Summary
Målet med denne protokol er at kvantificere reparation af definerede DNA-protein krydsbindinger på plasmid DNA. Lesioned plasmider er transfekteret ind i modtagerens pattedyr cellelinjer og lav-Molekylær vægt høstet på flere gang point efter Transfektion. DNA reparation kinetik er kvantificeret benytter strand-specifikke primer forlængelse efterfulgt af qPCR.
Abstract
Formålet med denne metode er at levere en fleksibel, hurtig og kvantitativ teknik til at undersøge kinetik af DNA-protein bitmapgenkendelse (DPC) reparation i pattedyr cellelinjer. I stedet for globalt boltpistoler fjernelse af xenobiotiske-induceret eller spontan kromosomale DPC fjernelse, undersøger dette assay reparation af en homogen, kemisk definerede læsion specifikt indført på et websted inden for en plasmid DNA substrat. Vigtigst, denne tilgang undgår brug af radioaktivt materiale og er ikke afhængig af dyre eller højt specialiseret teknologi. I stedet, det er baseret på standard rekombinant DNA procedurer og bredt tilgængelige real-time, kvantitative polymerase kæde reaktion (qPCR) instrumentation. I betragtning af den iboende fleksibilitet i strategien udnyttet, størrelsen af crosslinked protein og arten af den kemiske kobling og præcis DNA kan sekvens rammerne af webstedet udlæg varieres for at løse de respektive bidrag af disse parametre til den samlede effektivitet af DPC reparation. Brug denne metode, plasmider, der indeholder en lokationsspecifik DPC blev transfekteret i celler og lavmolekylære DNA inddrives på forskellige tidspunkter efter Transfektion. Gendannede DNA er derefter udsat for strand-specifikke primer forlængelse (SSPE) ved hjælp af et supplement til den beskadigede del af plasmidet primer. Siden DPC læsion blokke Taq DNA polymerase, kan forholdet mellem repareret til un-reparerede DNA kvantitativt vurderes ved hjælp af qPCR. Cyklus tærskelværdier (CT) bruges til at beregne procent reparation på forskellige tidspunkter i de respektive cellelinjer. Denne SSPE-qPCR metode kan også bruges til at vurdere kvantitativt reparation kinetik af enhver DNA addukt at blokke Taq-polymerase.
Introduction
Beskrevet heri er en PCR-baseret analyse betegnes SSPE-qPCR. Formålet med denne metode er at kvantificere DPC reparation på plasmid DNA transfekteret til reparation mangelfuld og dygtige pattedyrsceller. Denne analyse er hurtige, kvantitative, yderst fleksible og direkte foranstaltninger reparation aktivitet. Mens denne betænkning fokuserer på brug af denne metode til at studere reparation af DPC'er, illustrerer resultaterne præsenteres nedenfor at reparation af enhver læsion som blokerer Taq-polymerase kan studeres ved hjælp af denne metode.
Rationalet bag udviklingen af denne metode er at få indsigt i de mekanismer, hvorigennem pattedyrceller reparere DPC'er. I modsætning til andre typer af DNA-skader er DPC'er massivt forskelligartede1,2. Undersøgelser har vist, at hundredvis af cellulære proteiner kan blive crosslinked DNA og der for hvert protein der er i princippet, talrige aminosyre sidekæder, der kunne blive kovalent tilknyttet cellulære DNA3. Derudover er der mange kemiske fastgøringspunkter til proteiner på DNA-backbone, herunder flere positioner på nukleotid baser samt ribose sukker4,5. Denne kemiske mangfoldighed rejser den udsigten til, at forskellige biokemiske veje kan påberåbes til at reparere forskellige typer af DPC'er. Det var med denne bekymring i tankerne at SSPE-qPCR analysen blev udviklet.
Flere teknikker er blevet udviklet for at få indsigt i Molekylærbiologi af cellulære DPC reparation. Følgende giver et overblik over de store tilgange, der er blevet udviklet, med et resumé af store styrker og svagheder hver besidder. Det er værd at understrege, at mens dette resumé fokuserer på studier af DPC reparation i pattedyr celle kultur systemer, betydelige bidrag til den nuværende model af DPC reparation er foretaget ved hjælp af mikrobielle og celle-fri systemer, der ikke er drøftet i denne Håndskriftet.
Måske er den nemmeste strategi, der kan træffes for at få indsigt i genetik af DPC reparation at vurdere de respektive følsomhed til celledød observeret i wild-type og muterede celler udsat for stoffer, der inducerer DPC'er6,7. Denne strategi er relativt hurtigt, billigt, og kræver ikke specialiseret ekspertise ud over evnen til at udføre grundlæggende celle kultur teknikker. Modvægt disse fordele er talrige begrænsninger for denne tilgang, herunder følgende. For det første måler analysen ikke direkte DNA reparation. Den arbejdshypotese, ligger til grund for denne strategi er at inaktivere mutationer i gener kodning relevante DNA reparation proteiner resulterer i en ophobning af DNA skade at udløsere programmeret celledød. Men mutationer i gener kodning ikke-DNA-reparation proteiner kunne, hovedstol, forbedre (eller reducere) cellulære følsomhed til xenobiotiske-induceret celledød. Andet, agenter, der skaber DPC'er uvægerligt fremkalde andre former for DNA-skader (en undtagelse er 5-aza-2'-deoxycytadine, men denne agent også udtømmer cellulære methyltransferase niveauer8). Det er derfor tænkeligt, at forbedrede cellulære overfølsomhed overfor den pågældende agent kan afspejle defekter i reparation af interstrand krydsbindinger eller andre læsioner. Tredje, som blev nævnt ovenfor, DPC'er repræsenterer en stærkt heterogen klasse består af forskellige typer af kemiske krydsbindinger, der involverer forskellige protein partnere. Det er muligt, at mens reparation af en eller flere undertyper af disse læsioner kan ændres i en særlige genetiske baggrund, denne forskel ikke kan være tilstrækkeligt markant ændre cellulære overfølsomhed over for døden induceret af denne agent. I Resumé, mens denne strategi udgør et attraktivt udgangspunkt, fremhæver de begrænsninger, der er skitseret ovenfor betydningen af at forfølge andre, mere direkte metoder til at studere kinetik af DPC reparation.
