Summary
Her beskriver vi en protokoll for å utføre cisterna magna cannulation (CMc), en minimal invasiv måte å levere tracers, underlag og signalnettverk molekyler i spinalvæske (CSF). CMc kombinert med ulike modaliteter for bildebehandling, og kan glymphatic systemet og CSF dynamics vurdering, samt hjernen hele levering av ulike forbindelser.
Abstract
Cisterna magna cannulation (CMc) er en enkel prosedyre som gir direkte tilgang til spinalvæske (CSF) uten operative skade på skallen og hjernen parenchyma. I bedøvet gnagere tillater eksponering av dura mater av sløv Disseksjon av innsetting av en kanyle i cisterna magna (CM). Kanyle, består av en tynn skrå nål eller borosilicate kapillære, er tilknyttet via en polyetylen rør montering. Bruker en sprøytepumpe, sprøytes molekylene deretter på kontrollert priser direkte inn CM, som er kontinuerlig med subarachnoid space. Fra subarachnoid space, kan vi spore CSF flukser av konvektive strømme inn perivascular plass rundt gjennomtrengende arterioler, der stoff utveksling med interstitiell væske (ISF) oppstår. CMc kan utføres for akutt injeksjoner umiddelbart etter kirurgi eller kronisk implantasjon, med senere injeksjon i bedøvet eller våken, fritt flytte gnagere. Kvantifisering av tracer distribusjon i hjernen parenchyma kan utføres av epifluorescence, 2-fotonet mikroskopi og magnetisk resonans imaging (MRI), avhengig av egenskapene fysikalsk-kjemiske injisert molekyler. Dermed gir CMc sammen med ulike Bildeteknikker et kraftig verktøy for vurdering av glymphatic systemet og CSF dynamikk og funksjon. Videre kan CMc benyttes som en kanal for rask, hjernen hele levering signalnettverk molekyler og metabolske underlag som ikke ellers kunne krysse blod-hjernebarrieren (BBB).
Introduction
Cerebrospinalvæske (CSF) bader sentralnervesystemet (CNS) i ventrikkel systemet og langs subarachnoid områder, en anatomisk definerte plass i sammenheng med ventriklene, som omgir hjernen og ryggmargen. En av Hovedfunksjonene til CSF er å gi en rute for klarering av metabolitter og solutes fra hjernen parenchyma. Klaring muliggjøres via den nylig oppdaget glymphatic system1, hjernen analog til eksterne lymfesystemet. Her, vi beskriver og diskuterer cisterna magna cannulation (CMc), en minimal invasiv metode for direkte levering av molekyler i CSF. CMc er den viktigste metoden for å studere funksjonen glymphatic. Videre kan CMc også bli brukt for studiet av CSF dynamikken og en rask, hjernen hele levering av ikke-blod-hjerne barrieren (BBB) permeable molekyler i hjernen parenchyma, langs perivascular plassen.
CMc utnytter psykologiske prinsippene av CSF bevegelse dynamics gjennom CNS å levere merket tracer molekyler eller narkotika inn i fylt med CSF løpet av cisterna magna (CM). Molekyler er injisert gjennom en kanyle implantert i den atlanto-tilpassing dural membran dekket CM. molekyler blir deretter utført av CSF bulk flyte inn i hjernen parenchyma via paravascular plass1. Tracer eller kontrast agent inn i CMc følger CSF, hvilke innrømmer vurdering av CSF bevegelse og glymphatic tilstrømningen av kvantifisere intensitetsnivåer merket molekyler angir hjernen parenchyma. CMc er kompatibel med forskjellige Bildeteknikker inkludert epifluorescence, 2-fotonet mikroskopi og magnetisk resonans imaging (MRI). Også denne vurderingen kan være utført både i vivo eller ex vivo. Viktigere, gir CMc effekten av glymphatic under narkose eller under naturlig søvn og våken, fritt bevegelige dyr.
