Summary
Aqui nós descrevemos um método para gerar culturas esferoide tridimensional de células epiteliais nasais humanas. Esferoides são então estimulados a unidade de fibrose cística regulador de condutância transmembrana (CFTR)-íon dependente e secreção fluida, quantificar a mudança no tamanho luminal esferoide como um proxy para função CFTR.
Abstract
Enquanto a introdução de medicamentos de modulador de fibrose cística regulador de condutância transmembrana (CFTR) revolucionou a cuidados na fibrose cística (CF), o modelo de terapia genótipo-dirigido, atualmente em uso tem várias limitações. Grupos de primeira, raro ou pouco estudado de mutação são excluídos dos ensaios clínicos definitivos. Além disso, como drogas adicionais modulador entrarem no mercado, ele se tornará difícil de otimizar as escolhas de modulador para um sujeito individual. Estas duas questões são tratadas com o uso de sistemas de paciente-derivado, individualizado pré-clínicos modelo de função CFTR e modulação. Células epiteliais nasais humanas (HNEs) são uma fonte facilmente acessível de tecido respiratório para esse modelo. Aqui, descrevemos a geração de um modelo tridimensional esferoide de função CFTR e modulação usando HNEs primários. HNEs são isolados de indivíduos de uma forma minimamente invasiva, expandiu-se em condições de reprogramação condicionais e semeado na cultura esferoide. Dentro de duas semanas de semeadura, culturas de esferoide geram esferoides HNE que podem ser estimulados com 3', 5'-cíclico adenosina monofosfato (cAMP)-gerando agonistas para ativar a função CFTR. Inchaço de esferoide é então quantificado como um proxy de atividade CFTR. Esferoides HNE capitalizar a origem minimamente invasiva, mas respiratória das células nasais para gerar um modelo acessível e personalizado relevante para um epitélio refletindo a mortalidade e a morbidade da doença. Em comparação com as culturas HNE interface ar-líquido, esferoides são relativamente rápidas amadurecer, que reduz a taxa de contaminação global. Na sua forma atual, o modelo é limitado pela baixa taxa de transferência, mas isso é compensado pela relativa facilidade de aquisição de tecido. Esferoides HNE podem ser usados para confiantemente quantificar e caracterizar a atividade CFTR no nível individual. Um estudo em curso para amarrar esta quantificação na vivo resposta droga irá determinar se esferoides HNE são verdadeiro pré-clínicos preditor de resposta do doente à modulação de CFTR.
Introduction
Fibrose cística (CF) é uma doença fatal, autossômica recessiva, afetando mais de 70000 pessoas em todo o mundo1. Esta doença genética da vida-gordura é causada por mutações na condutância transmembranar de fibrose cística regulador proteína (CFTR)2. CFTR é um membro da família de gaveta de trifosfato de adenosina-ligação e funções como um canal iônico, permitindo a circulação de cloreto e bicarbonato através das membranas apicais de epitélios polarizadas múltiplos, incluindo o trato gastrointestinal, glândulas sudoríparas, respiratória e árvore, entre outros3,4. Como tal, disfuncional CFTR leva à disfunção epitelial multissistêmica, com maior mortalidade decorrente da doença respiratória1. No pulmão CF, perda do CFTR-conduzido as vias aéreas superfície líquida (ASL) regulamento e muco lançamento leva ao muco espessado, obstrução das vias aéreas, infecção crônica e remodelação progressiva das vias respiratórias e perda de função de pulmão1,5.
Apesar da identificação de disfunção CFTR como a causa da doença, terapias em CF tradicionalmente focada na atenuação dos sintomas (por exemplo, terapia de reposição de enzimas pancreáticas, terapias de limpeza das vias respiratórias)1. Esta abordagem foi revolucionada recentemente pelo advento da novela terapêutica, denominado "Moduladores CFTR," que destino diretamente CFTR disfuncional. Esta abordagem mudou a paisagem clínica de gestão sintoma para doença-modificando conta mas carrega várias limitações6,7,8,9,10. Atividade do modulador é específico para o defeito de proteína que acompanham cada mutação CFTR e limitada para selecionar populações genéticas11. Essa limitação é impulsionada pela natureza heterogênea dos defeitos de proteína, mas também pelo impracticality de ensaios clínicos em grupos de rara mutação. Além disso, entre indivíduos com genótipos estudados (por exemplo, F508del/F508del CFTR, o mais comum mutação CFTR), há grande variabilidade na doença fardo e modulador resposta6,7,8 ,9,11.
Para superar esses dois problemas, os investigadores propuseram o uso de modelos personalizados para testes pré-clínicos12. Este conceito utiliza tecido do paciente específico para gerar um sistema individualizado ex vivo modelo para testes de compostos, prevendo na vivo resposta assunto para terapias de forma personalizada. Uma vez validado, tal modelo poderia ser usado por médicos para terapia de precisão unidade independentemente do genótipo CFTR subjacente do paciente.
Brônquico epitelial (HBE) as células humanas obtidas de explant tecido no momento do transplante de pulmão estabeleceram a possibilidade de tal modelo para CF13,14. HBEs crescidos em uma interface ar-líquido (ALI) permitem a quantificação de CFTR funcional diretamente por meio de testes eletrofisiológicos, ou indiretamente através de medidas de ASL homeostase13,15. Este modelo tem sido fundamental para a compreensão de biologia CFTR e foi um impulsionador essencial no desenvolvimento do CFTR moduladores16. Infelizmente, HBE modelos não são defensáveis como um modelo personalizado devido a natureza invasiva da aquisição (transplante de pulmão ou escovagem brônquica) e falta de amostras para aqueles com mutações raras ou doença leve. Por outro lado, tecido intestinal, obtido a partir de espécimes de biópsia retal ou duodenal, pode ser usado para medição de corrente intestinal (ICM) ou um ensaio baseado em inchaço organoides para estudo individualizado CFTR função17,18, 19. ensaios de organoides, em particular, são modelos muito sensíveis de CFTR atividade20,21,22. Ambos os modelos são limitados pela fonte de tecido (tecido intestinal, enquanto a maioria das doenças de patologia é respiratória) e o método semi-invasivo de aquisição. Como alternativa, vários investigadores estudaram nasal epitelial (HNE) as células humanas para modelo CFTR restauração23,24,25. HNEs podem com segurança ser colhidas pelo pincel ou curetagem em indivíduos de qualquer idade e, quando cultivadas em ALI, recapitular muitas características da HBEs25,26,,27,28. Culturas de monocamada HNE tradicionalmente tem sido limitadas pela transformação escamosa e há muito tempo a maturidade29. Além disso, relatou um curto-circuito atuais medições em HNEs são menores do que aqueles em HBEs, sugerindo uma janela menor para detectar a eficácia terapêutica25.
Dada a necessidade de um modelo de cultura de tecidos personalizados, não-invasivo, respiratória da função CFTR, procuramos mesclar a sensibilidade de um ensaio de organoides inchaço-baseado, com carácter invasivo e respiratória da HNEs. Aqui, descrevemos o nosso método de gerar culturas "esferoide" 3-dimensional da HNEs para estudo individualizado de CFTR em um ensaio baseado em inchaço30. Esferoides HNE polarizar confiantemente com o ápice epitelial para o centro da esfera, ou o lúmen. Este modelo recapitula a numerosas características de um epitélio respiratório inferior e amadurece mais rapidamente do que as culturas ALI. Como um ensaio funcional, esferoides HNE confiantemente quantificam uma gama de CFTR função, bem como a modulação em grupos de mutação estudada (por exemplo, F508del CFTR). Este ensaio baseado em inchaço capitaliza sobre as propriedades de transporte de íon/sal de CFTR, indiretamente, medindo influxo de fluidos para o spheroid como água segue apical efluxo de sal. Desta forma, esferoides estimuladas com CFTR funcional incham robustamente, enquanto aqueles com CFTR disfuncional menos incham ou encolhem. Isto é quantificado através de análise de imagens de pré e esferoides pós-estimulação de 1 h, medindo a área luminal e determinar a porcentagem mudam. Esta medida pode ser comparada em seguida através de grupos experimentais para triagem de bioatividade de drogas de forma paciente específico.
