Summary
Este protocolo describe un método sencillo y conveniente para marcar y visualizar energizados cromosomas en las células mitotic usando la etiqueta Histone2B-GFP BacMam 2.0 y un sistema de microscopia confocal spinning disc.
Abstract
Los cromosomas deben ser fiable y uniforme separados en células de la hija durante la división celular mitótica. Fidelidad de la segregación cromosómica es controlado por múltiples mecanismos que incluyen el eje montaje puesto de control (SAC). El saco es parte de un sistema complejo que es responsable para la prevención de un progreso de la célula por mitosis salvo los cinetocoros cromosómicos se han unido para huso de microtúbulos. Cromosomas anormales y retraso cromosómico segregación es un indicador de puntos de control de ciclo celular disfuncional y pueden utilizarse para medir la estabilidad genómica de dividir las células. Desregulación del saco puede resultar en la transformación de una célula normal en una célula maligna a través de la acumulación de errores en la segregación cromosómica. Implementación del saco y la formación de los cinetocoros complejo están estrictamente regulados por interacciones entre quinasas y fosfatasas como proteína fosfatasa 2A (PP2A). Este protocolo describe la proyección de imagen de células vivas de los cromosomas en fibroblastos embrionarios de ratón aislados de ratones que tenían un nocaut de la subunidad reguladora de la PP2A-B56γ del revestimiento. Este método supera las deficiencias de otros ciclo celular control técnicas de imagen como la citometría de flujo o inmunocitoquímica que sólo proporcionan una instantánea de un estado de citocinesis de la célula, en lugar de una visualización dinámica espaciotemporal de los cromosomas durante la mitosis.
Introduction
En el siguiente protocolo, describimos un método conveniente para visualizar la segregación cromosómica y la progresión mitótica durante el ciclo celular en fibroblastos embrionarios de ratón usando histona 2B-GFP, etiquetado BacMam 2.0 y proyección de imagen de células vivas.
Puestos de control de ciclo celular monitor segregación cromosómica y juegan un papel importante en el mantenimiento de la integridad genética de la célula 1,2,3. Acumulación de los cromosomas segregados mal puede llevar a aneuploidía, que es una característica de los tumores sólidos más 4. Por lo tanto, la detección de los cromosomas del revestimiento puede utilizarse como un método para el estudio de inestabilidad cromosómica.
Etiquetado fluorescente proteínas pueden ser utilizado para visualizar segregación cromosómica vivo y cromosomas rezagados pero la generación de etiquetas mCherry o proteína H2B-GFP etiquetado requiere conocimiento substancial del gene entrega y biología molecular 5. Aquí describimos el uso del reactivo de CellLight Histone2B-GFP BacMam 2.0, regente de CL-HB, por simplicidad en lo sucesivo. Este reactivo puede utilizarse inmediatamente y elimina así las preocupaciones sobre la integridad y calidad de vector. Además, este reactivo no requiere el uso de tratamientos potencialmente dañinos o lípidos y productos químicos del colorante de carga. A diferencia de las etiquetas fluorescentes convencionales, el regente de la CL-HB manchas independientemente de la función (es decir., potencial de membrana). El regente CL-HB puede ser simplemente añadido a las células y se incubó toda la noche para la expresión de la proteína. El regente de la CL-HB no se replica en células de mamíferos y puede ser utilizado en la configuración de nivel de bioseguridad (BSL) 1 laboratorio. También, se puede detectar esta transfección transitoria después de la incubación durante la noche durante 5 días, tiempo suficiente para llevar a cabo análisis celulares más dinámico.
