Summary
Tilgjengeligheten av somatiske SCs er avgjørende for regenerativ medisin, sykdom modellering og få innsikt i SC egenskaper. Presenterer her vi eksperimentelle strategier for å omprogrammere, i vitro, atskilte voksen celler til sine tilsvarende utvides vev-spesifikke stem/stamfar celler av forbigående uttrykk for enkelt transcriptional co aktivatoren YAP.
Abstract
Her presenterer vi for å isolere primære differensierte celler og slå dem i stammen/stamfar celler (SCs) av den samme linjen av forbigående uttrykk av transkripsjon faktor YAP. Med denne metoden konverteres luminal differentiated (LD) celler i melkekjertlene musen til cellene som viser molekylære og funksjonelle egenskaper mammary SCs. YAP også blir fullt differensiert bukspyttkjertelen exocrine cellene i bukspyttkjertelen duct-lignende progenitors. Tilsvarende til endogene, naturlig SCs, kan YAP-indusert stilk-lignende celler ("ySCs") til slutt utvides som organoid kulturer langsiktig i vitro, uten ytterligere behov for ektopisk YAP/TAZ, som ySCs er utstyrt med en arvelig selv fornyende SC-lignende tilstand.
Reprogramming prosedyren presenteres her tilbyr muligheten til å generere og utvide i vitro progenitor celler av ulike vev kilder fra differensierte celler. Enkel utvidelse av somatiske celler ex vivo har implikasjoner for regenerativ medisin, forståelse mekanismer av svulsten og, mer generelt, for celle og utviklingsbiologi studier.
Introduction
Vev-spesifikke somatiske stamceller (SCs) er avgjørende for vev fornyelse og reparasjon etter skader. Muligheten til å enkelt isolere og unlimitedly utvide ex vivo somatiske SCs representerer et kritisk problem for potensielle regenerativ Therapy og SC programmer i grunnforskning og sykdom modellering. Fremgang i denne retningen, har imidlertid vært begrenset av vanskelighetene med å fange SC delstaten ulike epithelial organer i vitro. Faktisk i flere voksen vev bosatt SCs kan finnes ikke, eller ikke være lett tilgjengelig eller deres antall og regenererende potensial kan bli erodert av aldring eller sykdom forhold. I 2016, begynte vi å fylle dette gapet ved rapportering som uttrykk for en enkelt transcriptional coactivator, YAP (ja-assosiert protein) eller dens nært beslektede protein TAZ (transcriptional aktivator med en PDZ motiv), i terminalt differensierte celler effektivt skaper funksjonelle, utvidbare, ikke-tumorigenic, autologous celle populasjoner som er operativt og molecularly utvisket fra deres tilsvarende vev-spesifikke SCs1. En puls av vedvarende YAP eller TAZ dagene er tilstrekkelig til å indusere utseendet til selvstendig fornye somatiske SCs. Dette er en stabil tilstand som er ikke lenger avhengig av kontinuerlig transgene uttrykk, som det kan overføres gjennom cellen generasjoner uten videre uttrykk for ektopisk YAP/TAZ1. Protokollen presenteres her detaljer prosedyren brukes til å generere de novo epithelial stammen/stamfar celler melkekjertlene og bukspyttkjertelen, fra differensierte celler av disse vev. Denne prosedyren fyller en svart boks i gjeldende omprogrammering/transdifferentiation arena. Største innsats i disse retningene har faktisk så langt sentrert på cellen overgang til en indusert pluripotent stamceller (iPSC) tilstand, etterfulgt av konvertering av disse embryonale og pluripotent SCs i mer differensierte celler. Men er iPSCs tumorigenic en gang introdusert i voksen vev, øke behovet for å utvikle protokoller for deres fullstendig og effektiv differensiering2. Men kommer dette differensiering trinnet, selv når det er mulig, på prisen på langsiktige utvidelsesmuligheter, selv-organisering og orgel repopulation potensialer. Disse er viktige egenskaper for organ gjenfødelse som faktisk er typisk bare av endogene vev-spesifikke SCs og tiden beskrevet YAP-indusert SCs (ySCs). Tilsvarende differensierte direkte transdifferentiation av én celle type til en annen ved hjelp av cocktailer av ulike transkripsjon faktorer også generere celler som mangler essensielle proliferativ og stemness potensielle3.
Fremgangsmåten som er beskrevet her tar også nytte av den nylig introdusert organoid teknologien, som endogene SCs kan utvides og differensiert ex vivo4. YAP-indusert SCs kan generere organoid-forming SCs selv i eksperimentell, biologiske eller sykdom som endogene SCs ikke finnes. Vi ønsker å merke seg at forskjellen med andre reprogramming, type celle plastisitet formidles av YAP kan tilsvare den eneste formen for hjemfall til SC-lignende status som oppstår i levende vev. Reacquisition av SC-lignende trekk er tilknyttet tissue reparasjon eller kreftfremkallende aktivisering5. Selv om unnværlig for homeostase av flere voksen vev, er YAP og/eller TAZ helt avgjørende for regenerasjon, tumor vekst og ekspansjon av somatiske SCs i vitro1,6,7,8 ,9,10,11,12
Protocol
Alle dyr prosedyrer ble utført følge retningslinjene institusjonelle og godkjent av OPBA og helse
1. generasjon YAP-indusert Mammary stilk-lignende celler (yMaSCs)
Merk: Alle medier og løsning komposisjoner for avsnitt 1 angis i tabell 1.
- Isolering av primære mammary celle populasjoner
- Forberede under celle kultur hette: disponibel skalpeller, hyaluronidase løsning, dissosiasjon medium, Hemolytisk løsning, sortering løsning, kollagen I belegg løsning, Ca2 + chelaterande løsning, vask medium #1, vaske middels #2, dispase løsning, mammary 2D kultur medium, isen kalde HBSS/PS.
- For en typisk eksperiment, ofre 10 kvinnelige mus (enten CD-1 C57BL/6 belaste), 8-12 uker gammel av cervikal forvridning. Sterilisere magen med rikelig 70% etanol løsning før disseksjon.
- Dissekere brystkjertlene ved å gjøre en Y-formet snitt langs magen huden og forsiktig skiller kjertler fra peritoneum ved å trekke forsiktig med Dumont tang. Plasser dissekert kjertel i en ikke-celle selvklebende rett med 10 mL is kaldt HBSS/PS (20 kjertler for hver rett), og pass på ikke å bære over alle hud-del.
- Under vev kultur hette, vaske hver kjertel når i 10 mL av fersk HBSS/PS og plassere dem i en tom ikke-celle selvklebende rett (20 kjertler for hver rett). Ikke bruk vev kultur plater, som cellene vil tendere til å holde seg til dem forårsake betydelig tap av materiale.
