Summary
Protokollen beskrevet i dette dokumentet bruker musen levator auris longus (LAL) muskler registrere spontan og nerve-utløste postsynaptic potensialer (gjeldende-klemme) og strøm (spenning-klemme) i nevromuskulær krysset. Bruk av denne teknikken kan gi viktig innsikt i mekanismer av synaptic overføring under normal og sykdom.
Abstract
Denne protokollen beskriver en teknikk posten synaptic overføring fra nevromuskulær krysset under gjeldende-klemme og spenning-klemme forhold. En ex vivo utarbeidelse av levator auris longus (LAL) brukes fordi det er en tynn muskel som gir enkel visualisering av nevromuskulær krysset microelectrode impalement på motor endplate. Denne metoden gjør opptak av spontane miniatyr endplate potensialer og strøm (mEPPs og mEPCs), nerve-utløste endplate potensialer og strøm (EPPs og EPCs), samt egenskapene membran motor endplate. Resultatene fra denne metoden inkluderer det quantal innholdet (QC), antall vesicle release nettsteder (n), sannsynligheten for vesicle utgivelsen (prel), synaptic tilrettelegging og depresjon, samt muskel membran tiden konstant (τ m) og input motstand. Bruk av denne teknikken til musen modeller for menneskelig sykdom kan markere viktige patologi i sykdom stater og identifisere romanen behandling strategier. Fullt spenning-klemanordning en enkelt synapse gir denne metoden en av de mest detaljerte analysene av synaptic overføring tilgjengelig.
Introduction
Studere synaptic overføring i nevromuskulær krysset gir innsikt i dynamiske forholdet mellom nervøs og skjelettlidelser muskel-systemer og er en utmerket modell for å undersøke synaptic fysiologi. Levator auris longus (LAL) er en tynn muskel, slik at de nevromuskulær Forbindelsesstykke å være lett å visualisere. Tidligere rapporter har beskrevet bruke LAL undersøke synaptic narkotika og giftstoffer og har preget de skjelettlidelser muskel fiber egenskapene av LAL1,2. Tallrike studier har brukt LAL undersøke nevromuskulær fysiologi3,4,5,6,7,8. For elektrofysiologi, muligheten til å observere LAL nevromuskulær veikryss gir nøyaktig plassering av microelectrodes på motor endplate og reduserer klemme plassproblemer i innspillingen synaptic overføring. Gjeldende-klemme opptak av muskel membran egenskapene som membran tidskonstant (τm) og inngang motstand (Ri) er lett oppnådd. Disse egenskapene kan videre måles fra samme muskelfibre brukes til å registrere nevromuskulær overføring, slik at for en direkte sammenligning av synaptiske funksjon i muskel membran egenskapene. Analyse av disse dataene gir innblikk i de fysiske mekanismene av mange neuromuscular sykdommen og USA endret aktivitet.
Et viktig aspekt av teknikken beskrevet her er bruk av spenning-klemme for synaptic innspillinger, som er ikke underlagt de ikke-lineære funksjonene i gjeldende-klemme og er uavhengig av egenskapene muskel membran. Fordeler ved spenning-klemme i motsetning til gjeldende-klemme undersøke nevromuskulær overføring ble etablert av banebrytende innsats i 1950-tallet9. Under gjeldende-klemme er EPPs som overskrider 10-15 mV i amplitude ikke en lineær produkt av mEPP amplitude9. For eksempel, hvis den gjennomsnittlige mEPP 1 mV, en EPP 5 mV kan antas for å være av 5 mEPPs (QC 5); mens en EPP 40 mV blir produktet av mer enn 40 mEPPs. Denne ikke-linearitet på større EPPs oppstår fordi drivkraft for EPP, som er forskjellen mellom membran potensialet og likevekt potensial for acetylcholin reseptor (~ -10 mV), vesentlig synker under store EPPs. Dette problemet unngås spenning-klemme eksperimenter fordi muskel membran potensialet ikke endres under spenning-klemme eksperimenter. En ulempe er at spenningen-klemme eksperimenter er teknisk vanskelig å fullføre enn gjeldende-klemme opptak. Med dette i bakhodet utviklet McLachlan og Martin en enkel matematisk korreksjon som står for ikke-lineære funksjonene i gjeldende-klemme innspillinger av EPPs10. Rettelsene fungerer bra11,12,13, men viktigere, antar at muskel membran egenskapene ikke er avbrutt.
Muskel membran egenskapene er spesielt viktig å vurdere om studere forhold eller sykdom stater som forstyrrer muskelen. For eksempel er Skjelettmuskel fra R6/2 transgene modellen av Huntingtons sykdom hyperexcitable på grunn av en gradvis reduksjon i hvile klorid og kalium strøm14,15. Som en konsekvens, er mEPPs og EPPs forsterket i R6/2 skjelettmuskelen. Flere faktorer kan sikkert, endre mEPPs og EPPs. Arbeide med en annen modell av Huntingtons sykdom mus (R6/1) fant endringer i EPPs som syntes å være relatert til SNARE-proteiner8. For å vurdere mekanismer forårsaker endret nevromuskulær overføring, ville det være gunstig å eliminere effektene av endrede muskel membran egenskaper ved hjelp av en spenning-klemme. I en fersk studie, ble R6/2 nevromuskulær overføringen studert under både gjeldende - og spenning-klemme forhold ved hjelp av teknikken beskrevet heri. Helheten av motor endplates var spenning-festet med mindre enn 1% feilen ved å plassere to microelectrodes i lengde konstant endplate16. Det ble vist at spenningen-klemme og korrigert gjeldende-klemme poster gitt kontrasterende målinger av nevromuskulær overføring i R6/2 muskel. Dette understreker at det kan være vanskelig å korrigere EPPs for ikke-lineære funksjonene Hvis egenskapene muskel membran har endret og viser fordelene ved å få spenning-klemme poster som er uavhengige av muskel membran egenskapene. Protokollen presenteres her er ideelt for å undersøke forhold eller sykdom stater som påvirker synaptic overføring og egenskapene postsynaptic membran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr prosedyrer ble utført i henhold til Animal Care og bruk komiteen av Wright State University.