CMc teknikken kan benyttes for å studere ulike aspekter av fluid dynamikk i CSF, men har vist seg for å være spesielt nyttig for å studere glymphatic systemet. Glymphatic stasjoner konvektive flyten av CSF fra feltet periarterial via aquaporin-4 (AQP-4) vannkanaler, som er bundet i membranen av astrocytic vaskulære-innpakning endfeet. Konvektive flyten muliggjør utveksling av CSF og interstitiell væske (ISF) i hjernen parenchyma. CSF/ISF inneholder metabolsk avfall og solutes så blir fjernet fra hjernen parenchyma via perivenous plass2,3. Til slutt, når CSF/ISF periferien via nylig beskrevet dural lymfekar4,5. Glymphatic systemet har vist avgjørende klarering av skadelige avfall metabolitter som amyloid-β2. Videre er glymphatic klaring nedsatt i aldring6, etter traumatisk brain skader7, og dyr modeller av diabetes8 og Alzheimers9. Spesielt er glymphatic aktivitet avhengige, viser betydelig høyere aktivitet under søvn eller anestesi i forhold til våkenhet1. Faktisk viser unge bedøvet dyr høyeste glymphatic aktiviteten. Dermed er eksperimentelle kvantifisering av glymphatic aktivitet kritisk når studere sin rolle i helse og sykdom.
Flere studier har adressert CSF dynamikk og dens utveksling med interstitiell væske (ISF) i hjernen parenchyma. Men metodene som leveres merket molekyler er ganske invasiv, utløser parenchyma hjerneskade og endringer i hjernetrykk (ICP) (se gjennom10). Noen eksempler er intraventricular eller intraparenchymal injeksjoner som involverer craniotomy eller boring av en burr hull i skallen. Disse prosedyrene har blitt vist å endre ICP, dermed forstyrre glymphatic funksjon2. Også slike invasive metoder indusere astrogliosis og øke AQP-4 immunoreactivity i parenchyma skadet hjernen og dens omgivelser11,12. Som astrocyttene og AQP-4 er viktige elementer av glymphatic, er CMc metoden for valg for sine studier. De viktigste fordelene ved CMc i forhold til mer invasiv prosedyrer er vedlikehold av en intakt skallen og hjernen parenchyma, unngå ICP endringer og astrogliosis, henholdsvis. Dermed åpner CMc sammen med ulike bildebehandlingsverktøy for en rekke muligheter til å studere ikke bare glymphatic systemet, men også dynamikken og mekanismer for strømning i homeostase og dyr modeller av nevrologiske sykdommer.
Den cisterna magna cannulation (CMc) prosedyren gir enkel og direkte tilgang til spinalvæske (CSF). Ved å injisere ulike molekyler (f.eks fluorescerende tracers, MRI kontrast agenter) kan eksperimentator spore deres bevegelser innen CSF rommet og vurdere aktiviteten til glymphatic systemet. Følgende protokollen beskriver både den akutte CMc, for injeksjoner umiddelbart etter kirurgi, og kronisk implantering av kanyle, der dyr gjenoppretter fra den kirurgiske prosedyren for en senere injeksjon. Den viktigste forskjellen mellom akutte og kroniske implantation er at kronisk implantation tillater for studier av glymphatic aktivitet i våken mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble utført i samsvar med det europeiske direktivet 2010/63/EU for dyr forskning og ble godkjent av dyr eksperimenter rådet under det danske departement for miljø og (2015-15-0201-00535).
1. prosedyre for Cannulation
- Kanyle forberedelse
Merk: Unngå å berøre kanyle med ikke-sterilt hansker.- Bryte skrå metall spissen av en 30G dental nål med en nål holder.
- Bruker en nål holder, forberede kanyle ved å sette inn skrå metall spissen (ca 0,3 cm) i en 30 cm lengde på PE10 rør (polyetylen rør 0,024" OD x 0.011" ID) fylt med aCSF (126 mM NaCl, 2,5 KCl, 1,25 mM NaH2PO4 , 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 10 mM glukose, 26 mM NaHCO3; pH 7.4 når gasset med 95% O2 og 5% CO2).
- Skyll kanyle med aCSF bruker en 1 mL sprøyte med en 30G nål (30 G x ½" 0.3 x 12).
