Summary
Hier presenteren we een protocol om te beschrijven van extracellulaire blaasjes (EVs) isolatie in in vitro gekweekte medium uit volwassen Schistosoma japonicum.
Abstract
Extracellulaire blaasjes (EVs) zijn membraanachtig blaasjes uitgebracht door een aantal van de cellen in de extracellulaire communicatie. EVW vertegenwoordigen een bevolking van heterogene blaasjes, waarvan groottewaaier tussen 40 en 1000 nm. Geaccumuleerde bewijs aangegeven dat EVs spelen een belangrijke regelgevende rol in pathogene agens-gastheer interacties. Een diep begrip van Schistosoma EVW moet inzicht verwerven in de mechanismen die ten grondslag liggen aan de Schistosoma-gastheer interacties, ontwikkeling van nieuwe strategieën tegen schistosomiasis. Hier, streven wij naar verdere studie EVs functies in schistosomes door de presentatie van een protocol voor de isolatie en de karakterisering van het EVW van volwassen Schistosoma japonicum (S. japonicum). EVW werden geïsoleerd van in vitro cultuur medium gebruik van centrifugeren gecombineerd met een commerciële exosome isolatie kit. De geïsoleerde S. japonicum EVs (SjEVs) doorgaans bezitten een diameter van 100-400 nm en worden gekenmerkt door transmissie elektronische microscopie en het westelijke bevlekken. Het gebruik van PKH67 kleurstof-geëtiketteerden SjEVs heeft aangetoond dat SjEVs door de ontvangende cellen zijn geïnternaliseerd. Over het geheel genomen biedt onze protocol een alternatieve methode voor het isoleren van EVs van volwassen schistosomes; de geïsoleerde SjEVs mogelijk geschikt voor functionele analyse.
Introduction
Extracellulaire blaasjes (EVs) zijn een bevolking van kleine membraan-gebonden blaasjes ingekapseld en verschillende eiwitten, lipiden, nucleïnezuren. Recente studies aangetoond dat de EVs een cruciale rol in de cel-cel communicatie, en betrokken bij de regulering van tal van fysiologische processen zijn, met inbegrip van cel ontwikkeling, immuunregulatie, angiogenese en cel migratie2, 3,4,5. Vergaren van bewijs geeft aan dat de EVs, circulerende exosomes, en hun lading miRNA mogelijke biomarkers voor bepaalde ziekten6vertegenwoordigt.
Verschillende protozoa zoals Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruzien Leishmania spp., hebben aangetoond te kunnen afscheiden van EVs; wormen zijn bovendien bevonden om afscheiden van EVW in levende gastheren7. Betrokken te worden bij de handhaving van de infectie, pathogeniteit8en9van de immuunregulatie is parasitaire EVs gebleken. De nieuwste studies in schistosomes beide Schistosoma mansoni (S. mansoni) 10,11 en S. japonicum12 hebben aangegeven dat volwassen schistosomes afscheiden exosome-achtige blaasjes die mogelijk deelnemen aan de functionele voorschriften van specifieke biologische processen.
Tot op heden, zijn verschillende methoden gebruikt om extracellulaire blaasjes, zoals ultracentrifugatie, ultrafiltratie13, het gebruik van polymeer gebaseerde reagentia, grootte-uitsluiting chromatografie en immunoaffinity isolatie isoleren. Deze verschillende methoden beschikken over hun eigen voordelen en beperkingen14. In het algemeen ultracentrifugatie wordt beschouwd als de gouden standaard methode om vesikel te isoleren. Deze methode is echter lijden van de beperking van mogelijke EV aggregatie14.
In schistosomes, een paar methoden zijn gemeld voor EV isolatie: deze omvatten ultracentrifugatie11,12,10 en het gebruik van commerciële EV isolatie kit16 voor verschillende stadia (eieren16, schistosomula11, volwassen schistosomes10,12,17). Gezien het feit dat microvesicles van een breed scala van grootte variërend van enkele honderden nanometer duizend nanometer, ontwikkelden we een alternatieve methode die met het gebruik van Bank centrifuge, ultrafiltratie en een commerciële EV isolatie kit combineert te isoleren van de EVs uit volwassen Schistosoma japonicum. De geïsoleerde EVs meestal bezat een diameter van 100-400 nm en met succes door de ontvangende cellen waren geïnternaliseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de lokale ethische commissie van Shanghai veterinaire Research Institute, Chinese Academie van landbouwwetenschappen (toestaan nummer: SHVRIAU-14-0101).
