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Medicine

व्यक्तिगत सिस्टिक फाइब्रोसिस Transmembrane कंडक्टर नियामक अध्ययन के लिए मानव नाक उपकला कोशिका Spheroids की पीढ़ी

Published: April 11, 2018 doi: 10.3791/57492
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Division of Pulmonary Medicine, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

Summary

यहाँ हम मानव नाक उपकला कोशिकाओं के तीन आयामी अंडाकार आकृति संस्कृतियों उत्पन्न करने के लिए एक विधि का वर्णन. Spheroids तो सिस्टिक फाइब्रोसिस Transmembrane कंडक्टर नियामक (CFTR) ड्राइव करने के लिए उत्तेजित कर रहे हैं-निर्भर आयन और द्रव स्राव, CFTR समारोह के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में अंडाकार आकृति चमकदार आकार में परिवर्तन को बढ़ाता है.

Abstract

जबकि सिस्टिक फाइब्रोसिस Transmembrane कंडक्टर नियामक की शुरूआत (CFTR) मॉडुलन दवाओं सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF), जीनोटाइप-निर्देशित चिकित्सा मॉडल वर्तमान में उपयोग में कई सीमाएं हैं में क्रांति की देखभाल की है । पहले, दुर्लभ या अध्ययन उत्परिवर्तन समूहों निश्चित नैदानिक परीक्षणों से बाहर रखा गया है । इसके अलावा, अतिरिक्त मॉडुलन दवाओं के रूप में बाजार में प्रवेश, यह एक व्यक्ति विषय के लिए मॉडुलन विकल्प का अनुकूलन करने के लिए मुश्किल हो जाएगा. इन मुद्दों के दोनों रोगी के उपयोग के साथ संबोधित कर रहे हैं, व्युत्पंन CFTR समारोह और मॉडुलन के व्यक्तिगत नैदानिक मॉडल प्रणालियों । मानव नाक उपकला कोशिकाओं (HNEs) इस तरह के एक मॉडल के लिए श्वसन ऊतक के एक आसानी से सुलभ स्रोत हैं. इस के साथ साथ, हम CFTR समारोह और मॉडुलन प्राथमिक HNEs का उपयोग कर के एक तीन आयामी अंडाकार आकृति मॉडल की पीढ़ी का वर्णन । HNEs एक न्यूनतम इनवेसिव फैशन में विषयों से अलग कर रहे हैं, सशर्त reprogramming शर्तों में विस्तारित, और अंडाकार आकृति संस्कृति में वरीयता प्राप्त । बोने के 2 सप्ताह के भीतर, अंडाकार आकृति संस्कृतियों HNE spheroids कि 3 ' के साथ उत्तेजित किया जा सकता है उत्पंन, 5 ' चक्रीय adenosine मोनोफोस्फेट (शिविर)-एगोनिस्ट समारोह को सक्रिय करने CFTR पैदा । अंडाकार आकृति सूजन तो CFTR गतिविधि के एक प्रॉक्सी के रूप में quantified है । HNE spheroids नाक कोशिकाओं के ंयूनतम इनवेसिव, अभी तक श्वसन मूल पर कैपिटल के लिए एक सुलभ, व्यक्तिगत एक उपकला रोग रुग्णता और मृत्यु दर को प्रतिबिंबित करने के लिए प्रासंगिक मॉडल उत्पंन करने के लिए । वायु तरल अंतरफलक HNE संस्कृतियों की तुलना में, spheroids अपेक्षाकृत परिपक्व है, जो समग्र संदूषण दर को कम कर देता है जल्दी कर रहे हैं । अपने मौजूदा रूप में, मॉडल कम प्रवाह द्वारा सीमित है, हालांकि इस ऊतक अधिग्रहण के सापेक्ष आसानी से भरपाई है । HNE spheroids के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है मज़बूती से मात्रा और व्यक्तिगत स्तर पर CFTR गतिविधि की विशेषता । एक निरंतर अध्ययन करने के लिए इस ठहराव टाई करने के लिए vivo दवा प्रतिक्रिया में अगर HNE spheroids CFTR मॉडुलन करने के लिए रोगी प्रतिक्रिया के एक सच्चे पूर्व नैदानिक कारक हैं निर्धारित करेगा.

Introduction

सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF) एक घातक, autosomal अवकाश ७०,००० लोगों को दुनिया भर में1से अधिक प्रभावित रोग है । यह जीवन-छोटा आनुवंशिक रोग सिस्टिक फाइब्रोसिस Transmembrane कंडक्टर नियामक प्रोटीन (CFTR)2में उत्परिवर्तनों के कारण होता है । CFTR adenosine ट्राइफॉस्फेट-बाध्यकारी कैसेट परिवार के एक सदस्य है, और एक आयन क्लोराइड के आंदोलन की अनुमति चैनल के रूप में कार्य करता है और जठरांत्र संबंधी मार्ग सहित कई ध्रुवीय शिखर के epithelia झिल्ली में बिकारबोनिट, पसीने की ग्रंथि, और श्वसन पेड़, दूसरों के बीच3,4। इस तरह के रूप में, बेकार CFTR multisystem उपकला रोग की ओर जाता है, सबसे मृत्यु के साथ श्वसन रोग1से उपजी. CF फेफड़ों में, CFTR चालित airway सतह तरल (ASL) विनियमन और बलगम रिहाई की हानि और अधिक मोटा होना बलगम की ओर जाता है, airway रुकावट, जीर्ण संक्रमण, और प्रगतिशील airway remodeling और फेफड़ों के समारोह के नुकसान1,5.

रोग के कारण के रूप में CFTR रोग की पहचान के बावजूद, CF में चिकित्सा पारंपरिक रूप से लक्षणों के शमन पर ध्यान केंद्रित (जैसे, अग्नाशय एंजाइम रिप्लेसमेंट थेरेपी, airway निकासी चिकित्सा)1. इस दृष्टिकोण हाल ही में उपंयास चिकित्सकीय के आगमन से क्रांति की थी, "CFTR मॉडुलन," कि सीधे बेकार CFTR लक्ष्य । इस दृष्टिकोण से नैदानिक परिदृश्य लक्षण प्रबंधन से रोग-संशोधित देखभाल करने के लिए स्थानांतरित कर दिया है, लेकिन कई सीमाएं6,7,8,9,10वहन करती है । मॉडुलन गतिविधि प्रत्येक CFTR उत्परिवर्तन के साथ प्रोटीन दोष के लिए विशिष्ट है और आनुवंशिक आबादी11का चयन करने के लिए सीमित. इस सीमा प्रोटीन दोषों की विषम प्रकृति से प्रेरित है, लेकिन यह भी दुर्लभ उत्परिवर्तन समूहों में नैदानिक परीक्षणों की अव्यावहारिकता से । इसके अलावा, अच्छी तरह से अध्ययन पादी के साथ विषयों के बीच (जैसे, F508del/F508del CFTR, सबसे आम CFTR उत्परिवर्तन), वहां रोग के बोझ में व्यापक परिवर्तनशीलता है और मॉडुलन प्रतिक्रिया6,7,8 ,9,11.

इन दोनों मुद्दों को दूर करने के लिए जांचकर्ताओं ने12नैदानिक परीक्षण के लिए वैयक्तिकृत मॉडलों के उपयोग का प्रस्ताव किया है । इस अवधारणा को एक व्यक्तिगत फैशन में उपचार के लिए vivo विषय प्रतिक्रिया में भविष्यवाणी, यौगिक परीक्षण के लिए एक अलग पूर्व vivo मॉडल प्रणाली उत्पन्न करने के लिए रोगी-विशिष्ट ऊतक का उपयोग करता है । एक बार पुष्टि की, इस तरह के एक मॉडल चिकित्सकों द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है परिशुद्धता थेरेपी रोगी के अंतर्निहित CFTR जीनोटाइप की परवाह किए बिना ड्राइव ।

मानव दमा उपकला (HBE) फेफड़ों प्रत्यारोपण के समय explant ऊतक से प्राप्त कोशिकाओं CF13,14के लिए इस तरह के एक मॉडल की संभावना स्थापित. HBEs एक हवाई तरल इंटरफेस (अली) में उगाया electrophysiologic परीक्षण या परोक्ष ASL homeostasis13,15के उपायों के माध्यम से सीधे के माध्यम से कार्यात्मक CFTR ठहराव के लिए अनुमति देते हैं । यह मॉडल CFTR जीवविज्ञान को समझने के लिए महत्वपूर्ण रहा है और CFTR ढा16के विकास में एक महत्वपूर्ण चालक था । दुर्भाग्य से, HBE मॉडल अधिग्रहण के इनवेसिव प्रकृति (फेफड़े प्रत्यारोपण या दमा ब्रशिंग) और दुर्लभ उत्परिवर्तन या हल्के रोग के साथ उन लोगों के लिए नमूनों की कमी के कारण एक व्यक्तिगत मॉडल के रूप में तर्कसंगत नहीं कर रहे हैं । इसके विपरीत, आंतों के ऊतकों, मलाशय या ग्रहणी बायोप्सी नमूनों से प्राप्त, आंतों वर्तमान माप के लिए इस्तेमाल किया जा सकता (आईसीएम) या एक सूजन-आधारित organoid परख व्यक्तिगत CFTR समारोह का अध्ययन करने के लिए17,18, 19. Organoid परख, विशेष रूप से, CFTR गतिविधि20,21,22के बहुत संवेदनशील मॉडल हैं । दोनों मॉडलों ऊतक स्रोत द्वारा सीमित कर रहे है (आंत्र ऊतक, जबकि सबसे रोग विकृति श्वसन है) और अधिग्रहण के अर्द्ध इनवेसिव विधि । वैकल्पिक रूप से, कई जांचकर्ताओं मॉडल CFTR बहाली23,24,25के लिए मानव नाक उपकला (HNE) कोशिकाओं का अध्ययन किया है । HNEs सुरक्षित रूप से किसी भी उंर के विषयों में ब्रश या curettage द्वारा काटा जा सकता है और, जब अली में संस्कृति, दोहराऊंगा के कई लक्षण HBEs25,26,27,28। HNE monolayer संस्कृतियों परंपरागत रूप से स्क्वैमस परिवर्तन और एक लंबे समय के लिए29परिपक्वता के द्वारा सीमित किया गया है । इसके अलावा, HNEs में कम सर्किट वर्तमान माप की सूचना HBEs में उन लोगों की तुलना में छोटे हैं, एक छोटी खिड़की का पता लगाने के लिए चिकित्सीय प्रभावकारिता25।