1. musen Eutanasi
- Plass musen i en lufttett glass anesthetizing kammer i avtrekksvifte.
- Utsett musen via innånding til en dødelig dose isoflurane (Mette, eller ~ 25%). Drar musen i kammeret til ikke puste kan observeres.
- Fjern musen fra kammeret og utføre en cervical forvridning som sekundær av euthanasia.
2. fjerning av hår fra Dorsal overflaten av hodet, nakken og ryggen
- Bruk en elektrisk barbermaskin for å fjerne meste av håret på dorsal overflaten av hodet, nakke, og baksiden av musen. Også fjerne håret rundt og på venstre øre.
Merk: Vær forsiktig når du barberer huden rundt ørene, huden kan bli fanget i bladene av og skade underliggende muskelvev. - Bruke hår fjerning krem med en bomullspinne barberte området for å fjerne gjenværende hår. Vente ca 1 minutt og skyll hårfjerning krem med vann ved å bruke en klem, og børste vekk eventuelle gjenværende krem eller hår med en bomullspinne og klappe huden tørr.
3. fjerne hud for å avsløre Levator Auris Longus muskelen
- Under en stereo dissecting mikroskop, lag et lite innsnitt (bare dyp nok å trenge gjennom huden) på baksiden av musen på nivå med scapulae. Kutt huden med mikro disseksjon saks, etter banen som vises i figur 1A-B.
- Bruke fine tang (for eksempel nr. 5), trekke opp huden langs kuttet nær scapulae. Bruker våren saks, kuttet connective vev for å skille huden fra underliggende muskelvev mens nærmer øret. Viktigere, kuttet connective vev med blad pekte i huden for å unngå utilsiktet kutting av eksponert muskelvev.
- Regelmessig perfuse utsatt muskler med en fysiologisk saltløsning, for eksempel følgende Na+ eksterne buffer som består av (i mM): 144 NaCl, 4 KCl, 1,2 CaCl2, 0,6 MgCl2, 5 glukose, 1 NaH2PO4, pH 7.4 med NaOH, og har en osmolality på 300 ± 5 mmol/kg. Når connective vev er kuttet til det venstre øret, kuttet huden rundt øret å fjerne huden helt fra musen og kaste den.
Merk: LAL festes på undersiden av øret og kan lett bli skadet under fjerning huden. Det er greit å la ca 1 mm av huden rundt foten av øret å unngå klipping LAL.
4. fjerning av Levator Auris Longus muskel og omkringliggende vev
- Bruker våren saks, start med å kutte muskler som er underlegen LAL, som kobles til ryggraden mellom scapulae. Start på den høyre skulderblad, like til høyre for midtlinjen, og kutte mot rostral slutten av musen, mens resterende på høyre side av midtlinjen. Fortsett å kutte hele veien gjennom til slutten av muskelvev på kraniet.
Merk: LAL er mest overfladiske muskler koblet til den mediale siden av øret og midtlinjen, som vist i figur 2. For flere bilder viser en bok av EC Greene17 utmerket, håndtegnede bilder av LAL. - Bruk tang til å fange kuttet vev umiddelbart til høyre for midtlinjen, deretter forsiktig løfte og begynne cutting vevet mot venstre øre bladene av saksen presset mot kraniet fjerne flere lag av muskler som er dårligere enn den venstre LAL. La alle lagene koblet midlertidig for å unngå tilfeldigvis kutte av LAL under fjerning.
- Kuttet med blad parallelt og presset mot kraniet slik nerve som innervates LAL, som brytes rundt ørekanalen, og går musklene på medial side av øret. Fortsette skjære gjennom ørekanalen, holde så mye av nerve vedlagt som mulig.
Merk: Nerve som leverer LAL grener av ansikts nerve og bør bevares som det vil bli benyttet senere i prosedyren. - Kuttet fettvev som er bare forbi ørekanalen langs den samme banen som vises i figur 1B på ventrolateral delen av øret. Også Skjær langs den venstre skulderblad som ble gjort til høyre fjerne muskelen helt fra musen.
5. Levator Auris Longus muskel isolasjon
- Plass LAL, og omkringliggende vev, i en beholder. Bruke en container som dissekert vevet kan være festet til bunnen, som en Petriskål med silikon elastomer bunn. Bade og vaske ofte vevet i en fysiologisk saltløsning.
- Avskåret høydepunkt av øret langs bunnen av øret, etterlot den cartilaginous del av øret knyttet til LAL. Vend muskler slik at den underlegne siden vender opp (LAL på bunnen av parabolen).