1. in Vitro cultuur van Schistosomes
Opmerking: Schistosomes vertegenwoordigen een biohazard. Werknemers moeten het dragen van latex handschoenen helemaal tijden wanneer behandeling van wormen, schistosomal schorsingen of andere biologische materialen aanverwante. Nieuw-Zeeland konijnen waren besmet met ~ 2.000 cercariae via abdominale blootstelling. Schistosomes in de lever stadium werden verzameld uit konijnen die zijn besmet met S. japonicum cercariae op 28 dagen na infectie door perfusie van de lever en de lymfklieren aders. De procedures van worm collectie hebben aangeroepen in eerdere publicaties rapportage studies in muizen18.
- Verzamelen van parasieten in een bekerglas van 500 mL. Was ze grondig en voorzichtig 3 x met 200 mL voorverwarmd (37 ° C) PBS (pH 7.4).
- Aparte ~ 200 worm paren voor elke petrischaal 90 mm. Daarna wassen de parasieten grondig en voorzichtig 2 x met 50 mL voorverwarmd (37 ° C) RPMI-1640 kweekmedium dat 100 U van penicilline en 100 mg/mL streptomycine.
- Handhaven van parasieten in voorverwarmde RPMI-1640-kweekmedium zonder antibiotica bij 37 ° C minder dan 5% CO,2 bij een dichtheid van ~ 5 worm paren /mL voor 2 h in 90 mm Petri schotel 40 mL.
Notities: Het RPMI 1640-medium mag geen serum bevatten, anders exogene extracellulaire vesikel zal worden ingevoerd.
2. pre-behandelde voorwaarde Media
- Verzamel het kweekmedium en centrifugeer dan het medium bij 4 ° C bij 2.000 × g gedurende 30 min tegmental puin worm te verwijderen van de eieren.
- Het supernatant overbrengen in een verse buis en filtert vervolgens de oplossing met behulp van een filter van de spuit 0,22 µm.
- Verzamelen van de gefilterde oplossing in een dialyzed zak (moleculair gewicht cut-off: 3.5kD) en klik vervolgens dialyze de oplossing om met 8% PEG8000-oplossing bij 4 ° C's nachts.
Notities: Deze stap is belangrijk voor de verrijking van SjEVs voor het verhogen van het rendement van de SjEVs isolatie.
3. isolatie van SjEVs
- Breng de dialyzed oplossing over in een nieuwe buis en voeg vervolgens 0.5 volumes van het totale exosome isolatie reagens.
- Meng de oplossing goed door de vortexing of op en neer pipetteren teneinde homogeniteit van de oplossing te waarborgen.
- Incubeer het mengsel bij 2 ° C tot 8 ° C's nachts.
- Centrifugeer het mengsel bij 15.000 × g gedurende 1 uur bij 2 ° C tot 8 ° C.
- Gecombineerd en verwijder het supernatant.
Notities: EVW bevinden zich in de pellet aan de onderkant van de buis (niet zichtbaar in de meeste gevallen). - Resuspendeer de pellet EVs in 2 mL PBS en sla de EVs-oplossing bij-80 ° C tot verdere analyse.
4. karakterisering van het EVW door het westelijke bevlekken
- Bepaal de eiwitconcentratie van het SjEVs monster, bijvoorbeeld door BCA assay.
- 10-20 µg van het EVW in 22.5 µL RIPA buffer voor te bereiden. Voeg vervolgens 7,5 µL van 4 x laden buffer en warmte gedurende 5 minuten bij 95 ° C.
- Afzonderlijke SjEVs proteïnen door 12% SDS-pagina gel.
- Breng de eiwitten aan Membraan PVDF en vervolgens sonde met anti-CD63 antilichamen (1:1, 000 verdunning), gevolgd door het sonderen met anti-konijn IgG-HRP (1:5, 000 verdunning).
- Gebruik van ECL detectie reagens voor membraan ontwikkeling en detecteren de signalen door een chemiluminescentie imaging systeem.