एक व्यक्तिगत, गैर इनवेसिव, श्वसन CFTR समारोह के ऊतक संस्कृति मॉडल के लिए की जरूरत को देखते हुए, हम एक सूजन आधारित, गैर इनवेसिव और HNEs के श्वसन प्रकृति के साथ organoid परख की संवेदनशीलता विलय की मांग की । यहां, हम 3 पैदा करने की हमारी विधि का वर्णन आयामी "अंडाकार आकृति" एक सूजन में व्यक्तिगत CFTR अध्ययन के लिए HNEs की संस्कृतियों-परख 30 आधारित है । HNE spheroids क्षेत्र केंद्र, या लुमेन की ओर उपकला शीर्ष के साथ मज़बूती से ध्रुवीकरण. यह मॉडल एक कम श्वसन उपकला के कई लक्षण recapitulates और अधिक जल्दी से अली संस्कृतियों की तुलना में परिपक्व होता है । एक कार्यात्मक परख के रूप में, HNE spheroids मज़बूती से CFTR समारोह की एक सीमा है, साथ ही अच्छी तरह से अध्ययन उत्परिवर्तन समूहों में मॉडुलन (जैसे, F508del CFTR) मात्रा । यह सूजन के आधार पर परख आयन/CFTR के नमक परिवहन गुण, परोक्ष रूप से अंडाकार आकृति में तरल पदार्थ का तांता मापने के रूप में पानी शिखर नमक समाप्ति के बाद । इस फैशन में, पूरी तरह कार्यात्मक CFTR के साथ उत्तेजित spheroids मजबूती से प्रफुल्लित है, जबकि बेकार CFTR के साथ उन कम या हटना प्रफुल्लित । यह पूर्व के छवि विश्लेषण के माध्यम से quantified है और 1 एच पद उत्तेजना spheroids, चमकदार क्षेत्र को मापने और प्रतिशत परिवर्तन का निर्धारण । इस उपाय तो प्रयोगात्मक समूहों में एक रोगी विशेष फैशन में दवा के लिए गैर-गतिविधि के लिए स्क्रीन की तुलना में किया जा सकता है ।

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Protocol

HNE नमूने सिनसिनाटी चिल्ड्रन अस्पताल चिकित्सा केंद्र CF अनुसंधान केंद्र के माध्यम से भर्ती विषयों से खरीदे गए । यहां बताए गए सभी तरीकों को सिनसिनाटी चिल्ड्रन्स हॉस्पिटल मेडिकल सेंटर के इंस्टीट्यूशनल रिव्यू बोर्ड (आईआरबी) ने मंजूरी दे दी है । परीक्षण से पूर्व सभी विषयों से लिखित सहमति प्राप्त की गई.

1. विस्तार मीडिया और एंटीबायोटिक मीडिया तैयार

  1. तालिका 1में सूचीबद्ध मीडिया घटकों को इकट्ठा करना । गल कमरे के तापमान पर जमे हुए सामग्री और आवश्यक स्टॉक समाधान बनाने के रूप में "विस्तार मीडिया" के तहत तालिका 1 में संकेत दिया ।
    नोट: हैजा विष हैंडलिंग जब देखभाल का उपयोग करें, जो विषाक्त अगर घूस, और एक त्वचा, आंख, और श्वसन अड़चन है । बनाओ और सभी समाधान और मीडिया में स्वच्छ शर्तों के तहत गठबंधन के सुरक्षा कैबिनेट ।
  2. एक ५० मिलीलीटर serologic पिपेट का उपयोग कर, निकालें और अन्य सामग्री के अलावा के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए एक कंटेनर से ५० मिलीलीटर बेस मध्यम (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम/ एक autoclaved 1 एल कांच की बोतल में हाथ से सभी बेस मीडिया डालो ।
  3. एक ५० मिलीलीटर serologic पिपेट या उपयुक्त के रूप में 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करना, सभी शेष घटकों के "विस्तार मीडिया" खंड से autoclaved ग्लास मीडिया युक्त बोतल में 1 तालिका के हस्तांतरण । धीरे से हाथ से बोतल को मिलाकर भंवर में घूमता.
  4. फ़िल्टर मीडिया में एक ताजा, बाँझ 1 L, ०.२२ µm polyethersulfone (पी इ एस) फिल्टर कुप्पी निर्माता के निर्देशों का उपयोग और "विस्तार मीडिया" और तारीख के साथ व्याख्या.
  5. एंटीबायोटिक मीडिया तैयार करते हैं । "एंटीबायोटिक मीडिया के तहत 1 तालिका में संकेत के रूप में आवश्यक एंटीबायोटिक स्टॉक समाधान बनाओ ।
    1. एक ५० मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर, विस्तार मीडिया के १५० मिलीलीटर एक ताजा २५० मिलीलीटर autoclaved कांच की बोतल के लिए स्थानांतरण ।
    2. एक 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करना, मीडिया से युक्त autoclaved ग्लास बोतल में 1 तालिका के "एंटीबायोटिक मीडिया" खंड से सभी घटकों को जोड़ने । हाथ से भंवर मिश्रण जब तक मीडिया दिखने में वर्दी है ।
    3. फ़िल्टर मीडिया में एक ताजा, बाँझ २५० मिलीलीटर, ०.२२ µm पी इ एस फिल्टर कुप्पी निर्माता के निर्देशों का उपयोग और "एंटीबायोटिक मीडिया" और तारीख के साथ व्याख्या.
  6. एक महीने तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर मीडिया, अगर बादल छोड़, संदूषण सुझाव ।

2. विभेद मीडिया तैयार करें

  1. तालिका 2में सूचीबद्ध मीडिया घटकों को इकट्ठा करना । गल कमरे के तापमान पर जमे हुए सामग्री और आवश्यक स्टॉक समाधान बनाने के रूप में तालिका 2में संकेत दिया ।
    नोट: retinoic एसिड हैंडलिंग जब सावधानी का प्रयोग करें, जो एक प्रजनन विष है, विषाक्त हो सकता है अगर निगल लिया, और त्वचा जलन का कारण बनता है । बनाओ, aliquot, और सभी समाधान और मीडिया के लिए स्वच्छ शर्तों के तहत गठबंधन में सुरक्षा कैबिनेट ।
  2. निकालें और आधार मध्यम के ५२ मिलीलीटर एक कंटेनर से छोड़ अन्य सामग्री के अलावा के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए । एक autoclaved 1 एल कांच की बोतल में सभी बेस मीडिया डालो ।
  3. एक 25 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट या 1-एमएल पिपेट के रूप में उपयुक्त का उपयोग करना, सभी शेष घटकों को स्थानांतरित करने के लिए 2 तालिका से युक्त autoclaved ग्लास बोतल मीडिया और भंवर से धीरे हाथ से मिश्रण करने के लिए ।
  4. फ़िल्टर मीडिया में एक ताजा, बाँझ 1 L, ०.२२ µm polyethersulfone (पी इ एस) फिल्टर कुप्पी निर्माता के निर्देशों का उपयोग और "विभेद मीडिया" और तारीख के साथ व्याख्या.
  5. एक महीने तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर मीडिया, अगर बादल छोड़, संदूषण सुझाव ।

3. कोट संस्कृति व्यंजन और प्लेट फीडर Fibroblasts

नोट: सुरक्षा कैबिनेट में साफ शर्तों के तहत सभी चरणों का पालन करें ।

  1. एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में ०.५ मिलीलीटर कोलेजन स्टॉक की और ३७.५ मिलीलीटर बाँझ पानी का मिश्रण ।
  2. प्रत्येक साफ P100 संस्कृति पकवान में कोलेजन समाधान के पिपेट 4-5 मिलीलीटर, पूरी सतह को सुनिश्चित करने के कवर किया जाता है ।
  3. ढक्कन के साथ कवर व्यंजन और ३७ ° c और 5% CO2पर रातोंरात मशीन ।
  4. सुरक्षा कैबिनेट में, सभी डिश ढक्कन हटा दें । भंवर समाधान पकवान कवर करने के लिए, तो महाप्राण ।
  5. 1 घंटे के लिए पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश के लिए जोखिम द्वारा बंध्याकरण बर्तन पर वापस प्लेस ढक्कन, ढेर और एल्यूमीनियम पंनी के साथ कवर व्यंजन ।
  6. 3-6 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर लेपित व्यंजन की दुकान, सेल संस्कृति का उपयोग करने से पहले यूवी प्रकाश 15-30 मिनट के तहत पुनः निष्फल ।
  7. एक HNE नमूना प्राप्त करने से पहले 24 ज, एक पूर्व लेपित पकवान और माउस भ्रूण Fibroblast (MEF) और तारीख के रूप में लेबल निष्फल ।
  8. विस्तार मीडिया जोड़ें प्लेट (लगभग 5 मिलीलीटर) एक serologic पिपेट के साथ कवर करने के लिए ।
  9. गल ३७ ° c waterbath में 2 x 106 विकिरणित MEFs की एक शीशी । जैसे ही MEFs गल जाते हैं, शीशी के आधे जोड़ (लगभग 106 कोशिकाएं) 1-एमएल पिपेट के साथ पकवान को, हाथ से फैलाने के लिए घूमता है.
  10. ३७ ° c और 5% सह HNE संस्कृति के लिए तैयारी में रातोंरात2 पर मशीन ।
    नोट: यदि आवश्यक हो, कदम 3.7-3.10 कोशिकाओं चढ़ाना पहले देर के रूप में ६० मिनट के रूप में किया जा सकता है, हालांकि रातोंरात आदर्श है ।