En række relaterede tilgange er blevet udviklet for at nå dette mål. For eksempel, har efterforskere udviklet metoder til at skelne mellem 'gratis' DNA og protein bundet DNA9,10,11. Med disse tilgange, er det muligt at sammenligne steady state niveauer af DPC'er eller efter eksponering for en DPC-producerende agent i forskellige genetiske baggrunde. De to strategier, der har været mest udbredt inddrage adskille DPC-holdige DNA fra gratis DNA ved hjælp af enten en nitrocellulose membran bindende strategi eller KCl/SDS nedbør12,13. I den tidligere tilgang er celler mængden og passeret gennem en nitrocellulose filter. Fordi nitrocellulose binder protein, bevarer filteret protein-linked DNA, tillader gratis DNA at passere igennem. I den sidstnævnte strategi er protein-bundne DNA adskilt fra gratis DNA faktum, at SDS binder sig til protein, men ikke DNA, og kan blive fremskyndet ved tilsætning af KCl. Derfor, protein-linked DNA bliver uopløselig mens ubundne DNA forbliver i opløsning. DPC-holdige DNA kan derefter være quantitated ved hjælp af radiolabeled thymidine (hvis celler var oprindeligt metabolisk mærket) eller ved en DNA-selektiv fluorescerende farvestof som Hoechst 33258. Disse metoder er reproducerbare og kræver et lille antal trin. De giver imidlertid ikke oplysninger om arten af de kemiske bitmapgenkendelse hvorigennem protein er knyttet til DNA. Derudover er det vigtigt at bemærke, disse assays kan overvurdere DPC reparation af falsk scoring inkomplet reparation, dvs, proteolytiske forarbejdning til mindre DNA-peptid krydsbindinger, der ikke måske være så let fanget eller udfældet som bona fide DNA reparation.
Komet assays kan bruges til at visualisere DPC dannelse i celler14. I disse eksperimenter, tilstedeværelsen af DPC'er formindske DNA migration, som derefter kan vendes ved forbehandling med proteinase K. Længden af halen kan derfor bruges til at anslå DPC dannelse. Men som nævnt ovenfor, DPC-dannende stoffer oprette andre typer af DNA-skader, som kunne ændre hale længde. Denne protokol er også meget tekniske og kræver ekspertise og uddannelse i Konfokal billedbehandling.
Massespektrometri kan bruges til at studere DPC reparation kinetik efter behandling med crosslinking agenter15,16,17. Disse eksperimenter behandle celler med DPC-dannende agents og isolere DPC'er via biotin capture eller phenol: chloroform (1:1) udvinding. Massespektrometri kan derefter bruges til at identificere crosslinked proteiner eller kvantificere mængden af DPC'er dannet over tid. Den største fordel ved denne tilgang er arten af de data, der er produceret. Det er muligt at præcist katalog typer af proteiner, der bliver crosslinked efter udsættelse for en xenobiotiske, men denne protokol er dyrt, tidskrævende, og er begrænset af typen af bitmapgenkendelse, der kan detekteres.
Maizels et al. udviklet en følsom RADAR (hurtig tilgang til DNA addukt recovery) analysen til at kvantificere immunodetection af DNA-protein adukter samt en ELISA-baserede RADAR assay18,19. Disse assays er især nyttige for fældefangst DNA-protein mellemprodukter, der forbigående dannes i cellerne og generere prøver egnet til masse spektroskopi til at identificere nye protein adukter. Denne immunodetection assay afhængig af tilgængeligheden af antistoffer til at fange DNA-protein bitmapgenkendelse og derfor kan ikke være i stand til at opdage forringede DNA-peptid adukter formularen under reparation. For nylig, en specifik DPC reparere pathway knyttet til DNA-replikation og DNA-afhængige metalloprotease Spartan blev opdaget i hvilke DPC'er er proteolyzed til mindre peptider under reparation20,21. Nedarvede mutationer i dette gen er forbundet med Ruijs-Aalfs syndrom hos mennesker, en sygdom karakteriseret ved genomisk ustabilitet, for tidlig aldring og leverkræft22. Mus med gensplejsede spartanske gendefekter vise tilsvarende fænotyper23.
Vært-cellen reaktivering af transcriptional aktivitet er blevet brugt til at studere reparation af definerede læsioner på transfekteret plasmid DNA substrater24,25. I disse eksperimenter, plasmid som indeholder DPC'er (eller andre former for DNA læsioner) at blokere en transkription af en reporter, såsom luciferase, er transfekteret i celler. Luminescence målinger taget 24-72 h er senere derefter korreleret med DPC reparation. Men disse indirekte reparation assays er i stand til at opdage reparation begivenheder tidligere end 24 timer efter Transfektion og kan ikke skelne mellem RNA-polymerase bypass af delvist repareret substrater og komplet reparation.
