Summary
שוחרת הגידול טיפולית בתאי גזע mesenchymal (MSCs) מבטיחים לטיפול פולשני גליובלסטומה. השתלת אופטימלית כולל משלוח של MSCs לתוך חלל כריתה הגידול על פיגומים. כאן, טכניקות פרה כדי ללמוד טיפול MSC גליובלסטומה הינם מסופקים לרבות: כריתה הגידול תמונה מונחה; השרשת נזרע MSC פיגומים; טיפול לאחר הניתוח מעקב.
Abstract
גליובלסטומה (GBM), שכיחה ביותר אגרסיבי הסרטן במוח העיקרי, נושא תוחלת חיים של 12-15 חודשים. תוחלת החיים קצרה הוא בחלקו בשל חוסר היכולת של הטיפול הנוכחי, המורכב כריתה כירורגית ולאחריו הקרנות וכימותרפיה, כדי למנוע גידול פולשני מוקדים. טיפול של מוקדים אלה עשוי להשתפר עם tumoricidal האנושי בתאי גזע mesenchymal (MSCs). MSCs התערוכה הגידול חזק tropism, ניתן לתכנן חלבונים אקספרס טיפולית להרוג תאים סרטניים. החידושים במודלים פרה מציינים כי כריתה כירורגית גורם אובדן MSC מוקדמת מפחית את היעילות הטיפולית. היעילות של טיפול MSC יכולים להשתפר על ידי זריעה MSCs על גרדום poly(lactic acid) מתכלה (PLA). MSC משלוח לתוך חלל כריתה כירורגית על גרדום PLA משחזר תא השמירה, התמדה, ורצח הגידול. לחקור את ההשפעות של פלה נזרע MSC השרשה ב- GBM, דרושה מודל פרה מדויק. כאן אנו מספקים פרה פרוטוקול ניתוח כריתה הגידול תמונה מונחה של GBM בעכברים חיסונית לקויה ואחריו מתחילה MSC לגרדום השרשה. MSCs מתוכננים עם בונה lentiviral צורונים אקספרס, מפרישים טיפוליות הקשורות TNFα בתדר אפופטוזיס ליגנד (שובל), כמו גם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) כדי לאפשר מעקב פלורסנט. באופן דומה, לתאי הגידול U87 מתוכננים mCherry אקספרס ו גחלילית לוציפראז, מתן כפול פלורסנט/זורח מעקב. בעוד בשימוש כיום עבור חוקרים תאי גזע מתווכת מסירת הרפוי, פרוטוקול זה יכול להיות שונה כדי לחקור את ההשפעה של כריתה כירורגית על התערבויות אחרות GBM.
Introduction
גליובלסטומה (GBM) הוא הסרטן השכיח ביותר במוח העיקרי בקרב מבוגרים, עם עגומה חציון ההישרדות של רק 12-15 חודשים1,2,3,4,5. הישרדות שלא חל שיפור משמעותי מאז 2005 כאשר קליני הסטנדרטי העכשווי של כריתה כירורגית מקסימלי ולאחריו הקרנות וכימותרפיה temozolomide הנלווה ו אדג'וונט היה מאומץ6,7. בעוד טיפול זה מספק חולים עם הקלה זמנית של הסימפטומים, סטנדרט של טיפול לטיפול תמיד תוצאות הישנות סרטן פולשני foci להתחמק כריתה, מוגנים מפני טיפולים מערכתית על ידי מחסום הדם - מוח (BBB). אסטרטגיות אשר המטרה גידול פולשני foci תוך עקיפת BBB נחוצים בדחיפות לה לתוכניותיך נגד המחלה הזאת אגרסיביים, מתישה.