-
Kirurgisk prosedyre
Merk: Den kroniske CM cannulation lar dyrene å gjenopprette fra den kirurgiske prosedyren. CM injeksjoner er laget dagen etter kanyle implantasjon, og viktigst, kan utføres i enten bedøvet eller våken dyr. Siden dette er en gjenoppretting kirurgi, bør prosedyrer utføres under sterile forhold.- Veie musen (C57BL/6JRj, begge kjønn, 8 uker) og bedøve det med en blanding av ketamin og xylazine (100 mg/kg, 10 mg/kg, henholdsvis) via intraperitoneal (IP) injeksjon. Eventuelt redose musen med halve dosen av ketamin (50 mg/kg) under kirurgiske prosedyren. Alternativt, for kronisk cannulation, bedøve musen ved å plassere den i en isoflurane induksjon kammeret på 2,5-3% isoflurane, i ca 1 L/min O2. I dette tilfellet, bruk en nesen kjegle for å opprettholde isoflurane anestesi på 1,5-2% i hele operasjonen.
- Når tå knipe reflekser opphøre og åndedrett blir langsom og jevn, plassere dyret i en stereotaxic ramme over en varmeputen.
- Bruke ophthalmica salve. Gjenta under operasjonen når det er nødvendig.
- Barbere hodet og halsen av musen, fjerne pels og sterilisere eksponert hud først med en alkoholholdige vattpinnen og deretter to ganger med chlorhexidine (0,5%) eller joden løsning (2%). Gjenta sterilisering to ganger.
Merk: Endre den kirurgiske drapere å fjerne rusk og hår etter barbering. Drapere dyret for å beskytte det sterile feltet. - For den kroniske cannulation, administrere 0,5 - 1 ml lidocaine/bupivacaine (1 mg/ml og 0,25 mg/ml, henholdsvis) subcutaneously (SC) på webområdet snitt. Administrere buprenorfin (0,05 mg/kg, SC) for post-kirurgiske analgesi.
- Fastsette musen i stereotaxic rammen. Kontroller fiksering, enten intraural eller zygomatic buen, vippe hodet litt slik at den danner en vinkel på 120° til kroppen (figur 1E).
- Finn delen av skallen stikker umiddelbart over nakkemusklene - occipital toppen. Løft overliggende huden med en pinsett, og kuttet en mandel formet stykke hud på ca 1 cm langs midtlinjen. Bruk bomull vattpinner eller øye spears til å kontrollere alle resulterende blødning.
- Bruke occipital toppen som et referansepunkt, trekkes fra hverandre overfladisk connective vev for å avsløre nakkemusklene nedenfor.
- Skille musklene på midtlinjen ved nøye kjører tang ned midt i snitt området i anterior-posterior aksen. Med et par buede tang i hver hånd, bli tipsene i midten nederst på skallen og trekke muskler til side.
Merk: Dette bør utsett CM, som vises som en liten invertert trekant, skissert av lillehjernen ovenfor og marg under, bak gjennomsiktig dural membranen (figur 1B og 1 C). - Bruker en kirurgisk øye spyd eller bomull swab, tørk dural membranen dekker CM.
-
Innsetting av kanyle i CM
- Fjern kanyle fra aCSF-fylt sprøyten, holde 30G nålen festet til den bakre enden av slangen.
- Fest 30G nålen destillert vann-fylt 100 µL sprøyte koblet til en sprøytepumpe.
- Sette inn en luftboble på ca 1 cm i kanyle ved uttak luften ved hjelp av en sprøytepumpe.
- Bruker en sprøytepumpe, trekke 12 μL ønsket CSF tracer i kanyle.
- Forstå kanyle, fylt med CSF tracer, nær tube-dekket nålen med et par buede pinsett holdt i dominerende hånden. Holder langfingeren av ikke-dominante hånd over baren øret på motsatt side og holde den stødig for senere bruk som en hvile for kanyle.
- Sett inn kanyle i en vinkel på 45 grader i forhold til mus hodet, passerer i sentrum av CM, identifisert av dens trekantet aspektet sett gjennom dura. Unngå alle penetrasjon av lillehjernen eller forlengede. Kontroller at nålen settes bare til en dybde på 1-2 mm, dvs til skråkant er helt under dura. Slipp pinsett holder kanyle, og la kanyle hvile på ikke-dominante hånd.
Merk: Skrå slutten av dental nålene krever anvendelsen av noen kraft til å pierce dural membranen dekker CM. - Eventuelt tørke av eventuelle CSF lekkasje på penetrasjon bruker en kirurgisk øye spyd eller bomull vattpinner.