- Fint hakke brystkjertlene med skalpeller til en homogen blanding av 1 mm3 er oppnådd. Gjenopprette hakket vev fra hver rett i 10 mL av dissosiasjon medium med en 25 mL serologisk pipette å unngå tilstopping og overføre suspensjon i et 50 mL konisk rør pipettering minst 5 x for å disaggregate vev klumper.
Merk: For en effektiv fordøyelse, riktig hakking av vev i trinn 1.1.5 er avgjørende. - Inkuber 1t på 37 ° C med kontinuerlig kraftig risting. Etter 1 h, sjekk homogenate og forlenge inkubering av 10 min hvis klumper er fortsatt til stede. Nedspinning fordøyd vevet 400 x g i 5 minutter ved romtemperatur og kast nedbryting. Resuspend vev pellet i 3 mL Hemolytisk løsning og ruge 3 min på is.
Merk: Hemolyse er en ganske harde behandling, så strenge timing er viktig på dette trinnet. - Vask celler med 10 mL av vask medium #1, Nedspinning fordøyd vevet 400 x g i 5 min og forkaste nedbryting. Resuspend vev pellet i 10 mL for vask medium # 2 og plate i 10 cm vev kultur retter. Inkuber rettene 1t på 37 ° C i en celle kultur inkubator.
Merk: Dette trinnet vil tillate fjerning av flertallet av fibroblaster, som skal holde kultur parabolen. - Gjenopprette celle suspensjon fra retter og hell i en 50 mL konisk rør. Spinn på 400 x g i 5 min og eliminere nedbryting. Vask pellet to ganger på 10 mL av Ca2 + chelaterande løsning av snurrende ned 400 x g i 5 min hver gang. Resuspend pellet i 5 mL av 0,25% Trypsin/EDTA og Inkuber i 5 min på 37 ° C.
- Legg til 5 mL dispase løsning på trypsin løsningen og supplere med DNase jeg 1μg/mL. Pipetter opp og ned minst 5 x gjennom en 1 mL-spissen disaggregate DNA klumper og ruge i 10 min ved 37 ° C, rister hver 3 minutter.
- Legge til 10 mL av vask medium #2 og filter i et nytt 50 mL konisk rør gjennom en 40 μm celle sil. Nedspinning celle suspensjon 400 x g i 5 min og kast nedbryting, sørge for å eliminere alle flytende.
- Rensing av mammary epitelceller av FACS
- Klargjør antistoff blandingen ved å legge 10 μL Lin (mus avstamning antistoff cocktail), 12 μL anti-CD326 (Ep-CAM), til en siste konsentrasjon av 30 ng/mL, 10 μL anti-CD49f, til en siste konsentrasjon av 25 ng/mL, 10 μL anti-CD61, til en siste konsentrasjon av 10 ng/mL , 2,5 μL anti-CD29, til en siste konsentrasjon av 2,5 ng/mL.
Merk: fra denne trinn til trinn 1.3, alltid være i mørket, unngå bleking av fluorescently merket antistoffer. For hver pellet: - Holde et lite antall celler (ved å dyppe en 100 μL tips i pellet) i et separat rør. Resuspend cellene i 500 μL sortering løsning i et FACS rør og holde på isen som umerkede prøven FACS fremgangsmåten.
- Resuspend hver pellet i 200 μL av vask medium #1, tilsett 44,5 μL av antistoff, Pipetter grundig og ruge i 30 min på isen i mørket. Fortynne celle suspensjon i 10 mL av vask medium #1, Nedspinning 400 x g i 5 min og kast nedbryting.
- Resuspend celle pellet i 2 mL sortering løsning og filteret gjennom en cap-sil FACS tubeand videre til FACS-separasjon av celle populasjoner (som i figur 1B). Før du utfører multicolor FACS protokollen, må du korrigere det mulig ringvirkninger av hver fluorochrome i hver av de andre. Dette ruge hver fluorophore-konjugerte antistoffer separat med cellen suspensjon og måle spectral overlapping verdier for alle fluorophores og alle detektorer, via én farge kontroller, for å skape en kompensasjonsmatrise.
Merk: I dette eksperimentet, sorterer utstyrt med 85 μm dyse var ansatt. En typisk forberedelse fra 10 kvinnelige mus vil gi ca 800.000 LD celler. Fortsett til sekundære filtrering hvis klumper danne under FACS prosedyren.
- Klargjør antistoff blandingen ved å legge 10 μL Lin (mus avstamning antistoff cocktail), 12 μL anti-CD326 (Ep-CAM), til en siste konsentrasjon av 30 ng/mL, 10 μL anti-CD49f, til en siste konsentrasjon av 25 ng/mL, 10 μL anti-CD61, til en siste konsentrasjon av 10 ng/mL , 2,5 μL anti-CD29, til en siste konsentrasjon av 2,5 ng/mL.
- Såing av primære mammary LD celler
- Under FACS prosedyren coat en multi godt vev kultur plate med kollagen jeg belegg løsning. Inkuber 1t på 37 ° C, 5% CO2 i en celle kultur inkubator. Fjerne belegg løsningen og vask med vask medium #1 like før plating.
- Vask celler fra FACS prosedyre med 10 mL vaskeløsning #1, spinne ned 400 x g i 5 min og eliminere nedbryting. Resuspend celle pellet mammary 2D kultur medium (500 µL/vel) og kollagen behandlet plate. La cellene sitter i en celle kultur inkubator 48 h for riktig celle vedlegg og spre.
Merk: En typisk sortering fra 10 kvinnelige mus, 6-8 brønner av en 24-vel multi godt plate vil gi en optimal celle tetthet (100 000 celler/vel).
- Induksjon av yMaSCs (YAP-indusert Mammary stamceller)
Merk: Dette trinnet videre, alle prosedyrer bør utføres under BSL-2 forhold.- Forberede mammary kolonien medium. Fersk legge kjelleren membran matrisen til medium like før cellen seeding.
- For induksjon av YAP-indusert mammary stilk celler (yMaSCs), transduce primære LD cellene av lentiviral infeksjon ved å blande ett volum for FUdeltaGW-rtTA virus nedbryting, ett volum for FUW-Tejo-YAP (eller TAZ) nedbryting, med to bind av serum-free mammary 2D kultur medium 2 x konsentrasjoner av kosttilskudd, i et totalt volum på 500 mL. Inkuber celler med lentiviral supernatants 48 h. For en typisk lentiviral forberedelse, se online protokollen22.
- Etter infeksjon, vask tilhenger celler og behandle med mammary 2D kultur medium med 2 µg/mL doxycycline å indusere eksogene YAP (eller TAZ) genuttrykk. Celler som er infisert med tom, EGFP eller YAPS94A uttrykke vektorer eller celler som er infisert med induserbart YAP (eller TAZ) vektorer, men forlater uten doxycycline som negative kontroller.