האדם גזע mesenchymal (MSCs) מבטיחים כמו סמים רכבי ההעברה עבור GBM עקב שלהם8,tropism הגידול מקורית9. MSCs בעלי קולטנים ל ולהעביר כלפי גורמים מסיסים להפריש גידולים, כולל 1α סטרומה תא-derived factor (דגכ-1α), מטריקס מטאלו-פרוטאינאז-1 (MMP-1), ומונוציט chemoattractant חלבון-1 (MCP-1) בין היתר10, 11 , 12 , 13. הנדסה MSCs כדי לבטא להפריש תרופות ציטוטוקסיות מאפשר להם להיות רתום כמו גידול-יונת משלוח סמים כלי רכב. MSCs מהונדסים לנוע לעבר גידול פולשני foci ולספק חלבונים טיפולית. גישה זו הוכיחה כדאיות במגוון של פרה GBM מודלים9,14. עם זאת, הרוב המכריע של מודלים אלה אינן כוללות כריתה כירורגית למרות הרלוונטיות הקלינית של רכיב זה. מתעוררים מחקרים באמצעות דגמים חדשים של כריתה חשף כי הסרת גידול כירורגי מפחית את התמדתו של תאי גזע מוזרקים ישירות לתוך חלל כירורגי ה-15. אובדן יכולת הקיום, גרמו יעילות מופחתת, ככל הנראה בגלל ירידות מינון, משך הזמן של סמים להעביר מוקדי גידול פולשני.
כדי להגדיל את תאי הגזע הכדאיות ואת משלוח סמים, MSCs יכול להיות נזרע על גבי פיגומים לפני ההשתלה. ב פרוטוקול זה, מסתיימים, resorbable electrospun nanofibrous poly(lactic acid) (PLA) משמש פיגומים עבור ה-PLA MSCs. הגמשת תואמת את הצורה של חלל כריתה על השתל, אשר ממקסם טיפולית כיסוי ומצמצמת מרחק MSCs חייב לנסוע כדי להגיע תאים סרטניים. MSCs יישארו על הגרדום במהלך ההשתלה, עוברים את לגרדום לכיוון תאים סרטניים לאחר ההשתלה16,17. MSCs ותרופות ציטוטוקסיות שהם נושאים ואז להצטבר על מוקדים הגידול. מסירת תרופות ציטוטוקסיות הגידול דורש MSC הכדאיות והתמדה, אשר שניהם נמצאים שנעזר השרשה על פיגומים.
בהליך זה, משמשים וקטורים lentiviral לזירוז ביטוי יציב של פלורסנט (במבחנה מעקב), זוהרים (ויוו מעקב) סמני סרטן וגם תאי שורות. הקו GBM האנושי U87 נגוע עם mCherry ו גחלילית לוציפראז (U87 mCh-Fl), וכן את MSCs טיפולית-שאינם עם GFP, renilla לוציפראז (MSC GFP-Rluc). הווריאציה טיפולית של MSCs אקספרס הקשורות TNFα אפופטוזיס גרימת ליגנד (MSC-שובל). שובל, חלבון מופרש צורונים, נקשר בקרבת מקום המוות רצפטורים על סרטן תאים, יוזם אפופטוזיס בתיווך קספאז18.
כאן, אנו מספקים פרוטוקול פרה תמונה מונחה GBM כריתה כירורגית של השרשת נזרע MSC פיגומים. בקצרה, עכברים עירום ניתנת גולגולת ואחריו שלושה ימים מאוחר יותר orthotopic סטיאוטטי הזרקה של U87 mCh-Fl להקים הגידול העיקרי. הגידול engrafted גדל במשך תקופה של שבוע. PLA פיגומים הם נזרע עם MSCs 48 שעות לפני ניתוח כריתה. הגידול הוא resected אז תחת הדרכתו פלורסנט, לגרדום MSC-טעון הוא מושתל לתוך חלל כריתה. הישרדות נטל ועכבר הגידול מתבצע לאחר מכן וכאב לאחר הניתוח עם ביולומינסנציה הדמיה (בלי). ציר זמן של הליכים אלה מוצגים להלן (איור 1).