Hver af de metoder beskrevet ovenfor har fordele og har bidraget til den nuværende model af DPC reparation. Men SSPE-qPCR assay omgår flere af de begrænsninger i forbindelse med disse andre tilgange og derfor kan give mere specifik indsigt i DPC reparations-mekanismer. SSPE-qPCR assay kan eksempelvis direkte måle reparation af lokationsspecifikke DPC'er på DNA i intakt pattedyrsceller. Denne metode er alsidige og har været brugt til at opnå reparation resultater efter Transfektion i hamster og menneskelige cellelinjer. Transfektion af plasmidet kan udføres ved hjælp af lipofection eller elektroporation i kulturperler pattedyr cellelinjer. Det sikrer også, at kun reparation af definerede DPC'er er målt, og ikke andre typer af DNA-skader induceret af de fleste DPC-dannende agents. SSPE-qPCR er nemme at udføre, billig og hurtig. Resultater opnået ved hjælp af denne analyse har fundet reparation begivenheder så tidligt som 2 h efter Transfektion. Brug denne metode, kan variabler, der kan påvirke DPC reparation resultater studeres på en måde, der er følsomt og effektivt. For eksempel har rollen af transkription i DPC reparation endnu skal evalueres nøje. På grund af fleksibiliteten i SSPE-qPCR assay, kan webstedet crosslinking af DPC manipuleres til at behandle dette spørgsmål. Desuden kan indførelse af en oprindelse af replikering til DPC-bærende plasmid bruges til at behandle indflydelse af replikering på DPC reparation. Derudover kan flere krydsbindinger oprettes på plasmidet at undersøge forskelle i reparation af en enkelt DPC versus flere krydsbindinger. Disse er spørgsmål, der ville være vanskeligt at besvare med kromosomale DNA men kan let løses ved hjælp af SSPE-qPCR assay. Samlede, SSPE-qPCR analysen kræver renset, plasmid DNA i mikrogram mængder indeholdende en læsion af en kendt placering. Adukter udover DPC kan bruges i denne analyse, dog læsion skal være i stand til at blokere udvidelsen af Taq-polymerase.
Protocol
1. generation af DPC-holdige Plasmid
- Kombinere 80 pmol af oligonukleotid indeholder en 8-oxoguanine rest (20 µL) med 10 enheder af T4 polynucleotide kinase (1 µL) i 10 x ligase buffer (5 µL). Tilsæt vand for at nå en samlet maengde paa 50 µL og inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter i et bad med opvarmet vand.
- Kombinere de fosforyleres oligonukleotid (50 µL), 80 pmol enkeltstrenget DNA (80 μl), 100 enheder Taq-polymerase (20 µL) i 10 x Taq reaktion buffer (25 µL), 100 mM ATP (20 µL), 10 mM dNTP'er (20 µL), NEB buffer 2 (25 µL) og 8 µg BSA (20 µL) til i alt 260 µL. Incubate den prøven i en thermocycler fastsat til 75 ° C i 15 min. efterfulgt af 37 ° C i 5 min. Næste, Tilføj 60 U af T4 polymerase (20 µL), 8.000 U T4 ligase (20 µL), 100 mM ATP (20 µL), 10 mM dNTP'er (20 µL), NEB buffer 2 (15 µL) og 8 µg BSA (20 µL) til i alt 375 µL. Inkuber reaktion natten over ved 37 ° C (figur 1A).
- Oprette en 50/50 buffer-mættet phenol: chloroform blanding. Tilføj lige store mængder af hver komponent, mix, og spin i en tabel-top centrifuge på 21,130 x g i 5 min. Chloroform drev vand ud af den buffer-mættet phenol at danne to lag: en øvre, vandige lag og en bund, organiske lag. Tilføje 375 µL af den lavere, organiske lag primer udvidelse reaktion, mix, og spin i en tabel-top centrifuge på 21,130 x g i 5 min.
Forsigtig: Phenol og kloroform er farlige stoffer, og der tages forholdsregler til at undgå kontakt med øjne eller hud.- Efter centrifugering, omhyggeligt uddrag det øverste lag og bland med ammoniumacetat føjes til en endelig koncentration på 0,3 M efterfulgt af 2 bind af 100% ethanol. Gemme løsningen på-20 ° C i mindst 30 min eller natten over.
- Spin prøven i en tabel-top centrifugeres ved 15.000 x rpm ved 4 ° C i 10 min. Fjern supernatanten og vaske pelleten i 1 mL af 70% ethanol. Spin prøven i en tabel-top centrifuge på 15.000 x rpm ved 4 ° C for 5 min. Fjern supernatanten og resuspenderes i 100 µL vand.
- Kombinere 50 µL DNA fra det forrige trin med 16 µL 6 x gel-loading farvestof og 34 µL vand og underlagt elektroforese på en 0,8% lav-Smelt Agarosen gel indeholder 0,5 µg/mL ethidiumbromid. Kør gelen 2 V/cm på 10 cm gel til 6 h i 1 x TAE buffer. Punktafgifter supercoiled bandet ved hjælp af et barberblad og vejer gel Skive (figur 1A). Køre en positiv kontrol til at tjene som markør for hvor kovalent lukkede, supercoiled DNA vandrer.
Forsigtig: Ethidiumbromid er et mutagen og bør der tages forholdsregler til at undgå kontakt med huden. Det er også vigtigt at minimere den tid, plasmid prøven er udsat for UV for at reducere dannelsen af UV photoproducts.- Fordøje gel udsnit ved at føje 10% β-agarase reaktion buffer for hver mg af gel vægt. Der inkuberes ved 65 ° C i 10 min og afkøles til 42 ° C. Tilføje 10 U af β-agarase og inkuberes ved 42 ° C i 1 time.
- Følgende inkubation, måle lydstyrken og tilføje ammoniumacetat til en endelig koncentration på 0,3 M og chill på is i 15 min. der centrifugeres ved 15.000 x g i 15 min. ved stuetemperatur, indsamle supernatanten, og Tilføj 2 bind af isopropanol. Chill ved-20 ° C natten over.
- Centrifugeres renset, supercoiled DNA i 10 min på 15.000 x rpm i en tabel-top centrifugeres ved 4 ° C og resuspenderes i 40 µL vand.
