Summary
Entrega local de la droga a las glándulas submaxilares es de interés en biología de la glándula salival de entendimiento y para el desarrollo de nuevas terapias. Presentamos un protocolo de inyección de retroductal actualizada y detallada, diseñado para mejorar entrega exactitud y reproducibilidad experimental. La aplicación presentada en este documento es el de nanopartículas poliméricas.
Abstract
Dos objetivos comunes de la terapéutica de la glándula salival son prevención y cura de la disfunción del tejido siguiendo ya sea autoinmune o lesión por radiación. Por entregar localmente compuestos bioactivos a las glándulas salivales, mayores concentraciones de tejido pueden lograrse con seguridad frente a la administración sistémica. Además, de tejido de la blanco los efectos de la acumulación extra glandular de material pueden dramáticamente reducidos. En este sentido, retroductal la inyección es un método ampliamente utilizado para la investigación de la glándula salival biología y Fisiopatología. Retroductal administración de factores de crecimiento, células primarias, vectores adenoviral y fármacos de molécula pequeña se ha demostrado para apoyar la función de la glándula en el entorno de la lesión. Previamente hemos demostrado la eficacia de una estrategia de nanopartículas-siRNA de retroductally inyectado para mantener la función de la glándula después de la irradiación. Aquí se detalla un método altamente eficaz y reproducible para administrar nanomateriales a la glándula submaxilar murina a través del conducto de Wharton (figura 1). Describir el acceso a la cavidad bucal y delinear los pasos necesarios al conducto de Wharton cannulate, con más observaciones que sirven como controles de calidad durante todo el procedimiento.
Introduction
Disfunción de las glándulas salivales tiene muchas etiologías, incluyendo el síndrome de Sjögren, una pérdida mediada autoinmune del tejido secretor funcional e hiposalivación inducida por la radiación (ROG), una secuela común de cabeza y cuello cáncer radioterapia1. Pérdida de la función salival debido a cualquier condición predispone a los individuos a oral y sistémica de la infección, caries dental, disfunción digestiva y deglución, debilitación de discurso y depresión mayor1,2,3. Como resultado, calidad de vida sufre significativamente, con las intervenciones que se limita a la paliación de los síntomas más que curar4. Para investigar nuevas terapias en vivo, es de interés para administrar compuestos bioactivos directamente a la glándula salival.
Retroductal inyectable es un método valioso para entregar compuestos bioactivos directamente a las glándulas salivales y comprobar la eficacia en la enfermedad, lesión, o en la homeostasis del tejido normal. Las tres glándulas salivales mayores son la parótida (PG), el submaxilar (SMG) y sublingual (SLG), todos de que está vacía en la cavidad bucal a través de conductos excretores. La anatomía de la murine SMG permite acceso directo a través de la canulación del conducto de Wharton, ubicada en el piso de la boca bajo la lengua5. Tras la canulación, fármacos solvatados pueden administrarse directamente en el SMG. Después del parto de retroductal, difusión extra glandular está limitada por la cápsula de tejido circundante que regula el intercambio de material con el que rodea las estructuras6. El SMG y su conducto están estructurados de manera similar en los seres humanos y habitualmente se acceden durante el SMG cirugía y sialoendoscopy7. En humanos y ratones, la PG es además accesible a través del conducto de Stensen en la mucosa bucal8.
En modelos murinos de RIH, inyección de retroductal SMG se ha utilizado para ofrecer terapéutica incluyendo factores de crecimiento, células primarias, vectores adenoviral, citoquinas y compuestos antioxidantes modulan la respuesta celular a la lesión, y reducir el tejido daño5,9,10,11,12,13,14,15,16. El más notable éxito clínico de retroductal inyectable es la administración de un vector adenoviral para dirigir la expresión de un canal de agua (Acuaporina 1; AQP1) en pacientes después de la radiación para cáncer de cabeza y cuello17.