איור 1: השתלשלות ההליכים. עכברים בתחילה מקבלים חלון גולגולתי (יום 0). לאחר תקופה של התאוששות של שלושה ימים, הם גידולים מושתל (3 ביום) ולגדול למשך שבוע. פיגומים הם נזרע עם MSCs (יום 8) יומיים לפני הגידול כריתה, ועל ההשתלה ההליך (10 יום). התקדמות הגידול והיעילות הטיפולית יוערכו באמצעות שלאחר הניתוח הדמיה לאחר מכן (יום 10 +). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת צפון קרולינה בצ'אפל היל.
הערה: הליך זה מבוצע על עכברים עם גולגולת, כמו גרסה מותאמת של פרוטוקול Mostany ו- Portera-Cailliau19 שבה נמחקת לרקמת העצם זה הוא הוסר בניתוח, עוזב את המוח נגיש עבור הקמת ו בסופו של דבר כריתה של גידולים GBM. בעקבות הניתוח, גידולים נוצרים באמצעות השרשה סטיאוטטי כפי שמתואר אוזאווה ו ג'יימס20. ואנחנו משתילים עונה 1 פרק 10-5 U87 mCh-Fl התאים בקואורדינטות סטיאוטטי הבאים (ב מ מ bregma): (2.5, 0 -0.5).
1. תא תרבות, לגרדום הכנה
הערה: פיגומים צריך להיות מוכן 48 שעות לפני ההשתלה בעכברים. אמצעי האחסון הבאים הינם מסופקים על בסיס לכל-לגרדום. להכפיל כמויות לפי הצורך עבור פיגומים נוספים.
- לחתוך פיגומים פלה לחתיכות בגודל חלל כריתה (כ 2 מ מ x 2 מ"מ). פיגומים ניתן לחתוך ביד באמצעות מספריים או באמצעות ניקוב חורים עבור הדיר.
- לחטא במועט אתנול 70% למשך 15 דקות ולאחריו אנו ממליצים PBS. מקום לגרדום הנשר של Dulbecco ששונה בינוני (DMEM) המכילה 10% סרום שור עוברית (FBS) ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין בעת הכנת התאים זריעה.
- תרימי בתרבית MSCs באמצעות 0.05% טריפסין (3-5 מ"ל בקבוקון T75). דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. ודא כי התאים יש הרים, ולאחר מכן להוסיף 7-10 מ"ל DMEM הבקבוק כדי להשבית טריפסין.
- העברת תוכן הבקבוק שפופרת צנטרפוגה 15-mL. ספירת תאים באמצעות של hemocytometer. גלולה 5 x 105 MSCs עבור כל לגרדום באמצעות צנטריפוגה ב g x 100 למשך 5 דקות.
- וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend MSCs ב 5 µL DMEM לכל 5 x 105 תאים.
- להכין פיגומים זריעה על ידי מלטף אותם.
- הסר לפיגום DMEM טבילה עם מלקחיים ומניחים באופן זמני אותו על המכסה של צלחת 6-. טוב. הרם המכסה, כשמאחוריו droplet של עודף DMEM לגרדום.
- במקום לגרדום בחזרה על המכסה שוב במיקום חדש, יבש. חוזר 3 - 5 פעמים ולאחר מכן מקם לגרדום מיובשים חלקית בצלחת 6-ובכן חדש עבור זריעה. חזור על כל לגרדום.
הערה: גרדום מיובשים חלקית מספק תא אופטימלית זריעה תוצאות. אם לגרדום רטובים מדי, התאים מתחלקים ממנה לגרדום, לדבוק הצלחת טוב להלן. אם לגרדום יבש מדי, ה-droplet אינם מתפשטים מעל לגרדום כולו, וכתוצאה מכך התפלגות התא הראשוני המסכן.
- באמצעות פיפטה של, מערבבים בעדינות את הבקבוקון בתאי גזע כדי homogenize את המתלים, כפי כמה תאים עשויים התיישבו לתחתית.