Merk: Infeksjonen kan valideres av qRT PCR med primere gjelder menneskelige YAP transgene, som beskrevet tidligere1. - Etter 7 dager med induksjon med doxycycline, koble tilhenger celler av inkubasjon 0,05% Trypsin/EDTA (150 μL/vel) i 10 min på 37 ° C; Stopp trypsinization fortynne 1:5 i vask medium #2 (600 μL/vel) og telle celler. Resuspend celler i mammary kolonien medium (1 mL for hver brønn), supplert med 2 μg/mL doxycycline og frø på en clonogenic tetthet av 1000 celler/godt i 24-vel ultralow vedlegg plater.
Merk: Kontroller at mammary kolonien mediet er iskaldt ved kjeller membran matrix tillegg. Kjelleren membran matrisen må alltid være lagret på 20 ° C ved ankomst og tint sakte på 4 ° C over natten; Når tint, må det alltid håndteres på isen, ifølge produsenten retningslinjer. - Når YAP-uttrykke LD celler starte voksende og vokse som maske-lignende kolonier i suspensjon (yMaSC kolonier) (14 dager etter såing), telle og behandle for videre analyse (figur 1 c).
Merk: Negativ kontroll celler (som punkt 1.4.3) vil forbli som enkeltceller. - Fylle kulturen med fersk Mammary kolonien Medium hver 72 h i løpet av 14 dager yMaSC koloni vekst; Dette forberede en aliquot av mammary kolonien medium uten 5% kjelleren membran matrise, supplert med 10 x konsentrasjonen av kosttilskudd og legge til 1:10 av det totale volumet i hver brønn (f.eks 100 μL i 1 mL av totale medium), å unngå overdreven fortynning av matrix suspensjon.
- Sub dyrking av yMaSCs
- Gjenopprette primære koloniene fra den mammary koloni mediet, og oppheve tilknytningen og reseed.
Merk: yMaSC kolonier avledet fra YAP-omprogrammeres LD celler erverve selvtillit fornyelse kapasitet og kan være vellykket sub kulturperler uten ytterligere doxycycline administrasjon (dvs, uavhengig av uttrykket av transgene YAP/TAZ). - Forberede, under celle kultur hette, mammary kolonien medium som i trinn 1.4.1 og melkekjertlene organoid medium.
- Samle hvert utvalg og ruge i overflødig volumet (10:1) av is kaldt HBSS 1t på is, for å solubilize kjelleren membran matrix. Vask kolonier 3 x av sentrifugering 180 x g for 5 min og resuspend i isen kalde HBSS. Inkuber koloniene i 0,05% trypsin/EDTA i 10 min på 37 ° C å få en enkeltcelle suspensjon. Pipetter kolonier opp og ned 10 x med p1000 tips å sikre fullstendig dissosiasjon enkeltcelle nivå.
- Antall og reseed celler i mammary kolonien medium (1 mL for hver brønn) uten doxycycline på en clonogenic tetthet av 1000 celler/godt i 24-vel ultralow vedlegg plater. Gjenta dette passaging prosedyren hver 10-14 dager for å vurdere selvtillit fornyelse.
- Før tredje passering, passasje yMaSC kolonier i organoid kultur forhold, å forbedre yMaSC ekspansjon og tillate dannelsen av mini-kjertler, som selv organisere i en bilayered epitel tett som minner om melkekjertlene i vivo histologiske organisasjon.
- Gjenopprette kolonier fra mammary kolonien mediet som i trinn 1.5.3 og 1.5.4. Resuspend koloniene i 100% vekst faktor redusert kjelleren membran matrise, vurderer for å replate maksimalt 20-25 koloniene for hver brønn av en 24-vel ultralow vedlegg plate i 150 µL av matrix.
- Inkuber plater i en celle kultur inkubator for 40 min ved 37 ° C og la kjelleren membran matrix stivne og deretter overlay gels med 500 μL mammary organoid medium.
- Etter et par dager sjekk for dannelsen av koloniene skjemaet spirende organoids (figur 1E).
- Etter 10-14 dager, passasje eller prosessen til organoids for videre analyse.
- Passasje organoids kulturer, gjenopprette organoids ved å samle hvert utvalg og incubating inne overflødig volum (10:1) av is kaldt HBSS 1t på is, for å solubilize kjelleren membran matrix. Vask organoids 3 x av spinn ned på 180 x g i 5 min og resuspend i isen kalde HBSS.
- Inkuber organoids i 0,05% trypsin/EDTA i 10 min på 37 ° C å få en enkeltcelle suspensjon. Pipetter organoids opp og ned 10 x med p1000 tips å sikre fullstendig dissosiasjon enkeltcelle nivå.
- Reseed som en enkelt celle suspensjon i en dråpe 100% vekstfaktor redusert kjelleren membran matrix (150 μL for hver brønn av en 24-vel ultralow vedlegg plate). La kjelleren membran matrix danner en gel med rugende 40 min ved 37 ° C i en celle kultur inkubator og overlegg gels med 500 μL mammary organoid medium.
Merk: yMaSC organoids kan være cryopreserved ved å utvinne fra 100% kjelleren membran matrix kultur som i trinn 1.5.13, unngå trypsinization. Lagre i mammary organoid medium med 10% DMSO. - Raskt fryse yMaSC organoids ved-80 ° C og deretter bevart i flytende nitrogen.
- Gjenopprette primære koloniene fra den mammary koloni mediet, og oppheve tilknytningen og reseed.
2. generasjon av yDucts
Merk: Alle medier og løsning komposisjoner for del 2 er angitt i tabell 2.
- Isolering av primære bukspyttkjertelen acini
- Plasser disseksjon tang og saks i 70% EtOH og forberede under en celle kultur hette acinar kultur medium, 15 mL for hver mus; acinar utvinning medium, 60 mL for hver mus; PBS/PS; lagerløsning collagenase jeg; collagenase jeg løsningen A, 15 mL for hver mus; nøytralisert rotte hale kollagen jeg løsning. Nøytralisere rotte hale kollagen jeg pH = 7, ved å justere først med 0,1 N NaOH å bufre eddiksyre i som kollagen er oppløst, og deretter med 10N HCl. Dilute til 2,5 mg/mL i PBS/PS. holde rotte hale kollagen jeg og alle reagenser på isen for å nøytralisere den. Ofre 6 til 9 uker gammel mus til riktige genotype.
- Plasser hver musen på ryggen, og vask magen med 70% etanol løsning. Gjøre en langsgående snitt langs bukveggen. Finn og analysere bukspyttkjertelen (ved hjelp av milten som guide) og plasserer den i en 10 cm ikke-celle selvklebende rett i 10 mL isen kalde PBS/PS. overføre rettene umiddelbart under celle kultur hette. Dette trinnet og utover, fungere alltid under celle kultur hette.