- Bitmapgenkendelse 12 pmol (15 µL) af DNA til 36 pmol af oxoguanine glycosylase (1 µL) i buffer, som indeholder 100 mM NaCl (3 µL), 1 mM MgCl2 (3 µL), 20 mM Tris-HCl pH 7,0 (6 µL) og 10 mM natrium cyanoborohydride (2 µL) at nå frem til en afsluttende bind af 30 µL ved 37 ° C i 30 min26. Fjerne 1 µL af crosslinked prøve og fortyndes i 500 µL vand til at tjene som en 0 h data peger og analysere på PCR i trin 3.
2. kCl/SDS nedbør
- For at visualisere crosslinking effektivitet, fordøje begrænsning 1 µg crosslinked plasmid med 1 μL BspDI i 10 x buffer ved 37 ° C i 1 time til at generere to forskellige størrelse DNA fragmenter.
Bemærk: Et fragment bliver crosslinked til protein (4,4 kb) og den anden vil ikke (2,8 kB) (figur 1B).- Deler prøverne i halvdelen, tilføje SDS til både til en endelig koncentration på 0,5%, og der inkuberes ved 65 ° C i 10 min.
- Tilføje KCl (slutkoncentration 100 mM) til en af prøverne, og der inkuberes i isbad i 5 min.
- Centrifugeres begge prøver på 12.000 x g i 5 min. ved 4 ° C og køre analysere på en agarosegel til at anslå den procent konjugation af protein-DNA12.
Bemærk: KCl/SDS nedbør bruges til kvalitetskontrol, ikke substrat forberedelse.
3. Transfektion i pattedyrceller
- 1 dag før Transfektion, plade 0,5 x 106 celler/brønd i en 6-godt plade. Den næste dag, Bland 1,5 µg (30 µL) af DPC-holdige plasmid (fra trin 1,6) med 300 µL serum-fri kultur medier. I et andet rør, bland 12 µL Transfektion reagens og 300 µL serum-fri kultur medier. Kombinere 300 µL fortyndede DNA med 300 µL fortyndede Transfektion reagens og Inkuber i 5 min ved stuetemperatur. Tilsæt 250 µL af komplekser til hver af to brønde og Inkuber i et minimum af 1 h ved 37 ° C.
- Efter inkubation, fjerne medier, der tilsættes 1 mL 0,6% SDS/0,01 M EDTA, og Inkuber ved stuetemperatur i 10-15 min. skrabe celler ved hjælp af en gummi politimand og overførsel til en 1,5 mL mikrofuge tube. Tilføje 200 µL af 5 M NaCl (endelig koncentration på 1 M), inverter forsigtigt 5 gange, og der inkuberes ved 4 ° C natten over27.
- Centrifugeres prøver på 21,130 x g i en tabel-top centrifugeres ved 4 ° C i 30 min, bundfaldet supernatanten, ethanol som beskrevet ovenfor, og pelleten i 50 µL vand.
4. SSPE-qPCR
- Bland 1 µL af gendannede DNA fra hvert tidspunkt (herunder 0 h), 2 x SYBR green PCR master mix (30 µL), 27 µL vand og 1 µL (100 pMol) af primer supplerer skader strand af plasmid (Primer R, figur 2). Udføre PCR ved hjælp af følgende betingelser: indledende pre smelte i 10 min. ved 90 ° C, efterfulgt af 8 cyklusser af: 90 ° C, 15 s, 65 ° C, 1 min. Ved afslutningen af cyklus 8 tilføje 1 µL (100 pMol) den anden primer til i alt 60 µL (Primer L, figur 2)28 (Se Tabel af materialer for reagens detaljer).
- Mix 1 µL af unamplified overvandt hvert tidspunkt (herunder 0 h), 2 x master mix (30 µL), 27 µL vand og 1 µL af hver primer (100 pMol) til i alt 60 µL DNA.
- Indlæse en 96-brønd PCR pladen med prøverne fra trin 4.1 og 4.2 (20 µL/brønd, i tre eksemplarer) og udføre qPCR for 30 cykler ved hjælp af ovennævnte betingelser.
- Middelværdier CT fra hver sæt af tredobbelt prøver. Subtrahere CT værdier dannet i trin 4.1 fra dem i trin 4.2 at opnå delta CT værdi for hver prøve. Subtrahere 0 h tidspunkt fra delta CT værdi til at fjerne enhver baggrund (Se Repræsentant resultater sektion for en detaljeret beskrivelse).
- Konvertere delta CT værdi i procent reparation ved hjælp af formlen:
Representative Results
For at udnytte SSPE-qPCR assay for at vurdere cellulære DPC reparation, skal en tilstrækkelig mængde (µg beløb) af høj kvalitet DPC reparation underlag forberedes. For at opnå dette produkt, var en oligonukleotid, der indeholder en 8-oxoguanine rest udglødet til supplerende enkeltstrenget DNA, primer udvidet og gel renses for at sikre, at kun kovalent lukkede cirkulære produkt blev anvendt til transfections (figur 1a). denne rapport fokuserer på substrater som brændstof-fældefangst bruges til at oprette en kovalent bitmapgenkendelse mellem rekombinant human oxoguanine glycosylase og en ribose enhed på en dobbelt-strenget cirkulære plasmid molekyle, men analoge tilgange kan bruges til at opnå kemisk forskellige DPC substrater. Oxoguanine glycosylase/ved fældefangst strategien er især attraktive givet de ekstremt høje effektivitet af crosslinking reaktion. Som vist i figur 1B, KCl/SDS nedbør udføres på en DPC substrat, der havde blevet fordøjet i to fragmenter selektivt og næsten kvantitativt forarmet DNA-fragment husly i DPC. Disse resultater understøtter den konklusion, at stort set 100% af plasmid substrat molekyler indeholder et protein bitmapgenkendelse.