- Slipp 2-3 dråper cyanoacrylate lim på dural membran omgir kanyle. Legg en dråpe lim gasspedalen å kurere limet umiddelbart. Dekk hodeskallen og nakken med en blanding av dental sement (ca 0,5 mg) og cyanoacrylate lim (3-5 dråper). Umiddelbart etter gjelde en dråpe lim gasspedalen å kurere.
- For kronisk cannulation, kuttet slangen (forlater ca 2-3 cm knyttet til kanyle) og forsegle den med kirurgisk sveising å beholde intrakranielt trykk (ICP) nivåer, ved å hindre CSF lekkasje gjennom slangen.
- For kronisk cannulation, administrere carprofen (5 mg/kg, SC)
- For kronisk cannulation, Plasser musen i et bur, holder den over en varmeputen å opprettholde kroppstemperatur til dyret er helt tilbake fra anestesi.
Merk: Dyr bør være enkeltvis plassert inne deres burene å sikre at kanyle forblir intakt. Kontroller at nesen er klart sengetøy ved å plassere musen på et papirhåndkle eller andre solid substrat.
Merk: Dagen når dyr er utvinnes fra den kirurgiske prosedyren utføres for kanyle innsetting, de kan være injisert med CSF tracers. For injeksjon under narkose, administrere en blanding av ketamin/xylazine (100 mg/kg, 10 mg/kg, henholdsvis; IP) og fortsette til fremgangsmåten i del 2. For injeksjon i våken dyr, går du til punkt 3.
2. injeksjon av CSF Tracers via akutt implantert CM kanyle i bedøvet dyr
Merk: For injeksjon av CSF tracers via akutt implantert CM kanyle i bedøvet dyr, umiddelbart etter trinn 8 fra forrige avsnitt, videre til CSF tracer injeksjon, som beskrevet nedenfor.
- Bruker en sprøytepumpe, starte injeksjon i CM av CSF tracers med en hastighet på 1 μL/min for 5 eller 10 min, fører til et totalvolum på 5 µL eller 10 µL, henholdsvis. På slutten av injeksjon, Tillat de CSF tracer til å sirkulere gjennom hjernen for 30 min med kanyle uforstyrret.
- Etter 30 min, kuttet slangen koblet til kanyle (ca 4 cm avstand fra pinne-spissen) og forsegle enden med kirurgisk sveising.
- Under dyp anestesi, euthanize dyret ved halshogging. Raskt dissekere hjernen og reparere vevet ved nedsenking i 4% paraformaldehyde (PFA) fortynnet i fosfat bufret saltvann (PBS, 0.01M, pH 7.4) overnatting (o/n) på 4 ° C.
3. injeksjon av CSF Tracers via kronisk implantert CM kanyle i våken dyr
- Bruker en sprøytepumpe, trekke 7 µL eller 12 µl av ønsket CSF tracer inn en kanyle består av ca 30 cm PE10 rør med en skrå dental pinne-spissen på 0,5 cm.
- Forsiktig holde dyr og kuttet ca 1 cm med slangen festet til kanyle.
- Under mild påbud, raskt koble kanyle fylt med CSF tracer til CM implantert kanyle.
- Bruker en sprøytepumpe, start injeksjon i CM av CSF tracers med en hastighet på 1 µL/min. injisere 7 µL eller 12 µL, å oppnå et endelig antall CSF injisert tracer 5 µL eller 10 µL, slik kompenserende aCSF igjen i den implanterte kanyle. På slutten av injeksjon, Tillat de CSF tracer til å sirkulere gjennom hjernen for 30 min med kanyle uforstyrret. Kontroller at slangen fortsatt festet injeksjon og sirkulasjon perioder.