- Overføre hver bukspyttkjertelen i en ny ikke-celle selvklebende rett tidligere fylt med 7 mL av collagenase jeg løsningen A.
- Raskt hakke hver bukspyttkjertelen med et par av disponibel skalpeller, å få en homogen vev suspensjon av omtrent 1 mm3 fragmenter.
Merk: Det er viktig å merke seg at denne fremgangsmåten bør ta mer enn 2 min for optimal celle levedyktighet. - Inkuber parabolen for collagenase fordøyelsen ved 37 ° C, 5% CO2 i en celle kultur inkubator for 10 min, rister hver 3 minutter for å sikre homogen vev fordøyelsen.
- Gjenopprette fordøyd vevet i en 50 mL konisk tube (en for hver bukspyttkjertelen), vaske parabolen med 10 mL av Acinar vask Medium og plasserer den i samme 50 mL konisk rør, pipettering fordøyd vev opp og ned ikke mer enn 3 x.
- Nedspinning fordøyd vevet i 5 min 100 x g ved 18 ° C og fjerne nedbryting.
Merk: Nedspinning cellene på 18 ° C til lavere collagenase aktivitet i dette trinnet. - Resuspend vev pellets i 7 mL av collagenase jeg løsningen A og hell denne løsningen i en ny 10 cm ikke-celle selvklebende rett.
- Inkuber parabolen for en ny runde med collagenase fordøyelsen ved 37 ° C i 10 min som i trinn 2.1.5, rister hver 3 minutter for å sikre homogen vev fordøyelsen. I mellomtiden Forbered en ren 50 mL konisk tube for hver bukspyttkjertelen toppet med en 100 μm celle sil.
- Gjenopprette fordøyd vevet og passerer gjennom 100 μm celle silen macerating vev med et sterilt 10 mL sprøytestempelet (Husk å nøye trykk ned vevet, unngå skjær krefter tangential til sil overflaten). Vask parabolen med 10 mL av acinar vask medium, og denne 10 mL passere samme 100 μm celle silen.
- Nedspinning fordøyd vevet i 5 min 100 x g ved 18 ° C og fjerne nedbryting.
- Gjenopprette vev pellets med 10 mL av acinar vask medium. Overføre celle løsningen i en 50 mL konisk tube allerede inneholder ytterligere 10 mL av fersk acinar vask medium, unngå overdreven pipettering for rørets av pellet.
- Nedspinning fordøyd vevet i 5 min 100 x g ved 18 ° C og fjerne nedbryting.
- Nøye resuspend fordøyd vevet i 6 mL av acinar utvinning medium og distribuere det i 2 wells av 6-vel multi godt vev kultur plate, 3 mL. Under en stereomicroscope nøye vurdere kvaliteten på acinar isolasjon, som vises som en homogen suspensjon av acinar sektorgrupper, med en mindre andel av enkeltceller (se figur 2B); fjerne alle store vev klumper slutt presentere (vanligvis vises også for det blotte øye), ved pipettering dem ut av løsningen.
- Såing av primære bukspyttkjertelen acini
- Inkuber fordøyd acinar klynger på 37 ° C i en celle kultur inkubator for 2t, slik at celle utvinning.
- Under celle utvinning pelsen 48-og flere brønner med 100 μL men rotte hale kollagen jeg og ruge 1t på 37 ° C i en celle kultur inkubator å tillate en hydrogel pute til skjemaet.
- Etter 2 timer med celle utvinning, samle acinar celle suspensjon i en konisk tube, spinne ned i 5 min 100 x g ved 18 ° C og fjerne nedbryting.
- Resuspend acini i riktige volumet av acinar kultur medium (150 μL for hver brønn av en 48 godt vev kultur plate). Frø hver dissosiert bukspyttkjertelen i 16 brønner å oppnå en optimal tetthet (100-120 acinar klynger/vel).
- Fortynne denne acinar hjuloppheng med en lik mengde men rotte hale kollagen jeg løsningen, holde rør på is. Bland nøye og raskt frø celle suspensjon på kollagen pute beskrevet i 2.2.2 (300 μL for hver brønn av en 48 godt multi godt vev kultur plate).
- Inkuber 1t på 37 ° C i en celle kultur inkubator å tillate en hydrogel skjemaet.
- Induksjon av bukspyttkjertelen organoids
- Overlegg kollagen hydrogels med 500 μL av Acinar kultur Medium med 2 μg/ml doxycycline for YAP-avhengige induksjon av bukspyttkjertelen organoids fra R26-rtTAM2; Tejo-YAPS127A mus; negative kontroller tilbys av wt celler dyrket i samme forhold eller R26-rtTAM2; Tejo-YAPS127A celler kultivert i fravær av doxycycline.
- Kultur acinar celler i Acinar kultur Medium supplert med 2 μg/mL doxycycline for 5 til 7 dager forfriskende kultur medium (300 μL/vel) hver 48t og etter organoid dannelsen av morfologiske endringer mot cyste danner ductal-lignende strukturer ( Figur 2C). Når organoids er dannet, celler kan passaged i bukspyttkjertelen organoid kultur forhold eller høstet for videre analyser (f.eks: RNA utvinning, immunofluorescence).
- Sub dyrking av bukspyttkjertelen organoids
- For å vurdere deres selvtillit fornyelse kapasitet, clonally passasje YAP-indusert bukspyttkjertelen organoids (yDucts) i tredimensjonale kjelleren membran matrise hydrogels (bukspyttkjertelen organoid kultur betingelser) uavhengig av eksogene YAP/TAZ forsyning (dvs. uavhengig av doxycycline administrasjon).
- Forberede Trypsin 0,05%/EDTA; 100% vekstfaktor redusert kjelleren membran matrise; Bukspyttkjertelen Organoid Medium og Collagenase jeg løsningen B.
- Forberede en 15 mL konisk rør med 4 mL Collagenase jeg løsning B for hver brønn for å være passaged.
- Forkaste kultur medium, nøye pakke hydrogels fra brønnene ved mild aspirasjon og overføre dem til konisk rør.
- Inkuber rør på 37 ° C for 30 min, med kontinuerlig kraftig risting for å tillate komplett fordøyelsen av kollagen matrix (Sjekk hvert 10 min før hydrogel er helt solubilized). Nedspinning gjenopprettede cellene på 750 x g i 2 minutter og fjerne nedbryting.
- Inkuber gjenopprettede celler i 1 mL av Trypsin 0,05%/EDTA i 10 min på 37 ° C å få en enkeltcelle suspensjon. Fortynne trypsin med 9 mL PBS 1 x Nedspinning 750 x g i 2 minutter og fjerne nedbryting.