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Protocol
Amostras HNE foram obtidas de indivíduos recrutados através de Hospital Medical Center CF Research Center Cincinnati infantil. Todos os métodos descritos aqui foram aprovados por institucional Review Board (IRB), do Hospital Medical Center infantil de Cincinnati. Obteve-se consentimento escrito de todos os indivíduos antes do teste.
1. prepare a expansão Media e Media antibiótico
- Reunir os componentes de mídia listados na tabela 1. Descongelar materiais congelados à temperatura ambiente e fazer as necessárias soluções conforme indicado na tabela 1 em "Mídia de expansão".
Nota: Tenha cuidado ao manusear a toxina da cólera, que é tóxico quando ingerido e é um irritante respiratório, olhos e pele. Fazer e combinar todas as soluções e meios de comunicação em condições limpas no armário a biossegurança. - Usando uma pipeta sorológica de 50 mL, remova e descarte a 50 mL de meio base (Dulbecco modificado águia médio/F12) de um recipiente para compensar a adição de outros materiais. Despeje todos os meios de base à mão em um frasco de vidro de 1 L esterilizada.
- Usando uma pipeta sorológica de 50 mL ou 1 mL pipeta conforme o caso, transferi todos os componentes restantes da seção de "meios de comunicação expansão" da tabela 1 para o frasco de vidro esterilizado contendo os meios de comunicação. Agite suavemente o frasco com a mão para misturar.
- Meios de filtro em um fresco, estéril 1L, 0,22 µm polietersulfona (PES) balão usando as instruções do fabricante do filtro e anotar com data e "meios de comunicação expansão".
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Prepare a mídia antibiótica. Fazem necessárias soluções antibióticas de estoque conforme indicado na tabela 1 em "Mídia antibiótica."
- Usando uma pipeta sorológica de 50 mL, transferi 150 mL de expansão de mídia para uma garrafa de vidro esterilizada fresco 250ml.
- Utilizando uma pipeta de 1 mL, adicione todos os componentes da seção "Antibiótico Media" da tabela 1 para o frasco de vidro esterilizado contendo os meios de comunicação. Agite com a mão até que a mídia é uniforme na aparência.
- Meios de filtro em um fresco, esterilizado 250ml, 0.22 balão de filtro do PES µm usando as instruções do fabricante e anotar com "meios de comunicação antibiótico" e a data.
- Armazenar mídia a 4 ° C por até um mês, descartando-se nublado, sugerindo a contaminação.
2. preparar a mídia de diferenciação
- Reunir os componentes de mídia listados na tabela 2. Descongelar materiais congelados à temperatura ambiente e fazer as necessárias soluções conforme indicado na tabela 2.
Nota: Tenha cuidado ao manusear o ácido retinoico, que é uma toxina reprodutiva, pode ser tóxico se for ingerido e causa irritação de pele. Make, alíquota e combinar todas as soluções e meios de comunicação em condições limpas no armário a biossegurança. - Remova e descarte a 52 mL do meio de base de um recipiente para compensar a adição de outros materiais. Despeje todos os meios de base em um frasco de vidro de 1 L esterilizada.
- Usando uma pipeta sorológica de 25 mL ou 1 mL pipeta conforme o caso, transferir todos os componentes restantes da tabela 2 para o frasco de vidro esterilizado contendo a mídia e agitar suavemente o frasco à mão para misturar.
- Meios de filtro em um fresco, estéril 1L, 0,22 µm polietersulfona (PES) balão usando as instruções do fabricante do filtro e anotar com "meios de comunicação diferenciação" e a data.
- Armazenar mídia a 4 ° C por até um mês, descartando-se nublado, sugerindo a contaminação.
3. casaco cultura pratos e fibroblastos alimentador da placa
Nota: Execute todas as etapas em condições limpas no armário a biossegurança.
- Misture 0,5 mL de estoque do colágeno e 37,5 mL de água estéril em um tubo cónico de 50 mL.
- Pipete 4-5 mL de solução de colágeno para cada prato limpo de cultura P100, garantindo que toda a superfície é coberta.
- Cobrir pratos com tampas e incubar durante a noite a 37 ° C e 5% de CO2.
- A gabinete de segurança biológica, remova todas as tampas do prato. Agite a solução para cobrir o prato e, em seguida, Aspire.
- Esterilize por exposição à radiação ultravioleta (UV) luz para tampas de lugar h. 1 volta sobre os pratos, pratos de pilha e cubra com papel alumínio.
- Pratos de loja revestido a 4 ° C, por 3-6 meses, re-esterilização sob UV luz 15-30 min antes do uso de cultura de células.
- 24 h antes de obter uma amostra HNE, esterilizar um prato pré-pintados e o rótulo como Mouse embrionárias fibroblastos (MEF) e a data.
- Adicione a mídia de expansão para cobrir a placa (cerca de 5 mL), com uma pipeta sorológica.
- Descongele um frasco de 2 x 106 irradiados MEFs em banho-maria 37 ° C. Assim que os MEFs são descongelados, adicione metade do frasco (aproximadamente 106 células) no prato com uma pipeta de 1 mL, rodopiando à mão para dispersar.
- Incube a 37 ° C e 5% CO2 durante a noite em preparação para cultura HNE.
Nota: Se necessário, passos 3.7-3.10 podem ser realizada até 60 min antes de chapeamento de células, embora durante a noite é ideal.
4. obter e processar amostra HNE
- Certifique-se de IRB-aprovado o consentimento/favorável é obtido para todas as disciplinas.
- Tem golpe paciente nariz para limpar o muco solto.
- Visualize inferior corneto usando um rhinoscope. Certifique-se de sem lesões ou pólipos são presente que pode impedir a coleta de amostra.
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Colete células nasais de narina primeira curetagem ou escovando.
- Curetagem: Cureta de curva no seu ponto médio para criar um ligeiro, ângulo de ~ 135° com o ápice longe da Copa de cureta. Introduza a cureta na narina e avançar a Copa cureta sob corneto inferior. Delicadamente pressione o copo cureta contra os inferiores corneto e raspar o corneto, puxando a cureta para a frente, repetição total de 3 - 4 vezes.
- Escova: Passe a citologia escovar abaixo do inferior Corneto, então girar e mover o pincel entrar e sair um pouco de 4 - 5 vezes, sem sair da narina.
- Cureta de lugar/escova em um cônico de 15 mL cheio de mídia antibiótico. Repita as etapas 4.3-4.4 para a outra narina, colocando a cureta/escova no mesmo tubo cónico.
- Loja cónica no gelo até que esteja pronto para processamento. Certifique-se que o processamento ocorre dentro de 4 h de aquisição da amostra, mas pode ocorrer tão tarde quanto 24 h após a aquisição, se necessário.
5. processo e expandir HNE células em pratos
Nota: Execute todas as etapas em condições limpas no armário a biossegurança.