5. de karakterisering van het EVW door transmissie-elektronenmicroscopie
- Voeg 2 µL van geïsoleerde SjEVs tot 200 mesh formvar beklede rasters en dan laat ze drogen bij kamertemperatuur.
- Vlek met 2% Phosphotungstic zuur voor 1 min en vervolgens laat ze drogen bij kamertemperatuur.
- De rasters op de monsterhouder van de transmissie-elektronenmicroscoop laden en blootgesteld aan een 80 kV elektronenstraal voor beeldopname.
6. SjEVs Label met PKH67 en cel opname Assay
Notities: Alle volgende stappen werden uitgevoerd bij kamertemperatuur (20-25 ° C), tenzij anders aangegeven.
- Pipetteer 5 µg SjEVs oplossing in een conische bodem polypropyleen buis en pas het volume aan 12 mL door RPMI 1640 medium toe te voegen.
- Centrifugeer het SjEVs bij 110.000 × g gedurende 90 min bij 4 ° C om SjEVs pellet.
- Na het centrifugeren, moet u zorgvuldig de bovendrijvende substantie gecombineerd.
Opmerking: De PKH67 ethanolbevattend kleurstof moet niet worden toegevoegd direct naar de SjEV pellet, aangezien dit in heterogene kleuring en verminderde levensvatbaarheid resulteren zou. - Bereid een 2 x EV schorsing oplossing door toevoeging van 1 mL verdunningsmiddel C naar de SjEV pellet; om ervoor te zorgen volledige dispersie, resuspendeer met zachte pipetteren.
- Net voordat hij kleuring in verdunningsmiddel C, stelt u een vers 2 x kleurstof oplossing door toevoeging van 2 µL van de PKH67 ethanolbevattend kleurstof oplossing aan 1 mL verdunningsmiddel C in een centrifugebuis polypropyleen en vermenging goed te verspreiden.
- Voeg snel de 1 mL 2 x EV schorsing (stap 6.4) 1 ml 2 x kleurstof oplossing (stap 6.5) en onmiddellijk meng het monster door pipetteren.
- Laat het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 4 minuten inwerken.
- Stop de kleuring door toevoeging van 4 mL FBS en vervolgens Incubeer gedurende 1 minuut.
- Toevoegen RPMI1640 medium om het volume aan 12 mL en vervolgens Centrifugeer bij 110.000 × g bij 4 ° C voor 90 min.
- Verwijder het supernatant en RPMI1640 medium om resuspendeer de PKH67 met het label SjEV pellets toevoegen.
- Centrifugeer bij 110.000 × g bij 4 ° C voor 90 min te wassen eenmaal en voegt u PBS om resuspendeer de SjEVs pellets.
7. SjEVs-Cell opname Assay
- Zaad zoogdiercellen zoals NCTC kloon 1469 cellen of HEK293T cellen in 6-Wells-platen (2 × 105 cellen per putje) en 's nachts de cellen cultuur.
- Voeg 5 µg SjEVs PKH67-geëtiketteerd en vervolgens cultuur cellen bij 37 ° C gedurende 2-4 uur.
- Na incubatie het medium verwijderen en de cellen met PBS tweemaal wassen.
- Herstellen van de cellen met de 4% formaldehyde oplossing gedurende 15 minuten en twee keer meer met PBS gewassen.
- Vlek celkernen met 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
- Observeer de cellen met behulp van fluorescentie microscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om te kwantificeren van de opbrengst van geïsoleerde SjEVs met behulp van de beschreven protocol, gebruikt wij BCA eiwit assay voor toegang tot de eiwitconcentratie van de geïsoleerde SjEVs van 28-daagse volwassen schistosomes. Zoals blijkt uit tabel 1, varieerde de eiwitconcentratie SjEV 208 µg tot 250 µg per 100 mL medium (tabel 1). De grootte van de deeltjes, zoals bepaald door de Malvern nanoparticle analyse, vermeld dat de geïsoleerde SjEVs van 100 varieerde nm tot 400 nm, met de hoogste bevolking ongeveer 220 nm in grootte (Figuur 1). Verdere karakterisering van de SjEVs door transmissie-elektronenmicroscopie geopenbaard EVs als ronde blaasjes van ongeveer 100-200 nm in diameter (Figuur 2). Western blotting analyse aangegeven dat de geïsoleerde SjEVs werden herkend met behulp van CD63 antilichamen, dat is een typische EV marker (Figuur 3). Fluorescentie microscopie opmerking aangegeven dat de SjEVs van PKH67-label waren geïnternaliseerd door de NCTC kloon 1,469 cellen en dat de SjEVs vooral werden verspreid in het cytoplasma van de ontvangende cellen (Figuur 4).