- Resuspend celle pellet i isen kalde vekstfaktor redusert kjelleren membran matrix og frø i svært lav vedlegg plater (vanligvis en dråpe 150 μL i en godt av en 24-vel plate).
- La kjelleren membran matrix hydrogel stivne av rugende plater i en celle kultur inkubator 40 min ved 37 ° C og deretter overlay med bukspyttkjertelen Organoid Medium (500 μL for hver brønn). yDucts vil vokse som cyste-lignende organoids i 7-10 dager (figur 2D).
- For ytterligere passaging organoids kan fjernes fra kjelleren membran matrisen ved inkubasjon i isen kalde PBS 1 x for 30 min, etterfulgt av vask 3 ganger av spinn nede på 180 x g for 5 min og rørets i isen kalde PBS 1 x å unngå matrix carryover. Organoids er så atskilt med trypsin 0,05% for 10 min å få en enkeltceller suspensjon og reseeded i frisk kjelleren membran matrix og deretter kledde med bukspyttkjertelen Organoid Medium (som 2.4.7-2.4.8).
- yDuct organoids kan være cryopreserved i flytende Nitrogen ved å utvinne fra 100% kjelleren membran matrix kultur som i trinn 2.4.9, unngå trypsinization, og lagre i bukspyttkjertelen Organoid Medium supplert med 10% DMSO.
- yDuct organoids er raskt frosset på-80 ºC og deretter bevart i flytende Nitrogen.
Representative Results
Generering av yMaSCs
En oversikt over den eksperimentelle strategien for å omprogrammere primære mammary LD celler av forbigående uttrykk for YAP vises i figur 1A. Primære mammary LD epitelceller blir renset ved fluorescerende-aktivert celle sortering13. Figur 1B viser en typisk sortering prosedyre å få tre distinkte subpopulasjoner: Basal celler (EpCAMlavCD49fhøyCD61-), Luminal stamfar (LP) celler (EpCAMhøyCD49flavCD61+ ) og LD celler (EpCAMhøyCD49flavCD61-). Forsiktig gating av de tre subpopulasjoner er avgjørende for å isolere en ren forberedelse av LD celler, som er fullt differensiert og helt vekst arrestert når seeded i melkekjertlene kolonien danner forhold (se figur 1 c, venstre panel). Motsatt, når indusert uttrykke eksogene YAP, LD celler starter proliferating å danne lett gjenkjennelig tett epithelial kolonier i 5% kjelleren membran matrix suspensjon kulturer (figur 1 c). Effektiviteten av reprogramming, attestert rundt 3% for en typisk eksperimentet, kan være scoret ved å telle antall kolonier over antall enkeltceller opprinnelig seeded i kjelleren membran matrix suspensjon kulturer (figur 1 d). Deretter omprogrammeres luminal celler (yMaSCs) kan passering i 100% kjelleren membran matrise organoid kultur forhold (se ordningen i figur 1A), selv organisere i komplekse organoid-lignende strukturer som utvikler rundt flere lumen og vise bemerkelsesverdig selvtillit fornyelse evne til selv i fravær av doxycycline (dvs. i fravær av transgene YAP uttrykk) (figur 1E). Histologisk, yMaSC-avledet organoids vise et basale lag (K14 positive), overfor kjelleren membran matrix rekonstituert ECM og et luminal lag (K8 positiv), overfor lumen-lignende hulrom i organoid (figur 1F). Denne arkitekturen er utvisket fra av organoids dannet av innfødte MaSCs (figur 1F).
Generering av yDucts
En oversikt over den eksperimentelle strategien å omprogrammere primære bukspyttkjertelen acini av forbigående uttrykk for YAP vises i figur 2A. Hele acinar klynger er isolert fra hoveddelen av bukspyttkjertelen vev av en kombinasjon av mild dissosiasjon og størrelse eksklusjon gjennom filtrering. En typisk forberedelse vises i figur 2B. Etter isolasjon, skal acinar celle klynger vises som en suspensjon av exocrine acinar enheter av homogen størrelse, med ingen kontaminering av endokrine Langerhans holmer eller fragmenter av bukspyttkjertelen ductal treet og minimal avstandtagen til enkeltceller. Forurensning av endokrine holmer eller ductal fragmenter er en indikasjon på mangelfull selektiv filtrering (trinn 2.1.10), muligens på grunn av harde håndtering; uønsket dissosiasjon av acinar klynger til enkeltceller kan skyldes overdreven collagenase behandling eller Ubufret aktivitet av proteolytisk utgitt av vev, som kan være dempet av ekstra SBTI behandling.
En typisk acinar reprogramming eksperiment vises i figur 2C; innen 5-7 dager etter kultur i 3D kollagen-basert hydrogel i nærvær av doxycycline, bukspyttkjertelen acini avledet fra R26-rtTAM2/Tejo-YAPS127A mus lett slå inn duct-lignende klynger (som vi kalt yDucts), komponert av en tynn monolayer av epitelceller som sprer rundt en voksende sentral hulrom. Reprogramming effektiviteten, som er rundt 70% for en typisk eksperiment, kan måles lett av scoring antallet duct-lignende klynger over antall seeded acini (figur 2D). Kontrollen negative celler, som er R26-rtTAM2 / + celler eller R26-rtTAM2/Tejo-YAPS127A celler igjen uten doxycycline, alltid forbli etter mitotisk acinar klynger i disse kultur forhold, som tidligere rapportert1 ,14,15. Omprogrammeres yDucts kan deretter bli passaged på enkeltcelle nivå i Matrigel-baserte organoid kultur forhold16 (se ordningen i figur 2A), viser bemerkelsesverdig selvtillit fornyelse evne til selv i fravær av doxycycline (dvs. i fravær av transgene YAP uttrykk) (figur 2E).