- Usando uma pipeta de 1 mL e mídia da amostra cónica, lave todas as células de escovas de curetas/citologia no mesmo tubo cónico. Uma vez limpo, descartar curetas / brushes.
- Centrífuga cônico no 360 x g e 4 ° C por 5 min.
- Aspire o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o centrifugado.
- Ressuspender o sedimento celular em 3 mL de solução de desprendimento de célula, pipetagem com uma ponta de 1 mL para homogeneizar a mistura.
- Centrífuga cônico no 360 x g e 4 ° C por 5 min.
- Repita os passos 5.3-5.5 uma vez.
- Aspire o sobrenadante restante, tomando cuidado para não perturbar o centrifugado.
- Ressuspender o pellet em 1 mL de antibiótico Media e contagem de células com um hemocytometer.
- Utilizando uma pipeta de 1 mL, chapa de células gota a gota sobre o prato revestido, fibroblasto-semeado, preparado na etapa 3.10. Adicione mídia antibiótico para totalmente, cubra o prato e dispersar as células em toda a superfície. Rotular o prato com o conteúdo e data e incubar a 37 ° C e 5% de CO2.
- Após 48 h, certifique-se de que as células estão conectadas para o prato de cultura. Aspire a mídia e substituir com bastante fresco Media antibiótico para cobrir a placa.
- Mudar a mídia 3 x semanal, aspirando a velha mídia com uma linha de vácuo e pipeta Pasteur e substituindo com suficiente mídia fresca para cobrir a placa. Depois de 5 dias na mídia de antibiótico, altere os meios de comunicação para mídia de expansão, continuando a substituir três vezes por semana.
Nota: O risco de contaminação é alto na primeira semana da cultura. Manter amostras frescas numa incubadora separado para minimizar o risco de contaminação cruzada. - Verifique o crescimento celular várias vezes por semana. Uma vez que as células são aproximadamente 70-80% de confluencia, prossiga para as células de passagem.
6. passagem HNE células
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Prepare a solução de tripsina 0,1% de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).
Nota: Tenha cuidado de manipulação tripsina, que é um irritante de olhos e pele, respiratória.- Pesa 15 mg de tripsina do pâncreas dos suínos em um tubo cônico.
- Pesa 56 mg de EDTA em um tubo cônico separado.
- O gabinete de segurança biológica, transferi tripsina e EDTA para uma garrafa de vidro esterilizada 250ml. Use uma pequena alíquota de salina tampão fosfato (PBS) para lavar os tubos de tripsina/EDTA para garantir a transferência completa.
- Adicione PBS estéril para trazer a solução total para 150 mL. Feche a tampa firmemente.
- Incube a solução de tripsina em um banho-maria 37 ° C até dissolver totalmente. Verifique cada 15 min e remova prontamente uma vez dissolvido.
Nota: Não deixe desmarcada por períodos prolongados de tempo (por exemplo, durante a noite), como tripsina em solução irá desnaturar se aquecido por muito tempo. - Limpe a garrafa com 2-3 jatos de 70% de etanol e retornar para a biossegurança do armário.
- Filtrar a solução de tripsina-EDTA 0,1% para um fresco, estéril 250ml, 0.22 balão de filtro do PES µm usando as instruções do fabricante e anotar com conteúdo e data.
- Armazenar a solução de tripsina-EDTA a 4 ° C por até um mês, descartando-se nublado.
- Trazer meios de diferenciação, 0,1% solução de tripsina-EDTA e PBS estéril à temperatura mais 30 min. Clean com etanol a 70% e a transferência para uma gabinete de biossegurança limpa.
- Na biossegurança do armário, use uma linha de vácuo e pipeta Pasteur para aspirar e descarte de meios de cultura de tecidos o prato. Lave o prato adicionando, agitando, e 5 mL de PBS usando uma pipeta limpa serológica de aspiração.
- Usando uma pipeta sorológica de 5 mL, adicionar 5 mL de solução de tripsina-EDTA 0,1% para o prato de cultura de tecidos e retornar para a incubadora a 37 ° C e 5% de CO2 por 5 min.
- Visualize as células em um microscópio invertido em 4-10 X. Verificar que as células desanexar do prato, tornar-se redondo e flutuam. Bata levemente o lado do prato cultura para desalojar as células, e/ou re-incubar por um adicional 5 min, até que a maioria das células são desanexados.
Nota: Tenha cuidado para não remover rapidamente as células uma vez retiradas o prato de cultura; exposição prolongada a 0,1% Trypsin-EDTA irá prejudicar a viabilidade celular. - Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, adicionar 5 mL de expansão de mídia para o prato e coletar todo conteúdo líquido (10 mL no total) em um tubo cônico de 50ml rotulados, estéril.
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Se as células permanecem aderentes ao prato de cultura, repita os passos 6,4 6,6 através de de duas vezes, coletando conteúdo no mesmo tubo cónico.
- Se as células permanecem aderentes ao prato de cultura após três rodadas de exposição de solução de tripsina, use um raspador de célula estéril remover suavemente o restante. Depois de raspar o prato, lavar o raspador e o prato com 5 mL de mídia de expansão e recolher no mesmo tubo cónico rotulado.
Nota: Se a passagem de esferoides, modifica este procedimento para executar uma tripsinização diferencial. Após a adição de tripsina solução (etapa 6.4.), verifique se o prato com frequência até fibroblastos têm destacado (tipicamente 1-2 min), deixar as células epiteliais só poligonais anexado ao prato. Coletar e Reserve este sobrenadante, que podem ser passadas para a frente para expansão. Repita as etapas de 6.4-6.6 usando a mesma solução de tripsina e coletar apenas as células epiteliais remanescentes para cultura de esferoide.
- Se as células permanecem aderentes ao prato de cultura após três rodadas de exposição de solução de tripsina, use um raspador de célula estéril remover suavemente o restante. Depois de raspar o prato, lavar o raspador e o prato com 5 mL de mídia de expansão e recolher no mesmo tubo cónico rotulado.
- Centrífuga cônico a 360 x g por 5 min e 4 ° C. Aspire a mídia de cônica.
- Resuspenda o pellet de células em 1 mL de expansão Media e contagem de células usando um hemacytometer.
- Uma vez quantificado, as células podem ser divididas, se necessário, e passadas encaminhar para um novo prato de cultura (incluindo a preparação de co-cultura de fibroblasto, etapa 3 e chapear pilhas para expansão, passos 5.9-5.12) ou cultivadas como esferoides (etapa 7).
Nota: Se passagem para um novo prato de cultura para a expansão, uma densidade de semeadura de 0.5-1 × 106 células em um prato de P100 é recomendado.
7. a propagação de células para culturas de esferoide HNE
Nota: Realizar todos os procedimentos nesta etapa, além de centrifugação, em uma armário de biossegurança limpa.
- Descongele a matriz da membrana basal no gelo por instruções do fabricante (100 µ l por esferoide bem).
Nota: Considere fazer estéril alíquotas de 500 µ l da matriz da membrana basal na recepção; Este montante será propagar uma única placa de 4. - Separe um número adequado de células diferencialmente trypsinized, passadas (da etapa 6,9), para uma concentração final de 500.000 células por mL da matriz. Para uma placa de 4, use 200.000 células. Colete em um tubo de 1,5 mL.
- Centrifugue a mistura celular e mídia a 360 x g por 5 min a 4 ° C. Completamente, mas cuidadosamente Aspire e descartar a mídia usando uma pipeta de 1 mL, tomando cuidado para não perturbar o centrifugado.