Previamente, hemos desarrollado y demostrado la eficacia de un sistema de nanopartículas poliméricas-siRNA retroductally inyectada para proteger la función de la glándula salival de RIH11,18,19,20. Como una extensión de nuestro trabajo en el pasado, aquí, demostramos nuestro protocolo para la inyección de SMG de retroductal usando una nanopartícula fluorescente etiquetada (NP) capaz de cargar y entregar de lo contrario poco solubles drogas21,22, 23.
Se ha sintetizado lo NP de un copolímero del diblock compuesto de poli (estireno-alt-maleico anhydride)-b-poly(styrene) (PSMA) a través de la adición reversible cadena fragmentación (balsa) polimerización, tal como se describe anteriormente21. A través del intercambio de solvente, estos polímeros montan espontáneamente uno en estructuras de micelas NP con una hidrofóbica interior e hidrofílico exterior21. El NPs están marcado con rojo Texas fluoróforo para permitir la verificación de la entrega de la NP en las glándulas sin sacrificar el animal. Imágenes de animales en vivo y immunohistochemistry SMG se muestra en 1 h y 1 día después de la inyección.
Este actualizado y protocolo reproducible de la canalización debe permitir que otras personas lograr la inyección de retroductal. Esperamos que esta refinada técnica será fundamental para en vivo estudios y desarrollo terapéutico24,25.
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Protocol
Todo en vivo los procedimientos descritos a continuación fueron aprobados por el Comité de la Universidad sobre los recursos de la Universidad de Rochester, Rochester, NY.
1. preparación
- Con tubo de 32G catéter intracraneal con inserción de alambre, corte 3 cm del tubo para formar un extremo biselado, aproximadamente 45° al eje longitudinal. Confirman que el cable es más largo que el tubo de al menos 1 cm.
- Coloque 50 μl de solución de nanopartículas PSMA (figura 1), u otro material de inyección, en una jeringa Hamilton. Para reducir la probabilidad de barotrauma durante la inyección, acople el tubo del catéter, con el mandril quitado, a la jeringa y expulse el volumen muerto.
- Revise la solución de la inyección para asegurarse de que la nanopartícula es completamente solvatados para prevenir obstrucción ductal después de la administración.
- Preparar solución de atropina 0,1 mg/ml.
Nota: Debido a atropina es sensible a la luz y se degrada con el tiempo, esta solución debe ser hecha el día de la inyección y protegida de la luz hasta que administra.
2. acceder y visualizar el punto de entrada Ductal
- Pesar ratones C57/BL6 utilizando una balanza analítica.
- Utilizando una jeringa de 0.5 mL con aguja 29 x ½", anestesiar ratones con una solución salina estéril inyectada por vía intraperitoneal de 100 mg/kg ketamina y 10 mg/kg xilacina. Proceder al paso siguiente cuando el ratón deja de responder a estímulos, que ocurre generalmente dentro de 5 a 10 minutos después de la inyección.
Nota: Este procedimiento también puede realizarse con isoflurano, pero requerirá de un cono de nariz personalizado que permita el acceso a la cavidad oral. - Para evitar la sequedad durante el procedimiento, aplique lubricante a los ojos y colocar el ratón en una posición prona en un escenario personalizado.
Nota: Para mantener las condiciones apropiadas para el procedimiento intraoral, herramientas deben desinfectarse o esterilizarse antes de cada uso. - Asegurar los incisivos sobre una viga de metal para abrir la cavidad bucal y usar una banda elástica para aplicar tensión hacia abajo detrás de los incisivos mandibulares (figura 2A).
- Alinear el ratón bajo el microscopio de disección que se visualiza la base de la mandíbula.
- Para ensanchar la boca, usar un retractor de acero personalizado, curvado para aplicar tensión bilateralmente en la mucosa bucal.
- Para visualizar las papilas submaxilares, sujete y levante suavemente la lengüeta del piso de la boca usando fórceps romos.
Nota: Las papilas aparecerán como dos protuberancias pálidas debajo de la lengua (figura 2B). - Para facilitar la visualización y manipulación más dentro de la cavidad oral, coloque el algodón entre la lengua y la mucosa bucal.