- לאט לאט פיפטה 2.5 µL טריים מעורבבים MSC ההשעיה ישירות על הגרדום, יצירת droplet קטן מעל לגרדום.
- להוסיף 300 µL DMEM הקצוות של כל טוב. פעולה זו תמנע התאדות של תא ה-droplet. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, המאפשר את התאים לצרף אל הגרדום.
- עם מלקחיים, בעדינות להתהפך פיגומים בצלחת היטב. זרע 2.5 µL טריים מעורבבים MSC ההשעיה (התוצאה סך של 5 x 105 תאים נזרע לכל לגרדום). דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, המאפשר את התאים לצרף אל הגרדום.
- מכסים פיגומים ב- DMEM על-ידי הוספת 2 מ"ל כל טוב של צלחת 6-. טוב. הרם בעדינות פיגומים כדי לאפשר תקשורת לזרום מתחתם. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במצב זה במשך 48 שעות לפני ניתוח ההשתלה.
- בדוק פיגומים לאחר 24 שעות ואת הוספה/שינוי של התקשורת אם עודף אידוי או מדיה דהוי כתוצאה מחוסר איזון ה-pH הוא ציין.
2. קרינה פלואורסצנטית מונחה כריתה, השרשה לגרדום
הערה: לעקר את כל הכלים לפני אתחול ניתוח. לנהל נגד כאבים מניעתי כפי שמתואר בספר הנהלים IACUC מוסדיים.
- מניחים את המסגרת stereotaxic על השלב של פלורסצנטיות לנתח stereomicroscope.
- עזים ומתנגד העכבר מתחת איזופלוריין בשאיפה בתא אינדוקציה. ברגע מרדימים, לאבטח את העכבר בתוך המסגרת stereotaxic אספקה רציפה הרדמה נשאפים דרך מתאם חרוט האף איזופלוריין. לשמור על טמפרטורת הגוף עם כרית החימום ו/או בדיקה.
הערה: 4-5% איזופלוריין מתאים אינדוקציה, 2-3% מתאים לצורך תחזוקה, אך זה חייב להיות מותאם ולעקוב אחר עבור כל עכבר. - להחיל משחה אופטלמולוגיות בעיניים כדי למנוע התייבשות של הקרנית. לעקר את האתר החתך של הקרקפת עם סדרה של אלכוהול שלוש, שלוש betadine מגבונים.
- לבצע בדיקת רפלקס של קמצוץ הבוהן על כל איבר ואשר תגובה שלילית כדי להבטיח ההרדמה המתאים. ודא קצב הנשימה יציב כ 55-65 נשימות לדקה.
- באמצעות מלקחיים, צבוט והרם בעדינות את הקרקפת. עושים חתך rostral-סימטרית ליניארי קו האמצע עם מספריים כירורגיים. להשקיית החתך עם PBS ולהסיר שומן תת-עורי המוליך עצה כותנה בצורה מעגלית צחצוח. לארגן את העור כך החלון הגולגולת נוסדה קודם לכן הוא גלויה לגמרי.
- בעדינות לנקב את הפנים רק לגבולות החלון הגולגולת באמצעות מחט 18-G של דורא. חזור עד החתך באופן מלא רשמים הפנים של החלון.
- להסיר את השכבה הקשה של המוח על ידי פילינג אותו משם באמצעות מלקחיים בסדר, חשיפת parenchyma הבסיסית של הגידול.
- לאתר את הגידול mCh-Fl U87 על-ידי כיבוי אורות חדר והפעלה זריחה-מצב stereomicroscope. היכונו כריתה על-ידי טעינת טיפ פיפטה של µL 1-200 לתוך סוף הצנרת של משאבת ואקום.
- הפעל את משאבת ואקום. נכרות את הגידול על ידי בעדינות כ רפה בעברית רקמות פלורסנט עד אין אות נשאר. כבה את משאבת ואקום וזורקים את הקצה פיפטה. להפעיל את פלורסצנטיות מחוץ לחדר את האורות על.