- Usando uma ponta de pipeta de 1 mL, adicione 100 µ l por planejado bem da matriz da membrana basal ao tubo de 1,5 mL contendo as células. Mantenha o tubo no gelo.
- Pipetar acima e para baixo para cuidadosamente e completamente Ressuspender as células na matriz da membrana basal. Agir rapidamente para evitar a solidificação da matriz. Evite esvaziar completamente a ponta da pipeta para assegurar-se de bolhas de ar não sejam introduzidas a mistura de célula/matriz.
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Sementes de alíquotas de matriz 100 µ l em cada poço de uma placa de cultura 4-fertilização in vitro.
- Usando um par limpo da tesoura, retire o distal 3 a 4 mm de uma ponta de pipeta de 200 µ l.
- Usando a ponta aparada, cuidadosamente Pipete 100 µ l da mistura de célula/matriz para o centro de cada poço. Pipete lentamente, com o objetivo de fazer uma única matriz "gota" no centro de cada poço. A queda deve continuar a ser esférica e não deve tocar os lados do poço. Ao mover a placa, faça então com cuidado a evitar perturbar estas gotas.
- Incube as gotas de matriz de membrana basal em 37 ° C e 5% CO2 por 30 min, até sólido.
- Cuidadosamente Pipete 500 µ l de mídia de diferenciação em cada poço, tomando cuidado para não perturbar a queda de matriz. Certifique-se de que a mídia só um disfarce da matriz cair e adicione mais se necessário.
8. diferenciar e amadurecer HNE esferoides
- Usando uma ponta de pipeta de 1 mL, suavemente, Aspire toda a mídia do poço; Evite aspirar a matriz, que irá destruir esferoides em parte da matrix, que, embora qualquer esferoides que deixaram para trás podem permanecer viáveis.
- Usando uma ponta de pipeta de 1ml fresco, suavemente adicione 500 µ l de mídia de diferenciação para o poço em torno da matriz. Não toque a matriz com a pipeta e evitar perturbar a queda de matriz.
- Volte esferoides a incubadora a 37 oC e 5% de CO2 para o crescimento contínuo. Repita os passos de 8,1 8,3 por três vezes semanais.
- Avalie a morfologia de esferoide diariamente sob um microscópio invertido em 20 X. Esferoides devem formar dentro de 3-5 dias de chapeamento e atingir a maturidade dentro de aproximadamente 10 dias.
9. pré-tratamento, estimular e esferoides HNE para análise da imagem
- Pré-tratamento esferoides como desejado antes da imagem como descrito anteriormente,30.
Nota: Para o pré-tratamento de VX809, adicione 3 µM de VX809 para a mídia para 48-72 h antes da imagem latente. Misture 1 µ l de 10mm VX809 estoque (veja a Tabela de materiais) em 3,3 mL de mídia para esta concentração. - Mudar cada um bem de esferoides de 1ml de fresco de diferenciação de mídia, incluindo pré-tratamento (etapas 8.1-8.3) antes de imagem esferoides.
- Prepare a estimulação fresca drogas soluções (forskolina, 3-isobutil-1-methylxanthine [IBMX], VX770 e CFTR inibidor 172 [Inh172]) de estoques (ver Tabela de materiais). Para forskolin/IBMX, adicione 1 µ l de cada unidade populacional a 98 µ l de água estéril em um único rotulado tubo de 1,5 mL. Para VX770 e Inh172, adicione 1 µ l de cada unidade populacional a 99 µ l de água estéril em tubos separados etiquetados 1,5 mL. Fazer um volume total permitindo a 50 µ l de solução para cada bem testados. Prepare soluções sob condições estéreis no armário a biossegurança.
- Transferi a placa de esferoide para uma câmara incubada conjunto para 37 ° C e 5% CO2, montado em um microscópio invertido equipado com software de captura de imagem eletrônica e um estágio mecânico para ajuste XY. Ligue o microscópio e câmera, bem como o computador de imagem.
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Capture imagens de linha de base de esferoides em um poço.
- Abra o software de captura de imagem (5.5 Slidebook para instruções abaixo). Uma vez inicializado, abra um novo arquivo, clicando em "Arquivo", depois "Novo". Nesse sentido o nome do arquivo e clique em "Salvar".
- Cuidadosamente, retire a tampa de placa de cultura e centralize uma gota de matriz sobre o objetivo.
- Começando no topo da gota matriz, mova em uma grade para encontrar esferoides ampliação de 20 x com a ocular do microscópio. Concentre-se acima e para baixo para capturar a esfera no seu ponto mais largo. Anote a localização de cada esferoide no mapa da gota matriz para re-identificar depois da imagem latente.
- No software, clique em "Captura de imagem". Para exposição, selecione "Manual" e digite 50 ms. Certifique-se de outras configurações são apropriadas (fator de Bin: 1 x 1, w: 512, 512 h:, X e Y Offset: 0). Digite um nome apropriado para cada imagem na caixa "Nome" (por exemplo, esferoide 1 linha de base). Clique em "Start" para exibir uma imagem ao vivo e "Salvar" para capturar uma imagem de linha de base.
- Repita etapas 9.5.1-9.5.4 até gol número é atingido, ou soltar toda matriz é fotografada.
Nota: As diferenças de grupo podem ser detectadas com tão poucos como esferoides de 3-5 por condição, no entanto, tornou-se nossa prática de esferoides de 10 ou mais por condição para aumentar o poder da imagem. Variabilidade do ensaio é demonstrada na Figura 2 da seção "Representante resultados", com amostras de esferoides de 8-10 por assunto, por exemplo.
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Estimule esferoides.
- Utilizando uma pipeta de 200 µ l, adicione 50 µ l da droga da estimulação adequada para a mídia dentro do poço, tomando cuidado para não perturbar a matriz.
Nota: Após esta diluição 10 vezes (50 µ l em 500 µ l de mídia), a concentração de fármaco final será: forskolina 10 µM, IBMX 100 µM, VX770 1 µM, Inh172 10 µM. - Para o campo apenas, adicione única forskolin/IBMX.
- Para cAMP + VX770, adicione forskolin/IBMX primeiro, depois o VX770 depois de 2 min.
- Para condições de inibida, adicionar Inh172 primeiro, depois a forskolina/IBMX depois de 2 min.
- Utilizando uma pipeta de 200 µ l, adicione 50 µ l da droga da estimulação adequada para a mídia dentro do poço, tomando cuidado para não perturbar a matriz.
- Imediatamente após a estimulação, monitore esferoide inchaço por timelapse imagiologia por 1h. No software, clique em "Captura de imagem". Clique em "Timelapse" e defina o intervalo de 30 s, com uma duração de 60 min. Enter um nome apropriado e clique em "Salvar" para iniciar o timelapse.
Nota: Timelapse padrão é para capturar imagens de um esferoide único cada 30 s para assegurar uma alta qualidade de vídeo. Alternativamente, realizar captura de ampliação inferior do poço inteiro (por exemplo, 4 X), e menos imagens capturadas se desejado. Se for usado um palco automatizado, executar timelapse de esferoides todos usando coordenadas predefinidas; caso contrário, use o timelapse de um subconjunto de esferoides para fornecer uma análise qualitativa de inchaço e assegurar que sem problemas sistemáticos surgem durante a imagem (por exemplo, descolamento de matriz do poço). -
Imediatamente após a conclusão da imagem timelapse 1 h, capturar imagens pós-estimulação de todos os esferoides (por passo 9.5) usando o mapa criado na etapa 9.5.3.
- Referem-se a pré-estimulação imagens para garantir que o mesmo plano de foco é usado para imagens de acompanhamento (a qualidade focal de em torno de células, esferoides ou detritos grandemente facilitar este processo).