Figur 1: Isolasjon av primære mammary LD celler og induksjon av mammary stamceller. (A) skjematisk fremstilling av den eksperimentelle prosedyren vedtatt for å omprogrammere primære mammary LD celler. (B) representant FACS-tomter illustrerer en typisk sortering prosedyre å rense LD celler. i) avstand celler er gated ifølge fremover og side scatter for levende celler (P1, blå); II) befolkningen P1 deretter videre Portes ifølge sin Lin profil: subpopulasjon avstamning-negativ celler (P2, grå) velges, unntatt avstamning-positive blodkreft celler. III) befolkningen P2 deles så inn i en EpCAMhøy (P3; gul + grønn) og en EpCAMlav (P6, rød) subpopulasjoner; IV) P3 og P6 er deretter videre gated etter sin CD61/CD49f-profil i tre subpopulasjoner: EpCAMlavCD49fhøyCD61- Basal celler (P7, rød), EpCAMhøyCD49flavCD61+ LP celler (P8, gul) og EpCAMhøyCD49flavCD61- LD celler (P9, grønn). (C) bilder er illustrerende for LD celler, infisert med de angitte konstruerer, evnen til å danne mammary kolonier 15 dager etter seeding mammary kolonien medium. Bare uttrykk for YAP celler sving inn colony-forming celler, mens negativ kontroll celler (EGFP-infisert) forblir som vekst-arrestert enkeltceller. Skala bar = 50 μm. (D) kvantifisering av kolonien danner evne til angitte celler, som (C). Dataene presenteres som betyr + SD og er representant for fem uavhengige eksperimenter, hver med seks tekniske gjentak. (E) representativt bilde av YAP-omprogrammeres mammary stilk cellen som celler (yMaSCs) etter 12 dager i organoid kultur forhold i frisk tredimensjonale 100% kjelleren membran matrix hydrogel i fravær av Doxycycline. Skala bar = 100 μm. (F) representant immunofluorescence bilder for basale markøren K14 (grønn) og luminal markøren K8 (rød) av organoids avledet fra de angitte cellene, etter 12 dager i organoid kultur forhold. Skala bar = 10 μm. Dette tallet er gjengitt fra Panciera et al., 20161. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Isolering av primære bukspyttkjertelen acinar celler og induksjon av bukspyttkjertelen progenitors. (A) skjematisk fremstilling av den eksperimentelle prosedyren vedtatt for å omprogrammere primære bukspyttkjertelen exocrine acinar celler. (B) representativt bilde av primære bukspyttkjertelen acini bare etter isolasjon prosedyren (trinn 2.1.14). Acinar preparatet skal vises som en homogen suspensjon av acinar sektorgrupper, med minimal tilstedeværelsen av enkeltceller. Skala bar = 400 μm. (C) representant bilder av primære bukspyttkjertelen acini avledet fra R26-rtTAM2 (øvre panel)eller R26-rtTAM2; Tejo-YAPS127A (lavere paneler) mus og kultivert i 3D kollagen jeg-basert hydrogel for 5 dager med eller uten Doxycycline (doxy), som angitt. Bare konvertere uttrykk for YAP primære acini cellene vokser som cyste som organoid etter Doxycycline. Skalere barer = 70 μm. (D) kvantifisering av bukspyttkjertelen acini evnen til å danne ductal organoids på transgene YAP overuttrykte som (C). Dataene presenteres som betyr + SD og er fem uavhengige eksperimenter, med fire tekniske gjentak. (E) representativt bilde av YAP-reprogramed ductal-lignende celler (yDucts) etter tre passasjer i frisk tredimensjonale 100% kjelleren membran matrix hydrogel i fravær av Doxycycline. Skala bar = 130 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Isolering av primære mammary celler | |
| Ca2 + chelaterande løsning | Butikken på 4 ° C |
| EDTA | 0.02% w/V |
| PBS | |
| Kollagen jeg belegg løsning | |
| Eddiksyre 0.02N, pH 3,23 | |
| Rotte hale kollagen (belegg) | 1:50 |
| Dispase løsning | Butikken på 4 ° C |
| Dispase | 5 mg/ml |
| PBS | |
| Dissosiasjon Medium | |
| DMEM:F12 | |
| Hyaluronidase lagerløsning | 400 U/mL |
| Penn/Strep | 1 x |
| Lagerløsning collagenase jeg | 600 U/mL |
| Haemolytic løsning | Butikken på 4 ° C |
| NH4Cl løsning | 1 deler |
| TrisBase 20.6 finans | 9 deler |
| justere pH til 7.2 | |
| HBSS/PS | Butikken på 4 ° C |
| HBSS | |
| Penn/Strep | 2 x |
| Hyaluronidase lagerløsning | Filteret 0,2 µm, butikken på 4 ° C |
| Hyaluronidase fra storfe testiklene (pulver) | 2000 U/mL |
| Natrium fosfat Buffer 1 M pH7.3 | |
| NH4Cl løsning | Lagre på T. amb. |
| H2O | |
| NH4Cl | 7.1 finans |
| justere pH til 7.65 | |
| Sortering løsning | Filteret 0,2 µm, butikken på 4 ° C |
| BSA | 0,1% |
| EDTA | 1 mM |
| HEPES pH 7 | 25 mM |
| PBS | |
| Vask Medium #1 | |
| DMEM/F12 | |
| Penn/Strep | 1 x |
| Vask Medium #2 | |
| DMEM/F12 | |
| FBS | 5% |
| Penn/Strep | 1 x |
| Mammary 2D kultur medium | |
| DMEM/F12 | |
| FBS | 2% |
| heparin | 4 mg/mL |
| L-glutamin | 1 x |
| murine bFGF | 10 ng/mL |
| murine EGF | 10 ng/mL |
| Penn/Strep | 1 x |
| Induksjon og Passaging av yMaSCs | |
| Mammary kolonien Medium | |
| DMEM:F12 | |
| FBS | 5% |
| heparin | 4 µg/mL |
| L-glutamin | 1 x |
| Matrigel (legge umiddelbart før såing) | 5% |
| murine bFGF | 20 ng/mL |
| murine EGF | 10 ng/mL |
| Penn/Strep | 1 x |
| Mammary Organoid Medium | |
| Avansert DMEM:F12 | |
| B27 | 1 x |
| GlutaMax | 1 x |
| heparin | 4 µg/mL |
| Hepes | 1 x |
| menneskelige Noggin | 100 ng/mL |
| murine bEGF | 20 ng/mL |
| murine EGF | 50 ng/mL |
| R-Spondin 1 | 1 µg/mL |
Tabell 1: generasjon yMaSCs. Sammensetningen av alle forskjellige kultur medier og lobbyer for isolering av primære mammary LD celler og induksjon av yMaSCs (del 1).
| Isolering av primære bukspyttkjertelen acini | |
| Acinar kultur Medium | |
| BPE | 50 µg/mL |
| BSA | 0,1% |
| Deksametason | 1 µg/mL |
| FBS | 0,1% |
| ITS-X | 1 x |
| Penn/Strep | 1 x |
| SBTI | 0,2 mg/mL |
| Waymouth's Medium | |
| Acinar vask Medium | |
| BSA | 0,1% |
| Penn/Strep | 1 x |
| RPMI Medium | |
| SBTI | 0,2 mg/mL |
| Acinar utvinning Medium | |
| Acinar kultur Medium | |
| FBS | 30% |
| Collagenase jeg løsningen A | |
| Acinar vask Medium | |
| Lagerløsning collagenase jeg | 360 U/mL |
| PBS/PS | Butikken på 4 ° C |
| PBS (fosfat-bufret saltvann) | |
| Penn/Strep | 1 x |
| Lagerløsning collagenase jeg | Butikken på 20 ° C |
| Collagenase, type jeg (pulver) | 6000 U/mL |
| PBS | |
| Passaging av bukspyttkjertelen organoids | |
| Collagenase jeg løsningen B | |
| PBS 1 x | |
| Lagerløsning collagenase jeg | 240 U/mL |
| Bukspyttkjertelen Organoid Medium | |
| Avansert DMEM/F12 | |
| B27 | 1 x |
| gastrin | 10 nM |
| menneskets FGF10 | 100 ng/mL |
| menneskelige Noggin | 100 ng/mL |
| murine EGF | 50 ng/ml |
| N-Acetylcysteine | 1,25 mM |
| Nikotinamid | 10 mM |
| Penn/Strep | 1 x |
| R-Spondin 1 | 1 mg/mL |
| SBTI | 0,2 mg/mL |
Tabell 2: generasjon yDucts. Sammensetningen av alle forskjellige kultur medier og lobbyer for isolering av primære acinar celler og induksjon og passaging av yDucts (inndeling 2.)