הערה: כדי לשלוט הדימום, להשקיית עם PBS קר ולהחיל יציב עם המוליך עצה כותנה. במקרים חמורים יותר, חלל כריתה גם באופן זמני עמוסים עם סוכן hemostatic כל עוד היא מוסרת לאחר הדימום הפסיק ואחריו עוד PBS השקיה. - מיד לפני ההשתלה לאט לטבול לגרדום PLA MSC מתחילה ב- PBS להסיר רכיבים המשויכים ומדיה לא רצויים. שתל לגרדום לתוך חלל כריתה. אם יש צורך, להוסיף 1 פיברינוגן µL (67-106 mg/mL) ואחריו µL 1 תרומבין (400-625 U/mL) כדי לאבטח לגרדום במקום.
- עם השכבה הקשה של המוח להסיר, להסיר את שארית העצם מחלון הגולגולת כבר שנמחקו, לסגור את הפצע פשוט על-ידי סגירת העור והחלת דבק כירורגי. להסיר את החיה הרדמה ואפשר לשחזר על משטח מחוממת.
- העכבר פעם פעולות כירורגיות, החזרה לכלוב. לנהל שיכוך כאב בזמן שאושרו על-ידי IACUC. חזור על הליך עבור כל עכבר.
3. שלאחר הניתוח הדמיה
- באמצעות המזרק 28-G אינסולין, להזריק עכברים עם D-luciferin (150 מ ג/ק ג בקרום הבטן).
- חכה 10 דקות. זה יאפשר את luciferin בכל רחבי הגוף, להגיב עם התאים הסרטניים לבטא לוציפראז במוח כדי לקבל ביטוי שיא.
- תחת הרדמה איזופלוריין (כפי שהוזכר קודם לכן), תמונה עכברים ביולומינסנציה (בלי) מערכת להמחיש הגידולים הדמיה. משתנים פעמים חשיפה הדרושים (שניות עד דקות) תלוי בגודל הגידול.
- חזור על הליך הדמיה לפי הצורך כדי לקבוע קינטיקה גידול הגידול. המשיכו לעקוב אחר בעלי חיים בריאות.
הערה: MSCs טיפולית צורונים יבטא את שובל, הורג תאים סרטניים ולדכא את צמיחת הגידול הכללי. הדמיה כל 2-5 ימים מספק תדירות מספיק למטרה זו. - כאשר הקצה מראש שפורטו בפרוטוקול IACUC מולאו, להקריב את העכברים מאת transcardial זלוף ולאסוף רקמות לצורך ניתוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תאים סרטניים U87 היו מתוכנן mCherry אקספרס ו גחלילית לוציפראז (U87 mCh-Fl) לפני ההזרקה, וכדי לאפשר כריתה תמונה מונחה, ביולומינסנציה מעקב (איור 2 א-ג). תאי גזע מהונדסים עם אבחון GFP-Rluc (MSC-GFP) או טיפולית GFP-משפט (MSC-שובל) באופן דומה, נזרע על גבי פיגומים PLA לאשר מצורף והתפשטות (איור דו-ממדי-F).