SSPE-qPCR analysen beskrives i afsnittet protokol udnytter CT værdier dannet af qPCR til at beregne procentdelen af DPC reparation efter Transfektion i pattedyrsceller. Som figur 2 illustrerer, blokerer protein bitmapgenkendelse Taq-polymerase fra udvide 'R' primer udglødet til DPC-holdige strand. En anden, kritisk funktion af denne analyse er indarbejdelse af otte runder af SSPE reaktioner (ved hjælp af R primer) inden du udfører qPCR assay. Mens ubeskadigede (eller repareret) DNA vil udvides i løbet af disse SSPE reaktioner, vil at skabe en bindingssted for downstream 'L' primer, beskadigede DNA (eller ufuldstændigt reparerede DNA) ikke udvides. Derfor øger SSPE overfloden af hver ubeskadigede (eller repareret) strand ved eight-fold. Det betyder, reparerede prøver som SSPE trin er udført før qPCR vil vise en CT værdi, der er tre enheder lavere end der opnås for en identisk prøve hvor SSPE ikke blev udført inden qPCR (figur 2). Tre-enhed forskellen i CT værdier observeret for de to behandlinger, benævnt ΔCT, afspejler, at 8 = 23. Denne delta CT værdi kan bruges til at beregne cellulære DNA reparation aktivitet ved hjælp af formlen: procent DNA reparation = (2ΔCT /23) x 100. Kontrol eksperimenter bekræftede, at et delta CT værdi af ca. 3 konsekvent blev observeret, når ubeskadiget substrat plasmider blev udsat til SSPE-qPCR (data ikke vist).
Tabel 1 viser eksempel CT værdier, der blev genereret fra DPC-holdige plasmid substrater, der blev genvundet fra kinesisk hamster lunge fibroblaster 3 t og 8 h efter Transfektion (tabel 1A), såvel som fra time nul prøver, dvs., prøver, der blev forberedt som beskrevet i afsnittet om protokollen, men ikke transfekteret ind i celler (tabel1B). Tabellen giver også ΔCT, og procent reparere værdier (beregnet efter formlen 2ΔCT/23 x 100) fremstillet af disse prøver. Som illustreret i tabel 1A, procent reparation beregnet fra prøver høstet 3 h og 8 h efter Transfektion var 66% og 93%, henholdsvis. Disse værdier skal derefter trækkes fra som analysen af 0 h prøven til at bestemme procent reparation. Tabel 1B skildrer CT værdier for to forskellige 0 h prøver, hvor effektiv crosslinking blev eller ikke blev nået inden Transfektion. Effektivt resulterede crosslinked prøve i et delta CT værdi af 0,8 der henviser til, at en dårligt crosslinked prøve resulterede i et delta CT værdi af 2.5. Til dato har det ikke været muligt at præcist bestemme kilden til 0,8 baggrund signal i den effektivt crosslinked 0 h prøve. Det er usandsynligt, at denne baggrund afspejler et lavt niveau af enten spontan DPC fjernelse, eller er på grund af et lavt niveau af Taq polymerase 'bypass' syntese via DPC læsion: omfattende eksperimenter udført på højt oprenset enkeltstrenget M13 substrat konsekvent givet en delta CT værdi af ca 0,8, baggrund dvs., det væsentlige identisk med dette' ' udvidelse set i DPC-holdige substrater. Det er derfor sandsynligt, at der er en lille grad af mis priming af 'R' primer under SSPE, resultater i generation af en lille mængde af produktet, som efterfølgende kan blive forstærket, når 'L' primer er tilføjet, og qPCR udføres. Bestræbelser på at eliminere denne baggrund ved at manipulere PCR betingelser har hidtil undladt at afhjælpe denne mangel. Subtraktion strategi beskrevet ovenfor tillader dog præcis estimering af DPC reparation aktivitet. Det er værd at bemærke, at ineffektive crosslinking af protein på plasmidet vil resultere i en forhøjet baggrund værdi. Dette er afbildet i eksempeldataene i tabel 1B hvor ineffektiv protein-DNA crosslinking resulterede i en højere delta CT værdi til tidspunkt 0. Kontrol forsøg udføres derfor altid før indlede transfections og substrater med delta CT værdier ophøjet over 0,8 tærskelværdi er kasseret. Som nævnt i qPCR protokol, er hver prøve opdelt i 3 boringer at sikre pipettering konsistens. Disse replikater er derefter gennemsnit for at opnå CT værdien for at prøve. Replikater at afvige mere end ± 0,1 er elimineret fra datasættet. Hvis alle tre replikater afvige mere end ± 0,1 fra hinanden, redone SSPE-qPCR assay, indtil der konsekvent værdier. Erfaringen viser, at mindst 3 uafhængige transfections skal udføres for at opnå pålidelige gennemsnitlige værdier, der kan blive udsat for statistisk analyse for at fastslå indflydelse af forskellige parametre på DPC reparation effektivitet.
