphatic. Para las inyecciones crónicas bajo anestesia, una mezcla de ketamina/xilacina (100 mg/kg; 10 mg/kg, respectivamente) se recomienda. Isoflurano en concentraciones superiores a 1,5% induce hinchazón del cerebro y no mejorar la actividad de glymphatic en comparación con el estado despierto1. Cuenta que después de la implantación de la CMc, animales deben ser únicos ubicado, con el fin de asegurar que CMc implantado animales no dañará la cánula de uno al otro. También, puesto que la implantación crónica de CMc es un procedimiento quirúrgico de recuperación, debe ser realizada bajo condiciones estériles y los animales deben recibir tratamiento analgésicos.
Lo importante, CMc puede utilizarse como un método para entregar trazadores de CSF en ratones como en ratas, con mínimas modificaciones en el protocolo. Se deben administrar dosis de anestésicos adecuados y el máximo volumen de trazador de CSF que se inyecta en las ratas es 30 μL, debido a las diferencias en el tamaño de los espacios ventriculares y subaracnoideos entre las dos especies.
A pesar de su simplicidad procesal, cierta formación y la práctica se requiere para el experimentador realizar con éxito la CMc. Puesto que el CM varía en tamaño entre las especies y los individuos, es aconsejable practicar el reconocimiento de su estructura. Practicar el procedimiento con azul de Evans (2% en aCSF) permite que el experimentador confirmar la inserción de la aguja correcta. En ocasiones, un buque estará ubicado directamente en la línea media del CM, con lo cual la aguja debe insertarse junto a la nave, pero tan cerca como sea posible a la línea media. Estos casos deben considerarse, para la posterior confirmación que marcadores se distribuyen uniformemente, a pesar de la colocación fuera del centro de la punta de la aguja. Importante, la membrana atlanto-occipital, cubriendo el CM es mecánicamente resistente, y se debe aplicar suficiente presión para insertar la punta de la aguja biselado. Sin embargo, es fundamental que la presión no produce hundiendo la punta de la aguja en la médula o el cerebelo. Para facilitar la inserción de la aguja en el CM, la cabeza de los animales debe inclinarse hacia abajo en un ángulo de 120° en relación con el cuerpo, que se extiende de la membrana. Importante, debe tener precaución que no se obstruyan la respiración por esta flexión de la cabeza. Si la punta de la aguja debe entrar en el cerebelo, trazadores puede quedar retenidas en el tejido y no distribuir en el espacio subaracnoideo. Daño a la médula es con frecuencia fatal, mientras que el cerebelo en cánulas crónica puede dañar en postración y general de anormalidades en el comportamiento de los animales. Para minimizar el riesgo de esta eventualidad, pueden usarse agujas con una longitud de bisel más pequeño.
Al mover los músculos en la región del cuello que cubre la membrana dura para insertar la cánula en la CM, el sangrado puede ocurrir. Hisopos de algodón pueden usarse para absorber el sangrado, pero también se puede aplicar solución de cloruro férrico. Cloruro férrico tiene un efecto hemostático18y también provoca el endurecimiento de los músculos del cuello alrededor del sitio de incisión, ayudando así a obtener la correcta inserción de la aguja en el CM. férrico cloruro también se seca el cráneo y la membrana dural, que presenta más superficies para la adherencia de la cánula. Para CMc, aplicar 1-2 gotas de solución de cloruro férrico (10%) (aproximadamente 1 mL) en un algodón esponja y frote los músculos del cuello y la cresta occipital. Sin embargo, tópico cloruro férrico posiblemente puede escurrirse a través de la membrana en el LCR, con efectos desconocidos sobre la homeostasis cerebral. Si el uso de cloruro férrico es un motivo de preocupación, se pueden utilizar en su lugar herida retractores para mantener abierto el sitio de la incisión. Eliminar los retractores de la herida después de aplicar el pegamento de cianoacrilato evita involuntario apego al sitio de la incisión.
El CMc es un procedimiento simple y reproducible para entregar las moléculas directamente en el compartimiento de la CSF. Puesto que el CMc es mínimamente invasivo, es el método preferido para la visualización del sistema glymphatic y puede ser combinado con diferentes modalidades de imágenes como epifluorescencia y microscopía 2-fotón o MRI. Así, CMc representa una gran herramienta para estudios de dinámica de fluidos, es decir, la CSF y la ISF y también de separación líquido cerebral. Debido a la cobertura macroscópica del sistema glymphatic, CMc tiene el potencial para ser utilizado para entregar las moléculas todo el cerebro.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Novo Nordisk e Instituto Nacional de desórdenes neurológicos y Stroke, NINDS/NIH (M.N.). A.L.R.X. y S.H-R son los beneficiarios de una beca postdoctoral y una beca de doctorado de la Fundación Lundbeck, respectivamente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SOPIRA Carpule 30G 0.3 x 12mm | Kulzer | AA001 | |
| Polyethylene Tubing 0.024” OD x 0.011” ID | Scandidact | PE10-CL-500 | |
| 30G x ½” 0.3 x 12 mm Luer-Lock | Chirana T. Injecta | CHINS01 | |
| Chlorhexidine 0.5% (chlorhexidine digluconate) | Meda AS | no catalogue number, see link in comments | http://www.meda.dk/behandlingsomrader/desinfektion/desinfektion-af-hud/klorhexidin-sprit-medic-05/ |
| Alcohol Swab 70% Isopropyl Alcohol 30 x 60mm | Vitrex Medical A/S | 520213 | |
| Viskoese Oejendraeber Ophtha | Ophtha | 145250 | |
| Wooden applicator, Double cotton bud (Ø appr. 4 - 5 mm, length appr. 12 mm) | Heinz Herenz | 1032018 | |
| Eye spears | Medicom | A18005 | |
| Ferric chloride 10% solution | Algeos | NV0382 | |
| Kimtech Science Precision Wipes Tissue Wipers | Kimberly Clark Professional | 05511 | |
| Loctite Super Glue Precision 5g | Loctite | no catalogue number, see link in comments | http://www.loctite-consumer.dk/da/produkter/superglue-liquid.html |
| Insta-Set CA Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-152 | |
| Dental Cement Powder | A-M Systems | 525000 | |
| Surgical weld | Kent Scientific Corporation | INS750391 | |
| Hamilton syringe GASTIGHT® , 1700 series, 1710TLL, volume 100 μL, PTFE Luer lock | Hamilton syringes | 1710TLL | |
| LEGATO 130 Syringe pump | KD Scientific | 788130 | |
| Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS; 0.01M; pH 7.4) | Sigma Aldrich | P3813 | |
| Ovalbumin, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | O34784 | |
DAPI (diamidino-2-phenylindole) Solution (1 mg/mL) |
Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Dextran, Fluorescein, 3000 MW, Anionic | Thermo Fisher Scientific | D3305 | |
| E-Z Anesthesia EZ-7000 Classic System | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Attane Isofluran 1000 mg/g | ScanVet | 55226 | |
| Euthanimal 200mg/mL (sodium pentobarbital) | ScanVet | 545349 | |
| Ketaminol Vet 100 mg/mL (ketamine) | Intervet International BV | 511519 | |
| Rompin Vet 20 mg/mL (xylazin) | KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH | 148999 | |
| Xylocain 20 mg/mL (lidocain) | AstraZeneca | 158543 | |
| Marcain 2.5 mg/mL (bupivacain) | AstraZeneca | 123918 | |
| Bupaq Vet 0.3 mg/mL (buprenorphine) | Richter Pharma AG | 185159 |
References
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