3. ductal canulación y la colocación de la línea
- Con fina, pinzas curvas, agarre tubo del catéter con la inserción de alambre. Para el óptimo control manual durante la canulación, alinee el tubo con la curvatura de las pinzas (Figura 3A).
- Usando el microscopio de disección, mover las pinzas y el alambre en el campo de visión.
Nota: El cable debe que sobresale del tubo. - Suavemente aplique presión en la base de una papila submaxilar utilizando el cable incluido para producir un pinchazo pequeño, superficial, mucosa (0,076 mm de diámetro) que facilitará la posterior entrada de los tubos del catéter (0,25 mm de diámetro). Si se encuentra resistencia, corte frescos puntas biseladas en la tubería y la inserción de alambre con unas tijeras de disección agudas.
- Después de la entrada, retirar el estilete y, usando el microscopio de disección, confirmar la presencia de saliva en el sitio de punción. Evitar movimientos fuertes o bruscos (retirada o inserción) el estilete que puede causar sangrado o comprometer integridad ductal.
- Retire el estilete dentro de la tubería (figura 3B).
- Para asegurar que la tubería de inyección se ajusta a la abertura del conducto de Wharton, inserte el tubo que contiene el estilete rígido guía en la punción anterior (figura 2 C).
Nota: Si no se realiza rápidamente, hinchazón local puede impedir la reinserción. - Para evitar la presión por obstrucción ductal prolongada, retirar el tubo. Inspeccione para verificar que una apertura, visible bajo microscopía, puede verse en la papila submaxilar. Si se presenta sangrado visible, retire el estilete y vuelva a intentar desde el paso 3.2 en las papilas submaxilares opuestas.
- Sin mover el ratón, administrar una inyección intraperitoneal de solución de atropina de 1 mg/kg, para reducir la salivación durante el procedimiento. Espere 5-10 minutos.
- Sostenga el extremo del tubo de la jeringa e inserte en el orificio usando el microscopio de disección (figura 3). Si se encuentra resistencia, corte un extremo biselado fresco a la tubería y el reintento.
- Una vez que la tubería esté en su lugar dentro de la papila submaxilar, avanzar lentamente 3-5 mm en el conducto. Suelte el tubo de las pinzas.
- Para mejorar el sello entre la tubería y la papila submaxilar, seque la interfaz frotando suavemente con una gasa durante 1 minuto.
- Revise para confirmar que la posición de la tubería no ha cambiado durante el secado.
4. inyección
- Inyectar el material a una velocidad de 10 μl/min Revise para confirmar que el ratón permanece sedado y no muestra señales de incomodidad (Figura 2D).
Nota: Las inyecciones de 15-50 μl son bien toleradas. La inyección de volúmenes grandes puede causar barotrauma. - Después de la inyección, mantener la presión de la jeringa por 5 min mejorar la retención del material dentro del conducto de Wharton y SMG (figura 4). Inspeccione la papila submaxilar periódicamente para asegurar que la tubería no sale el orificio ductal.
- Con unas pinzas finas, sujete y retire suavemente el tubo de las papilas submaxilares.
Nota: Es normal observar algunas salida flúida de las papilas. - Retire el separador y algodón de la cavidad oral antes de mover el ratón de la etapa.
Nota: El animal no se debe dejar desatendido hasta que ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal. Además, aseguran que el ratón no se encuentra con otros ratones hasta que se recuperó completamente.
5. verificación y análisis
Nota: Una en vivo sistema de proyección de imagen (IVIS) puede utilizarse para evaluar la retención de las nanopartículas fluorescencia marcadas después de la inyección (como se muestra 1 h y 24 h después de la inyección en la figura 5).
- Para visualizar mejor la señal fluorescente dentro de SMG, a través de la piel, quitar la piel ventral que cubría las metralletas por afeitarse o usar un depilatorio químico.
Nota: Después de eutanasia, SMG tejido también puede recolectarse, fijo (noche en paraformaldehído al 4%) y teñido usando immunohistochemistry para confirmar la persistencia de fluorescencia etiquetada NP un día después de la inyección (figura 6).