Figur 1. Generation af en DPC-holdige plasmid. (A) en oligonukleotid indeholder en 8-oxo-guanin rester (rød) er udglødet enkeltstrenget DNA (fed sort cirkel) og udvidet for at oprette dobbelt-strenget plasmid (primer forlængelse produkt angivet med stiplet linje). Efter elektroforese i ethidiumbromid, bandet svarende til supercoiled DNA (rød boks) er skåret ud fra en lav-Smelt agarosegel og fordøjes med β-agarase. Baner: (1) molekylvægt markør, (2) enkeltstrenget DNA, (3) dobbelt-strenget DNA, (4) primer udvidet prøve. (B) Oxoguanine glycosylase (forkortet hOGG1, afbildet som en orange cirkel) er crosslinked for 8-oxo-guanin restkoncentrationen via natrium cyanoborohydride og den deraf følgende DPC substrat fordøjet til at generere en 2.800 basepar, gratis DNA-fragment og en 4.400 basepar fragment knyttet til protein. SDS er føjet til den prøve, der er så opdelt i to dele, hvoraf den ene er behandlet med KCl og centrifugeres til sediment DPC-holdige DNA (afbildet som en orange pellet). Supernatanten fra denne sidstnævnte prøve (afbildet som blå væske i centrifugeglasset) og prøven ikke udsat for KCl udsættes til gelelektroforese. Baner: (1) molekylvægt markør, (2) -KCl, (3) + KCl. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: kvantificering af beskadigede plasmid via SSPE-qPCR. Plasmid DNA er denatureret og en primer supplerende til de beskadigede strand (R) er udglødet og udvidet. Denne proces gentages til ialt 8 cyklusser. Med en beskadiget substrat (top) Taq-polymerase er blokeret af DPC læsion og vil ikke producere fuld længde produkt tråde. Derimod med en repareret substrat (nederst) vil Taq-polymerase producere fuld længde produkt tråde der indeholder bindingssted for primer L. Efter 8 cykler, primer L er tilføjet, og cyklus tærskelværdier bestemmes ved hjælp af qPCR. Eksempel forstærkning resultater for beskadigede og ubeskadigede substrater er illustreret til højre med den røde linje, der repræsenterer DNA, der undergik primer udvidelse før qPCR og blå repræsenterer DNA, der ikke var primer udvidet før qPCR. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Tabel 1A | ||||
| Tid | -Primer forlængelse | + Primer forlængelse | Δ CT | Procent reparation |
| (2ΔCT/23x 100) | ||||
| 3 h | 23,5 | 21.1 | 2.4 | 66 |
| 8 h | 29,4 | 26,5 | 2.9 | 93 |
| Tabel 1B | ||||
| Tid | -Primer forlængelse | + Primer forlængelse | Δ CT | Procent baggrund |
| (2ΔCT/23x 100) | ||||
| 0 h | 15,4 | 14.6 | 0,8 | 22 |
| 0 h | 15,4 | 12,9 | 2.5 | 71 |
Tabel 1: beregning af procent reparere ved hjælp af CT værdier genereret fra SSPE-qPCR. (A) reparation af DPC-holdige substrat transfekteret i V79 kinesisk hamster lunge fibroblaster 3 t og 8 h efter Transfektion. (B) SSPE-qPCR 0 h prøver ikke transfekteret ind i celler. I en stikprøve af effektiviteten af crosslinking reaktionen mellem DNA og oxoguanine glycosylase var høj (dette eksempel viste en lav delta CT værdi) mens i anden prøven effektiviteten af protein crosslinking var lav (i dette eksempel viste en relativt høj delta CT værdi). Se tekst af Repræsentative resultater for detaljer.
Discussion
SSPE-qPCR metode giver adskillige fordele i forhold til andre tilgange ved at undersøge reparation af en homogen befolkning, der indeholder en enkelt, definerede DPC læsion. Det er bemærkelsesværdigt, at ud over at kontrollere identiteten af protein og type af kemiske bitmapgenkendelse bruges til at forbinde proteinet til DNA, er det muligt at nemt manipulere sekvens sammenhæng som DPC læsion er indført. Vi har udforsket indflydelse på DPC reparation af at indføre læsion på enten skabelonen eller kodning strand af en plasmid nedstrøms af en aktiv promotor locus. Vi er ligeledes i færd med at undersøge indflydelse på DPC reparation af replikering ved hjælp af en M13 plasmid som indeholder en SV40 oprindelsen af replikering transfekteret ind i HEK293T celler. Analysen beskrevet heri direkte foranstaltninger DPC reparation, i modsætning til andre strategier som vært celle reaktivering, indirekte skøn reparere aktivitet24,25. Desuden er ordningen robust, følsomme og kvantitative. I modsætning til andre systemer, som måler DPC fjernelse, denne analyse registrerer kun komplet reparation begivenheder, dvs., det kræver ikke kun at DPC læsion fjernes men at integriteten af de duplex DNA være fuldt restaureret17. Dette er fordi abasic websteder og rifter eller pauser i phosphodiester rygrad blokere analysen så effektivt som de oprindelige DPC læsion29.
Mens denne betænkning fokuserer på en bestemt type af DPC, som blev skabt af brændstof diffusering af et enzym reaktion mellemliggende, vi i øjeblikket udvikler metoder til at studere reparation af DPC'er involverer andre proteiner og læsioner som protein koblingen til DNA opstår gennem nucleoside base i stedet for ribose holdning. Bruger reduktiv undersøgelsesområde, har vi skabt protein og peptid krydsbindinger knyttet til guanin eller cytosin base af et DNA primer30. Disse oligonukleotider blev renset til homogenitet og bruges til at generere supercoiled plasmider, der indeholder DNA-proteiner og DNA-peptid krydsbindinger. Mens effektiviteten af disse reaktioner er noget reduceret i forhold til den oxoguanine glycosylase bitmapgenkendelse metode beskrevet i detaljer ovenfor, de var ikke desto mindre vellykket og muliggøre kontrol af reparation af disse substrater i wild-type og nukleotid excision reparation-mangelfuld pattedyr cellelinjer. Vi har også brugt SSPE-qPCR analysen for at studere reparation af oxoguanine læsioner og en syntetisk ribose-kolesterol konjugat, som tidligere blev vist repareres via cellular nukleotid excision reparation maskiner31. Som figur 2 viser grafisk, reparation af enhver læsion at blokke primer udvidelse af Taq-polymerase kan, i princippet måles ved hjælp af SSPE-qPCR assay.
Nuværende modeller af DPC reparation tyder på, at større DPC'er (> 10 kDa) udsættes for proteolytisk forarbejdning til mindre peptid læsion inden fjernelse32,33,34. Mest sandsynlige kandidater ansvarlig for denne proteolyse er proteasom eller en specifik protease i humane celler opkaldt spartanske20,21,35,36,37, 38. yderligere undersøgelser i rollerne af disse proteaser kan gennemføres ved hjælp af SSPE-qPCR assay. Proteasom hæmmere kan anvendes til at forbehandle celler før Transfektion med DPC-holdige substrater. Alternativt, spartanske knockdown cellelinjer kunne være transfekteret med beskadigede plasmider at belyse sin rolle i proteolyse af større DPC'er.