- Salve arquivos com uma anotação emparelhada da etapa 9.5.4 (por exemplo, esferoide 1 pós-estimulação).
Nota: concluir esta etapa imediatamente após o timelapse, como esferoides podem continuar a inchar.
- Substitua a mídia na imagem bem com Media de diferenciação fresco.
- Repita as etapas de 9.5 através de 9,9 para cada poço/condição, ajustando a drogas de estimulação, como indicado para condições experimentais.
- Uma vez que todas as imagens é concluída, retorne esferoides para a incubadora a 37 ° C e 5% de CO2.
Nota: Dependendo da esterilidade da câmara microscópio incubadas, contaminação pós-estimulação de esferoides pode ser bastante comum. Manter imagem de esferoides numa incubadora separado, para minimizar o risco de contaminação cruzada, ou descartar esferoides imediatamente após a imagem.
10. analisar imagens de esferoide HNE
- Exporte imagens capturadas tudo para um formato compatível com software de análise de imagem. No software, clique em "Exibir", passe o mouse sobre "Exportação" e selecione "Default vistas de todas as imagens como TIFF...". Salve para o disco rígido ou uma unidade flash para análise.
Nota: A análise comercial software (Tabela de materiais) e arquivos. TIFF executam bem e são descritos aqui, embora análise também pode ser realizado usando outras plataformas. Ao nomear arquivos, analisando imagens de pessoal deve ser cego para as condições experimentais, mas consciente de que as imagens estão emparelhadas (pré e pós-estimulação) para garantir a análise equivalente. -
Usando o software de análise, delinear a área luminal de cada imagem de esferoide e exportar em um software de análise de dados.
- Software de análise aberta. Clique em "Arquivo", depois "abrir" e navegue até a pasta do arquivo que contém imagens de esferoide. Selecione todas as imagens para análise e clique em "Abrir".
- Clique em "Medida" e selecione "Medições de região". Região medições caixa de diálogo, selecione o droptab "Configuração" e certifique-se de caixas "Nome da imagem" e "Área" são verificadas.
- Clique em "Log" e selecione "Abrir dados Log". Clique em "Okey" sobre dados diálogo caixa e nome do arquivo de Log em conformidade (por exemplo, condição X, Data). Isto irá transferir todas as medições para uma planilha.
- Selecione o botão de ferramenta "Região de rastreamento" e cuidadosamente rastrear o lúmen do spheroid na primeira imagem para análise. Na caixa de diálogo de medição da região, clique em "Dados de Log" para efetuar a medição em Excel.
- Repita etapas 10.2.2-10.2.4 até que todos os esferoides são analisados.
- Calcular a variação percentual (100 * [Post-stim - Baseline] ÷ Baseline) na área luminal da linha de base para cada individual esferoide par de imagem e compilar dados para análise.
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Representative Results
HNEs deve anexar para o prato de cultura e formam pequenas ilhas de células dentro de 72 h de semeadura; exemplos de formação de ilha de bom e pobre em uma semana são mostrados na figura 1A e 1B, respectivamente. Estas ilhas devem expandir para cobrir o prato ao longo de 15-30 dias. Amostras de pequenas ou de qualidade inferior podem levar mais tempo e muitas vezes não renderá esferoides útil. Contaminação com agentes infecciosos é evidenciada pela mídia fundo amarelo/nublado, insuficiência das células para anexar para o prato de cultura, e/ou visualização directa de fungos/bactérias. Qualquer culturas contaminadas devem ser descartadas imediatamente para evitar contaminação cruzada.
Dentro dos primeiros 3-4 dias de cultura na matriz da membrana basal, pequenas estruturas císticas devem começam a se formar na matriz. Estas amadureça ao longo de aproximadamente 10 dias em esferoides intactas, demonstrando uma parede fina e uma superfície luminal. Se banhado a densidade descrita, culturas bem sucedidas irão conter esferoides de 50-100 por gota de matriz. Os lúmens podem ser relativamente clara (Figura 1) ou cheia de restos celulares e muco (Figura 1); o primeiro é mais comum em esferoides com selvagem-tipo CFTR (wtCFTR) e a última em esferoides CF. Mascaramento para delinear a área luminal dos esferoides na Figura 1 e 1D é demonstrada na Figura 1E e 1F, respectivamente. Exemplos de culturas mal formado/malsucedido esferoide são fornecidos na Figura 1 e 1 H.
Dados funcionais representativos para o tipo selvagem e esferoides HNE homozigotos F508del CFTR são mostrados na Figura 2A e 2B, respectivamente; Este dados são representante de > 10 amostras HNE exclusivas no tipo selvagem e F508del CFTR indivíduos homozigotos30. Em suma, esferoides com CFTR funcional incham, enquanto aqueles com swell CFTR disfuncional significativamente menor, ou podem encolher. Especificamente, esferoides de indivíduos com wtCFTR devem inchar mais de uma hora quando estimulado e deve inchar menos ou encolher se estimulada na presença do inibidor CFTR Inh172. Inversamente, esferoides de homozigotos para F508del CFTR um assunto também devem encolher ou inchar muito, com aumentou ligeiramente inchaço (ou menos encolhimento) quando farmacologicamente corrigida com os moduladores CFTR, VX809 e VX770. Análises anteriores de fiabilidade de esferoide dentro e entre os sujeitos com o mesmo genótipo demonstram segregação funcional de genótipos CFTR e modesta variabilidade em medidas repetidas30.
| Componente de mídia | Solução-mãe | Quantidade | Armazenamento |
| Expansão de mídia | |||
| DMEM / mistura de nutrientes F-12 "Base de mídia" | Utilização como é | recipientes de 2 x 500 mL | Armazenar a 4 ° c até a data de vencimento de fabricante |
| Soro fetal bovino | Utilização como é | 50 mL | Armazenar a-20 ° c até a data de vencimento de fabricante |
| Toxina da cólera | 10 mg em 1 mL de água estéril | 1 Μ l | Loja estoque a-20 ° c até seis meses |
| Fator de crescimento epidérmico | 500 µ g em 1 mL de água estéril | 20 Μ l | Loja estoque a-20 ° c até seis meses |
| Hidrocortisona | 0,4 mg em 400 µ l de água estéril | Toda parte alíquota 400 µ l | Fazer fresco com cada lote. Armazenar o pó em temperatura ambiente até a data de vencimento de fabricante |
| Adenina | 24 mg em 1 mL de água estéril | Alíquota inteira 1ml | Fazer fresco com cada lote. Armazenar o pó em temperatura ambiente até a data de vencimento de fabricante |
| Y-27632 | 3,2 mg em 1 mL de água estéril | Alíquota inteira 1ml | Fazer fresco com cada lote. Armazenar o pó a-20 ° c até a data de vencimento de fabricante |
| Mídia de antibiótica | |||
| Anfotericina B | Utilização como é | 1,2 mL | Armazenar a 4 ° c até a data de vencimento de fabricante |
| Ceftazidima | 15 mg em 1 mL de água estéril | Alíquota inteira 1ml | Fazer fresco com cada lote. Armazenar o pó a-20 ° c até a data de vencimento de fabricante |
| Tobramicina | 15 mg em 1 mL de água estéril | Alíquota inteira 1ml | Fazer fresco com cada lote. Armazenar o pó a-20 ° c até a data de vencimento de fabricante |
| Vancomicina | 15 mg em 1 mL de água estéril | Alíquota inteira 1ml | Fazer fresco com cada lote. Armazenar o pó a-20 ° c até a data de vencimento de fabricante |
Tabela 1: Componentes da expansão e mídia antibiótica.