- Plass en PIN-kode, for eksempel et insekt pin, gjennom det øre kanalen å holde prep på plass. Deretter bruker mindre pinner, pin gjenværende vev på motsatt side av midtlinjen av LAL. Ved hjelp av pinsett, trekk huden på den laterale delen av øret å strekke muskelen og plassere en liten pin gjennom huden. Gjenta dette trinnet til vev er godt sikret på maten, som vist i Figur 3.
Merk: Liten disseksjon pinner kan gjøres ved å kutte tips av Akupunkturnåler til ønsket lengde. Disse små pinner minimere skade på vev og kan brukes med vann-nedsenking mikroskop mål med lang arbeide avstander. - Start fjerne musklene (vist i Figur 4), som dekker LAL (auricularis superior, bortfører auris longus, og interscutularis), og de bundet til LAL via bindevev og er spesielt tett nær den midtlinjen, med nr. 5 tang og våren saks.
- Bruke tang til å trekke opp på overliggende muskel laget, kuttet connective vev med blad orientert mot muskel laget blir trukket og ta vare for å unngå klipping eller skår LAL. Skjær mot midtlinjen og stoppe kutte om lag tre fjerdedeler av veien til midtlinjen. Deretter klippet parallelt midtlinjen fjerne hver muskel lag. Oppbevare fjerne muskelgrupper lag til bare LAL gjenstår.
- Fjern noen av de gjenværende bindevevet som dekker LAL, som hjelpemidler i impalement av elektrodene. Forsiktig bruk nr.5 tang til å trekke connective vev fra LAL og skjære den bort med våren saks. Bare fjerne vev som kan gjøres så enkelt uten risiko for skade LAL i prosessen. Fjern alle store nerver som innervate underlegne muscle lagene på dårligere overflaten av LAL som kan hindre visualisering av nevromuskulær veikryss.
6. isolering av Nerve
- Identifisere nerve som innervates LAL bruker en nerve stimulator (for eksempel to platina ledninger koblet til en puls generator); det vil være flere nervene kjører fra ørekanalen til musklene. Touch nerver med nerve stimulator leverer noen gjeldende (gjeldende varierer rundt 5 V). Når muskelen kontrakter, er riktig nerve identifisert.
- Forsiktig ta vevet nær nerve og bruke våren saks for å skille nerve fra vevet rundt øret. For å minimere skade, beholde de fleste av nerve i noen omkringliggende vev, som vil bli brukt senere å sikre nerve til opptak parabolen.
Merk: Motor nerve som innervates av LAL ligger på medial side av ørekanalen åpning. - Hvis bruker en bipolar stimulerende elektrode, fjerne de omkringliggende vev bare rundt en region av nerve, distale fra muskelen. Hvis bruker en suge elektrode, fjerne omkringliggende vev nederst kuttet av nerve.
Merk: Dette er en god sluttpunkt. Dette er en god stoppe. Hvis en pause er nødvendig det dissekert LAL prep kan vedlikeholdes i fysiologiske løsning eller konstant perfusjon for et par timer for å sikre at ikke akkumuleres skadelige metabolitter. Bruke store mengder løsning eller konstant perfusjon for å sikre at ikke akkumuleres skadelige metabolitter. - Neste, løsne og overføre muskelen til en perfusjonsmåling kammer for elektrofysiologi eksperimenter under en oppreist satt mikroskop.
Merk: Bruk en perfusjonsmåling kammer med bløt bunn som vevet kan være sikkert festet (figur 5A). - Feste muskler endene (øre og midtlinjen) og langs kanten av muskelen. Plasser nerve vinkelrett muskelfibre og feste det til bunnen av parabolen gjennom noen overflødig vev som var intakt på slutten av nerve. Holde vevet badet i en fysiologisk saltløsning hele tiden.
Merk: Det er også nyttig å ha rundet, forhøyet materiale direkte under LAL muskelfibre. Dette ekstra støtte hjelpemidler i elektrode impalement og kan gjøres fra en liten del av silikon-elastomer kastet i en 50 mL konisk tube liggende på siden. Avrundet delen av elastomer kan festes til bunnen av perfusjon kammeret ved hjelp av en liten mengde frisk silikon. Et diagram av perfusjon kammeret er vist i figur 5B-C. Muskelfibre kan følge svært tett nylig kastet silikon elastomer (som er veldig hydrofobe) og bli skadet. Det er nyttig å belegge eller blokkere kastet nylig silikon med protein, tilsvarende til blokkering trinn i en immunoblot. For å blokkere det, har vi inkubert nylig kastet silikon i en konsentrert løsning av bovin serum albumin over natten.
7. elektrofysiologi utstyr oppsett
- Klargjøre eller tine dele et fargestoff som hjelp til å visualisere nevromuskulær krysset, som mitokondrie fargestoff 4-(4-diethylaminostyryl)-1-methylpyridinium18, som er lysfølsom og bør lagres fra lys. Også tine elektrode løsninger. Vortex alle dele å sikre at alle solutes er i løsningen. Forberede en fysiologisk saltløsning som inneholder 1 µM μ-Conotoxin GIIIB (μ-CTX) og 80 µM BTS (valgfritt).
- Sikre til perfusjon kammeret LAL til mikroskopet scenen. Plass elektroden referanse i en kopp fylt med 3 M KCl, som er koblet til innspillingen kammeret via en agar broen. Koble referanse elektroden forsterkeren per instruksjonene fra produsenten.