- På slutten av CSF tracer sirkulasjon tid, går du til euthanasia ved halshogging, sikre at dyret er dypt anesthetized. Raskt dissekere hjernen og reparere vevet ved nedsenking i 4% paraformaldehyde (PFA) fortynnet i fosfat bufret saltvann (PBS, 0.01M, pH 7.4) overnatting (o/n) på 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
På fiksering av mus eller rotter i en stereotaxic ramme, er hals musklene rundt regionen occipital crest rett ut dissekert for å avsløre den cisterna magna (CM). Trekantet strukturen i CM gjenkjennes lett mellom caudal delen av lillehjernen og medulla (figur 1A-1 C). Kanyle settes 1-2 mm i CM av forsiktig piercing atlanto-tilpassing membranen (figur 1 d). Dura membranen er en tøff struktur og innsetting av kanyle forbedres ved å vippe dyr hodet av en 120° i forhold til kroppen. Ved hjelp av en injeksjon pumpe, er annerledes merket molekyler deretter sprøytes inn cisterna magna til kontrollert priser (figur 1E). Etter en slik at CSF tracer sirkulasjon, euthanized dyr. Hjernen er omhyggelig dissekert og fast ved neddykkelse i 4% PFA o/n på 4 ° C. Makroskopisk dorsal visninger av hjernen høstet fra CM-injisert gnagere vises fordelingen av CSF tracers i subarachnoid cisterner av lillehjernen, olfactory pære og paravascular plass langs midten cerebral arteriene (MCAs) (figur 1F ). I ventrale delen av hjernen vises makroskopisk visninger CSF tracer distribusjon langs sirkel av Willis (figur 1G). Histologiske deler av CM-injisert hjerner videre avsløre paravascular distribusjon av tracers i hjernen parenchyma. Mus injisert under narkose (figur 1 H) (eller under naturlig søvn, se1) viser en bemerkelsesverdig økning i tracer distribusjon i hjernen parenchyma i forhold til mus injisert mens våken og fritt bevegelige inne deres hjem bur (figur 1I).
Figur 1: injeksjon av tracers i cisterna magna. (A) skjematisk oversikt over mus hodet og hjernen viser plasseringen av cisterna magna (CM) i forhold til hjernen og kraniale strukturer. (B) Photomicrograph utsatt cm etter rundt hals Musklene er rett ut dissekert og presset til sidene. (C) høyere forstørrelse av området i B (svart rektangel), viser invertert trekantet strukturen i CM (stiplet linje) og plasseringen i forhold til de omkringliggende strukturer, dvs occipital kam, lillehjernen og forlengede. (D) Photomicrography av kanyle inn cm (E) ordningen av lateral visningen av musen fast hodet, litt skrå i en vinkel på 120 ° i forhold til kroppen. Innfelt stiplet rektangel avgrenses området viser oppsettet av en parasagittal visning av en parasagittal visning av musen hjernen kanyle inn CM, som beskrevet i E. En sprøyte, som er koblet til en injeksjon pumpe, brukes til å levere CSF tracers eller kontrast agenter i CM gjennom et rør koblet til en fin 30G nål. Representant bilder av hele musen hjernen 30 minutter etter CM injeksjon med et fluorescerende tracer sett fra dorsal (F) og ventrale (G) aspekter. (H, I,) Representant koronale hjernen deler counterstained med DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole, 1 µg/mL i PBS) mus injisert med CSF tracers i CM under bedøvet (H) og bevissthet (I), 30 min etter CM injeksjon med en hastighet på 1 µL/min av en 5 µL volumet av en blanding av ovalbumin-AF647 konjugert (OA, 45kDa, 2% i aCSF) og dekstran-FITC konjugert (DEX, 3kDa, 2% i aCSF). Skala barer, 5 mm B, C, F, G; 2 mm for D og 500 µm for H, I. Cb, lillehjernen; CM, cisterna magna; Ctx, bark; og OB, olfactory pære. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har presentert en protokoll som beskriver en detaljert fremgangsmåte for cisterna magna cannulation (CMc), som tilbyr en enkel metode for å levere merket molekyler CSF rommet. CMc kan den påfølgende visualiseringen av CSF dynamikk, både i vivo og ex vivo, bruker ulike modaliteter for imaging eller histology.
En av de viktigste fordelene med CMc teknikken ligger i den direkte tilgangen til subarachnoid rommet uten å utsette hjernen av craniotomy. Som ikke krever skallen vinduet eller gjennomtrengning av hjernen parenchyma med en pinne-spissen, tillater CMc levering av molekyler til CSF rommet og vurdering av glymphatic systemet av en minimal invasiv prosedyre, med bare korte forstyrrelse av intrakranielt trykk (ICP).