4. प्राप्त करें और प्रक्रिया HNE नमूना

  1. सुनिश्चित करें कि आईआरबी-अनुमोदित सहमति/असेंट सभी विषयों के लिए प्राप्त है ।
  2. रोगी झटका नाक ढीला बलगम स्पष्ट करने के लिए है ।
  3. कल्पना हीन turbinate प्रयोग एक rhinoscope । कोई घाव या जंतु सुनिश्चित करें कि नमूना संग्रह बाधा हो सकता है मौजूद हैं ।
  4. curettage या ब्रश द्वारा पहली नाक से नाक की कोशिकाओं को इकट्ठा ।
    1. Curettage: अपनी मध्यबिंदु पर बेंड curette एक मामूली बनाने के लिए, ~ १३५ curette कप से दूर एपेक्स के साथ° कोण । नाक में curette डालें और अवर turbinate के तहत curette कप अग्रिम । धीरे अवर turbinate के खिलाफ curette कप प्रेस और curette आगे खींचकर turbinate परिमार्जन, 3-4 बार कुल दोहरा ।
    2. ब्रश: अवर turbinate नीचे cytology ब्रश पास है, तो घुमाएं और ब्रश चाल में और बाहर थोड़ा 4-5 बार, नाक से बाहर निकलने के बिना ।
  5. एंटीबायोटिक मीडिया से भरे 15 मिलीलीटर शंकु में curette/ दोहराएं चरण 4.3-4.4 अंय नाक के लिए, एक ही शंकु ट्यूब में curette/
  6. प्रक्रिया के लिए तैयार होने तक शंकु को बर्फ पर रखें । सुनिश्चित करें कि प्रक्रिया नमूना प्राप्ति के 4 h के भीतर होती है, लेकिन यदि आवश्यक हो तो प्राप्ति के बाद 24 h के रूप में देर हो सकती है ।

5. प्रक्रिया और व्यंजन में HNE कोशिकाओं का विस्तार

नोट: सुरक्षा कैबिनेट में साफ शर्तों के तहत सभी चरणों का पालन करें ।

  1. एक 1-एमएल पिपेट और मीडिया का प्रयोग नमूना शंकु से, curettes/cytology ब्रश से सभी कोशिकाओं को एक ही शंकु ट्यूब में धो लें । एक बार साफ, curettes/
  2. 5 मिनट के लिए ३६० x g और 4 ° c पर शंकु केंद्रापसारक ।
  3. महाप्राण supernatant, देखभाल लेने के लिए सेल गोली परेशान नहीं है ।
  4. सेल की टुकड़ी समाधान के 3 मिलीलीटर में फिर से निलंबित सेल गोली, एक 1 मिलीलीटर टिप के साथ pipetting मिश्रण homogenize के लिए ।
  5. 5 मिनट के लिए ३६० x g और 4 ° c पर शंकु केंद्रापसारक ।
  6. चरण 5.3-5.5 एक बार दोहराएं ।
  7. महाप्राण शेष supernatant, देखभाल लेने के लिए सेल गोली परेशान नहीं है ।
  8. फिर से एक hemocytometer के साथ एंटीबायोटिक मीडिया और गिनती कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर में गोली निलंबित ।
  9. एक 1-मिलीलीटर पिपेट, प्लेट की कोशिकाओं लेपित, fibroblast-वरीयता प्राप्त पकवान ३.१० कदम में तैयार पर dropwise का उपयोग करना । पूरी तरह से पकवान कवर और सतह भर में कोशिकाओं को फैलाने के लिए एंटीबायोटिक मीडिया जोड़ें । सामग्री और दिनांक और ३७ ° c और 5% सह पर मशीन के साथ लेबल डिश2।
  10. ४८ ज के बाद यह सुनिश्चित करें कि कोशिकाएं कल्चरल डिश से जुड़ी हों । महाप्राण मीडिया और पर्याप्त ताजा एंटीबायोटिक मीडिया के साथ प्रतिस्थापित करने के लिए थाली कवर ।
  11. बदलें मीडिया 3x साप्ताहिक, aspirating एक वैक्यूम लाइन और पाश्चर पिपेट के साथ पुराने मीडिया, और पर्याप्त ताजा मीडिया के साथ की जगह के लिए थाली को कवर । एंटीबायोटिक मीडिया पर 5 दिनों के बाद, विस्तार मीडिया के लिए मीडिया बदलने के लिए, तीन बार साप्ताहिक की जगह जारी है ।
    नोट: संस्कृति के पहले सप्ताह में संदूषण जोखिम अधिक है । पार संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए एक अलग मशीन में ताजा नमूने रखें ।
  12. सेल विकास की जांच कई बार साप्ताहिक । एक बार कोशिकाओं को लगभग 70-80% धाराप्रवाह हैं, कोशिकाओं को पारित करने के लिए आगे बढ़ना ।

6. पारित HNE कोशिकाओं

  1. ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) में ०.१% Trypsin सॉल्यूशन तैयार करें ।
    नोट: सावधानी हैंडलिंग trypsin, जो एक त्वचा, श्वसन, और आंख अड़चन है का उपयोग करें ।
    1. एक शंकु ट्यूब में सुअर का अग्ंयाशय से trypsin के 15 मिलीग्राम वजन ।
    2. एक अलग शंकु ट्यूब में EDTA के ५६ मिलीग्राम वजन ।
    3. में, एक autoclaved २५० मिलीलीटर कांच की बोतल में trypsin और EDTA का स्थानांतरण । trypsin/EDTA ट्यूबों कुल्ला करने के लिए पूर्ण हस्तांतरण सुनिश्चित करने के लिए बाँझ फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के एक छोटे से aliquot का प्रयोग करें ।
    4. १५० मिलीलीटर समाधान कुल लाने के लिए बाँझ पंजाबियों जोड़ें । ढक्कन कसकर बंद करें ।
    5. पूरी तरह से भंग जब तक एक ३७ ° c waterbath में trypsin समाधान की मशीन । हर 15 मिनट की जांच करें और तुरंत एक बार भंग हटा दें ।
      नोट: समय की लंबी अवधि के लिए अनियंत्रित छोड़ मत (जैसे, रातोंरात), समाधान में trypsin के रूप में अगर बहुत लंबे समय के लिए गर्म स्वभाव होगा ।
    6. ७०% इथेनॉल के 2-3 स्प्रे के साथ साफ बोतल और सुरक्षा कैबिनेट के लिए वापस जाएं ।
    7. फ़िल्टर ०.१% Trypsin-EDTA समाधान में एक ताजा, बाँझ २५० मिलीलीटर, ०.२२ µm पी इ एस फ़िल्टर कुप्पी निर्माता के निर्देशों का उपयोग और सामग्री और तारीख के साथ व्याख्या.
    8. एक महीने तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर trypsin-EDTA समाधान की दुकान, अगर बादल छोड़.
  2. भेदभाव मीडिया लाओ, ०.१% Trypsin-EDTA समाधान, और बाँझ पंजाबियों कमरे के तापमान पर 30 min. ७०% इथेनॉल और एक स्वच्छ सुरक्षा कैबिनेट के लिए स्थानांतरण के साथ साफ ।
  3. में, एक निर्वात लाइन का उपयोग करें और पाश्चर पिपेट करने के लिए महाप्राण और टिशू कल्चर डिश से मीडिया को त्यागें । जोड़कर, घूमता है, और aspirating एक स्वच्छ सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर पंजाब के 5 मिलीलीटर पकवान धो लो ।
  4. एक 5 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का प्रयोग, ०.१% Trypsin के 5 मिलीलीटर-EDTA ऊतक संस्कृति डिश के लिए समाधान और ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन को वापस और 5% सह 5 मिनट के लिए जोड़ें ।
  5. 4-10x पर एक औंधा माइक्रोस्कोप पर कोशिकाओं कल्पना. जांच करें कि कोशिकाओं डिश से अलग, गोल हो, और फ्लोट । धीरे संस्कृति पकवान के पक्ष का दोहन करने के लिए कोशिकाओं को हटाना, और/या फिर से एक अतिरिक्त 5 मिनट के लिए जब तक अधिकांश कोशिकाओं अलग कर रहे है गर्मी ।
    नोट: संस्कृति पकवान से अलग एक बार कोशिकाओं को जल्दी से हटाने के लिए सावधानी रखना; ०.१% के लिए लंबे समय तक निवेश Trypsin-EDTA कोशिका व्यवहार्यता ख़राब होगा ।
  6. एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग करना, पकवान को विस्तार मीडिया के 5 मिलीलीटर जोड़ें और एक लेबल, बाँझ ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में सभी तरल सामग्री (10 मिलीलीटर कुल) इकट्ठा ।
  7. यदि कक्ष संस्कृति डिश के लिए अनुयाई रहते हैं, एक ही शंकु ट्यूब में सामग्री एकत्रित करने के लिए दो बार ६.६ के माध्यम से ६.४ चरणों को दोहराएँ ।
    1. यदि कोशिकाओं Trypsin समाधान जोखिम के तीन दौर के बाद संस्कृति डिश के लिए अनुयाई रहते हैं, एक बाँझ सेल खुरचनी धीरे से शेष को दूर का उपयोग करें । पकवान परिमार्जन के बाद, खुरचनी और विस्तार मीडिया के 5 मिलीलीटर के साथ पकवान धोने और एक ही लेबल शंकु ट्यूब में इकट्ठा ।
      नोट: यदि passaging spheroids करने के लिए, एक अंतर trypsinization करने के लिए इस कार्यविधि को संशोधित करें । trypsin समाधान (चरण ६.४.) जोड़ने के बाद, डिश अक्सर जब तक fibroblasts अलग है (आम तौर पर 1-2 मिनट), पकवान से जुड़ी केवल बहुभुज उपकला कोशिकाओं छोड़ने की जांच करें । लीजिए और इस supernatant, जो आगे विस्तार के लिए पारित किया जा सकता है अलग सेट । दोहराएं चरण 6.4-6.6 एक ही trypsin समाधान का उपयोग, और केवल शेष उपकला कोशिकाओं अंडाकार आकृति संस्कृति के लिए इकट्ठा ।
  8. 5 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए ३६० x g पर शंकु केंद्रापसारक । शंकु से महाप्राण मीडिया ।
  9. एक hemacytometer का उपयोग कर विस्तार मीडिया और गिनती कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड ।
  10. एक बार quantified, कोशिकाओं को विभाजित किया जा सकता है यदि आवश्यक हो और या तो एक नई संस्कृति पकवान (fibroblast सह संस्कृति, चरण 3, और विस्तार, कदम 5.9-5.12) या spheroids (चरण 7) के रूप में संस्कृति के लिए चढ़ाना कोशिकाओं की तैयारी सहित पर आगे गुजर ।
    नोट: यदि विस्तार के लिए एक नई संस्कृति डिश के लिए passaging, एक P100 डिश में 0.5-1 × 106 कोशिकाओं के बीज का घनत्व की सिफारिश की है ।