Discussion
Her presenterer vi for å omprogrammere ex vivo terminalt differensiert epitelceller av ulike vev i sine tilsvarende vev-spesifikke progenitor celler (eller ySCs) av forbigående uttrykk for YAP, som rapportert tidligere1. Vi har detaljerte fremgangsmåter: en slik at omprogrammering av FACS-renset celler gjennom lentiviral vektorer og en ny en som unngår viral infeksjon og tar nytte av transgene YAP uttrykk. Hver protokoll presenterer en effektiv strategi for å isolere og kultur primære differensierte celler og en strategi for å fremtvinge eksogene YAP genuttrykk i differensierte celler, genererer de novo somatiske vev-spesifikke utvides stilk celler (se skjemaer i tallene 1A og 2A).
Vi viste at isolasjon strategier her presentert effektivt isolere en ren befolkning av differensierte celler, som demonstrert av det faktum at vi aldri oppdaget noen utvekst fra negativ kontroll prøver (tall 1 c og 2 C).
Lentiviral vektorer brukt i denne studien omprogrammere primære mammary LD celler, er doxycycline induserbart, tilbyr muligheten for en stram kontroll av transgene uttrykket; Dette gjør det mulig for å slå på og av eksogene YAP uttrykk på vil. Spesiell oppmerksomhet bør plasseres unngå bruk av en overdreven viral titer, så dette kan være skadelig tanke reprogramming effektivitet. Ved primær acinar celler byttet vi til en fullt transgene tilnærming for å få en YAP-avhengige omprogrammering med minimal manipulasjoner. Denne siste strategien er også spesielt egnet for primære bukspyttkjertelen acini, isolert acinar klynger er neppe mottakelig for lentiviral infeksjon og svært skjøre. Transgene strategi ansatt tilbyr samme fordelen av doxycycline-avhengige lentiviral vektorer for tett kontroll av genuttrykk. Videre bærer transgene strategien utnyttes med primære bukspyttkjertelen acini fordelen av en mye høyere reprogramming effektivitet sammenlignet den viral-indusert omprogrammering mammary LD celler. Utover de ulike iboende plastisitet knyttet til cellene stammer fra forskjellige vev, kan høyere frekvensen av bukspyttkjertelen omprogrammering utledes fra høyere effektiviteten av uttrykk forbundet til uniform og autonome YAP uttrykk i alle explanted celler. Spesielt, har vi vist at eksogene YAP er ikke lenger nødvendig etter generasjon av ySCs (yMaSC kolonier og yDucts), uten at det påvirker deres selvtillit fornyelse kapasitet. Dette er fordi ySCs reaktivere endogene YAP/TAZ og bruke dem for selvtillit fornyelse når eksogene YAP slås av1.
Vi validert forestillingen om at ySCs faktisk kommer fra differensierte celler ved å kontrollere cellen av opprinnelsen til våre reprogramming eksperimenter gjennom genetisk avstamning-sporing valideringer1.
Omfattende karakteriseringySCs viser at YAP-indusert omprogrammering genererer normal somatiske SCs1 som jeg) på transcriptomic nivå, ySCs vise massiv overlapper med innfødte SCs; II) ySCs vise differensiering potensielle og kan generere en multilineage avkom alltid begrenset til identiteten til deres vev av opprinnelse; III) ikke-tumorigenic når transplantert i vivoySCs er ikke forvandlet.
Her beskriver vi også prosedyrer for å opprettholde og utvide i kultur både yMaSCs og yDucts som organoids innebygd i 100% kjelleren membran matrise hydrogels. Disse forholdene tillater for selv-organisering av ySCs i tredimensjonale organoids som sikrer opprettholdelse av stemness egenskaper langsiktig i kultur, slik at å utvide dette stammer bestander på vilje for nedstrøms analyser og programmer. For ukjente årsaker vi kunne yMaSC organoids ved å plassere infisert LD celler direkte i organoid oppdrettsforholdene 7 dager etter doxycycline behandling i plast vev kultur plate; med andre ord, er det mellomliggende vekst trinnet i mammary kolonien forhold viktig. I våre hender krever enda innfødte MaSCs mammary kolonien betingelser før passaging i organoid kultur. Videre oppnås mest effektive organoid resultatet når vi unngå dissociating primære koloniene i enkeltceller, men heller overføre intakt koloniene i organoid kultur forhold.
Organoid oppdrettsforholdene bærer også fordelen av å gi muligheten til å cryopreserve ySCs, forutsatt at organoids gjenopprettes fra deres matriser, unngå celle dissosiasjon før kryonisk bevaring i nitrogen bad.