Spesielt injeksjon i CM er nedstrøms hovedkilde til CSF, den choroid plexi i ventrikkel systemet (lateral, tredje og fjerde ventriklene). Fra laterale ventriklene, CSF flyter tredje ventrikkel via de intraventricular foramina (foramen av Monro) og tredje til fjerde ventriklene via hjernens akvedukt (akvedukten av Sylvius) til hjernestammen og ryggmarg (omtalt i3 ). CSF når subarachnoid space via CM av strømmer gjennom median blenderåpning (eller foramen av Magendie), og dermed CMc injeksjoner omkjøringsvei hele ventrikkel systemet. Men mens dette kan være problematisk i enkelte modeller av CSF/ISF dynamics gjennom ventriklene, krever direkte injeksjon av tracers i ventriklene invasiv kirurgiske prosedyrer som boring av burr hull i vinduene skallen, og anvendelse av ventrikkel injeksjoner forstyrre betydelig ICP13. Likeledes, press injeksjon av tracers i subarachnoid rommet13,14 i våre hender opphever fluks av CSF tracers langs paravascular plassen. I kontrast, selv om CMc innebærer punktering av dural membranen, ICP er bare transiently plaget og er raskt restaurert2.
Bruker CMc, kan glymphatic aktivitet måles i bedøvet dyrene etter akutt CMc og våken dyr, observere en 24-timers restitusjonsperiode på kanyle implantasjon. Akutt CMc er egnet for kombinasjon med 2-fotonet bildebehandling, som inneholder detaljert informasjon om glymphatic aktivitet i cortex til en dybde på ca 200 µm1,2. Viktigere, gir akutt CMc også fordelen av støtte objektiv MRI studier, der tracer distribusjon etterfølges dynamisk i forhold til en enkelt grunnlinje bilde anskaffet før oppstart av CSF tracer injeksjon15, 16 , 17. for Mr, dental nålen brukes til CMc bør erstattes av en borosilicate kapillær (ca 1 cm lengde, tuppens diameter på ca 20 µm) knyttet til PE slangen.
I motsetning til akutt cannulation lar kronisk CMc eksperimentator å utføre CSF tracer injeksjon i dyr under naturlig søvn eller under narkose, samt i våken, fritt flytte dyr. Dette er en avgjørende faktor siden glymphatic aktivitet er svært state-avhengige; Tracer tilstrømningen til parenchyma er mye større i dyr som ble injisert under narkose eller sover enn i dyr som ble injisert i våken tilstand1. Dyr med en kronisk implantert kanyle kan i tillegg motta CSF tracer i deres hjem bur, således minimere forvirrende faktorer på grunn av effektene av stress og opphisselse glymphatic aktivitet. For kronisk injeksjoner under narkose, en blanding av ketamin/xylazine (100 mg/kg, 10 mg/kg, henholdsvis) anbefales. Isoflurane på konsentrasjoner over 1,5% induserer hjernen hevelse og forbedre ikke glymphatic aktivitet i forhold til våken tilstand1. Merk at etter CMc implantasjon, dyr skal være enkelt ligger, for å sikre at CMc implantert dyr ikke vil skade kanyle av hverandre. Også siden CMc kronisk implantation er en gjenoppretting kirurgisk prosedyre, det skal utføres under sterile forhold og dyr skal motta post-operational smertestillende.
Viktigere, kan CMc brukes som en metode for å levere CSF tracers mus og rotter, med minimal modifikasjoner til protokollen. Det maksimale volumet av CSF tracer som injiseres i rotter er 30 µL, på grunn av forskjeller i størrelsen på ventrikkel og subarachnoid mellomrom mellom de to artene riktig bedøvelse dose skal administreres.