7. HNE अंडाकार आकृति संस्कृतियों के लिए सीडिंग कक्ष

नोट: इस कदम में सभी प्रक्रियाओं, केंद्रापसारक के अलावा अंय, एक स्वच्छ सुरक्षा कैबिनेट में ले ।

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार बर्फ पर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स गल (१०० µ एल प्रति अंडाकार आकृति अच्छी तरह से) ।
    नोट: रसीद पर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के बाँझ ५०० µ l aliquots बनाने पर विचार; यह राशि एक सिंगल 4-वेल प्लेट सीड होगी ।
  2. अलग से एक उचित संख्या में अंतर trypsinized, पारित कोशिकाओं (चरण ६.९ से) के लिए एक अंतिम एकाग्रता के लिए ५००,००० कोशिकाओं के प्रति एमएल मैट्रिक्स । एक 4-well प्लेट के लिए, २००,००० कोशिकाओं का उपयोग करें । एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में ले लीजिए ।
  3. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ३६० x g पर सेल और मीडिया मिश्रण केंद्रापसारक । पूरी तरह से, लेकिन ध्यान से महाप्राण और एक 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर मीडिया को त्यागें, देखभाल करने के लिए सेल गोली परेशान नहीं ले ।
  4. एक 1 मिलीलीटर पिपेट टिप का प्रयोग, १.५ मिलीलीटर कोशिकाओं से युक्त ट्यूब करने के लिए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स की योजना बनाई अच्छी तरह से प्रति १०० µ एल जोड़ें । बर्फ पर ट्यूब रखें ।
  5. पिपेट ऊपर और नीचे करने के लिए ध्यान से और अच्छी तरह से तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में कोशिकाओं reसस्पेंड । मैट्रिक्स के solidification से बचने के लिए जल्दी हटो । पूरी तरह से पिपेट टिप खाली करने के लिए हवाई बुलबुले सुनिश्चित करने के लिए मैट्रिक्स में पेश नहीं कर रहे है/
  6. बीज १०० µ एल मैट्रिक्स एक 4 अच्छी तरह से आईवीएफ संस्कृति की थाली के प्रत्येक कुआं में aliquots ।
    1. कैंची की एक साफ जोड़ी का उपयोग कर, बाहर एक २०० µ एल पिपेट टिप के बाहर 3-4 mm ट्रिम कर दीजिए ।
    2. छंटनी की नोक का प्रयोग, ध्यान से एक अच्छी तरह से केंद्र में सेल/मैट्रिक्स मिश्रण के १०० µ एल पिपेट । पिपेट धीरे, एक एकल मैट्रिक्स "एक अच्छी तरह के केंद्र में ड्रॉप" बनाने के लक्ष्य के साथ । बूंद गोलाकार रहना चाहिए, और अच्छी तरह के पक्षों को नहीं छूना चाहिए । जब प्लेट चलती है, तो सावधानी के रूप में इन बूंदों परेशान से बचने के लिए करते हैं ।
    3. मशीन तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स ३७ ° c और 5% CO2 30 मिनट के लिए, जब तक ठोस में गिरता है ।
    4. ध्यान से पिपेट ५०० µ एक अच्छी तरह से भिंनता मीडिया के एल, ध्यान में मैट्रिक्स ड्रॉप परेशान नहीं ले रही । सुनिश्चित करें कि मीडिया सिर्फ मैट्रिक्स ड्रॉप कवर और अधिक यदि आवश्यक जोड़ें ।

8. अंतर और परिपक्व HNE Spheroids

  1. एक 1 मिलीलीटर पिपेट टिप का उपयोग करना, धीरे से सभी मीडिया महाप्राण अच्छी तरह से; aspirating मैट्रिक्स है, जो मैट्रिक्स के उस हिस्से में spheroids नष्ट कर देगा से बचें, हालांकि किसी भी spheroids पीछे छोड़ व्यवहार्य रह सकते हैं ।
  2. एक ताजा 1 मिलीलीटर पिपेट टिप का प्रयोग, धीरे अंतर मीडिया के ५०० µ एल जोड़ने के लिए अच्छी तरह से चारों ओर मैट्रिक्स । मैट्रिक्स पिपेट के साथ स्पर्श न करें और मैट्रिक्स ड्रॉप परेशान करने से बचें ।
  3. ३७ oC और 5% CO2 पर चल रहे विकास के लिए मशीन पर लौटें spheroids । दोहराएं चरण ८.१ के माध्यम से ८.३ तीन बार साप्ताहिक ।
  4. 20X पर एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत अंडाकार आकृति आकृति विज्ञान दैनिक का मूल्यांकन करें । Spheroids चढ़ाना के 3-5 दिनों के भीतर फार्म चाहिए, और लगभग 10 दिनों के भीतर परिपक्वता तक पहुंचने ।