- På dette punktet, plasser elektroden nerve-stimulerende på nerve. Bruke en suge elektrode eller en liten bipolar elektrode, som de arbeider for nervestimulering.
- Plasser stimulerende elektroden som langt fra muskelen som mulig for å minimere antallet av stimulering gjenstander i opptak.
Merk: Stimulerende elektroden bør kontrolleres med en stimulans isolasjon enhet som kan styre spenning amplitude etter behov.
- Plasser stimulerende elektroden som langt fra muskelen som mulig for å minimere antallet av stimulering gjenstander i opptak.
- Sakte høyne spenningen ved å slå spenning knotten på stimulans isolasjon enheten til sammentrekninger er observert. Punktet der sammentrekning ble først observert er terskelen. Når terskelen er identifisert, sette spenningen på stimulans isolasjon enheten 1,5 * terskelen (eller som definert av eksperimentet).
Merk: Figur 6 viser det muskel prep angitt under en oppreist mikroskop og små bipolar elektroden på nerve bruker en Ettgreps bidétbatteri manipulator. Det er gunstig å ha laveste spenningen for stimulering mulig samtidig som tilstrekkelig over terskelen. En lavere stimulans spenning reduserer antall stimulering gjenstander under opptak. Også vil plassere stimulerende elektroden fra muskler redusere størrelsen på stimulering gjenstanden. Noen ganger vil slutten av nerve bli skadet fra dissection, så det kan være nødvendig å eksperimentere med hvor langs nerven stimulator skal plasseres. - Fjerne bading saltvann og erstatte med 5 µM 4-Di-2-Asp. Utsette det LAL prep til 4-Di-2-Asp for 10 min å oppnå tilstrekkelig fluorescens for nevromuskulær krysset visualisering (figur 7).
- Forberede to elektrode løsninger, 3 M KCl og K+ interne løsning bestående av (i mM) 75 aspartate, 5 MgCl2, 15 Ca(OH)2, 5 ATP disodium, 5 phosphocreatine disodium, 5 glutation, 20 MOPPER, 30 EGTA, pH 7.2 med KOH.
Merk: Løsningene bør være forberedt på forhånd; K+ interne løsningen kan lagres i dele på 20 ° C. - Fyll trakk glasset kapillær for spenningen-sensing elektroden med 3 M KCl. Bruk K+ interne løsningen (forberedt i trinn 7.6) for gjeldende sending elektroden; Bruk en smal nonmetallic nål (~ 34 gauge) knyttet til en 1 mL sprøyte enkelt fylle glass kapillærene. Forsiktig Tapp kapillærer å fjerne luftbobler; Kontroller at hver fylt elektroden har en motstand av 10-15 MΩ.
Merk: Kontroller og Merk motstanden av begge elektrodene programmvre data oppkjøpet. - Etter 10 min, utveksle 4-Di-Asp løsningen med normal Ca2 + løsning.
8. identifikasjon av nevromuskulær Junction bruker fluorescens
- Bruker en oppreist mikroskop med standard lyse-feltet og fluorescens belysning, se etter en lyse bånd av fluorescerende grønne nevromuskulær veikryss kjører vinkelrett muskelfibre langs prep som vist i figur 7A. Bruk en lav forstørrelse vann nedsenking målsetting (~ 10 X) til å identifisere nevromuskulær veikryss
Merk: Mikroskopet skal være utstyrt med en FITC kube (Ex: 480/40, Dichroic: 505LP, Em: 535/50), og en LED, laser, halogonlampe eller kvikksølv lampe til fluorescens. Minimere bilde bleking, vekselvis lyse-feltet og fluorescens belysning.
Merk: Dette bandet er vanligvis mer proksimale til bunnen av øret enn til midtlinjen. Bandet er regionen hvor de nevromuskulær veikryssene er mest konsentrerte. - Bytt til en høyere forstørrelse vann nedsenking målsetting (~ 40 X) og identifisere et nevromuskulær knutepunkt på det øverste laget av muskel undersøke med elektrofysiologi (figur 7B).
- Sikre de fylt Pipetter i pipette innehaverne på den aktuelle headstages, henhold til produsentens anvisninger. Bruk micromanipulators for å plassere elektrodene over muskel membranen i 100 µm av identifiserte nevromuskulær krysset (figur 7C). Plasser elektrodene bruker primært lys-feltet mikroskopi; bruke fluorescens for å bekrefte plasseringen av elektrodene i forhold til nevromuskulær krysset.
- Bruk først en lav forstørrelse (~ 10 X) målsetting å finne elektrodene og deretter bytte til en høyere forstørrelse (~ 40 X) målsetting for endelig plassering av elektrodene. Ikke stikke elektrodene inn i muskelen på dette punktet, først stille elektrodene.
9. tuning og Impaling elektrodene
- Når elektrodene er plassert over den ønskede fiberen, null og stille spenning-sensing elektroden bro balansering (eller tilsvarende tilnærming) og nøytralisere elektrode kapasitans henhold til produsentens anvisninger. Også null gjeldende sending elektroden.
- Ta begge elektrodene til overflaten av fiber. Sakte justere plasseringen av elektrodene på vei ned fiber slik at elektrodene være orientert med hensyn til nevromuskulær krysset, som beskrevet i trinn 8.3 og 8.4.