Por otra parte, anomalías cromosómicas podrían ser estudiados por varias técnicas como la citometría de flujo, inmunohistoquímica o fluorescencia in situ hibridación (pescado) 6. Citometría de flujo puede utilizarse para el estudio de la aneuploidía, que puede ser medido basado en contenido de ADN y la fase de células en ciclo celular. Aunque citometría de flujo puede utilizarse para medir aneuploidía, no proporciona información sobre segregación de errores cromosómica. PESCADO con técnicas de inmunohistoquímica utilizan sondas fluorescentes para obligar a ADN o los cromosomas. Mientras que estas técnicas proporcionan una instantánea de la situación de una población de células, no permiten el vivo de la célula de tal modo que falta cualquier información obtenida a través de la visualización espaciotemporal de citocinesis en células específicas durante un período de tiempo.
Este protocolo fue utilizado para estudiar los cromosomas de revestimiento o segregación errónea cromosómica en fibroblastos embrionarios de nocodazole tratado ratón (MEFs) aislado de PP2A-B56γ-ratones. Además de la anterior aplicación, este protocolo proporciona una herramienta sencilla para marcar y visualizar la segregación cromosómica en diversos tipos celulares que pueden utilizarse para estudiar la regulación del ciclo celular o inestabilidad cromosómica en las células del tumor. Además, también puede utilizado para el estudio de inestabilidad cromosómica causada por varios tratamientos con fármacos o para estudiar los efectos del gen golpee hacia fuera dando por resultado la segregación cromosómica de mal.
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Protocol
Todos los experimentos llevados a cabo en estos estudios fueron realizados según protocolos de actuación aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso en el centro de investigación de alimentos y drogas (FDA).
1. aislamiento y cultivo de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs)
- Aislar los fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) de una cepa de PP2A-B56γ-ratón y hermanos de camada de tipo salvaje por protocolo estándar 7,8,9.
- ExpandMEFs para 3 pasajes, congelar y almacenar hasta que se necesite para experimentos 8.
2. cultivo de Mefs en pozo 2 cámaras del vidrio para vivir imágenes
- Preparar 500 mL de medio de crecimiento de MEF con medio de Eagle modificado Dulbecco (DMEM/F12) con 10% suero bovino Fetal (FBS), antibióticos de penicilina/estreptomicina X 1, L-glutamina (200 mM) y 1 X aminoácidos no esenciales (AANE) en una botella de 500 mL de media.
- Descongelar los frascos de MEFs congelados de tipo salvaje y PP2A-B56γ-ratones en el paso 3 en el baño de agua precalentada a 37 ° C.
- Transferencia de MEFs descongeladas para tubos de 15 mL y añada lentamente gota a gota 20 mL de medio DMEM/F12 en los tubos de 15 mL con una pipeta de 10 mL.
- Transferencia de MEFs junto con 20 mL de DMEM/F12 medios de cultivo en matraces T75 y expandirlos hasta que las células son confluentes de 70%. Confluencia se estima usando un microscopio inverso a x 4 o 10 aumentos.
- Aspirar el medio de cultivo utilizando un Potrero de vidrio pipeta conectada a un sistema de vacío en la campana, añadir 3 mL de 0.25% tripsina/EDTA e incubar a 37 ° C por 5 minutos agregar 3 mL de medio de cultivo DMEM/F12 para detener la reacción.
- Centrifugar las células a baja velocidad (300 x g) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Cuidadosamente Quite el sobrenadante y Resuspenda el precipitado de células en 1 mL de medio de cultivo DMEM/F12 calentado previamente a 37 ° C en un baño de agua.
- Enumerar las células mediante el método de exclusión azul de tripano u otro celular apropiado contar método 8.
- Aproximadamente 20.000 MEFs/pozo en un pozo de 2 cámara cristal de la semilla. Añadir 200 μL/pocillo de medio de cultivo DMEM/F12 y dejar las células a conectarles incubando toda la noche a 37 ° C y 5% CO2.
3. sincronización
- Sincronizar MEFs en fase G0/G1 por incubando las células en medios de cultivo DMEM/F12 que contiene 0.1% FBS durante 24 h, para obtener un número máximo de células en fase G0/G1.