9. इलाज, उत्तेजित, और विश्लेषण के लिए छवि HNE Spheroids

  1. पहले से30वर्णित के रूप में इमेजिंग से पहले वांछित spheroids के रूप में मानें ।
    नोट: VX809 उपचार के लिए, इमेजिंग करने से पहले 48-72 ज के लिए मीडिया के लिए VX809 के 3 µ एम जोड़ें । इस एकाग्रता के लिए मीडिया के ३.३ मिलीलीटर में 10 मिमी VX809 स्टॉक की 1 µ एल मिक्स ( सामग्री तालिकादेखें).
  2. इमेजिंग spheroids से पहले spheroids के प्रत्येक कुआं को नए विभेदक मीडिया के 1 मिलीलीटर में बदलें, जिनमें पूर्व-उपचार शामिल है (चरण 8.1-8.3) ।
  3. तैयार ताजा उत्तेजना दवाओं समाधान (Forskolin, 3-isobutyl-1-methylxanthine [IBMX], VX770, और CFTR अवरोध करनेवाला १७२ [Inh172]) स्टॉक्स से ( सामग्री तालिकादेखें) । forskolin/IBMX के लिए, प्रत्येक स्टॉक के 1 µ l को ९८ µ l को एक ही लेबल १.५ मिलीलीटर ट्यूब में बाँझ पानी की डालें । VX770 और Inh172 के लिए, प्रत्येक शेयर के 1 µ एल जोड़ने के लिए अलग लेबल १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में बाँझ पानी की ९९ µ l । एक कुल एक अच्छी तरह से परीक्षण के लिए समाधान के ५० µ एल के लिए अनुमति मात्रा बनाओ । सुरक्षा कैबिनेट में बाँझ शर्तों के तहत समाधान तैयार करें ।
  4. एक मशीन ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% CO2, इलेक्ट्रॉनिक छवि पर कब्जा सॉफ्टवेयर और XY समायोजन के लिए एक यांत्रिक मंच से सुसज्जित एक औंधा माइक्रोस्कोप पर मुहिम शुरू करने के लिए सेट करने के लिए अंडाकार आकृति प्लेट स्थानांतरण । माइक्रोस्कोप और कैमरा, साथ ही इमेजिंग कंप्यूटर पर चालू करें ।
  5. एक अच्छी तरह से spheroids के आधारभूत छवियों पर कब्जा ।
    1. छवि कैप्चर सॉफ़्टवेयर (नीचे दिशाओं के लिए Slidebook ५.५) खोलें । एक बार शुरू, "फ़ाइल", फिर "नया" पर क्लिक करके एक नई फ़ाइल खोलें । फ़ाइल को तदनुसार नाम दें और "सहेजें" क्लिक करें ।
    2. ध्यान से संस्कृति प्लेट ढक्कन और केंद्र एक उद्देश्य पर छोड़ मैट्रिक्स निकालें ।
    3. मैट्रिक्स ड्रॉप के शीर्ष पर शुरू, एक ग्रिड में जाने के लिए माइक्रोस्कोप ऐपिस के साथ 20x आवर्धन पर spheroids खोजने के लिए । अपने विस्तृत बिंदु पर क्षेत्र को कैप्चर करने के लिए ऊपर और नीचे फ़ोकस करें । मैट्रिक्स ड्रॉप के एक नक्शे पर प्रत्येक अंडाकार आकृति के स्थान को फिर से व्याख्या इमेजिंग के बाद की पहचान ।
    4. सॉफ्टवेयर में, "छवि कैप्चर" पर क्लिक करें । एक्सपोजर के लिए, "मैनुअल" का चयन करें और ५० ms दर्ज करें सुनिश्चित करें कि अंय सेटिंग्स उपयुक्त है (बिन फ़ैक्टर: 1x1, W: ५१२, H: ५१२, X और Y ऑफ़सेट: 0) । "नाम" बॉक्स में प्रत्येक छवि के लिए एक उपयुक्त नाम दर्ज करें (उदा., अंडाकार आकृति 1 बेसलाइन) । एक आधारभूत छवि को कैप्चर करने के लिए एक लाइव छवि देखने के लिए "प्रारंभ" क्लिक करें, और "सहेजें" ।
    5. दोहराएँ चरण 9.5.1-9.5.4 तक लक्ष्य संख्या तक पहुँच गया है, या पूरे मैट्रिक्स ड्रॉप imaged है ।
      नोट: समूह मतभेद के रूप में कुछ शर्त प्रति 3-5 spheroids के साथ पता लगाया जा सकता है, तथापि, यह छवि के लिए हमारे अभ्यास बन गया है 10 या अधिक spheroids के प्रति शर्त को सत्ता में वृद्धि हुई है । परख की परिवर्तनशीलता एक उदाहरण के रूप में प्रति विषय 8-10 spheroids के नमूनों के साथ "प्रतिनिधि परिणाम" खंड के चित्रा 2 में प्रदर्शित किया जाता है ।
  6. उत्तेजित spheroids ।
    1. एक २०० µ एल पिपेट का प्रयोग, अच्छी तरह के भीतर मीडिया में उचित उत्तेजना दवा के ५० µ एल जोड़ने के लिए, ध्यान नहीं ले मैट्रिक्स को परेशान करने के लिए ।
      नोट: इस 10 गुना कमजोर पड़ने के बाद (५० µ एल में ५०० मीडिया के µ एल), अंतिम दवा एकाग्रता हो जाएगा: forskolin 10 µ मीटर, IBMX १०० µ मीटर, VX770 1 µ मीटर, Inh172 10 µ मी.
    2. केवल शिविर के लिए, केवल forskolin/IBMX जोड़ें ।
    3. शिविर + VX770 के लिए, forskolin/IBMX पहले जोड़ें, फिर VX770 2 मिनट के बाद ।
    4. बाधित शर्तों के लिए, पहले Inh172 जोड़ें, फिर 2 मिनट बाद forskolin/IBMX ।
  7. उत्तेजना के तुरंत बाद, मॉनिटर अंडाकार आकृति सूजन के लिए डीकॉक इमेजिंग द्वारा 1 ज. सॉफ्टवेयर में, "छवि कैप्चर" पर क्लिक करें । क्लिक करें "डीकॉक", और अंतराल सेट करने के लिए 30 s, ६० मिनट की अवधि के साथ एक उपयुक्त नाम दर्ज करें और "सहेजें" क्लिक डीकॉक प्रारंभ करने के लिए ।
    नोट: मानक डीकॉक एक एकल अंडाकार आकृति हर 30 एस की छवियों को पकड़ने के लिए एक उच्च गुणवत्ता वाले वीडियो सुनिश्चित करने के लिए है । वैकल्पिक रूप से, पूरी तरह (जैसे, 4x), और कम छवियों पर कब्जा कर लिया अगर वांछित की कम आवर्धन कब्जा करते हैं । यदि किसी स्वचालित अवस्था का उपयोग किया जाता है, तो पूर्वनिर्धारित निर्देशांकों का उपयोग करके सभी spheroids का डीकॉक करें; अंयथा, सूजन की एक गुणात्मक समीक्षा प्रदान करने के लिए spheroids के एक सबसेट के डीकॉक का उपयोग करें और कोई व्यवस्थित मुद्दों को सुनिश्चित करने के लिए इमेजिंग के दौरान उत्पन्न (जैसे, अच्छी तरह से मैट्रिक्स टुकड़ी) ।
  8. 1 एच डीकॉक छवि के पूरा होने पर तुरंत, पद के सभी spheroids की उत्तेजना छवियों (९.५ कदम प्रति) कदम 9.5.3 में बनाया नक्शे का उपयोग कर कब्जा ।
    1. पूर्व-उत्तेजना छवियों को देखें ध्यान का एक ही विमान सुनिश्चित करने के लिए अनुवर्ती छवियों (आसपास के कोशिकाओं, spheroids, या मलबे के फोकल गुणवत्ता के लिए प्रयोग किया जाता है बहुत इस प्रक्रिया की सुविधा) ।
    2. चरण 9.5.4 (उदा., अंडाकार आकृति 1 पद उत्तेजना) से युग्मित एनोटेशन के साथ फ़ाइलें सहेजें ।
      नोट: डीकॉक के तुरंत बाद इस चरण को पूरा, के रूप में spheroids प्रफुल्लित करने के लिए जारी रख सकते हैं ।
  9. अच्छी तरह से ताजा भेदभाव मीडिया के साथ छवि में मीडिया बदलें ।
  10. दोहराएँ चरण ९.५ के माध्यम से ९.९ के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से/हालत, समायोजन दवाओं प्रयोगात्मक स्थितियों के लिए संकेत के रूप में.
  11. एक बार जब सभी इमेजिंग, ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% CO2पर मशीन के लिए spheroids वापसी पूरा हो गया है ।
    ध्यान दें: मशीन माइक्रोस्कोप चैंबर की बांझपन पर निर्भर करता है, spheroids के बाद उत्तेजना संदूषण काफी आम हो सकता है । या तो छवि spheroids एक अलग मशीन में रखने के लिए, पार संक्रमण जोखिम को कम करने, या इमेजिंग के बाद तुरंत spheroids त्यागें ।

10. विश्लेषण HNE अंडाकार आकृति छवियां

  1. सभी कैप्चर की गई छवियां छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के साथ संगत स्वरूप में निर्यात करें । सॉफ्टवेयर में क्लिक करें "देखें", पर मंडराना "निर्यात", और चुनें "झगड़ा के रूप में सभी छवियों के डिफ़ॉल्ट विचार..." । हार्ड ड्राइव या विश्लेषण के लिए एक फ्लैश ड्राइव करने के लिए सहेजें ।
    नोट: एक व्यावसायिक विश्लेषण सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिका) और. tiff फ़ाइलें अच्छा प्रदर्शन और यहां वर्णित हैं, हालांकि विश्लेषण भी अंय प्लेटफार्मों का उपयोग किया जा सकता है । जब फ़ाइलों का नामकरण, स्टाफ छवियों का विश्लेषण प्रयोगात्मक स्थितियों के लिए अंधा हो जाना चाहिए, लेकिन पता है जो छवियों के (पूर्व और बाद उत्तेजना) बनती है समकक्ष विश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए ।
  2. विश्लेषण सॉफ्टवेयर का प्रयोग, प्रत्येक अंडाकार आकृति छवि के चमकदार क्षेत्र चित्रित और एक डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर में निर्यात ।
    1. विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें । "फ़ाइल" पर क्लिक करें, फिर "खुला" और अंडाकार आकृति छवियों वाले फ़ाइल फ़ोल्डर में नेविगेट. विश्लेषण के लिए सभी छवियां चुनें और "खोलें" क्लिक करें ।
    2. "माप" पर क्लिक करें और "क्षेत्र माप" चुनें. क्षेत्र माप संवाद बॉक्स में, droptab "कॉन्फ़िगरेशन" और सुनिश्चित करें कि "छवि नाम" और "क्षेत्र" बक्सों की जाँच कर रहे हैं चुनें ।
    3. "लॉग" पर क्लिक करें और "डेटा लॉग खोलें" चुनें. डेटा लॉग संवाद बॉक्स पर "ठीक" क्लिक करें और नाम फ़ाइल तदनुसार (उदा., शर्त X, दिनांक) । यह एक स्प्रेडशीट के लिए सभी माप हस्तांतरण होगा ।
    4. का चयन करें "क्षेत्र ट्रेस" उपकरण बटन और ध्यान से विश्लेषण के लिए पहली छवि में अंडाकार आकृति के लुमेन का पता लगाने. क्षेत्र माप संवाद बॉक्स में, Excel में माप लॉग करने के लिए "लॉग डेटा" क्लिक करें ।
    5. दोहराएँ कदम 10.2.2-10.2.4 जब तक सभी spheroids विश्लेषण कर रहे हैं.
  3. प्रत्येक व्यक्ति अंडाकार आकृति छवि जोड़ी के लिए आधारभूत से चमकदार क्षेत्र में प्रतिशत परिवर्तन (१०० * [Post-stim-बेसलाइन] ÷ आधारभूत) की गणना करें और विश्लेषण के लिए डेटा संकलित करे.