| Componente de mídia | Solução-mãe | Quantidade | Armazenamento |
| DMEM / mistura de nutrientes F-12 "Base de mídia" | Utilização como é | recipientes de 2 x 500 mL | Armazenar a 4 ° c até a data de vencimento de fabricante |
| Ultroser-G | 20 mL de água estéril em um frasco de 20 mL único, de liofilizado Ultroser-G | Toda 20ml alíquota | Fazer fresco com cada lote. Armazenar o pó a 4 ° c até a data de vencimento de fabricante |
| Clone fetal II | Utilização como é | 20 mL | Armazenar a-20 ° c até a data de vencimento de fabricante |
| Caneta Strep | Utilização como é | 10 mL | Armazenar a-20 ° c até a data de vencimento de fabricante |
| Extrato de cérebro bovino | Utilização como é | 2,48 mL | Armazenar a-20 ° c até a data de vencimento de fabricante |
| Transferrina | Utilização como é | 250 Μ l | Armazenar a-20 ° c até a data de vencimento de fabricante |
| Insulina | Utilização como é | 250 Μ l | Armazenar a-20 ° c até a data de vencimento de fabricante |
| Etanolamina | Utilização como é | 15 Μ l | Armazenar em temperatura ambiente até a data de vencimento de fabricante |
| Epinefrina | 2,75 mg em 1 ml de água estéril | Alíquota inteira 1ml | Fazer fresco com cada lote. Armazenar o pó a 4 ° c até a data de vencimento de fabricante |
| Triiodotironina | 8,4 mg em 50 µ l de DMSO | Toda parte alíquota de 50 µ l | Fazer fresco com cada lote. Armazenar o pó a-20 ° c até a data de vencimento de fabricante |
| Hidrocortisona | 7,24 mg em 1 mL de etanol | 1 Μ l | Loja estoque a-20 ° c até seis meses |
| Phsophoryletheanolamine | 35,25 mg em 1 mL de água estéril | 1 Μ l | Loja estoque a-20 ° c até seis meses |
| Ácido retinoico | 3 mg em 1 mL de DMSO | 1 Μ l | Loja estoque a-20 ° c até seis meses |
Tabela 2: Componentes do meio de diferenciação.
Figura 1 : HNE expansão e características estruturais de esferoides HNE. Brightfield imagens das culturas de expansão HNE levadas sete dias após o chapeamento demonstram sucesso (seta branca, painel A) e formação de colônia HNE malsucedido (painel B) sobre um fundo de fibroblasto do alimentador. WtCFTR sucesso e F508del homozigotos esferoides são mostrados em painéis C e D, respectivamente. Mascaramento para delinear a área luminal de esferoides de C/D é fornecido em painéis E e F, respectivamente. Culturas de esferoide malsucedido caracterizam-se por restos celulares pequenos e desorganizado (painel G) e/ou desorganizada aglomerados de células (painel H). Barra de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Características funcionais de esferoides HNE. Respostas funcionais representativas de esferoides de wtCFTR de um único doador, quando estimulado com a forskolina/IBMX com ou sem a presença do inibidor CFTR Inh172 são mostradas no painel (A) cada ponto representa a resposta em um esferoide único. Respostas funcionais representativas de esferoides homozigotos F508del de um único doador, quando estimulado com a forskolina/IBMX com ou sem a presença de VX809 e VX770 são mostradas no painel (B). Barras de erro = SEM. * * p < 0,01; p < 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo descreve a geração de culturas de esferoide de paciente-derivado nasal células capazes de produzir um modelo individualizado, específico da função CFTR. Existem várias etapas-chave no processo que deve ser atendido de perto para evitar a dificuldade. Primeiro é uma aquisição de boa amostra do nariz do paciente. Deve ter uma boa amostra > 50.000 células, limitada muco/detritos e estar pronto para processamento dentro de 4 h (apesar de sucesso também é facilmente alcançável com pernoite no gelo do transporte). Prática de aquisição de amostras com cureta ou escova pelo estudo pessoal é necessária, que é facilitada pela focando a aquisição de amostra cedo nas mãos de um ou dois provedores para maximizar seu conforto. Em segundo lugar, boa técnica limpa/estéril em todas as fases da cultura de tecidos é essencial. O principal modo de falha, em nossa experiência, para todas as culturas HNE é contaminação bacteriana ou fúngica, que pode complicar tanto a amostra primária e outras culturas crescentes na incubadora. Este risco aumenta somente com culturas de indivíduos com infecção crônica (por exemplo, CF), e, portanto, o sucesso depende em grande parte a capacidade de manter culturas limpo e separado. Nossa prática é manter uma incubadora separada somente para culturas propensos a infecção nos primeiros 5-7 dias, protegendo as culturas mais antigas, bem sucedidas de contaminação inadvertida. Em terceiro lugar, é importante estreitamente assistir células durante a fase de expansão e evitar overconfluence. Se as células forem permitidas para alcançar a plena confluência na placa, há um risco de que a cultura ou se tornam-se senescentes ou células começará a morrer e separe. Finalmente, quando chapear pilhas como esferoides, é importante para dispersar completamente as células através da matriz e a placa uma amostra uniformemente distribuída. Qualquer over - ou under - population das gotas matriz conduzirá ao fracasso de cultura, e grandes aglomerações de células não irão produzir bem sucedidos esferoides.
Durante a aplicação do presente protocolo, os investigadores podem encontrar alguns problemas comuns. Como mencionado acima, é melhor evitar contaminação pela aquisição de uma boa amostra inicial sem muco e técnicas de cultura limpa. Se for bem sucedida pela expansão da cultura, mas não diferenciadas esferas são formadas, vários problemas podem ter ocorrido. Se a matriz principalmente aparece vazia, é mais provável que as células foram semeadas em muito baixa densidade; Aumente a densidade de semeadura de tentativas posteriores de aproximadamente 20%. Por outro lado, se a matriz parece estar "sujo" com os restos da célula copiosa, é provável que as células foram semeadas em muito alta de densidade e as tentativas subsequentes deve usar uma densidade de semeadura reduzida em cerca de 20%. Uma complicação comum da pós-semeadura de alimentação e a manutenção é o desprendimento da matriz da nave a cultura. Isto é causado pelo exchange excessivamente agressivos e pode ser evitado, com cautela e manualmente alterando mídia com uma pipeta de 1 mL, sucção de parede não. Se encontrado, esferas ainda podem ser estimuladas e fotografadas, embora isto possa ser difícil se o matrix "flutua" no poço durante a imagem latente, necessitando de mapeamento cauteloso de esferoides dentro do poço.