| Monsters | EVs / 100ml gestolde voedingsbodem |
| #1 | 250 µg |
| #2 | 208 µg |
| #3 | 220 µg |
Tabel 1: SjEVs-eiwit verkregen uit kweekmedium; het bedrag van de SjEVs waartoe BCA assay per 100 mL gestolde voedingsbodem, met ~ 500 worm paren, is aangetoond.
Figuur 1 : Verdeling van geïsoleerde SjEVs van gekweekte medium size. 20 µL van SjEVs oplossing was verdund met 1000 µL PBS; het mengsel werd vervolgens geanalyseerd met behulp van een krachtige twee hoek deeltje en moleculaire grootte analyzer. Het resultaat weergegeven is representatief voor de gegevens van drie onafhankelijke isolatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Karakterisering van SjEVs door transmissie-elektronenmicroscopie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Westelijke bevlekken analyse van de geïsoleerde SjEVs tegen CD63 antilichamen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Opname van SjEVs door zoogdiercellen. De PKH label SjEVs zijn getoond in groen, terwijl de celkernen worden weergegeven in het blauw. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Recente studies over EVs hebben aangetoond dat Schistosoma die EVS een belangrijke rol in9,12,16, gastheer-pathogeen interacties3,spelen. Naar verdere adres hun regelgevende taken, is het essentieel om te isoleren van EVs van schistosomes. Hier beschrijven we een alternatieve methode om SjEV te isoleren. Deze methode levert de omvang van een breed scala van SjEVs, van 100 nm tot 400 nm, in volwassen S. japonicum. De volgende cel opname assay aangegeven dat EVs geïsoleerd krachtens het protocol van de beschreven met succes door de ontvangende cellen waren geïnternaliseerd en dat hun bijbehorende miRNAs regelgevende rollen17kunnen spelen.
EVs, die kunnen worden uitgescheiden door de vele verschillende soorten cellen, zijn ook aanwezig in allerlei lichaamsvloeistoffen19. Daarom is het belangrijk om te voorkomen dat kunstmatig invoering van exogene EVs tijdens het proces van SjEV isolatie. Het kweekmedium mogen bijvoorbeeld geen serum. De dichtheid van de worm in de in vitro cultuur moet redelijk te minimaliseren van de potentiële stress-respons en de sterftecijfers van wormen te verlagen. Bovendien moet opgemerkt worden dat de verschillende stadia van schistosomes of wormen van verschillende hosts verschillende EVs kunnen opleveren. Daarom is het absoluut noodzakelijk om de parasieten in in vitro omgevingen die sterk gelijken op de hostomgeving, en de voorwaarden onder welke SjEV isolatie wordt uitgevoerd moet consistent zijn. Bovendien kunnen we niet uitsluiten van de mogelijkheid van afwijking aan SjEVs veroorzaakt door cultuur stress gerelateerde.
Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van de SjEVs van 2 h in vitro voedingsbodems voor volwassen schistosomes. Een voordeel van dit protocol is dat korte cultuur tijd de stress die parasieten zijn blootgesteld minimaliseert, waardoor niet-fysiologische EV secretie. Daarnaast vonden we dat de SjEVs zoals beschreven in dit protocol geïsoleerd waren geïnternaliseerd door de ontvangende cellen, suggereren dat deze SjEVs biologisch actieve17kan worden. Dit protocol staat over het algemeen de efficiënte isolatie van SjEVs uit volwassen wormen met behulp van de gebruikelijke laboratoriumbenodigdheden en in staat stelt hun karakterisering gebruikend het westelijke bevlekken en cel opname assay. De geïsoleerde EVs kunnen worden gebruikt om te verder karakteriseren gastheer-pathogeen interacties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie was, gedeeltelijk of in zijn geheel, ondersteund door nationale Natural Science Foundation van China (31472187 en 31672550) en de landbouwkunde en het programma van de innovatie van de technologie van de Chinese Academie van landbouwwetenschappen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 4478359 | For isolating S. japonicum extracellular vesicles |
| PKH67 | Sigma-aldrich | MINI67 | For labeling Evs |
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11875119 | For parasite culture |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher SCIENTIFIC | 15140122 | |
| 0.22μm syringe filter | Merck | SLGP033RB | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo SCIENTIFIC | 68035 | |
| PEG8000 | Sangon Biotech | A100159 | |
| RIPA | Beyotime | P0013B | |
| EMD Millipore™ Immobilon™ Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) | Fisher scientific | WBKLS0100 | |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083 | |
| BCA kit | Beyotime | P0010 | |
| CD63 antibodies | Sangon Biotech | D160973-0025 | |
| PVDF | Bio-Rad | 1704273 | |
| Formvar/Carbon 400 mesh | Ted Pella | 01754-F | |
| Phosphotungstic Acid | Ted Pella | 19402 | |
| anti-mouse IgG-HRP | CWBIO | CW0102 | |
| NCTC clone 1469 cells | ATCC | ATCC® CCL-9.1™ | |
| FBS | HyClone | SV30087.02 | |
| Equipments | |||
| GE chemoluminescance imaging system | GE | ImageQuant LAS4000mini | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7600 | |
| Milli-Q water | Milli-Q | Milli-Q Elix | |
| Eppendor Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5804R | |
| Zetasizer Nano | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima L-100 XP Ultracentrifuge | |
| Incubator | ESCO | CCL-107B | |
| Microscope | Zeiss | Zeiss Axin Observer Z1 |
References
- Tetta, C., Ghigo, E., Silengo, L., Deregibus, M. C., Camussi, G. Extracellular vesicles as an emerging mechanism of cell-to-cell communication. Endocrine. 44 (1), 11-19 (2013).
- Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to Extracellular Vesicles: Biogenesis, RNA Cargo Selection, Content, Release, and Uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
- Riaz, F., Cheng, G. Exosome-like vesicles of helminths: implication of pathogenesis and vaccine development. Ann Transl Med. 5 (7), 175 (2017).
- Zhang, H. G., Grizzle, W. E. Exosomes and cancer: a newly described pathway of immune suppression. Clin Cancer Res. 17 (5), 959-964 (2011).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
- Li, Y., et al. Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis. Cell Res. 25 (8), 981-984 (2015).
- Marcilla, A., et al.
- Cwiklinski, K., et al. The Extracellular Vesicles of the Helminth Pathogen, Fasciola hepatica: Biogenesis Pathways and Cargo Molecules Involved in Parasite Pathogenesis. Mol Cell Proteomics. 14 (12), 3258-3273 (2015).
- Buck, A. H., et al. Exosomes secreted by nematode parasites transfer small RNAs to mammalian cells and modulate innate immunity. Nat Commun. 5, 5488 (2014).
- Sotillo, J., et al. Extracellular vesicles secreted by Schistosoma mansoni contain protein vaccine candidates. Int J Parasitol. 46 (1), 1-5 (2016).
- Nowacki, F. C., et al. Protein and small non-coding RNA-enriched extracellular vesicles are released by the pathogenic blood fluke Schistosoma mansoni. J Extracell Vesicles. 4, 28665 (2015).
- Wang, L., et al. Exosome-like vesicles derived by Schistosoma japonicum adult worms mediates M1 type immune- activity of macrophage. Parasitol Res. 114 (5), 1865-1873 (2015).
- Koh, Y. Q., Almughlliq, F. B., Vaswani, K., Peiris, H. N., Mitchell, M. D. Exosome enrichment by ultracentrifugation and size exclusion chromatography. Front Biosci (Landmark Ed). 23, 865-874 (2018).
- Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases. Nat Rev Endocrinol. 12 (9), 504-517 (2016).
- Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319 (2015).
- Zhu, S., et al. Release of extracellular vesicles containing small RNAs from the eggs of Schistosoma japonicum. Parasit Vectors. 9 (1), 574 (2016).
- Zhu, L., et al. Molecular characterization of S. japonicum exosome-like vesicles reveals their regulatory roles in parasite-host interactions. Sci Rep. 6, 25885 (2016).
- Lewis, F.
- Cheng, G. Circulating miRNAs: roles in cancer diagnosis, prognosis and therapy. Adv Drug Deliv Rev. 81, 75-93 (2015).