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Representative Results

HNEs संस्कृति डिश के लिए संलग्न करना चाहिए और बीज के ७२ ज के भीतर कोशिकाओं के छोटे द्वीपों के रूप में; एक सप्ताह में अच्छे और गरीब द्वीप गठन के उदाहरण क्रमशः चित्र 1a और 1bमें दिखाए जाते हैं । इन द्वीपों के लिए 15-30 दिन के पाठ्यक्रम पर पकवान कवर का विस्तार करना चाहिए । छोटे या उपइष्टतम नमूने अधिक समय लग सकता है, और अक्सर उपयोगी spheroids उपज नहीं होगा । संक्रामक एजेंटों के साथ संदूषण गहरे पीले/बादल मीडिया, कोशिकाओं की विफलता के लिए संस्कृति पकवान को संलग्न द्वारा सबूत है, और/या कवक के प्रत्यक्ष दृश्य/ किसी भी प्रदूषित संस्कृतियों को पार-संदूषण से बचने के लिए तुरंत छोड देना चाहिए ।

पहले के भीतर 3-4 संस्कृति के तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में दिनों, छोटे सिस्टिक संरचनाओं के लिए शुरू करने के लिए मैट्रिक्स में फार्म का होना चाहिए । ये लगभग 10 दिनों में बरकरार spheroids एक पतली दीवार और एक चमकदार सतह का प्रदर्शन में परिपक्व हो जाएगा । यदि वर्णित घनत्व पर चढ़ाया, सफल संस्कृतियों मैट्रिक्स ड्रॉप प्रति 50-100 spheroids शामिल होंगे । लुमेन अपेक्षाकृत स्पष्ट हो सकता है (चित्रा 1C) या सेलुलर मलबे और बलगम से भरा (चित्रा 1 डी); पूर्व के साथ spheroids में अधिक आम है जंगली प्रकार CFTR (wtCFTR), और CF spheroids में बाद । चित्रा 1C और 1 डी में spheroids के चमकदार क्षेत्र चित्रित करने के लिए मास्किंग क्रमशः चित्रा 1E और 1Fमें प्रदर्शित किया जाता है । खराब बनाई/असफल अंडाकार आकृति संस्कृतियों के उदाहरण चित्रा 1G और ज में प्रदान की जाती हैं ।

जंगली प्रकार और F508del CFTR homozygous HNE spheroids के लिए प्रतिनिधि कार्यात्मक डेटा क्रमशः चित्रा 2a और बीसी में दिखाया गया है; इस डेटा का प्रतिनिधि > है जंगली प्रकार में 10 अद्वितीय HNE नमूने और F508del CFTR homozygous विषयों30. संक्षेप में, कार्यात्मक CFTR गज़ब के साथ spheroids, जबकि बेकार CFTR के साथ उन काफी कम है, या सिकुड़ सकते है प्रफुल्लित । विशेष रूप से, wtCFTR के साथ विषयों से spheroids एक घंटे से अधिक गज़ब जब उत्तेजित होना चाहिए, और कम प्रफुल्लित करना चाहिए या यदि CFTR अवरोध करनेवाला Inh172 की उपस्थिति में उत्तेजित हटना । इसके विपरीत, F508del CFTR के लिए एक विषय homozygous से spheroids या तो हटना या बहुत थोड़ा प्रफुल्लित होना चाहिए, वृद्धि की सूजन के साथ (या कम सिकुड़ते) जब औषधीय CFTR मॉडुलन VX809 और VX770 के साथ सही. अंडाकार आकृति विश्वसनीयता के पिछले दोनों के भीतर और एक ही जीनोटाइप के विषयों के बीच विश्लेषण दोहराया उपायों में CFTR पादी और मामूली परिवर्तनशीलता के कार्यात्मक पृथक्करण का प्रदर्शन 30 ।

मीडिया घटक स्टॉक समाधान राशि भंडारण
विस्तार मीडिया
DMEM/एफ 12 पोषक तत्व मिश्रण "बेस मीडिया" के रूप में उपयोग करें 2x ५०० एमएल कंटेनरों निर्माता समाप्ति तिथि तक 4 º c पर स्टोर
भ्रूण गोजातीय सीरम के रूप में उपयोग करें ५० एमएल दुकान पर-20 º सी ऊपर निर्माता समाप्ति तिथि करने के लिए
हैजा विष 10 बाँझ पानी की 1 मिलीलीटर में मिलीग्राम 1 µ l छह महीने तक-20 º c पर स्टोर स्टॉक
एपिडर्मल वृद्धि कारक ५०० µ जी में 1 मिलीलीटर बाँझ पानी 20 µ l छह महीने तक-20 º c पर स्टोर स्टॉक
Hydrocortisone ०.४ मिलीग्राम ४०० में बाँझ पानी की µ l संपूर्ण ४०० µ l aliquot प्रत्येक बैच के साथ ताजा बनाओ । निर्माता समय सीमा समाप्ति दिनांक तक कमरे के तापमान पर पाउडर स्टोर
Adenine 24 बाँझ पानी के 1 मिलीलीटर में मिलीग्राम पूरे 1 मिलीलीटर aliquot प्रत्येक बैच के साथ ताजा बनाओ । निर्माता समय सीमा समाप्ति दिनांक तक कमरे के तापमान पर पाउडर स्टोर
वाई-२७६३२ ३.२ मिलीग्राम बाँझ पानी की 1 मिलीलीटर में पूरे 1 मिलीलीटर aliquot प्रत्येक बैच के साथ ताजा बनाओ । स्टोर पर पाउडर-20 º सी ऊपर निर्माता समाप्ति तिथि करने के लिए
एंटीबायोटिक मीडिया
Amphotericin बी के रूप में उपयोग करें १.२ एमएल निर्माता समाप्ति तिथि तक 4 º c पर स्टोर
Ceftazidime 15 बाँझ पानी की 1 मिलीलीटर में मिलीग्राम पूरे 1 मिलीलीटर aliquot प्रत्येक बैच के साथ ताजा बनाओ । स्टोर पर पाउडर-20 º सी ऊपर निर्माता समाप्ति तिथि करने के लिए
Tobramycin 15 बाँझ पानी की 1 मिलीलीटर में मिलीग्राम पूरे 1 मिलीलीटर aliquot प्रत्येक बैच के साथ ताजा बनाओ । स्टोर पर पाउडर-20 º सी ऊपर निर्माता समाप्ति तिथि करने के लिए
Vancomycin 15 बाँझ पानी की 1 मिलीलीटर में मिलीग्राम पूरे 1 मिलीलीटर aliquot प्रत्येक बैच के साथ ताजा बनाओ । स्टोर पर पाउडर-20 º सी ऊपर निर्माता समाप्ति तिथि करने के लिए

तालिका 1: विस्तार और एंटीबायोटिक मीडिया के घटक ।

मीडिया घटक स्टॉक समाधान राशि भंडारण
DMEM/एफ 12 पोषक तत्व मिश्रण "बेस मीडिया" के रूप में उपयोग करें 2x ५०० एमएल कंटेनरों निर्माता समाप्ति तिथि तक 4 º c पर स्टोर
Ultroser-जी एक एकल, 20 मिलीलीटर की बोतल में बाँझ पानी की 20 मिलीलीटर lyophilized Ultroser-G पूरे 20 मिलीलीटर aliquot प्रत्येक बैच के साथ ताजा बनाओ । निर्माता समाप्ति तिथि तक 4 º c पर स्टोर पाउडर
भ्रूण क्लोन द्वितीय के रूप में उपयोग करें 20 मिलीलीटर दुकान पर-20 º सी ऊपर निर्माता समाप्ति तिथि करने के लिए
कलम Strep के रूप में उपयोग करें 10 मिलीलीटर दुकान पर-20 º सी ऊपर निर्माता समाप्ति तिथि करने के लिए
गोजातीय ब्रेन निकालें के रूप में उपयोग करें २.४८ एमएल दुकान पर-20 º सी ऊपर निर्माता समाप्ति तिथि करने के लिए
कैल्सीटोनिन के रूप में उपयोग करें २५० µ l दुकान पर-20 º सी ऊपर निर्माता समाप्ति तिथि करने के लिए
इंसुलिन के रूप में उपयोग करें २५० µ l दुकान पर-20 º सी ऊपर निर्माता समाप्ति तिथि करने के लिए
Ethanolamine के रूप में उपयोग करें 15 µ l कमरे के तापमान पर स्टोर करने के लिए निर्माता समय सीमा समाप्ति दिनांक
एड्रेनालाईन २.७५ मिलीग्राम बाँझ पानी की 1 मिलीलीटर में पूरे 1 मिलीलीटर aliquot प्रत्येक बैच के साथ ताजा बनाओ । निर्माता समाप्ति तिथि तक 4 º c पर स्टोर पाउडर
ट्राईआयोडोथायरोनिन ८.४ मिलीग्राम में ५० µ l की DMSO संपूर्ण ५० µ l aliquot प्रत्येक बैच के साथ ताजा बनाओ । स्टोर पर पाउडर-20 º सी ऊपर निर्माता समाप्ति तिथि करने के लिए
Hydrocortisone ७.२४ इथेनॉल के 1 मिलीलीटर में मिलीग्राम 1 µ l छह महीने तक-20 º c पर स्टोर स्टॉक
Phsophoryletheanolamine ३५.२५ मिलीग्राम बाँझ पानी की 1 मिलीलीटर में 1 µ l छह महीने तक-20 º c पर स्टोर स्टॉक
Retinoic अम्ल DMSO की 1 मिलीलीटर में 3 मिलीग्राम 1 µ l छह महीने तक-20 º c पर स्टोर स्टॉक