Os investigadores podem levar a cabo várias modificações no protocolo, dependendo das necessidades do seu laboratório. Para imagens de alta resolução de esferoides, nós substituímos previamente as placas 4-bem com opções de vidro óptico, incluindo pratos de 35mm vidro-fundo ou slides de câmara. Isto permite a geração de imagens de alta resolução, ao vivo de esferoides, mas pode reduzir a taxa de transferência. Como alternativa, para aumentar a taxa de transferência, alíquotas menores de células na matriz podem ser semeadas em outros vasos (por exemplo, placas de cultura bem-24). Em nossa experiência, esferoides crescem melhores com a matriz em uma forma de "gota", em oposição ao formando uma folha no fundo do poço; como tal, tivemos o melhor sucesso com gotículas de pelo menos 25 µ l. investigadores pode desejar alterar a densidade da matriz diluindo com mídia. Isto reduz a quantidade total de matriz necessário, melhorando o custo do ensaio. Isto pode também, no entanto, alterar a composição de esferoide. Em nossa experiência anterior, concentrações menores da liderança da matriz da membrana basal alteraram estrutura esferoide, com formação completa ou parcial de esferoides em uma morfologia "célula-apex-out". Como tal, esferoides gerados através de quaisquer alterações de protocolo na concentração de matriz devem ser cautelosamente avaliadas para morfologia antes de realizar testes funcionais. Finalmente, estimulando diferentes, drogas inibidoras ou diferentes concentrações destas drogas, podem ser empregadas. Forskolin, IBMX e Inh172 foram escolhidos para nossos estudos com estas concentrações com base na experiência anterior de culturas ALI31. Usar outras drogas (por exemplo, isoproterenol para estimulação, GlyH101 por inibição) melhor pode aplicar ao estudo do investigador. Da mesma forma, utilizar diferentes concentrações de forskolin, IBMX ou Inh172 pode alterar a gama dinâmica do ensaio, no entanto, nós não sistematicamente testei essas opções.
Dado o número existente ex vivo paciente-derivado CFTR ensaios, o modelo descrito é notável por várias razões chaves. Primeiro, ele capitaliza sobre células nasais como uma fonte facilmente obtida do tecido respiratório. Contratos HNE podem ser realizado com segurança com treinamento mínimo em quase qualquer ambiente (clínica, OR, visita de pesquisa) em todos os grupos de idade25. Isto facilita a obtenção de amostra robusta e repetir a amostragem se necessário devido à dificuldade de crescimento ou contaminação. Em comparação com organoids intestinais, esferoides HNE caracterizam-se menos bem e aparecem ter uma menor gama dinâmica no presente formulário, no entanto, use de respiratória, em vez de tecido GI pode ser dos principais benefícios, como vários pilotos de doença CF (por exemplo infralateral, expressão do canal de sódio epitelial) não são equivalentes no intestino. Ao contrário de planares, culturas ALI de células HNE, esferoides são cultivadas mais rápido e podem ser mais representativo das condições na vivo , medir um processo fisiológico (homeostase fluido) que pode ser mais relevante do que sozinho de eletrofisiologia32. Melhorando o tempo de colheita de amostra para teste, potencial de contaminação é reduzida, aumentando assim a probabilidade de sucesso da cultura. Finalmente, a natureza 3-dimensional do modelo pode ser favorável para o romance e/ou complementares linhas de pesquisa em desenvolvimento das vias aéreas ou morfologia que não são viáveis em culturas ALI (por exemplo, muco luminal acompanhamento, estudos rápidos de diferenciação, etc.).
Existem várias limitações chaves de esferoides HNE como um ensaio de função CFTR. Em primeiro lugar, este ensaio permanece relativamente baixa produtividade. Usando os métodos atuais, aquisição de imagem leva mais de uma hora para cada condição de cultura e análise leva um adicional 20-30 min por condição. Isto é agravado pelo grau de sobreposição entre certas condições (tais como demonstrado na Figura 2A), que exige um maior número de medições (esta sobreposição em si também pode representar uma limitação a sensibilidade deste teste). Como tal, uma única experiência com 4-6 condições requer quase dois dias para a conclusão. Taxa de transferência pode ser melhorada, empregando métodos de captura de imagem automatizada e análise; Essas adaptações estão atualmente em progresso. Em segundo lugar, este modelo exige uma grande quantidade de matriz, que pode tornar-se caro. Como mencionado acima, diluição da matriz pode ajudar a superar esta barreira, mas deve ser tomada com cautela, como alterações no crescimento matriz irá provavelmente resultar em alterações na morfologia do esferoide. Em terceiro lugar, este modelo depende esferoide medições em apenas um plano XY e ignora inchaço no plano Z, que pode introduzir viés. Enquanto análises de reprodutibilidade anteriores têm sido reconfortantes, esta lacuna pode ser superada pelo uso de imagens automatizados com Z-plano de digitalização para calcular o volume30. Finalmente e mais importante, extenso trabalho para amarrar respostas esferoide na vivo droga resposta do sujeito individual ainda está para ser concluída. Na ausência desta correlação, o valor preditivo do modelo - enquanto prometendo - está claro.
Geração e análise de esferoides HNE permitem análise ex vivo da atividade individual CFTR e modulação, que em última análise, pode ser útil como um modelo pré-clínico da resposta da droga. Além disso, dada a extensa variabilidade na severidade da doença CF, um modelo tão individualizado pode fornecer insights sobre o microambiente exclusivo das vias aéreas de um sujeito. Dessa forma, esse modelo pode ser útil para estudos de biologia CFTR mais ampla e ajuda a compreender a heterogeneidade da doença. Uso futuro deste modelo, bem como outros modelos similares da função CFTR individualizada, mantém a promessa para melhor compreender a biologia CFTR no laboratório e a unidade personalizada e medicina de precisão na clínica.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela terapêutica de fundação de fibrose cística, conceder número CLANCY14XX0 e através da Fundação de fibrose cística, conceder o número CLANCY15R0. Os autores desejam agradecer a Kristina Ray pela sua assistência no recrutamento de paciente e fiscalização regulamentar. Os autores também desejam agradecer ao grupo de trabalho HNE, apoiado pela Fundação de fibrose cística, que ajudou na geração de recursos de cultura HNE: Preston Bratcher, Calvin Cotton, Martina Gentzsch, Elizabeth Joseloff, Michael Myerburg, Dave Nichols, Scott Randell, Steve Rowe, g. Salomão Marty e Katherine Tuggle.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf Tube | USA Scientific | 4036-3204 | |
| 150 mL Filter Flask | Midsci | TP99150 | To filter Media |
| 15 mL Conical Tube | Midsci | TP91015 | |
| 1 L Filter Flask | Midsci | TP99950 | To filter Media |
| 35 mm Glass-Bottom Dish | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | Optional |
| 3-Isobutyl-1-Methylxanthine (IBMX) | Fisher Scientific | AC228420010 | Prepare a 100 mM stock solution of 22.0 mg in 1 mL of DMSO |
| 50 mL Conical Tube | Midsci | TP91050 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies, Inc. | AT-104 | Cell detachment solution |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786-25G | See Table 1 |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A9528-100MG | See Table 1 |
| Bovine Brain Extract (9mg/mL) | Lonza | CC-4098 | See Table 2 |
| Ceftazidime hydrate | Sigma-Aldrich | C3809-1G | See Table 1 |
| Cell Scrapers 20 cm | Midsci | TP99010 | |
| CFTR Inh172 | Tocris Bioscience | 3430 | Prepare a 10 mM stock solution of 4.0 mg in 1 mL of DMSO |
| Cholera Toxin B (From Vibrio cholerae) | Sigma-Aldrich | C8052-.5MG | See Table 1 |