איור 2: תמונות נציג של תאים סרטניים פלורסנט MSCs נזרע על פלה. A-C) שלב, פלורסנט, בשילוב תמונות, בהתאמה, תאים סרטניים הצג U87 הנדסה לאחור עם בונה lentiviral לסמני mCh אקספרס-Fl. D-F) תמונות המתאימות של תאי גזע מהונדסים לבטא GFP-Rl או טיפולית GFP-טרייל נזרע על גבי החומר פיגומים פלה. גודל ברים = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
פוסט תמונות ניתנים להלן כדי להאיר את חלקים של הליך ניתוחי כריתה הגידול, לגרדום השרשה (איור 3). החיה הראשונה מרדימים, מיושר בכלי stereotaxic (איור 3 א). נפתח את העור, השכבה הקשה של המוח הוא קלופים בחזרה. הגידול הוא resected (איור 3B), כאשר בחן תחת אור לבן מופיע יוסרו לחלוטין. עם זאת, פלורסנט תמונות של הגידול לפני (איור 3C) לאחר כריתה (איור 3D) מציינים, בעוד הרוב המכריע של הגידול הוסר, כמות שיורית נשאר. תופעה זו דומה מקרים קליניים מנתחים איפה אפשרות להסיר תאים סרטניים במהירות העברה מן המסה העיקרית, לתוך שמיש אזורים במוח. המהלך MSCs טיפולית נודדות לכיוון הגידול שיורית foci שנותרו לאחר כריתה כירורגית. כדי לספק MSCs לתוך חלל כריתה, MSCs קודם נזרע על גבי ה-PLA ולאחר מכן הבונה לגרדום ממוקמת בחלל כריתה. נוכחות MSCs על הגרדום מאושרות שלאחר השתל על ידי הדמיה fluorescently GFP אות (איור 3E). Ex-vivo כל המוח תמונות להראות לגרדום מידות באופן יחסי חלל כריתה (איור 3F-H). לגרדום מופיעה גדולים משמעותית הניח שטוחים, אך יכול להיות יצוק לתוך הצורה של חלל כריתה במהלך ההשתלה. על ידי ציפוי על כל חלל, המרחק ש-mscs טיפולית יש להעביר להגיע הגידול foci ממוזער. לאחר הניתוח, רבנות בלי משמש כדי לעקוב אחר הגידול לאורך זמן לקבוע יעילות MSC-טרייל המועבר לגרדום.
איור 3: פוסט ניתוחית נציג ותמונות לאחר הניתוח. A) בסה כ מציג סדרת פוסט ניתוחית העכבר לפני החיתוך. Incised B) עכבר עם חלון הגולגולת וחושפים גידול המוני. שדה בהיר C) ותמונה כיסוי פלורסנט מציג את המיקום של הגידול. D) לאחר ניתוח כריתה חלל עם שארית גידול מוקדים. E) PLA מושתל לגרדום נזרע עם MSC-טרייל. F) פוסט-מורטם במוח רקמות עם לגרדום בשכבות. G) פלורסנט בשכבת-העל של סימון תאים GFP-טרייל. H) Magnified גירסה של ברים סולם ג = 5 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ניתוח יכול בדרך כלל להסתיים בתוך 30 דקות לכל עכבר, בהתחשב בכך הנקודות הבאות נלקחים בחשבון כדי למקסם את דיוק ולהימנע מלכודות זמן רב. ראשית, ודא שכשהעכבר ממוקם כראוי בכלי stereotaxic לפני הפעלת ההליך. תנועות ראש לא רצויים יגביל דיוק כירורגי של הניתוח, המיקום של הגידול השרשה, וכן מידת כריתה הגידול. לפני כריתה, להסיר לחלוטין את החלק של דורה המכסים את הגידול. דורא קשוח, סיבי מתקשה כמו מייבש במהלך השאיפה. אם שהיישום יוסר, השכבה הקשה של המוח מוקשח עשוי להגביל את העצמות עצה ניידות ולמנוע כריתה מלאה הגידול. במהלך כריתה, כלי הדם הם לרוב בטעות resected יחד עם הגידול, גרימת דימום משמעותי. עודף דם מפחיתה את עוצמת האות פלורסנט, מטשטש את הגידול. שמירה על גידול ניראות במהלך כריתה מבטיחה במידה הנכונה של כריתה, ומגביל את הסרת רקמה בריאה ודימום עודף. דימום קטן יותר, להשקיית הספינה פגומות בתמיסת קר והפעילו לחץ עדין עם המוליך עצה כותנה. אם הדימום ממשיך, לארוז סוכן hemostatic לתוך חלל למשך 2-3 דקות, ואז להסיר עם מלקחיים. להשקיית עם PBS לאחר מכן כדי לשחזר pH פיזיולוגיים לפני השתלת לגרדום נזרע התא. כאשר השלמת כריתה הדימום הפסיק, מהמלכודת הסופי הוא סגר לקוי בעור פצע. זו נגרמת בדרך כלל על ידי לחות עודפת (PBS או דם) המונעת את דבק כירורגי של מליטה ממבנה העור. למנוע זאת על ידי ייבוש בעדינות את העור עם המוליך עצה כותנה לפני החלת הדבק. אפשרי גם להדביק בטעות על העור ישירות אל הגולגולת אם הפער הפצע לא קודם מוחזק במצב סגור עם מלקחיים המיועדים להדבקה.