तालिका 2: विभेदक माध्यम के अवयव ।

Figure 1
चित्र 1 : HNE विस्तार और HNE Spheroids के संरचनात्मक विशेषताओं । चढ़ाना के बाद सात दिनों लिया HNE विस्तार संस्कृतियों की Brightfield छवियां सफल प्रदर्शन (सफेद तीर, पैनल एक) और असफल (पैनल बी) एक फीडर fibroblast पृष्ठभूमि पर HNE कॉलोनी गठन । सफल wtCFTR और F508del homozygous spheroids क्रमशः पैनलों सी और डीमें दिखाए जाते हैं । सी/डी से spheroids के चमकदार क्षेत्र को चित्रित करने के लिए मास्किंग क्रमशः पैनलों ई और एफमें प्रदान की जाती है । असफल अंडाकार आकृति संस्कृतियों छोटे, अव्यवस्थित सेलुलर मलबे (पैनल जी) और/या कोशिकाओं के अव्यवस्थित झुरमुट (पैनल एच) की विशेषता है । स्केल बार = १०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : HNE Spheroids के कार्यात्मक विशेषताओं । प्रतिनिधि कार्यात्मक wtCFTR spheroids के एक एकल दाता से प्रतिक्रियाओं, जब forskolin/IBMX के साथ/CFTR अवरोध करनेवाला Inh172 की उपस्थिति के बिना के साथ उत्तेजित पैनल में दिखाया गया है (a) प्रत्येक बिंदु एक एकल अंडाकार आकृति में प्रतिक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है । एक एकल दाता से F508del homozygous spheroids के प्रतिनिधि कार्यात्मक प्रतिक्रियाओं, जब forskolin के साथ प्रेरित/IBMX और VX809 की उपस्थिति के बिना/पैनल (B) में दिखाए जाते हैं । त्रुटि पट्टियां = SEM. * * p < 0.01; p < 0.001 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल रोगी की पीढ़ी नाक सेल अंडाकार आकृति एक व्यक्तिगत, CFTR समारोह के विशिष्ट मॉडल का उत्पादन करने में सक्षम संस्कृतियों का वर्णन करता है । इस प्रक्रिया में कई महत्वपूर्ण कदम है कि बारीकी से कठिनाई से बचने के लिए भाग लिया जाना चाहिए रहे हैं । पहले रोगी की नाक से एक अच्छा नमूना अधिग्रहण है । एक अच्छा नमूना है चाहिए > 50, 000 कोशिकाओं, सीमित बलगम/मलबे, और 4 घंटे के भीतर प्रसंस्करण के लिए तैयार हो (हालांकि सफलता भी आसानी से बर्फ पर रात शिपिंग के साथ प्राप्त है) । अध्ययन स्टाफ द्वारा curette या ब्रश के साथ नमूने प्राप्त करने का अभ्यास आवश्यक है, जो एक या दो प्रदाताओं के हाथों में जल्दी नमूना अधिग्रहण ध्यान केंद्रित करके अपने आराम को अधिकतम करने के लिए सुविधा है । दूसरा, सभी ऊतक संस्कृति कदम में अच्छी साफ/बाँझ तकनीक आवश्यक है । विफलता के प्राथमिक मोड, हमारे अनुभव में, सभी HNE संस्कृतियों के लिए बैक्टीरियल या कवक संदूषण है, जो दोनों प्राथमिक नमूना और मशीन में अंय बढ़ती संस्कृतियों जटिल कर सकते हैं । इस जोखिम केवल पुराने संक्रमण के साथ विषयों की संस्कृतियों के साथ बढ़ जाती है (उदा, CF), इसलिए सफलता काफी हद तक संस्कृतियों को साफ और अलग रखने की क्षमता पर टिका है । हमारे अभ्यास के लिए एक मशीन केवल संक्रमण प्रवण संस्कृतियों के लिए पहले 5-7 दिनों के भीतर अलग रखना है, अनजाने संदूषण से पुराने, सफल संस्कृतियों की रक्षा । तीसरा, विस्तार चरण के दौरान कोशिकाओं को बारीकी से देखना और संगम से बचने के लिए महत्वपूर्ण है । यदि कोशिकाओं को थाली पर पूर्ण संगम तक पहुँचने की अनुमति दी जाए, तो एक खतरा यह है कि संस्कृति या तो वृद्ध होनेवाला बन जाएगी या कोशिकाएँ मरने और अलग होने के लिए शुरू हो जाएंगी. अंत में, जब spheroids के रूप में कोशिकाओं चढ़ाना, यह अच्छी तरह से मैट्रिक्स के माध्यम से कोशिकाओं को फैलाने के लिए और एक समान रूप से वितरित नमूना थाली महत्वपूर्ण है । या तो अधिक या मैट्रिक्स बूंदों की जनसंख्या के तहत संस्कृति की विफलता को बढ़ावा मिलेगा, और कोशिकाओं के बड़े झुरमुट सफल spheroids का उत्पादन नहीं होगा ।

इस प्रोटोकॉल को लागू करते समय, जांचकर्ताओं को कुछ सामांय समस्याओं का सामना करना पड़ सकता है । संक्रमण, जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, सबसे अच्छा बलगम और स्वच्छ संस्कृति तकनीक के बिना एक अच्छा प्रारंभिक नमूना की खरीद से बचा है । यदि संस्कृतियों के विस्तार के माध्यम से सफल रहे हैं, लेकिन कोई विभेदित क्षेत्रों का गठन कर रहे हैं, कई मुद्दों पर हुई हो सकती है । यदि मैट्रिक्स ज्यादातर खाली प्रतीत होता है, यह सबसे अधिक संभावना है कि कोशिकाओं को भी एक घनत्व के कम वरीयता प्राप्त थे; लगभग 20% द्वारा बाद के प्रयासों के बोने के घनत्व में वृद्धि । इसके विपरीत, अगर मैट्रिक्स प्रतीत होता है "गंदा" प्रचुर सेल मलबे के साथ, यह संभावना है कि कोशिकाओं को भी एक घनत्व के उच्च पर वरीयता प्राप्त थे, और बाद में प्रयास एक बोने की सघनता का उपयोग करना चाहिए लगभग 20% से कम है । बाद के बीज बोने की एक आम जटिलता, और रखरखाव के संस्कृति पोत से मैट्रिक्स की टुकड़ी है । यह पीढ़ी आक्रामक मीडिया एक्सचेंज के कारण होता है और सावधानी से और मैंयुअल रूप से एक 1-एमएल पिपेट, नहीं दीवार चूषण के साथ मीडिया को बदलने से बचा जा सकता है । यदि का सामना करना पड़ा, क्षेत्रों अभी भी उत्तेजित हो सकता है और छवि, हालांकि यह मुश्किल हो सकता है अगर मैट्रिक्स "में अच्छी तरह से इमेजिंग के दौरान मंगाई", necessitating spheroids के भीतर अच्छी तरह से सतर्क मानचित्रण ।

जांचकर्ताओं प्रोटोकॉल के लिए कई संशोधनों का पीछा कर सकते हैं, उनकी प्रयोगशाला की जरूरतों पर निर्भर करता है । spheroids के उच्च रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए, हमने पहले ३५-mm ग्लास-नीचे व्यंजन या चैंबर स्लाइड सहित ऑप्टिकल ग्लास विकल्पों के साथ 4-वेल प्लेटों को प्रतिस्थापित किया है । यह उच्च संकल्प, spheroids के लाइव इमेजिंग के लिए अनुमति देता है, लेकिन प्रवाह को कम कर सकते हैं । वैकल्पिक रूप से, प्रवाह को बढ़ाने के लिए, मैट्रिक्स में कोशिकाओं के छोटे aliquots अन्य जहाजों में वरीयता प्राप्त किया जा सकता (जैसे, 24-well कल्चर प्लेट्स). हमारे अनुभव में, spheroids के रूप में अच्छी तरह से नीचे पर एक चादर बनाने के लिए विरोध के रूप में एक "छोटी बूंद" फार्म में मैट्रिक्स के साथ सबसे अच्छा हो जाना; के रूप में इस तरह, हम की बूंदों के साथ सबसे अच्छी सफलता मिली है कम से 25 µ एल जांचकर्ताओं को मीडिया के साथ कमजोर द्वारा मैट्रिक्स के घनत्व में परिवर्तन करना चाहते हो सकता है । यह आवश्यक मैट्रिक्स की कुल राशि कम कर देता है, परख की लागत में सुधार । यह भी हो सकता है, तथापि, अंडाकार आकृति संरचना में परिवर्तन । हमारे पिछले अनुभव में, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के कम सांद्रता बदल अंडाकार आकृति संरचना के लिए सीसा, या तो आंशिक या पूर्ण spheroids के एक "सेल में एपेक्स-आउट" आकृति विज्ञान के साथ । जैसे, spheroids मैट्रिक्स एकाग्रता में किसी भी प्रोटोकॉल परिवर्तन के माध्यम से उत्पंन सावधानी से कार्यात्मक परीक्षण से पहले आकृति विज्ञान के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए की कोशिश की है । अंत में, विभिंन उत्तेजक या निरोधात्मक दवाओं, या इन दवाओं के विभिंन सांद्रता, कार्यरत हो सकता है । Forskolin, IBMX, और Inh172 अली संस्कृतियों में पिछले अनुभव के आधार पर इन सांद्रता में हमारे अध्ययन के लिए चुना गया31। अंय दवाओं (जैसे, उत्तेजना के लिए isoproterenol, निषेध के लिए GlyH101) का प्रयोग बेहतर एक अंवेषक के अध्ययन के लिए लागू हो सकता है । इसी तरह, forskolin, IBMX, या Inh172 के विभिंन सांद्रता का उपयोग परख के गतिशील रेंज बदल सकते हैं, तथापि, हम व्यवस्थित इन विकल्पों का परीक्षण नहीं किया है ।

मौजूदा पूर्व vivo रोगी-व्युत्पंन CFTR परख की संख्या को देखते हुए, वर्णित मॉडल कई प्रमुख कारणों के लिए उल्लेखनीय है । सबसे पहले, यह श्वसन ऊतक के एक आसानी से प्राप्त स्रोत के रूप में नाक की कोशिकाओं पर कैपिटल । HNE अधिप्राप्ति लगभग किसी भी सेटिंग (क्लिनिक, या, सभी आयु समूहों में अनुसंधान यात्रा) में ंयूनतम प्रशिक्षण के साथ सुरक्षित रूप से किया जा सकता है25। यह मजबूत नमूना खरीद की सुविधा है, और अगर विकास कठिनाई या संदूषण के कारण आवश्यक नमूना दोहराने । आंतों organoids की तुलना में, HNE spheroids कम अच्छी तरह से विशेषता है और वर्तमान रूप में एक छोटे गतिशील रेंज है दिखाई देते हैं, हालांकि, सैनिक ऊतक के बजाय श्वसन का उपयोग एक महत्वपूर्ण लाभ हो सकता है, कई CF रोग ड्राइवरों के रूप में (उदा. mucociliary निकासी, उपकला सोडियम चैनल अभिव्यक्ति) पेट में समकक्ष नहीं हैं. के रूप में planar, HNE कोशिकाओं के अली संस्कृतियों का विरोध किया, spheroids तेजी से बड़े हो रहे है और vivo स्थिति में अधिक प्रतिनिधि हो सकता है, एक शारीरिक प्रक्रिया (द्रव homeostasis) है कि अधिक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी अकेले३२से अधिक प्रासंगिक हो सकता है मापने । नमूना खरीद से लेकर परीक्षण तक के समय में सुधार करके, संदूषण क्षमता घटाई जाती है, इसलिए संस्कृति की सफलता की संभावना बढ़ जाती है. अंत में, 3-मॉडल के आयामी प्रकृति airway विकास या आकृति विज्ञान है कि अली संस्कृतियों में व्यवहार्य नहीं है में अनुसंधान के उपंयास और/या पूरक लाइनों के लिए उत्तरदाई हो सकता है (जैसे, चमकदार बलगम ट्रैकिंग, भेदभाव के तेजी से अध्ययन, आदि) ।