Nota: Aunque hambre de suero se utilizó como método de preferencia, varios otros métodos pueden utilizarse dependiendo de la etapa mitótica en la que las células se necesitan para ser arrestado 10.
4. etiquetado
- Prepare solución de nocodazole en DMSO con 1,5 mg/mL. Nocodazole detiene las células en fase G2/M mediante la inhibición de la formación de microtúbulos 10.
- Tres días post sincronización, añadir 200 μL de medio de cultivo (con 10% FCS) y 200 ng/mL nocodazole regente CL-HB (histona 2B-GFP BacMam 2.0).
- Calcular al regente CL-HB partículas por célula (PPC) que se añade a las células como sigue:
Donde el número de células es el número total estimado de células en el momento del etiquetado, PPC es el número de partículas por célula, y 1 × 108 es el número de partículas por mL de reactivo. Por ejemplo, a las células de etiqueta 20.000 con un PPC de 30
Nota: Regente de CL-HB funciona con más tipos de células entre 10 y 50 de la PPC. Sin embargo, PPC 30 trabajado mejor para este estudio. - Incubar MEFs durante 18 h a 37 ° C y 5% CO2.
Nota: Para el experimento actual, visualización de los cromosomas en las células mitotic escapar el puesto de control de ensamblaje del huso produjo 18 h después de la detención del ciclo celular con nocodazole.
5. visualización de los cromosomas del revestimiento
- Visualizar los fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) utilizando un sistema de microscopio confocal spinning disco equipado con una cámara y una inmersión de aceite, 63 x objetivo.
- Uso de longitud de onda de excitación de 488 nm y longitud de onda 450 nm de emisión para la adquisición de imagen de canal GFP.
- Usar un sistema de microscopio confocal de disco giratorio con la capacidad de etapas exploración motorizadas, Z Piezo insertos, incubación de etapa superior y recuperación de fluorescencia directa tras foto blanqueo para esta técnica.
- Un día antes de la proyección de imagen, encienda la cámara y calentar toda la cámara a 37 ° C durante la noche.
- Encienda el microscopio, cámara, unidad de disco de hilatura, iluminador, láser de argón, computadora y etapa motorizada.
- Deje que el sistema caliente durante 3 minutos; activar el láser de argón girando en llave de encendido. El interruptor de palanca para el laser de argón de "standby" a "funcionamiento del laser".
- Inicie el software de adquisición y procesamiento de datos.
- Iniciar el controlador de CO2 para la incubadora de etapa superior y establecer la concentración de CO2 al 5%. Esto debe hacerse antes del comienzo de la proyección de imagen.
- Quitar el vidrio de cubierta de cámara de la incubadora y el lugar en el escenario para la visualización. Visualizar las células por medio de un aceite inmersión 63 x objetivo (NA1.4).
- Ve a través de las lentes oculares, enfocar la imagen e identificar una célula en etapa de descomposición (NEBD) envoltura nuclear.
- Iniciar el láser apropiado (488 nm láser de argón para visualizar Histone2B-GFP).
- Abrir la ventana de control de adquisición y establecer el tiempo de exposición para el canal GFP. Identificar una célula que se encuentra en NEBD.
- Manualmente determinar la parte superior de la celda objetivo y plano focal inferior y entrar en el sección configuración óptico xyz.
- Observar durante 20 min; Si la célula no procede a través de la división celular, deje de adquisición de imágenes después de 20 minutos y pasar a la siguiente celda que se encuentra en NEBD.
- Aproximadamente 1 h por celda es necesario para los cromosomas de revestimiento de la imagen durante la mitosis en PP2A-B56γ-células que escaparon de la SAC. Para obtener datos de una película, tomar fotos cada 3 minutos.
Nota: las células de tipo salvaje arrestaron y no avanzar más allá de NEBD cuando se tratan con nocodazole. - Guardar imágenes en formato de archivo de zvi para su posterior análisis.