עם שיקולים אלה בחשבון, בפרוטוקול לעיל מייצרת עקבית ומהימנה GBM כריתות כירורגיות המחקים סטנדרטי של טיפול מדויק ויוו בדיקה של התא המתעוררים וטיפולים מולקולה קטנה. עדיין, ניתן לשנות מספר רכיבי כדי לשרת את הצרכים ניסיוני מסוים. למשל, גידול מאפיינים כגון גודל, מיקום, היקף הפלישה ניתן לכוונן לשנות את המספר ההתחלתי ואת העומק של תאים מוזרק, הזמן בין הממסד הגידול כריתה, או על ידי החלפת הקו תא הגידול עצמו. יתר על כן, מחקר זה מבוצע בעכברים עירום athymic אשר המערכת החיסונית פרוץ סובלנית תאים אנושיים. עכברים המוסמכת החיסון עשוי להיות מתאים יותר עבור מחקרים באמצעות תאי עכבר.
לעומת מערכת סגורה (כלומר, העצם או coverslip מכניסים בחזרה למקום), גולגולת הופיעה פרוטוקול זה מפחית לחץ תוך-גולגולתי (ICP). מאז ICP מוגבר אחראי הופעת התסמינים כולל התקפים, עכברים יחוו של הארכה מלאכותית של הישרדות במודל זה. בעת הפגיעה ממוזערת בשל העיכוב החלה על קבוצות בקרה וטיפול, דגמים עתידיים יכול לסגור מחדש את מכסה העצם כדי לשחזר ICP ולקבוע את התפקיד כי זה משחק בטיפול תאים GBM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ד"ר גליונות, Bagó ו- Hingtgen יש הון עצמי הרפוי בז למי יש רישיון היבטים של תאי גזע וטכנולוגיה לגרדום של UNC בצ'אפל היל.
Acknowledgments
המחברים להכיר תרומות העריכה של ד ר קתרין Pietrosimone. PLA פיגומים יוצרו על ידי המעבדה של ד ר אליזבת Loboa, צפון קרוליינה סטייט. עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקרים UNC Lineberger מקיף במרכז לחקר הסרטן של אוניברסיטת סרטן UNC Translational ואת המכון למדעי קלינית (KL2TR001109, UL1TR001111).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Just for mouse stereotaxic instrument | Stoelting | 51730 | Maintains steady head positioning during surgery |
| Fluorescence dissecting stereomicroscope | Leica | M165 FC | Allows real-time imaging of tumor during resection |
| Motorized integrated stereotaxic injector (ISI) system | Stoelting | 53315 | Allows precise tumor cell injection volume and rate |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469 | Sugical glue to close skin wound |
| Artificial tears | Akorn | 664268 | Prevents eyes from drying during surgery |
| Webcol alcohol preps | Covidien | 6818 | Sterilize incision site |
| Betadine surgical scrub | Purdue Fredick Company | 6761815117 | Sterilize incision site |
| Cotton-tipped applicators | Fisherbrand | 23-400-115 | Surgery tool |
| E-vac aspirating system | Argos | EV310 | Vacuum pump used to resect tumor |
| Fibrinogen and thrombin extracted from as-received TISSEEL | Baxter | To temporarily secure the scaffold in the resection cavity | |
| IVIS Kinetic in vivo optical imaging system | Caliper Life Science | Bioluminescent Imager | |
| D-Luciferin potassium salt | PerkinElmer | 122799 | In vivo imaging agent |
References
- Adamson, C., et al. Glioblastoma multiforme: a review of where we have been and where we are going. Expert opinion on investigational drugs. 18 (8), 1061-1083 (2009).