वहां CFTR समारोह की एक परख के रूप में HNE spheroids के लिए कई प्रमुख सीमाएं हैं । सबसे पहले, यह परख अपेक्षाकृत कम प्रवाह रहता है । वर्तमान विधियों का प्रयोग, छवि अधिग्रहण प्रत्येक संस्कृति की स्थिति के लिए एक घंटे से अधिक लेता है, और विश्लेषण शर्त प्रति एक अतिरिक्त 20-30 मिनट लेता है । यह कुछ शर्तों (जैसे चित्र 2aमें प्रदर्शित) के बीच ओवरलैप की डिग्री से जटिल है, जो माप की एक बड़ी संख्या को आवश्यक है (यह अपने आप में ओवरलैप भी इस परख की संवेदनशीलता की एक सीमा का प्रतिनिधित्व कर सकता है) । जैसे, 4-6 शर्तों के साथ एक एकल प्रयोग पूरा होने के लिए लगभग दो दिन की आवश्यकता है । प्रवाह स्वचालित छवि पर कब्जा और विश्लेषण के तरीकों को रोजगार के द्वारा सुधार किया जा सकता है; इस तरह के रूपांतरों वर्तमान में प्रगति पर हैं । दूसरे, इस मॉडल में बड़ी मात्रा में मैट्रिक्स की आवश्यकता होती है, जो महँगी बन सकती है. जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, मैट्रिक्स के कमजोर पड़ने में मदद इस बाधा को दूर कर सकते हैं, लेकिन सावधानी के साथ लिया जाना चाहिए, के रूप में वृद्धि मैट्रिक्स में परिवर्तन की संभावना अंडाकार आकृति आकृति विज्ञान में परिवर्तन में परिणाम होगा । तीसरा, इस मॉडल एक XY विमान में अंडाकार आकृति माप पर निर्भर करता है केवल, और Z विमान में सूजन की उपेक्षा, जो पूर्वाग्रह का परिचय हो सकता है । जबकि पिछले reproducibility विश्लेषण किया गया है आश्वस्त, इस कमी को जेड के साथ स्वचालित इमेजिंग के उपयोग से दूर किया जा सकता है विमान स्कैनिंग के लिए30मात्रा की गणना । अंत में, और सबसे महत्वपूर्ण बात, व्यापक काम करने के लिए व्यक्तिगत विषय के लिए अंडाकार आकृति प्रतिक्रियाओं टाई vivo में दवा की प्रतिक्रिया अभी तक पूरा हो गया है । इस संबंध के अभाव में, मॉडल के पूर्वानुमानित मूल्य-जबकि होनहार-अस्पष्ट है ।

जनरेशन और HNE spheroids के विश्लेषण व्यक्तिगत CFTR गतिविधि और मॉडुलन, जो अंततः दवा की प्रतिक्रिया के एक पूर्व नैदानिक मॉडल के रूप में उपयोगी हो सकता है की पूर्व vivo विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं । इसके अलावा, CF रोग गंभीरता में व्यापक परिवर्तनशीलता को देखते हुए, इस तरह के एक व्यक्तिगत मॉडल एक विषय के अनूठे airway microenvironment में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । इस तरह, एक मॉडल व्यापक CFTR जीव विज्ञान और समझ रोग विविधता में सहायता के अध्ययन के लिए उपयोगी हो सकता है । इस मॉडल के भविष्य का उपयोग, साथ ही साथ व्यक्तिगत CFTR समारोह के अंय समान मॉडल, को बेहतर प्रयोगशाला में CFTR जीवविज्ञान समझ वादा रखती है, और व्यक्तिगत और क्लिनिक में सटीक दवा ड्राइव ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन चिकित्सकीय, अनुदान संख्या CLANCY14XX0 द्वारा समर्थित किया गया था, और सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन के माध्यम से, अनुदान संख्या CLANCY15R0. लेखक रोगी भर्ती और विनियामक निरीक्षण में उसकी सहायता के लिए क्रिस्टीना रे शुक्रिया अदा करना चाहता हूं । लेखक भी HNE कार्य समूह, सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन, जो HNE संस्कृति क्षमताओं की पीढ़ी में सहायता: प्रेस्टन Bratcher, केल्विन कॉटन, मार्टिना Gentzsch, एलिजाबेथ Joseloff, माइकल Myerburg, डेव Nichols, द्वारा समर्थित का शुक्रिया अदा करना चाहता हूं स्कॉट Randell, स्टीव रोवे, जी मार्टी सुलैमान, और कैथरीन Tuggle ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Eppendorf Tube USA Scientific  4036-3204
150 mL Filter Flask Midsci  TP99150 To filter Media
15 mL Conical Tube Midsci  TP91015
1 L Filter Flask Midsci  TP99950 To filter Media
35 mm Glass-Bottom Dish MatTek Corporation P35G-0-20-C Optional
3-Isobutyl-1-Methylxanthine (IBMX) Fisher Scientific  AC228420010  Prepare a 100 mM stock solution of 22.0 mg in 1 mL of DMSO
50 mL Conical Tube Midsci   TP91050
Accutase Innovative Cell Technologies, Inc. AT-104 Cell detachment solution
Adenine Sigma-Aldrich A2786-25G See Table 1
Amphotericin B Sigma-Aldrich A9528-100MG See Table 1
Bovine Brain Extract (9mg/mL) Lonza  CC-4098 See Table 2
Ceftazidime hydrate Sigma-Aldrich C3809-1G See Table 1
Cell Scrapers 20 cm  Midsci  TP99010
CFTR Inh172 Tocris Bioscience 3430 Prepare a 10 mM stock solution of 4.0 mg in 1 mL of DMSO
Cholera Toxin B (From Vibrio cholerae) Sigma-Aldrich C8052-.5MG See Table 1
CYB-1 Medical Packaging Corporation CYB-1 Cytology brush
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D5879-500ML
Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12 Hepes  Life Technologies  11330-057 Base Medium; See Tables 1 and 2
Epidermal Growth Factor (Recombinant Human Protein, Animal-Origin Free) Thermo Fisher Scientific PHG6045 See Table 1
Epinephrine Sigma-Aldrich E4250-1G See Table 2
Ethanol Fisher Scientific  2701
Ethanolamine Sigma-Aldrich E0135-500ML 16.6 mM solution; See Table 2
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) TCI America  E0084
Fetal Bovine Serum (high performance FBS) Invitrogen  10082147 See Table 1
Forskolin Sigma-Aldrich F6886-50 Prepare a 10 mM stock solution of 4.1 mg in 1 mL of DMSO
Growth Factor-Reduced Matrigel Corning, Inc. 356231 Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free, 10 mL.
Hemacytometer Hausser Scientific 1483
Human Collagen Solution, Type I (VitroCol; 3 mg/mL) Advanced BioMatrix 5007-A Collagen solution
HyClone (aka FetalClone II)  GE Healthcare  SH30066.03HI See Table 2
Hydrocortisone StemCell Technologies 07904 See Tables 1 and 2
Insulin, human recombinant, zinc solution Life Technologies  12585014 4 mg/mL solution; see Table 2
IVF 4-Well Dish, Non-treated NUNC (via Fisher Scientific) 12566350 4-well plate for spheroids; similar well size to a 24-well plate
MEF-CF1-IRR Globalstem GSC-6001G Irradiated murine embryonic fibroblasts
Metamorph 7.7 Molecular Devices Analysis Software; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software for a quote
Olympus IX51 Inverted Microscope Olympus Corporation Discontinued Imaging Microscope. Replacment: Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/  for a quote
Pen Strep Life Technologies  15140122 See Table 2
Phsophoryletheanolamine Sigma-Aldrich P0503-5G See Table 2
Retinoic Acid Sigma-Aldrich R2625-50MG See Table 2
Rhinoprobe Arlington Scientific, Inc. 96-0905 Nasal curette
Slidebook 5.5 3i, Intelligent Imaging Innovations Discontinued Imaging Software. Replacement: Slidebook 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook for a quote
Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 20012050
Sterile Water Sigma-Aldrich W3500-6X500ML
Tissue Culture Dish 100 Techno Plastic Products 93100 Tissue culture dish for expansion
Tobramycin Sigma-Aldrich T4014-100MG See Table 1
Transferrin (Human Transferrin 0.5 mL) Lonza  CC-4205 See Table 2
Triiodothryonine Sigma-Aldrich T6397-1G 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt  [T3]; See Table 2
Trypsin from Porcine Pancreas Sigma-Aldrich T4799-10G
Ultroser-G Crescent Chemical (via Fisher Scientific) NC0393024 20 mL lypophilized powder; See Table 2
Vancomycin hydrochloride from Streptomyces orientalis Sigma-Aldrich V2002-5G See Table 1
VX770 Selleck Chemicals S1144 Prepare a 1 mM stock solution of 0.4 mg in 1 mL of DMSO
VX809 Selleck Chemicals S1565 Purchase or prepare a 10 mM stock solution of 4.5 mg in 1 mL of DMSO
Y-27632 Dihydrochloride  ROCK inhibitor  Enzo LifeSciences  ALX-270-333-M025  See Table 1

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References

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चिकित्सा अंक १३४ सिस्टिक फाइब्रोसिस CFTR प्रेसिजन मेडिसिन Organoid अंडाकार आकृति नाक सेल सेल संस्कृति
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