Uanset metoden bruges til at oprette bitmapgenkendelse eller arten af DNA læsion, er det værd at understrege, at metoden SSPE-qPCR er kritisk afhængige af evnen til at generere betydelige mængder af homogene DPC-plasmid substrat. Trin vigtigt for denne analyse omfatter rensning af kovalent, lukket-cirkulære plasmid efter primer udvidelse for at eliminere enhver hakker eller lineær plasmid molekyler. Disse forurenende stoffer skal fjernes for at sikre, at enhver efterfølgende DPC reparation observeret ikke er på grund af nick-instrueret eller dobbelt-strenget pause-instrueret reparationsprocesser. Manglende evne til at skaffe tilstrækkelige mængder af supercoiled DNA efter primer udvidelse reaktioner kan overvindes ved at variere forholdet mellem oligonukleotid til enkeltstrenget DNA. Et andet vigtigt skridt for metoden SSPE-qPCR er crosslinking effektiviteten af protein til plasmidet. I denne undersøgelse, en effektiv, enzymatisk reaktion blev brugt til bitmapgenkendelse oxoguanine glycosylase protein til en 8-oxo-guanin læsion. Sub optimal crosslinking kan forbedres ved at variere mængden af protein føjet til reaktionen.
Mens de resultater, der er beskrevet i denne rapport har påberåbt sig lipofection at indføre DPC reparation substrater i modtagerens celler, der er ingen grund, på forhånd, andre transfections metoder kunne ikke anvendes. Vi har udført indledende undersøgelser og observeret at elektroporation39 kan også bruges. Men det er værd at bemærke, at vores erfaring, elektroporation Transfektion effektivitet er reduceret i forhold til lipofection og vi fandt det nødvendigt at bruge carrier DNA (op til 5 µg) ud over de 1,5 µg af DPC substrat for at få reparation data. Samlet set giver SSPE-qPCR metode beskrevet ovenfor en innovativ måde at udelukkende undersøger DPC reparation på plasmid DNA og generere ny indsigt i DNA skader svar.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health (ES023350). Lisa Chesner understøttes af uddannelse Grant 5T32HL007741. Vi takker Natalia Tretyakova (University of Minnesota) og Ashis Basu (University of Connecticut) og deres lab medlemmer for støtte og tekniske rådgivning under den tidlige og mellemliggende faser af dette arbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-oxoguanine modified oligo | Midland Certified Reagent Company | NA | Sequence: 5’AGGGTTTTCCA (8-oxo-dG)TCACGACGTT 3’ |
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Single-stranded M13 | NEB | N4040S | |
| Taq polymerase | NEB | M0267L | |
| ATP, 100mM | Thermo Scientific | R0441 | |
| dNTP Mix, 10mM each | Thermo Scientific | R0192 | |
| BSA | NEB | B9001S | |
| T4 polymerase | NEB | M0203L | |
| T4 ligase | NEB | M0202L | |
| β-agarase | NEB | M0392S | |
| Oxoguanine glycosylase 1 | NEB | M0241S | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4309155 | green PCR master mix |
| Primer R | UMN Genomic Center | NA | 5’CGGCTCGTATGTTGTGTG 3’ |
| Primer L | UMN Genomic Center | NA | 5’ GCTGCAAGGCGATTAAGT 3’ |
| Lipofectamine Reagent | Invitrogen | 18324-012 | transfection reagent |
| BspD1 | NEB | R0557S | |
| NEB buffer 2 | NEB | B7002S | |
| StepOnePlus Real Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| UltraPure Buffer-Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-047 | |
| Chloroform, reagent ACS, spectro grade | ACROS | 40463-5000 |
References
- Tretyakova, N. Y., Groehler, A., Ji, S. DNA-Protein Cross-links: Formation, Structural Identities, and Biological Outcomes. Accounts of chemical research. 48 (6), 1631-1644 (2015).
- Barker, S., Weinfeld, M., Murray, D. DNA-protein crosslinks: their induction, repair, and biological consequences. Mutat Res. 589 (2), 111-135 (2005).
- At Groehler, A. t, Degner, A., Tretyakova, N. Y. Mass Spectrometry-Based Tools to Characterize DNA-Protein Cross-Linking by Bis-Electrophiles. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 121, 63-77 (2016).
- Barker, S., Weinfeld, M., Zheng, J., Li, L., Murray, D. Identification of mammalian proteins cross-linked to DNA by ionizing radiation. J Biol Chem. 280 (40), 33826-33838 (2005).
- Dizdaroglu, M., Gajewski, E. Structure and mechanism of hydroxyl radical-induced formation of a DNA-protein cross-link involving thymine and lysine in nucleohistone. Cancer Res. 49 (13), 3463-3467 (1989).
- Chvalova, K., Brabec, V., Kasparkova, J. Mechanism of the formation of DNA-protein cross-links by antitumor cisplatin. Nucleic Acids Res. 35 (6), 1812-1821 (2007).
- Speit, G., Schutz, P., Merk, O. Induction and repair of formaldehyde-induced DNA-protein crosslinks in repair-deficient human cell lines. Mutagenesis. 15 (1), 85-90 (2000).
- Stingele, J., Bellelli, R., Boulton, S. J.
- Kohn, K. W., Erickson, L. C., Ewig, R. A., Friedman, C. A. Fractionation of DNA from mammalian cells by alkaline elution. Biochemistry. 19 (15), 4629-4637 (1976).
- Ewig, R. A., Kohn, K. W. DNA damage and repair in mouse leukemia L1210 cells treated with nitrogen mustard, 1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea, and other nitrosoureas. Cancer Res. 37, 2114-2122 (1977).
- Ewig, R. A., Kohn, K. W. DNA-protein cross-linking and DNA interstrand cross-linking by haloethylnitrosoureas in L1210 cells. Cancer Res. 38, 3197-3203 (1978).