- Asthagiri, A. R., Pouratian, N., Sherman, J., Ahmed, G., Shaffrey, M. E.
- Affronti, M., et al. Overall survival of newly diagnosed glioblastoma patients receiving carmustine wafers followed by radiation and concurrent temozolomide plus rotational multiagent chemotherapy. Cancer. 115 (15), 3501-3511 (2009).
- Erpolat, O., Akmansu, M., Goksel, F., Bora, H., Yaman, E., Büyükberber, S. Outcome of newly diagnosed glioblastoma patients treated by radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide: a long-term analysis. Tumori. 95 (2), 191-197 (2009).
- Minniti, G., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma in elderly patients. Journal of Neuro-Oncology. 88 (1), 97-103 (2008).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. The New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Delgado-López, P., Corrales-García, E. Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities. Clinical and Translational Oncology. 18 (11), 1062-1071 (2016).
- Wu, X., et al. In vivo tracking of superparamagnetic iron oxide nanoparticle-labeled mesenchymal stem cell tropism to malignant gliomas using magnetic resonance imaging. Laboratory investigation. Journal of Neurosurgery. 108 (2), 320-329 (2008).
- Nakamizo, A., et al. Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the treatment of gliomas. Cancer Research. 65 (8), 3307-3318 (2005).
- Xu, F., Shi, J., Yu, B., Ni, W., Wu, X., Gu, Z. Chemokines mediate mesenchymal stem cell migration toward gliomas in vitro. Oncology Reports. 23 (6), 1561-1567 (2010).
- Park, S., et al. CXCR4-transfected human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells exhibit enhanced migratory capacity toward gliomas. International Journal of Oncology. 38 (1), 97-103 (2011).
- Ho, I., et al. Matrix Metalloproteinase 1 Is Necessary for the Migration of Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells Toward Human Glioma. STEM CELLS. 27 (6), 1366-1375 (2009).
- Bexell, D., Svensson, A., Bengzon, J. Stem cell-based therapy for malignant glioma. Cancer Treatment Reviews. 39 (4), (2012).
- Nouri, F., Wang, X., Hatefi, A. Genetically engineered theranostic mesenchymal stem cells for the evaluation of the anticancer efficacy of enzyme/prodrug systems. Journal of Controlled Release. 200, 179-187 (2015).
- Kauer, T., Figueiredo, J. -L., Hingtgen, S., Shah, K. Encapsulated therapeutic stem cells implanted in the tumor resection cavity induce cell death in gliomas. Nature Neuroscience. 15 (2), 197-204 (2011).
- Bagó, J., Pegna, G., Okolie, O., Hingtgen, S. Fibrin matrices enhance the transplant and efficacy of cytotoxic stem cell therapy for post-surgical cancer. Biomaterials. 84, 42-53 (2016).
- Bagó, J., Pegna, G., Okolie, O., Mohiti-Asli, M., Loboa, E., Hingtgen, S. Electrospun nanofibrous scaffolds increase the efficacy of stem cell-mediated therapy of surgically resected glioblastoma. Biomaterials. 90, 116-125 (2016).
- Loebinger, M., Eddaoudi, A., Davies, D., Janes, S. Mesenchymal Stem Cell Delivery of TRAIL Can Eliminate Metastatic Cancer. Cancer Research. 69 (10), 4134-4142 (2009).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. J. Vis. Exp. (12), e680 (2008).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (41), e1986 (2010).