YAP omprogrammering prosedyren presentert kan konvertere distinkt forskjellige celletyper avledet fra forskjellige voksen vev til deres tilsvarende vev-spesifikke stamceller (vi har testet den med cellene mammary, bukspyttkjertelen og neuronal)1. Til forskjell fra iPSCs eller andre reprogramming innsats, kan YAP/indusert SCs opprettholde minnene om deres vev av opprinnelse. Av notatet, de differensiering av somatiske celler i celler med stilk-lignende egenskaper er den eneste formen for celle skjebne plastisitet og omprogrammere observert i vivo, for eksempel etter vevsskade, og å støtte sårheling5,17 , 18 , 19 , 20. det er bemerkelsesverdig at YAP og TAZ er hovedsakelig unnværlig for normal homeostase, men avgjørende for reparasjon av vev i flere vev11,21. Konsekvent med en fysiologisk funksjon av reprogramming trinnene som beskrives her, vist YAP/TAZ nylig seg å være nødvendig i intestinal gjenfødelse musen modeller pasienter med ulcerøs kolitt ved å få en konvertering av voksen intestinal celler i en reparasjon epitel som viser funksjonene i fosterets gut19. YAP omprogrammering dermed utvider gjeldende indusert celle plastisitet strategier ved å gi et middel til å generere somatiske stamceller, en stat som har vært så langt utfordrende for å fange i vitro. Denne kan hvis utvidet også til menneske-avledet celler, ha bred relevans fra regenerativ medisin programmer til studiet av somatisk stemness og for utvidelse av somatiske stilk celler i vitro.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker F. Camargo for gave Tejo-YAPS127A mus; R26-rtTAM2 mus (stock #006965) ble kjøpt fra Jackson laboratoriet. Vi takker Chiara Frasson og Giuseppe Basso hjelpen FACS prosedyrer. Dette arbeidet er støttet av AIRC spesielle Program molekylær Clinical Oncology '' 5 promille '' og en AIRC PI-Grant S.P, og Epigenetics flaggskip prosjektet CNR-Miur gir S.P. Dette prosjektet har mottatt finansiering fra europeiske Research Council (ERC) under EUs horisonten 2020 forskning og innovasjonsprogram (gi avtalen DENOVOSTEM nr. 670126).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL sterile syringes | Rays | 10LC | |
| 100 mm cell strainer | Corning | 352360 | |
| 15 mL sterile conical tubes | Corning | 430052 | |
| 24-well ultra low attachment plates | Costar | 3473 | |
| 40 mm cell strainers | Corning | 352340 | |
| 48-well multiwell plates | Corning | 353078 | |
| 50 mL sterile conical tubes | Corning | 430290 | |
| 6-well multiwell plates | Corning | 353046 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634028 | |
| B27 supplement (50x) | Gibco | 17504001 | |
| BPE | Gibco | 13028014 | |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| Collagenase, type I | Sigma | 17018029 | |
| dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| Dispase | Gibco | 1705-041 | |
| Disposable scalpels | Swann-Morton | 0503 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DnaseI | Roche | 11284932001 | |
| doxycycline hyclate | Sigma | D9891 | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 51976 | |
| FACS tubes (with strainer caps) | Falcon | 352235 | |
| FBS | Gibco | 10270106 | |
| FITC anti-mouse CD326 (Ep-CAM) | BioLegend | 118208 | |
| FUdeltaGW-rtTA | Addgene | #19780 | |
| FUW-tetO-EGFP | Addgene | #84041 | used as negative control |
| FUW-tetO-MCS | Addgene | #84008 | used as negative control |
| FUW-tetO-wtYAP | Addgene | #84009 | |
| FUW-tetO-YAPS94A | Addgene | #84010 | used as negative control (transcriptionally dead YAP mutant) |
| GlutaMax | Gibco | 35050061 | |
| HBSS | Gibco | 24020117 | |
| HCl | Sigma | 30721 | |
| heparin sodium salt | Sigma | H3149 | |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| human R-Spondin1 (His Tag) | Sino Biological | 11083-H08H-5 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H3506 | |
| ITS-X | Gibco | 51500056 | |
| K-14 antibody | Life Technologies | Ab7800 | |
| K-8 antibody | Life Technologies | Ab14053 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Lin (allophycocyanin [APC] mouse lineage antibody cocktail) | BD Biosciences | 51-9003632 | |
| Matrigel® Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| NaOH | J.T.Baker | 0402 | |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | |
| non-cell adhesive 10 cm dishes (sterile polystirol petri dish ø 94) | ROLL | 18248 | |
| PBS 10x | Euroclone | ECM4004XL | |
| PE Hamster Anti-Mouse CD61 | BD Biosciences | 553347 | |
| PE-Cy5 Rat Anti-Human CD49f | BD Biosciences | 551129 | |
| PE/Cy7 anti-mouse/rat CD29 Antibody | BioLegend | 102222 | |
| Pen/Strep (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Rat Tail Collagen I (coating) | Sigma | 122-20 | |
| Rat Tail Collagen I for 3D culture | Cultrex | 3447-020-01 | |
| recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| recombinant murine EGF | Peprotech | 315-09 | |
| recombinant murine FGF basic (bFGF) | Peprotech | 450-33 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 31870025 | |
| SBTI (Trypsin inhibitor from Glycine max) | Sigma | T6522 | |
| Tris BASE | Roche | 11814273001 | |
| Trypsin-EDTA 0,05% | Gibco | 25300054 | |
| Waymouth medium | Gibco | 31220023 |
References
- Panciera, T. Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ. Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).
- Bar-Nur, O. Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage. Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).
- Xu, J., Du, Y., Deng, H. Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications. Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Blanpain, C., Fuchs, E. Stem cell plasticity. Plasticity of epithelial stem cells in tissue regeneration. Science. 344 (6189), 1242281 (2014).
- Bai, H. Yes-associated protein regulates the hepatic response after bile duct ligation. Hepatology. 56 (3), 1097-1107 (2012).
- Cai, J. The Hippo signaling pathway restricts the oncogenic potential of an intestinal regeneration program. Genes Dev. 24 (21), 2383-2388 (2010).
- Elbediwy, A. Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis. Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).
- Taniguchi, K. A gp130-Src-YAP module links inflammation to epithelial regeneration. Nature. 519 (7541), 57-62 (2015).
- Zhang, W. Downstream of mutant KRAS, the transcription regulator YAP is essential for neoplastic progression to pancreatic ductal adenocarcinoma. Sci Signal. 7 (324), ra42 (2014).
- Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S.
- Azzolin, L. YAP/TAZ incorporation in the beta-catenin destruction complex orchestrates the Wnt response. Cell. 158 (1), 157-170 (2014).
- Stingl, J. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- Means, A. L. Pancreatic epithelial plasticity mediated by acinar cell transdifferentiation and generation of nestin-positive intermediates. Development. 132 (16), 3767-3776 (2005).
- Shi, G. Maintenance of acinar cell organization is critical to preventing Kras-induced acinar-ductal metaplasia. Oncogene. 32 (15), 1950-1958 (2013).
- Huch, M. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. EMBO J. 32, 2708-2721 (2013).
- Fernandez Vallone, V. Trop2 marks transient gastric fetal epithelium and adult regenerating cells after epithelial damage. Development. 143 (9), 1452-1463 (2016).
- Yanger, K. Robust cellular reprogramming occurs spontaneously during liver regeneration. Genes Dev. 27 (7), 719-724 (2013).
- Yui, S. YAP/TAZ-Dependent Reprogramming of Colonic Epithelium Links ECM Remodeling to Tissue Regeneration. Cell Stem Cell. , (2017).
- Pan, F. C. Spatiotemporal patterns of multipotentiality in Ptf1a-expressing cells during pancreas organogenesis and injury-induced facultative restoration. Development. 140 (4), 751-764 (2013).
- Panciera, T., Azzolin, L., Cordenonsi, M., Piccolo, S. Mechanobiology of YAP and TAZ in physiology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (12), 758-770 (2017).
- Lentiviral production and infection. , http://www.bio.unipd.it/piccolo/protocols/YAP_reprogramming_protocols.pdf (2016).