- Zhitkovich, A., Costa, M. A simple, sensitive assay to detect DNA-protein crosslinks in intact cells and in vivo. Carcinogenesis. 13 (8), 1485-1489 (1992).
- Chiu, S. M., Sokany, N. M., Friedman, L. R., Oleinick, N. L. Differential processing of ultraviolet or ionizing radiation-induced DNA-protein cross-links in Chinese hamster cells. Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med. 46 (6), 681-690 (1984).
- Merk, O., Reiser, K., Speit, G. Analysis of chromate-induced DNA-protein crosslinks with the comet assay. Mutat Res. 471 (1-2), 71-80 (2000).
- Loeber, R. L., et al. Proteomic analysis of DNA-protein cross-linking by antitumor nitrogen mustards. Chem Res Toxicol. 22 (6), 1151-1162 (2009).
- Gherezghiher, T. B., Ming, X., Villalta, P. W., Campbell, C., Tretyakova, N. Y. 1,2,3,4-Diepoxybutane-induced DNA-protein cross-linking in human fibrosarcoma (HT1080) cells. J Proteome Res. 12 (5), 2151-2164 (2013).
- Groehler, A. t, Villalta, P. W., Campbell, C., Tretyakova, N. Covalent DNA-Protein Cross-Linking by Phosphoramide Mustard and Nornitrogen Mustard in Human Cells. Chem Res Toxicol. 29 (2), 190-202 (2016).
- Kiianitsa, K., Maizels, N. A rapid and sensitive assay for DNA-protein covalent complexes in living cells. Nucleic Acids Research. 41 (9), e104 (2013).
- Kiianitsa, K., Maizels, N. Ultrasensitive isolation, identification and quantification of DNA-protein adducts by ELISA-based RADAR assay. Nucleic Acids Research. 42 (13), e108 (2014).
- Stingele, J., et al. Mechanism and Regulation of DNA-Protein Crosslink Repair by the DNA-Dependent Metalloprotease SPRTN. Molecular Cell. 64 (4), 688-703 (2016).
- Vaz, B., et al. Metalloprotease SPRTN/DVC1 Orchestrates Replication-Coupled DNA-Protein Crosslink Repair. Mol Cell. 64, 704-719 (2016).
- Maskey, R. S., et al. Spartan deficiency causes accumulation of Topoisomerase 1 cleavage complexes and tumorigenesis. Nucleic Acids Res. 45 (8), 4564-4576 (2017).
- Lessel, D., et al. Mutations in SPRTN cause early onset hepatocellular carcinoma, genomic instability and progeroid features. Nature Genetics. 46 (11), 1239-1244 (2014).
- Baker, D. J., et al. Nucleotide excision repair eliminates unique DNA-protein cross-links from mammalian cells. J Biol Chem. 282 (31), 22592-22604 (2007).
- Ahn, B., Kang, D., Kim, H., Wei, Q. Repair of mitomycin C cross-linked DNA in mammalian cells measured by a host cell reactivation assay. Mol Cells. 18 (2), 249-255 (2004).
- Fromme, J. C., Bruner, S. D., Yang, W., Karplus, M., Verdine, G. L. Product-assisted catalysis in base-excision DNA repair. Nat Struct Biol. 10 (3), 204-211 (2003).
- Hirt, B. Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cell cultures. J Mol Biol. 26 (2), 365-369 (1967).
- Lee, H. W., et al. Monitoring repair of DNA damage in cell lines and human peripheral blood mononuclear cells. Anal Biochem. 365 (2), 246-259 (2007).
- Sikorsky, J. A., Primerano, D. A., Fenger, T. W., Denvir, J. DNA damage reduces Taq DNA polymerase fidelity and PCR amplification efficiency. Biochemical and biophysical research communications. 355 (2), 431-437 (2007).
- Wickramaratne, S., Mukherjee, S., Villalta, P. W., Scharer, O. D., Tretyakova, N. Y. Synthesis of sequence-specific DNA-protein conjugates via a reductive amination strategy. Bioconjug Chem. 24 (9), 1496-1506 (2013).
- George, J. W., et al. Restoration of nucleotide excision repair in a helicase-deficient XPD mutant from intragenic suppression by a trichothiodystrophy mutation. Mol Cell Biol. 21 (21), 7355-7365 (2001).
- Minko, I. G., et al. Initiation of Repair of DNA-Polypeptide Cross-Links by the UvrABC Nuclease. Biochemistry. 44 (8), 3000-3009 (2005).
- Minko, I. G., Zou, Y., Lloyd, R. S. Incision of DNA-protein crosslinks by UvrABC nuclease suggests a potential repair pathway involving nucleotide excision repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, (2002).
- Reardon, J. T., Sancar, A. Repair of DNA-polypeptide crosslinks by human excision nuclease. PNAS. 103, 4056-4061 (2006).
- Lopez-Mosqueda, J., et al. SPRTN is a mammalian DNA-binding metalloprotease that resolves DNA-protein crosslinks. eLife. 5, e21491 (2016).
- Stingele, J., Schwarz, M. S., Bloemeke, N., Wolf, P. G., Jentsch, S. A DNA-dependent protease involved in DNA-protein crosslink repair. Cell. 158 (2), 327-338 (2014).
- Duxin, J. P., Dewar, J. M., Yardimci, H., Walter, J. C. Repair of a DNA-Protein Crosslink by Replication-Coupled Proteolysis. Cell. 159 (2), 346-357 (2014).
- Stingele, J., Habermann, B., Jentsch, S. DNA-protein crosslink repair: proteases as DNA repair enzymes. Trends in Biochemical Sciences. 40 (2), 67-71 (2015).
- Potter, H., Heller, R., et al. Transfection by Electroporation. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , CHAPTER Unit-9.3 (2003).