| CYB-1 | Medical Packaging Corporation | CYB-1 | Cytology brush |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D5879-500ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12 Hepes | Life Technologies | 11330-057 | Base Medium; See Tables 1 and 2 |
| Epidermal Growth Factor (Recombinant Human Protein, Animal-Origin Free) | Thermo Fisher Scientific | PHG6045 | See Table 1 |
| Epinephrine | Sigma-Aldrich | E4250-1G | See Table 2 |
| Ethanol | Fisher Scientific | 2701 | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E0135-500ML | 16.6 mM solution; See Table 2 |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | TCI America | E0084 | |
| Fetal Bovine Serum (high performance FBS) | Invitrogen | 10082147 | See Table 1 |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886-50 | Prepare a 10 mM stock solution of 4.1 mg in 1 mL of DMSO |
| Growth Factor-Reduced Matrigel | Corning, Inc. | 356231 | Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free, 10 mL. |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
| Human Collagen Solution, Type I (VitroCol; 3 mg/mL) | Advanced BioMatrix | 5007-A | Collagen solution |
| HyClone (aka FetalClone II) | GE Healthcare | SH30066.03HI | See Table 2 |
| Hydrocortisone | StemCell Technologies | 07904 | See Tables 1 and 2 |
| Insulin, human recombinant, zinc solution | Life Technologies | 12585014 | 4 mg/mL solution; see Table 2 |
| IVF 4-Well Dish, Non-treated | NUNC (via Fisher Scientific) | 12566350 | 4-well plate for spheroids; similar well size to a 24-well plate |
| MEF-CF1-IRR | Globalstem | GSC-6001G | Irradiated murine embryonic fibroblasts |
| Metamorph 7.7 | Molecular Devices | Analysis Software; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software for a quote | |
| Olympus IX51 Inverted Microscope | Olympus Corporation | Discontinued | Imaging Microscope. Replacment: Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/ for a quote |
| Pen Strep | Life Technologies | 15140122 | See Table 2 |
| Phsophoryletheanolamine | Sigma-Aldrich | P0503-5G | See Table 2 |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | See Table 2 |
| Rhinoprobe | Arlington Scientific, Inc. | 96-0905 | Nasal curette |
| Slidebook 5.5 | 3i, Intelligent Imaging Innovations | Discontinued | Imaging Software. Replacement: Slidebook 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook for a quote |
| Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | |
| Sterile Water | Sigma-Aldrich | W3500-6X500ML | |
| Tissue Culture Dish 100 | Techno Plastic Products | 93100 | Tissue culture dish for expansion |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014-100MG | See Table 1 |
| Transferrin (Human Transferrin 0.5 mL) | Lonza | CC-4205 | See Table 2 |
| Triiodothryonine | Sigma-Aldrich | T6397-1G | 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt [T3]; See Table 2 |
| Trypsin from Porcine Pancreas | Sigma-Aldrich | T4799-10G | |
| Ultroser-G | Crescent Chemical (via Fisher Scientific) | NC0393024 | 20 mL lypophilized powder; See Table 2 |
| Vancomycin hydrochloride from Streptomyces orientalis | Sigma-Aldrich | V2002-5G | See Table 1 |
| VX770 | Selleck Chemicals | S1144 | Prepare a 1 mM stock solution of 0.4 mg in 1 mL of DMSO |
| VX809 | Selleck Chemicals | S1565 | Purchase or prepare a 10 mM stock solution of 4.5 mg in 1 mL of DMSO |
| Y-27632 Dihydrochloride ROCK inhibitor | Enzo LifeSciences | ALX-270-333-M025 | See Table 1 |
References
- Rowe, S. M., Miller, S., Sorscher, E. J. Cystic fibrosis. N Engl J Med. 352 (19), 1992-2001 (2005).
- Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).
- Anderson, M. P., et al. Nucleoside triphosphates are required to open the CFTR chloride channel. Cell. 67 (4), 775-784 (1991).
- Boucher, R. C. Human airway ion transport. Part one. Am J Respir Crit Care Med. 150 (1), 271-281 (1994).
- Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. Cystic fibrosis: an inherited disease affecting mucin-producing organs. Int J Biochem Cell Biol. 52, 136-145 (2014).
- Accurso, F. J., et al. Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation. N Engl J Med. 363 (21), 1991-2003 (2010).
- De Boeck, K., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis and a non-G551D gating mutation. J Cyst Fibros. 13 (6), 674-680 (2014).
- Moss, R. B., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis who have an Arg117His-CFTR mutation: a double-blind, randomised controlled trial. Lancet Respir Med. 3 (7), 524-533 (2015).
- Wainwright, C. E., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR. N Engl J Med. , (2015).
- Brewington, J. J., McPhail, G. L., Clancy, J. P. Lumacaftor alone and combined with ivacaftor: preclinical and clinical trial experience of F508del CFTR correction. Expert Rev Respir Med. 10 (1), 5-17 (2016).
- CFTR2 Database. , www.cftr2.org (2017).
- Mou, H., Brazauskas, K., Rajagopal, J. Personalized medicine for cystic fibrosis: establishing human model systems. Pediatr Pulmonol. 50 Suppl 40, S14-S23 (2015).
- Randell, S. H., Fulcher, M. L., O'Neal, W., Olsen, J. C. Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research. Methods Mol Biol. 742, 285-310 (2011).
- Whitcutt, M. J., Adler, K. B., Wu, R. A biphasic chamber system for maintaining polarity of differentiation of cultured respiratory tract epithelial cells. In Vitro Cell Dev Biol. 24 (5), 420-428 (1988).
- Worthington, E. N., Tarran, R. Methods for ASL measurements and mucus transport rates in cell cultures. Methods Mol Biol. 742, 77-92 (2011).
- Van Goor, F., et al. Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18843-18848 (2011).
- Hug, M. J., Tummler, B. Intestinal current measurements to diagnose cystic fibrosis. J Cyst Fibros. 3 Suppl 2, 157-158 (2004).
- van Barneveld, A., Stanke, F., Ballmann, M., Naim, H. Y., Tummler, B. Ex vivo biochemical analysis of CFTR in human rectal biopsies. Biochim Biophys Acta. 1762 (4), 393-397 (2006).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nat Med. 19 (7), 939-945 (2013).
- Dekkers, J. F., et al. Optimal correction of distinct CFTR folding mutants in rectal cystic fibrosis organoids. Eur Respir J. 48 (2), 451-458 (2016).
- Dekkers, R., et al. A bioassay using intestinal organoids to measure CFTR modulators in human plasma. J Cyst Fibros. 14 (2), 178-181 (2015).
- Zomer-van Ommen, D. D., et al. Limited premature termination codon suppression by read-through agents in cystic fibrosis intestinal organoids. J Cyst Fibros. , (2015).
- Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure. In Vitro Cell Dev Biol. 27a (9), 684-686 (1991).
- Di Lullo, A. M., et al. An "ex vivo model" contributing to the diagnosis and evaluation of new drugs in cystic fibrosis. Acta Otorhinolaryngol Ital. 37 (3), 207-213 (2017).
- Pranke, I. M., et al. Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators. Sci Rep. 7 (1), 7375 (2017).
- Devalia, J. L., Davies, R. J. Human nasal and bronchial epithelial cells in culture: an overview of their characteristics and function. Allergy Proc. 12 (2), 71-79 (1991).
- Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro. Respir Med. 84 (4), 303-312 (1990).
- Thavagnanam, S., et al. Nasal epithelial cells can act as a physiological surrogate for paediatric asthma studies. PLoS One. 9 (1), e85802 (2014).
- Jorissen, M., Van der Schueren, B., Van den Berghe, H., Cassiman, J. J. The preservation and regeneration of cilia on human nasal epithelial cells cultured in vitro. Arch Otorhinolaryngol. 246 (5), 308-314 (1989).
- Brewington, J. J., et al. Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids. J Cyst Fibros. , (2017).
- Sun, H., et al. Tgf-beta downregulation of distinct chloride channels in cystic fibrosis-affected epithelia. PLoS One. 9 (9), e106842 (2014).
- Boucher, R. C. Evidence for airway surface dehydration as the initiating event in CF airway disease. J Intern Med. 261 (1), 5-16 (2007).