- Når begge elektrodene har kontaktet overflaten av muskel fiber, spidde sløv gjeldende sending elektroden først. Bruke teknikker som buzz (korte pulser av overflødig kapasitans kompensasjon), kort nåværende pulser eller trykke forsiktig tabellen for å forenkle elektrode impalement.
- Overvåke signalet, bruker et oscilloskop eller oscilloskop protokollen i den oppkjøp programvaren, til en negativ membran potensial er funnet, som angir at elektroden har vært impaled.
- Trykke ned skarpere spenning-sensing elektroden på muskelen til nivået av impaled gjeldende sending elektroden. Når begge elektrodene er i tråd med hverandre, spidde spenning-sensing elektroden bruker samme teknikkene med gjeldende sending elektroden.
- Ved vellykket impalement, med kontrolleren for forsterkeren, kan du bruke en konstant negativ holde oppdatert med gjeldende bestått elektroden å kompensere for membran skader på grunn av elektroden impalement. Som cellen begynner å sakte lade mot-80 mV, økning beholdning som trengs for å bringe cellen til den ønskede hvile potensielle (dvs.-80 til-85 mV).
Merk: Unngå opptak av fiber som krever et holdingselskap gjeldende større i absolutt verdi enn-25 nA i vill type muskel å minimere sjansen for opptak av usunn fiber. - Når fiber er stabil for et par minutter på den ønskede hvile potensielle, fortsette å muskel membran egenskaper eller nevromuskulære overføring.
10. registrere Postsynaptic membran egenskaper og Synaptic overføring
- Start med gjeldende-klemme opptak ved å bruke samme antall positive og negative gjeldende trinn for å måle det tilsvarende membran spenning svar, som brukes til å bestemme motor endplate Ri og τm. For å sikre passiv egenskaper, kan du bruke små spenning svar som nå en steady-state og har en lineær spenning gjeldende sammenheng16,19,20. Unngå opptak av fiber med en skadet eller usunn nerve, slik fiber har en mEPP frekvens av > 3 Hz.
- Deretter skriver du inn to elektrode spenning-klemme henhold til produsentens anvisninger. Spenning-klemme fiber på en membran potensialet i-85 mV. Spenning-klemme innstillinger skal oppnå signal-til-støy-forhold at påvisning av mEPCs.
Merk: Opprettholde tilstrekkelig spenning kontroll kan være et problem. Vi bruker to metoder for å minimere problemene. Først er fibrene impaled innen 100 µm av motor endplate som beskrevet tidligere, som er innenfor lengden konstant disse fiber21. Andre bruke vi gjenopprettingsfunksjonen DC på forsterkeren. Denne funksjonen setter en veldig høy spenning-klemme gevinsten. Tidligere arbeidet har beskrevet denne metoden i detalj og skissert en metode for å vurdere spenning-festet endplate16. - En gang i spenning-klemme, registrerer synaptic strøm (mEPCs og eEPCs) ved hjelp av ulike nervestimulering protokoller, basert på kravene i eksperimentet.
- Registrere spontan mEPCs og EPCs bruker en lav frekvens nerve stimulering protokoll (≤0.5 Hz) som gjør det mulig å post EPCs uten synaptic modulering (tilrettelegging eller moduleringshjul) for å vurdere quantal innhold. For å vurdere synaptic tilrettelegging eller depresjon, kan du bruke en høyfrekvent nerve stimulering protokollen (10 pulser på 50 Hz).
- Stimulere nerve på ønsket via en stimulans isolasjon enhet, som kan aktiveres ved hjelp av en puls generator som kontrolleres ved hjelp av programvare oppkjøpet.
- Når spenningen-klemme opptakene er gjort, tilbake forsterkeren en gjeldende-klemme innstilling, slå av alle strømmer og fjerne elektrodene fra fiber. Kontroller at elektrodene ikke bli tett eller drift i planlagte spenning under innspillingen.
Merk: Om drift, elektrode spenningen bør være 0 volt i ekstracellulære løsningen som de ble angitt før fiber impalement. For eksempel ville innspilte spenninger være usikker på om spenningen drev under eksperimentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 8 viser et eksempel på de nåværende pulser (figur 8A) og spenning svar (figur 8B) fra en LAL fiber under gjeldende-klemme fra en 12-uke-gamle wild type R6/2-mus. Tilstedeværelsen av mEPPs indikerer at disse postene ble tatt fra motor endplate. Postene ble innhentet i normal fysiologisk saltløsning. Disse gjeldende-klemme poster kan bli analysert for å fastslå Ri og τm at fiber16,19,20.
En representant opptak av en EPC og to mEPCs, innhentet under spenning-klemme betingelser, vises i figur 9A. Kort gjeldende nedbøyning foran EPC er gjenstand skyldes nervestimulering. Analyse av mEPCs og EPCs kan gjøres raskere med hendelsen programvare. Dette verktøyet kan forskeren å lage en mal som deretter kan automatisk oppdage hendelsene i innspillingen. Hendelsene kan være lagt og eksporteres til noen dataanalyse programvare. Figur 9B viser lagt EPCs og mEPCs (innfelt) fra en representant fiber.