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Representative Results
Inyección de Retroductal puede utilizarse para administrar NPs a SMG murino (figura 1). Aquí entregamos 50 μg PSMA NPs marcado con rojo Texas fluoróforo.
La colocación correcta del mouse permite de fácil acceso y visualización del piso de la boca (figura 2A-B). Las papilas submaxilares son identificadas como dos protuberancias carnosas debajo de la lengua. Tras la canulación (figura 2) y la inyección de atropina, tubo de la jeringa se puede colocar en las papilas submaxilares (Figura 2D).
Para facilitar la canulación, una pequeña punción en la papila submaxilar se hace primero con el estilete de alambre dentro del tubo del catéter (Figura 3A). Una vez hecho esto, se debe retraer el estilete dentro de la tubería para servir como una guía rígida mientras se hace una abertura más grande (figura 3B). El estilete tiene un diámetro de 0,076 mm, mientras que el tubo del catéter tiene un diámetro exterior de 0,25 mm. Tras la creación de esta abertura más grande, el catéter previamente cargado de la tubería, unida a la jeringa de la inyección, puede entonces guiarse en el orificio ductal (figura 3).
Después de la inyección, se recomienda que la jeringa se inmovilizó y mantuvo la presión de la inyección. Si la presión no se aplica, entrega tendrá éxito, aunque con menos eficiencia y reproducibilidad. Esto es demostrado por inyectar 50 μl de colorante de azul de toluidina 1% bilateral y observar coloración más débil en la glándula sin presión mantenida después de la inyección (figura 4).
Para verificar la entrega de la NP, el IVIS puede utilizarse para detectar la señal fluorescente en el ratón, que es lateralizado a la administración de correos 1 h región inyectado (figura 5). Este enfoque permite la confirmación sin euthanizing el ratón y puede continuarse longitudinalmente hasta que la señal ya no es detectable26,27.
Para confirmar la persistencia de NP en la SMG 24 h siguiente inyección, glándulas pueden ser seccionadas y vistas por proyección de imagen fluorescente. Aqp5 y Krt5 IHC marcan células ductales y secretoras de la SMG, respectivamente y NPs en ambos compartimientos (figura 6).
Figura 1 . Retrógrada inyección PDF. Tras la canulación ductal y la colocación de la jeringa, 50 μl de la solución de NP polimérica de 1 mg/mL se inyecta en el SMG. Micrográfo de electrón de la representante de la transmisión (TEM) muestra monodispersa (índice de polidispersidad = 0.2) población de NP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Retrógrada pasos inyección. (A) acceder a la cavidad oral mediante la separación de los incisivos maxilares y mandibulares. (B) visualizar las papilas (encajonadas) debajo de la lengua en el piso de la boca, que marcan la ubicación del conducto de Wharton. (C) usando un catéter con inserción de alambre, canule suavemente la base de la papila submaxilar. (D) después de la canulación, el tubo del catéter se puede intercambiar con tubo de jeringa haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Efectiva colocación de catéter y estilete para canulación del conducto de Wharton. (A) Alinee el tubo con la curvatura de las pinzas y corte un extremo biselado de la tubería y el cable para perforar inicialmente la papila sublingual. (B) Retire el estilete dentro del tubo para hacer una guía rígida para introducir la tubería dentro de la papila sublingual. (C) Inserte el tubo del catéter (estilete removido), unido a la jeringa de la inyección, en el orificio previamente hecho. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Mantener la siguiente presión de jeringa inyectable mejora la retención de material. Tras las inyecciones de retroductal de 50 μl de azul de toluidina 1%, jeringa de presión se mantuvo bien durante 5 minutos (derecho SMG - primera inyección) o la jeringa fue retirada inmediatamente después de la inyección (izquierda SMG - segunda inyección). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 . Confirmación de retroductal NP entrega después de la inyección. (A) En vivo Sistema (IVIS) la proyección de imagen demuestra la lateralización de la señal fluorescente rojo a la tratada (izquierda) del ratón 1 h después de la inyección. (B) señal de NP IVIS a las 24 h ha disminuido significativamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 . Confirmación de retroductal NP persistencia 24 h después de la inyección. A, C. Uninjected control SMG mancharon para Aqp5 y Krt5, marca secretor células acinares y ductales, respectivamente. B, D. En retroductal NP inyecta SMG, Aqp5 y Krt5 manchas muestran morfología normal de la glándula y NPs en los acinos y conductos (barras de escala: 75 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Retroductal inyección es crítica para la entrega de la droga localizada en la glándula salival. Esta técnica tiene aplicaciones en la detección de agentes terapéuticos para las condiciones incluyendo el síndrome de Sjögren y RIH9,10,28. Directa del fármaco en el SMG vía la inyección de retroductal ofrece una ventaja clave sobre la administración sistémica en su potencial para reducir los efectos off-target, incluyendo activación inmune11. La capacidad de maximizar la entrega de la droga locales, sin acumulación en los tejidos circundantes también puede habilitar pruebas terapéuticas en un rango de dosis más amplio que podría lograrse de forma sistémica.