Til tross for sin fremgangsmåter for enkelhet er noen opplæring og praksis nødvendig for eksperimentator å utføre CMc. Siden CM varierer i størrelse arter og enkelte dyr, er det tilrådelig å praktisere anerkjennelse av strukturen. Praktisere prosedyren med blå Evans (2% i aCSF), lar eksperimentator å bekrefte riktig nåleinnføring. Noen ganger vil et fartøy bli plassert direkte på midtlinjen i CM, hvorpå nålen skal settes ved siden av fartøyet, men så nær som mulig til midtlinjen. Disse tilfellene bør bemerkes senere bekreftelse at tracers fordeles jevnt, til tross for midtstilt plasseringen til pinne-spissen. Viktigere, atlanto-tilpassing membranen dekker CM er mekanisk tøff, og tilstrekkelig bør brukes for å sette inn skrå pinne-spissen. Imidlertid er det avgjørende at trykket brukes ikke resulterer i stuper pinne-spissen i medulla eller lillehjernen. For å lette nåleinnføring i CM, bør leder av dyr være skrå nedover i en vinkel på 120° i forhold til kroppen, som strekker seg membranen. Viktigere, bør være forsiktig ikke for å hindre åndedrett av dette hodet strekking. Hvis pinne-spissen bør angi lillehjernen, tracers beholdes i vevet og mislykkes å distribuere hele subarachnoid rommet. Skade medulla er ofte dødelig, mens lillehjernen skade i kronisk cannulations kan resultere i sammenbrudd og generell unormalt i oppførselen til dyrene. For å minimere risikoen for denne eventualitet, kan nåler med mindre skråkant lengde brukes.
Når du flytter musklene i nakken regionen som dekker dura membranen sette kanyle inn i CM, kan blødning oppstå. Bomull vattpinner kan brukes til å absorbere blødningen, men eventuelt ferric chloride løsning kan brukes. Ferric chloride har en hemostatic effekt18, og utløser også stivne av nakkemusklene rundt såret området, dermed bidra til å få riktig innsetting av nålen cm Ferric chloride også tørker ut skallen og dural membran, presenterer bedre overflater for vedheft av kanyle. CMc, gjelde 1-2 dråper ferric chloride løsning (10%) (ca 1 mL) i en bomull vattpinnen og dab nakkemusklene og occipital toppen. Imidlertid kan aktuell ferric chloride muligens sive gjennom membranen i CSF, med ukjente effekter på hjernen homeostase. Hvis bruk av ferric chloride til bekymring, kan man i stedet bruke sår retractors for å holde åpne webområdet snitt. Forsiktig fjerning av sår retractors etter at cyanoacrylate lim unngår utilsiktet vedlegg til webområdet snitt.
CMc er en grei og reproduserbar prosedyre å levere molekyler direkte inn CSF batterirommet. Siden CMc er minimal invasiv, det er den foretrukne metoden for visualisering av glymphatic systemet og kan kombineres med ulike tenkelig modaliteter som epifluorescence og 2-fotonet mikroskopi eller MRI. Dermed representerer CMc et flott verktøy for studier av fluiddynamikk, nemlig CSF og ISF, samt hjernen væske klaring. Grunnet makroskopisk dekning av glymphatic har CMc potensial til å brukes til å levere molekyler hjernen hele.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Novo Nordisk Foundation og National Institute av nevrologiske lidelser og slag, NINDS/NIH (M.N.). A.L.R.X. og S.H-R er mottakere av doc. og PhD stipend fra Lundbeck Foundation, henholdsvis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SOPIRA Carpule 30G 0.3 x 12mm | Kulzer | AA001 | |
| Polyethylene Tubing 0.024” OD x 0.011” ID | Scandidact | PE10-CL-500 | |
| 30G x ½” 0.3 x 12 mm Luer-Lock | Chirana T. Injecta | CHINS01 | |
| Chlorhexidine 0.5% (chlorhexidine digluconate) | Meda AS | no catalogue number, see link in comments | http://www.meda.dk/behandlingsomrader/desinfektion/desinfektion-af-hud/klorhexidin-sprit-medic-05/ |
| Alcohol Swab 70% Isopropyl Alcohol 30 x 60mm | Vitrex Medical A/S | 520213 | |
| Viskoese Oejendraeber Ophtha | Ophtha | 145250 | |
| Wooden applicator, Double cotton bud (Ø appr. 4 - 5 mm, length appr. 12 mm) | Heinz Herenz | 1032018 | |
| Eye spears | Medicom | A18005 | |