Figur 1 : Generelle plasseringen av den levator auris longus muskel
LAL muskelen ligger på dorsal overflaten av hodet. Den røde prikkede linjen understreker banen for å kutte huden for fjerning dorsal (A) og lateral (B) overflate. I LAL festes på undersiden av øret, dermed ca 1 mm av huden rundt foten av øret bør forbli intakt å unngå klipping LAL. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Utsatt levator auris longus muskel
LAL (gule og grønne) ligger like under huden, mest overfladiske muskler i det merkede området. Det er to deler av muskler, skallen (gul) og caudal (grønn) regioner. Regionen skallen kommer fra midtlinjen på de fire første cervical ryggsøylen og går mot den fremre del av foten av auricle. For referanse er midtlinjen et band av bindevev som går fra scapulae (hvit pil) mot nesen. Høyre og venstre LAL muskelen koble på midtlinjen over kraniet. Den kraniale delen av LAL er mye bredere enn den caudal delen. Delen caudal festes nær midtlinjen på fjerde og femte cervical ryggsøylen og kobler til bakre del av foten av auricle. Under dissection, holde et par millimeter huden rundt cartilaginous øret å hindre kutte LAL, som er merket i figur av en klammen stiplet linje. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Råolje Disseksjon av den levator auris longus omkringliggende muskler
Når fjernet fra dyret, er vevet låst, dorsal side ned (LAL nederst), i en silikon-elastomer foret parabol med fine nåler laget som beskrevet i del 5.3. Når festet til bunnen av fatet, kan overliggende muscle lagene fjernes. Et insekt pin gjennom ørekanalen angis med en hvit stiplet pil. Gul pilene viser ideelle pin plassering for fjerning av uønskede muskler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Muskulaturen laget direkte underlegen den levator auris longus
Uthevet i blått er bortfører auris longus (AAL), i rødt er auricularis scupularis (AS), og i gult er interscutularis (IS). I LAL er viktigste, underliggende muskel i dette bildet. For referanse, er øre og omkringliggende hud skissert av svart heltrukket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Silikon-elastomer-lined, egendefinerte perfusjon kammeret
Vises brukes egendefinerte 35 mm perfusjon parabolen til å sikre LAL elektrofysiologiske opptak (A). Silikon er brukt til å opprette en overflate egnet for lengter vevet. I midten av kammeret er en avrundet plattform som er nyttig når impaling fibrene. Plattformen støtter muskelfibre fra under når bruke en nedadgående kraft med elektroder under impalement prosessen. Denne plattformen ble formet av slik at silikon-elastomer til form til kurven for en 50 mL konisk rør. En bit av dette avrundet silikon elastomer kan deretter limes til bunnen av kammeret med mer silikon-elastomer. En disponert representasjon av parabolen samt utsikt side på vises i B og C hvor perfusjon kammeret kan sees tydeligere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Elektrofysiologi eksperimentere oppsett
En liten bipolar elektrode holdes på plass med en magnetisk Ettgreps bidétbatteri manipulator å stimulere nerve av LAL. Mikroskopet scenen gjøres enkelt holde en magnetisk plattform med bruk av en selvklebende magnetisk materiale (som kan bli funnet på håndverket eller jernvarehandel for å gjøre kjøleskap magneter). Også vist er headstages og elektroder plassert over en LAL prøve. Viktig er vann nedsenking, skrå målet med en keramisk dipping kjegle, som vist. Vinklet gir enklere elektrodeplassering og keramisk materiale minimerer elektrisk støy. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 : Nevromuskulær krysset ID
Alle bilder viser LAL med 5 µM 4-Di-2-Asp (grønn) for å tillate visualisering av nevromuskulær veikryss. (A) A lyse bånd av nevromuskulær veikryss kan sett (gule piler) når muskelen gjennom et 10 X mål. Forgrening axons kan også ses i pilens hvite stiplede. (B) små AC confocal stabler (5 x 1 µm) av tre nevromuskulær knutepunktene (gule piler). Sunn muskelfibre har klart striations samt flere myonuclei som vises som mørke flekker langs sarcolemma fiber (hvite piler). Ofte kan axons innervating de nevromuskulær veikryssene observeres også. (C) en fiber med en farget nevromuskulær sammenføyning som er impaled med glass elektroder. Elektrodene er forbedret med en hvit utheving slik at de kan bli sett lettere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8 : Gjeldende-klemme opptak av membran egenskaper
Injisert nåværende pulser (A) og den resulterende membranen mulige svar (B) spilt inn fra en fiber av LAL badet i fysiologiske saltvann. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9 : To elektrode spenning-klemme opptak
Rå spor av en EPC og to mEPCs registrert i to elektrode spenning-klemme (A). Lagt EPCs og mEPCs (innfelt) fra en enkelt fiber (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beskrevet her er forberedelse og bruk av musen LAL muskel for måling av nevromuskulær overføring under gjeldende - eller spenning-klemme forhold. Det er flere viktige punkter å vurdere for dissekere ut av LAL. Rengjøring overflødig bindevev muskel AIDS i elektrode impalement, som elektrodene kan ulempe bindevevet når posisjonering dem for impalement. Imidlertid bare fjerne bindevev som kan tas bort lett å begrense sjansene for skade muskelen. Isolasjon av nerve bør utføres med forsiktighet, fordi det er veldig delikat. For å unngå nerveskader, er det nyttig å la noen av de omkringliggende vev knyttet til slutten av nerve som en PIN-kode kan plasseres for å sikre nerve til parabolen. Også ta vare ikke for å knuse nerve ved plassering nerve stimulator. Til slutt, rekkefølgen som elektrodene er impaled i fiber er viktig. Sløv elektroden er ikke så lett å spidde og bør bli spiddet først. Hvis skarpe elektroden ble impaled først, kunne sløv elektroden presse muskel fiber før skjærer membranen, kan det forårsake skarpe elektroden å komme ut av fiber. Dette ville gjøre det nødvendig å spidde fiber en gang med skarpe elektroden som kan forårsake unødvendig membran skade. Det er også nyttig at forsterkeren brukes samtidig kan måle ladespenning og ladestrøm av gjeldende bestått elektroden slik at en negative utslag i membranen potensielle kan observeres, indikerer at elektroden har vært impaled.