6. procesamiento y análisis de imágenes
Nota: Ejecutar el procesamiento de imagen tridimensional y análisis utilizando cualquier software disponible como Axiovision versión 4.8.2 o Imaris versión 8.2. Para este estudio el ImageJ se utilizó el software.
- Abra la secuencia de imágenes. Si las imágenes ya están en un formato apilado, proceder al siguiente paso. Si no, combinar todas las imágenes relevantes en un pila utilizando ' imagen > pilas > pila de imágenes ' en la barra de menús.
- Realizar cualquier ajuste necesario a brillo/contraste y niveles.
- Para agregar un sello de tiempo a la película:
- Vaya a ' imagen > pilas > etiqueta...' en la barra de menús.
- Seleccione el formato adecuado, el valor inicial de tiempo y el intervalo de tiempo entre cada imagen.
- Marque la casilla 'Vista previa' y ajustar la configuración de la ubicación y formato. Pulse 'Aceptar' para aplicar la marca de tiempo.
- Para agregar una barra de escala a la película:
- La imagen escala bajo ' Analyze > Set escala ' en la barra de menús.
- En el campo de la 'Distancia en píxeles', introduzca un número de píxeles que se conoce la distancia y en el campo de la 'Distancia de la conocida' ingrese la distancia. Establece la unidad correcta de la longitud de la distancia, por ejemplo, en μm. Pulse 'Aceptar' para aplicar la escala a la pila.
- Ir a ' Analyze > Herramientas > escala bar... ' para agregar la barra de escala. El tamaño de la barra como 'En μm de ancho' y ajuste el resto de opciones según sea el caso de formato. Marque la casilla 'Todos los sectores de la etiqueta' para agregar la barra de escala a toda la pila.
- Previsualizar la película haciendo clic en el botón play triangular en la parte inferior izquierda el borde de la ventana de imagen. Ajustar la tasa de marco con ' imagen > pilas > Animación > animación opciones en la barra de menús.
- Exportar el archivo de película seleccionando ' archivo > Guardar como > AVI...' y seleccione la velocidad de fotogramas y la compresión.
- Pulse 'Aceptar' para seleccionar el guardar ubicación y nombre de archivo. Pulse 'Guardar' para guardar el archivo de película.
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Representative Results
MEFs de tipo salvaje y PP2A-B56γ-ratones fueron sembradas en un vidrio de cubierta de la cámara 2-bien y permitidos para fijar. En el día 2, MEFs se sincronizaron con 0.1% FBS para 24 h. El día 3, MEFs en medios con 200 ng/mL nocodazole y 30 regentwere de PPC CL-HB se incubaron durante 18 h a 37° C y 5% CO2. El día 4, las células fueron fotografiadas utilizando un sistema de microscopio confocal de disco giratorio (figura 1). En vivo la proyección de imagen de la célula fue utilizada para visualizar el destino de las células individuales como progresaron de NEBD a través de la mitosis (figura 2). Nocodazole es conocido por la detención de las células de tipo salvaje en fase G2M interfiriendo con la formación de microtúbulos. Se observó nocodazole tratamiento salvaje tipo células fueron detenidas en el panel superior de la metafase (figura 2). Observamos que falta de PP2A-B56γ debilitado el control del ciclo celular, que permitió PP2A-B56γ-MEFs superar la detención del ciclo celular inducido por nocodazole 9. Además, la segregación cromosómica anormal fue detectada en el 62% (13 de 21) de mitotic PP2A-B56γ-MEFs tratados con nocodazole (mostrado por las flechas amarillas en el panel inferior en la figura 2). Cinco de las PP2A-B56γ-MEFs detenido en NEBD y 3 pasó por mitosis sin defectos observables. En cambio, todos 21 células de tipo salvaje que se reflejada no procedió a través de la mitosis y fueron encontradas para ser arrestado por metafase (panel superior figura 2).