| Ferric chloride 10% solution | Algeos | NV0382 | |
| Kimtech Science Precision Wipes Tissue Wipers | Kimberly Clark Professional | 05511 | |
| Loctite Super Glue Precision 5g | Loctite | no catalogue number, see link in comments | http://www.loctite-consumer.dk/da/produkter/superglue-liquid.html |
| Insta-Set CA Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-152 | |
| Dental Cement Powder | A-M Systems | 525000 | |
| Surgical weld | Kent Scientific Corporation | INS750391 | |
| Hamilton syringe GASTIGHT® , 1700 series, 1710TLL, volume 100 μL, PTFE Luer lock | Hamilton syringes | 1710TLL | |
| LEGATO 130 Syringe pump | KD Scientific | 788130 | |
| Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS; 0.01M; pH 7.4) | Sigma Aldrich | P3813 | |
| Ovalbumin, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | O34784 | |
DAPI (diamidino-2-phenylindole) Solution (1 mg/mL) |
Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Dextran, Fluorescein, 3000 MW, Anionic | Thermo Fisher Scientific | D3305 | |
| E-Z Anesthesia EZ-7000 Classic System | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Attane Isofluran 1000 mg/g | ScanVet | 55226 | |
| Euthanimal 200mg/mL (sodium pentobarbital) | ScanVet | 545349 | |
| Ketaminol Vet 100 mg/mL (ketamine) | Intervet International BV | 511519 | |
| Rompin Vet 20 mg/mL (xylazin) | KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH | 148999 | |
| Xylocain 20 mg/mL (lidocain) | AstraZeneca | 158543 | |
| Marcain 2.5 mg/mL (bupivacain) | AstraZeneca | 123918 | |
| Bupaq Vet 0.3 mg/mL (buprenorphine) | Richter Pharma AG | 185159 |
References
- Xie, L., et al. Sleep Drives Metabolite Clearance from the Adult Brain. Science. , 373-377 (2013).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid β. Sci. Transl. Med. 4, 147ra111 (2012).
- Jessen, N. A., Munk, A. S. F., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner's Guide. Neurochem. Res. 40, 2583-2599 (2015).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. , (2015).
- Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. J. Exp. Med. 212, 991-999 (2015).
- Kress, B. T., et al. Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain. Ann. Neurol. 76, 845-861 (2014).
- Plog, B. A., et al. Biomarkers of Traumatic Injury Are Transported from Brain to Blood via the Glymphatic System. J. Neurosci. 35, 518-526 (2015).
- Jiang, Q., et al. Impairment of glymphatic system after diabetes. J. Cereb. Blood Flow Metab. , Under Revi (2016).
- Peng, W., et al. Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiol. Dis. 93, 215-225 (2016).
- Orešković, D., Klarica, M. The formation of cerebrospinal fluid: Nearly a hundred years of interpretations and misinterpretations. Brain Res. Rev. 64, 241-262 (2010).
- Dusart, I., Schwab, M. E. Secondary Cell Death and the Inflammatory Reaction After Dorsal Hemisection of the Rat Spinal Cord. Eur. J. Neurosci. 6, 712-724 (1994).
- Eide, K., Eidsvaag, V. A., Nagelhus, E. A., Hansson, H. -A. Cortical astrogliosis and increased perivascular aquaporin-4 in idiopathic intracranial hypertension. Brain Res. , (2016).
- Pullen, R. G., DePasquale, M., Cserr, H. F. Bulk flow of cerebrospinal fluid into brain in response to acute hyperosmolality. Am. J. Physiol. 253, F538-F545 (1987).
- Ichimura, T., Fraser, P. A., Cserr, H. F. Distribution of extracellular tracers in perivascular spaces of the rat brain. Brain Res. 545, 103-113 (1991).
- Iliff, J. J., et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. J. Clin. Invest. 123, 1299-1309 (2013).
- Ratner, V., et al. Optimal-mass-transfer-based estimation of glymphatic transport in living brain. Proc. SPIE--the Int. Soc. Opt. Eng. 9413, (2015).
- Lee, H., et al. The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport. J. Neurosci. 35, 11034-11044 (2015).
- Nouri, S., Sharif, M. R., Sahba, S. The effect of ferric chloride on superficial bleeding. Trauma Mon. 20, e18042 (2015).