Presentamos a este protocolo, con calidad y solución de problemas Compruebe pasos, como un método detallado y actualizado para ofrecer nanomateriales poliméricos a través del conducto de Wharton a la SMG murino20. Por ejemplo, el uso correcto de una guía facilita la colocación de la cánula. Además, usando borrar seco en lugar de colas de cianoacrilato para mantener la cánula en su lugar durante la inyección, se minimiza el riesgo de trauma mucosa. Este método puede utilizarse para el tratamiento de ratones con una variedad de compuestos y puede realizarse en varios días con el mismo ratón para evaluar una timecourse de repetición de la administración11.
Secreción de la glándula normal proporcionará un mecanismo de remoción simple y directa para el exceso de carga útil, aunque esta estrategia debe ser optimizada para diferentes aplicaciones por una cuidadosa selección de la sustancia inyectada y titulación de la dosis de atropina. En este caso, NPs persisten en el SMG durante al menos 24 h. Mediante el uso de NPs capaces de cargamento de droga o similar nanomateriales, aplicaciones futuras de este trabajo incluyen superar el límite de solubilidad que impida otra manera pruebas agentes hidrofóbicos con inyección de retroductal20,21.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Investigación en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de odontología y el Instituto Nacional de cáncer (NCI) de los institutos nacionales de salud Premio número R56 DE025098, DE027695 UG3 y F30 CA206296 Craniofacial Research (NIDCR). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud. Este trabajo también fue apoyado por la NSF DMR 1206219 y la innovación de la IADR en Premio de Cuidado Oral (2016).
Nos gustaría agradecer a Jayne Gavrity por su ayuda en la realización de experimentos IVIS. Nos gustaría agradecer a Karen Bentley por su entrada y asistencia en la realización de EM. Nos gustaría agradecer su ayuda con IHC Weng Pei-Lun. Nos gustaría agradecer a Matthew Ingalls por su ayuda en la preparación de la figura. Nos gustaría agradecer al Dr. Elaine Smolock y Emily Wu lectura crítica de este manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma Aldrich | P6503 | Pilocarpine |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-9 | Spring Scissors for Tracheostomy |
| Sterile Saline Solution | Medline | RDI30296H | Saline |
| Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | Curved Forceps |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Straight Forceps |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | Blunt Forceps |
| Fine Scissors- Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Dissection Scissors |
| Microhematocrit Heparinized Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22362566 | Capillary tubes |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh | N/A | Refresh Lacri-Lube |
| Goat polyclonal anti-Nkcc1 | Santa Cruz Biotech | SC-21545 | Nkcc1 Antibody |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | DAPI |
| GraphPad Prism | GraphPad | ver6.0 | Statistical Software |
| Cotton tipped applicator | Medline | MDS202000 | Applicator for eye ointment |
| 0.5cc Insulin Syringe, 29G x 1/2" | BD | 7629 | Syringe for intraperitoneal injection |
References
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