Figura 1 . Diagrama de flujo básico para la proyección de imagen de células vivas. MEFs de tipo salvaje y PP2A-B56γ-ratones fueron sembradas en un vaso de tapa cámara 2-bien durante la noche. Día 2, las células fueron sincronizadas con 0.1% FBS para 24 h día 3, las células fueron tratadas con 200 nocodazole ng/mL en medios de cultivo y 30 PPC histona 2B-GFP, reactivo BacMam 2.0 para 18 h. día 4 las células fueron reflejadas mediante sistema de microscopio confocal de disco giratorio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Se detectan anomalías cromosómicas en PP2A-B56γ-MEFs. Tiempo lapso microscopia vivo imágenes captadas en diferentes puntos de tiempo en mitosis (0-51 min) tipo de salvaje nocodazole tratado y PP2A-B56γ-MEFs. Las células de tipo salvaje fueron encontradas para ser arrestado en metafase (panel superior), mientras que PP2A-B56γ-MEFs eran capaces de ir a través de mitosis (panel inferior). Retraso cromosómico o segregación errónea puede verse en PP2A-B56γ-MEFs se indica por flechas amarillas en la parte inferior. Barra de escala = 5 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Puestos de control del ciclo celular que garanticen la segregación cromosómica precisa evitar aneuploide y celular transformación 1,2,3. En el presente estudio, encontramos que la inactivación de PP2A-B56γ resultó en un puesto de control de montaje de husillo debilitado. Celular directo imágenes nos permitieron observar la segregación errores cromosómica durante la mitosis en la MEFs de PP2A-B56γ tratados con nocodazole 9.
Este protocolo utiliza la etiqueta Histone2B-GFP generada por la tecnología 2.0 BacMam a los cromosomas de la etiqueta para la proyección de imagen de células vivas. Uno de los pasos críticos en el etiquetado es calcular la cantidad de partículas por las células (PPC) para lograr suficiente etiquetado. Se comprobó a través de la valoración que PPC 10-50 funciona mejor. Este reactivo podría ser tóxico para las células; por lo tanto, es necesario valorar PPC utilizada para lograr el equilibrio entre el etiquetado y la toxicidad a las células marcadas. Además, esta es una transfección transitoria y puede detectarse sólo hasta 5 días, por lo tanto, no puede ser apropiado para los estudios que se requieren períodos más largos de observación.
Etiquetado tradicional de la proteína o ADN puede requerir complicados protocolos, pero aquí utilizamos un reactivo que requiere sólo una incubación durante la noche con las células deseadas. Además, en vivo la proyección de imagen de la célula se realizó mediante microscopia confocal disco de spinning que a diferencia de la microscopía de láser confocal es más rápido y reduce la fototoxicidad y blanqueo efectos en la vida de las células de 11. Este protocolo permite la fácil y conveniente método para etiquetar las células mitotic y visualizar la segregación cromosómica en comparación con las otras técnicas tales como pescados, inmunohistoquímica y citometría de flujo. Este protocolo también permite la captura de imágenes de los cromosomas durante mitosis proporcionando información adicional a la obtenida mediante citometría de inmunocitoquímica, peces o flujo tradicional, lo que permite capturar los fenotipos tales del revestimiento como revestimiento cromosoma en espacio y tiempo. Este protocolo permite conveniente, rápido y fácil de los cromosomas en gran variedad de líneas celulares, células primarias, células madre, neuronas e inmortalizado células T 12,13,14.