En funksjon av LAL som kan være nyttig er muligheten til å fjerne begge muskler samtidig. Dette kan være stor for å utføre electrophysiology og molekylærbiologi eksperimenter i samme dyret. Dette kan oppnås ved å følge i hovedsak samme protokoll beskrevet her med mindre endringer. Følg alle trinnene under overskrifter 1-3 gjør alt beskrevet på høyre side i tillegg til venstre. I trinn 4 er det best å starte kutte på ventrolateral side av høyre øre fjerne musklene. Som beskrevet tidligere, alltid holde bladene presset mot skallen å kutte så dypt som mulig forlate dårligere muskler knyttet til LAL. Fortsette å kutte mot høyre øre forbi midtlinjen, holde bladet så dypt som mulig. På dette punktet, resten av fremgangsmåten er som beskrevet i denne protokollen, bare utføre trinnene på begge muskler. Når musklene er rengjort, en LAL kan bli kuttet bort og frosne for senere molekylær analyse og andre kan brukes for elektrofysiologi. Det ville være vanskelig å utføre elektrofysiologi studier med både muskler på samme dyret. Gjør midtlinjen kuttes til separate muskler og gjøre så vil sannsynligvis skade noen muskelfibre.
I LAL har lenge vært brukt til å undersøke nevromuskulær overføring fordi dens tynn natur tillater enkel identifisering av motor endplates og utmerket ex vivo perfusjon1,3,4,5 ,6,7,8. I tillegg til 4-di-2-asp, har andre grupper brukt rhodamin-konjugerte bungarotoxin i lave konsentrasjoner22. Vi har brukt LAL for elektrofysiologiske undersøkelser, purinergic signalering og defekter i Huntingtons sykdom16,20. I LAL er også ideell for live-celle tenkelig studier. For eksempel har flere studier brukt av LAL måle synaptic vesicle utgivelsen og opptak23,24. Dette kan gjøres med fargestoffer, som FM 1-43.
Fordi endplates kan lett observeres med et fluorescerende flekken, kan elektrodene plasseres i nærheten av motor endplate innenfor lengden konstant av muskel fiber. Elektrodeplassering i endplate og bruk av en høy samsvar to elektrode spenning-klemme system kan etterforskere til å full kontroll endplate potensial med mindre enn 1% feilen16. Dette kan være viktig fordi brukte rettelsene for ikke-lineær Sammendrag av synaptic potensialer registrert under gjeldende-klemme forhold10 ikke høyde for endringer i postsynaptic membranen forårsaket av eksperimentelle forhold og/eller sykdom tilstand. For eksempel vil redusert hvile endplate conductances forsterke postsynaptic potensialer19, selv de rettet for ikke-lineære summering. Derimot spenning-festet postsynaptic strømmer utsettes ikke for ikke-lineære summering feil og er uavhengig av egenskapene postsynaptic membran. Viser dette, har vi nylig vist kontrasterende resultater fra endplate potensialer sammenlignet med strøm innspilt fra hyper-nervøs Huntingtons sykdom Skjelettmuskel16.
En siste viktig fordel ved å bruke LAL studere nevromuskulær overføring er at opptak fra en enkelt synapse. Nevromuskulær overføring innspilt fra en enkelt, fullt spenning-festet endplate tilbyr noen av de mest detaljerte og nøyaktig dataene på synaptic overføring tilgjengelig, som er ideelt for modellering og unraveling kompleksiteten i synaptic fysiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Mark M. Rich og Daniel Miranda for redaksjonelle kommentarer, Ahmad Khedraki for å hjelpe etablere denne teknikken, og Wright State University for økonomisk støtte (oppstart fondet til A.A.V.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus Compound Microscope | Olympus | BX51WI | |
| 10x Objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
| 40x Objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF150-86-7.5 | |
| CCD Camera | Santa Barbara Instruments Group | ST-7XMEI | |
| Mater-9 Pulse Generator | AMPI | ||
| Iso-flex Stimulus Isolator | AMPI | ||
| pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis Software | Molecular Devices | 1-2500-0180 | |
| Concentric Bipolar Electrode | FHC | CBDSH75 | |
| Ball-joint Manipulator | Narishige | ||
| Non-metalic Syringes 34 Gauge | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Nikon Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | |
| No. 5 Forceps | Fine Science Tools | ||
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| No. 2 Forceps | Roboz | RS-5Q41 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz | RS-5912SC | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 2404019862 | |
| Hair Removal Cream | Nair | ||
| Grass SD9 Stimulator | Grass Medical | ||
| Model P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Axon Digidata 1550 Low-noise Data Acuisition System | Molecular Devices | ||
| Low Pass Bessell Filter | Warner Instrument Corp. | LPF-8 | |
| Left-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DL | |
| Right-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DR | |
| Single Motion Controler | Siskiyou Corp. | MC100e | |
| Crossed Roller Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641R | This was added to the Z-axis of the Left and Right-handed micromanipulators to allow the z axis to be motorized. This custom set-up is cheaper and less bulky than buying a 4-axis motorized micromanipulator. It also allows us to control both micromanipulators with one controller |
| All chemicals were orded from Fisher except, | |||
| BTS | Toronto Research Chemicals | B315190 | |
| CTX | Alomone Labs | C-270 | |
| 4-Di-2-Asp | Molecular Probes | Molecular probes is no longer a company. Now ordered through Fisher |
References
- Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).
- Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D. Fiber types in the mouse levator auris longus muscle: a convenient preparation to study muscle and nerve plasticity. J Neurosci Res. 59 (5), 692-697 (2000).
- Bertone, N. I., et al. Carbonic anhydrase inhibitor acetazolamide shifts synaptic vesicle recycling to a fast mode at the mouse neuromuscular junction. Synapse. , (2017).
- Garcia-Chacon, L. E., Nguyen, K. T., David, G., Barrett, E. F. Extrusion of Ca2+ from mouse motor terminal mitochondria via a Na+-Ca2+ exchanger increases post-tetanic evoked release. J Physiol. 574 (Pt 3), 663-675 (2006).
- Murray, L. M., et al. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet. 17 (7), 949-962 (2008).
- Nadal, L., et al. Presynaptic muscarinic acetylcholine autoreceptors (M1, M2 and M4 subtypes), adenosine receptors (A1 and A2A) and tropomyosin-related kinase B receptor (TrkB) modulate the developmental synapse elimination process at the neuromuscular junction. Mol Brain. 9 (1), 67 (2016).
- Rousse, I., St-Amour, A., Darabid, H., Robitaille, R. Synapse-glia interactions are governed by synaptic and intrinsic glial properties. Neuroscience. 167 (3), 621-632 (2010).
- Rozas, J. L., Gomez-Sanchez, L., Tomas-Zapico, C., Lucas, J. J., Fernandez-Chacon, R. Increased neurotransmitter release at the neuromuscular junction in a mouse model of polyglutamine disease. J Neurosci. 31 (3), 1106-1113 (2011).
- Takeuchi, A., Takeuchi, N. Further analysis of relationship between end-plate potential and end-plate current. J Neurophysiol. 23, 397-402 (1960).
- McLachlan, E. M., Martin, A. R. Non linear summation of end plate potentials in the frog and mouse. The Journal of Physiology. 311 (1), 307-324 (1981).
- Obis, T., et al. The novel protein kinase C epsilon isoform modulates acetylcholine release in the rat neuromuscular junction. Mol Brain. 8 (1), 80 (2015).
- Silveira, P. E., et al. Ryanodine and inositol triphosphate receptors modulate facilitation and tetanic depression at the frog neuromuscular junction. Muscle Nerve. 52 (4), 623-630 (2015).
- Wood, S. J., Slater, C. R. Safety factor at the neuromuscular junction. Prog Neurobiol. 64 (4), 393-429 (2001).
- Miranda, D. R., et al. Progressive Cl- channel defects reveal disrupted skeletal muscle maturation in R6/2 Huntington's mice. J Gen Physiol. 149 (1), 55-74 (2017).
- Waters, C. W., Varuzhanyan, G., Talmadge, R. J., Voss, A. A. Huntington disease skeletal muscle is hyperexcitable owing to chloride and potassium channel dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9160-9165 (2013).
- Khedraki, A., et al. Depressed Synaptic Transmission and Reduced Vesicle Release Sites in Huntington's Disease Neuromuscular Junctions. Journal of Neuroscience. 37 (34), 8077-8091 (2017).
- Greene, E. C. The anatomy of the rat. , Hafner Pub. (1955).
- Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. Fluorescent probes that stain living nerve terminals. J Neurosci. 7 (4), 1207-1214 (1987).
- Jack, J. J. B., Noble, D., Tsien, R. W. Electric current flow in excitable cells. , Clarendon Press. (1983).
- Voss, A. A. Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y(1) receptors. Journal of Physiology-London. 587 (23), 5739-5752 (2009).
- Albuquerque, E. X., McIsaac, R. J. Fast and slow mammalian muscles after denervation. Experimental Neurology. 26 (1), 183-202 (1970).
- Santafe, M. M., Urbano, F. J., Lanuza, M. A., Uchitel, O. D. Multiple types of calcium channels mediate transmitter release during functional recovery of botulinum toxin type A-poisoned mouse motor nerve terminals. Neuroscience. 95 (1), 227-234 (2000).
- Gaffield, M. A., Betz, W. J. Synaptic vesicle mobility in mouse motor nerve terminals with and without synapsin. J Neurosci. 27 (50), 13691-13700 (2007).
- Zhang, Z. S., Nguyen, K. T., Barrett, E. F., David, G. Vesicular ATPase Inserted into the Plasma Membrane of Motor Terminals by Exocytosis Alkalinizes Cytosolic pH and Facilitates Endocytosis. Neuron. 68 (6), 1097-1108 (2010).