Varios tipos de productos de terapia celular se están desarrollando con las esperanzas para el tratamiento de enfermedades variadas condiciones 15. Uno de los desafíos que enfrentan en el desarrollo de estas terapias con células madre implica problemas de seguridad debido a la posibilidad de inestabilidad genética y tumorigenesis. Este protocolo describe un método fácil y práctico a los cromosomas de la etiqueta en variedad de tipos celulares. En el futuro podría ser empleado para el desarrollo de un ensayo para estudiar y medir la inestabilidad genética y calidad de los productos de terapia celular.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer al Dr. Guo-Chiuan Hung y Dr. Bharatkumar Joshi valiosos comentarios que mejoraron el manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320082 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| MEM Non-Essential amino acids solution (100X) | Gibco | 11140050 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered saline | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMSO | EMD Millipore | MX 1458-6 | |
| Cryogenic vial storage boxes | Fisherbrand | 10-500-28 | |
| Cryogenic vials | Corning/costar | 431416 | |
| T75 flasks | Cellstar | 658175 | |
| 2 well chambered cover glass | Nunc | 155380PK | |
| Cellometer Vision Cell Profiler | Nexcelom Bioscience LLC | Cellometer Vision Trio | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| CellLight Histone 2B-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher Scientific Inc. | C10594 | |
| Zeiss Cell Observer Spinning Disk Confocal Microscope system | Carl Zeiss Microscopy | Zeiss Cell Observer SD | |
| Water Bath | Thermoscientific | 280 series | |
| Incubator | Sanyo commercial solutions | MCO-18AIC (UV) | |
| Class II Biological safety cabinet | The Baker Company | SterilGard | |
| Axiovision software | Zeiss | Ver.4.8.2 | |
| ImageJ software | National Institute of Health | Ver. 1.51r |
References
- Funk, L. C., Zasadil, L. M., Weaver, B. A. Living in CIN: Mitotic Infidelity and Its Consequences for Tumor Promotion and Suppression. Dev Cell. 39, 638-652 (2016).
- Etemad, B., Kops, G. J. Attachment issues: kinetochore transformations and spindle checkpoint silencing. Curr Opin Cell Biol. 39, 101-108 (2016).
- Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S.
- Jallepalli, P. V., Lengauer, C. Chromosome segregation and cancer: cutting through the mystery. Nat Rev Cancer. (2), 109-117 (2001).
- Zhu, L., et al. Mitotic protein CSPP1 interacts with CENP-H protein to coordinate accurate chromosome oscillation in mitosis. J Biol Chem. 290 (45), 27053-27066 (2015).
- Pikor, L., Thu, K., Vucic, E., Lam, W. The detection and implication of genome instability in cancer. Cancer Metastasis Rev. 32 (3-4), 341-352 (2013).
- Varadkar, P., Despres, D., Kraman, M., Lozier, J., Phadke, A., Nagaraju, K., McCright, B. The protein phosphatase 2A B56γ regulatory subunit is required for heart development. Dev Dyn. 243 (6), 778-790 (2014).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (64), e3854 (2012).
- Varadkar, P., Abbasi, F., Takeda, K., Dyson, J. J., McCright, B. PP2A-B56γ is required for an efficient spindle assembly checkpoint. Cell Cycle. 18 (12), 1210-1219 (2017).
- Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nat Protoc. 8 (3), 602-626 (2013).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. J Biomol Tech. 26 (2), 54-65 (2015).
- Versaevel, M., Braquenier, J. B., Riaz, M., Grevesse, T., Lantoine, J., Gabriele, S. Super-resolution microscopy reveals LINC complex recruitment at nuclear indentation sites. Sci Rep. 8 (4), 7362 (2014).
- Wild, T., Larsen, M. S., Narita, T., Schou, J., Nilsson, J., Choudhary, C. The Spindle Assembly Checkpoint Is Not Essential for Viability of Human Cells with Genetically Lowered APC/C Activity. Cell Rep. 1 (8), 1829-1840 (2016).
- Iuso, D., et al. Exogenous Expression of Human Protamine 1 (hPrm1) Remodels Fibroblast Nuclei into Spermatid-like Structures. Cell Rep. 1 (9), 1765-1771 (2015).
- Ratcliffe, E., Glen, K. E., Naing, M. W., Williams, D. J. Current status and perspectives on stem cell-based therapies undergoing clinical trials for regenerative medicine: case studies. Br Med Bull. 108, 73-94 (2013).
