Summary
Entrega de drogas local para as glândulas submandibulares é de interesse em biologia de glândula salivar de entendimento e para o desenvolvimento de novas terapêuticas. Apresentamos um protocolo de injeção retroductal atualizadas e detalhadas, destinado a melhorar a precisão de entrega e reprodutibilidade experimental. O aplicativo aqui apresentado é a entrega de nanopartículas poliméricas.
Abstract
Dois objetivos comuns das glândulas salivares terapêutica são prevenção e cura da disfunção do tecido seguindo ou auto-imune ou radiação. Entregando localmente compostos bioativos para as glândulas salivares, maiores concentrações de tecido podem ser alcançadas com segurança contra administração sistémica. Além disso, fora o tecido-alvo os efeitos da acumulação extra glandular de material podem ser drasticamente reduzidos. A este respeito, injeção de retroductal é um método amplamente usado para investigar a biologia das glândulas salivares e a fisiopatologia. Retroductal administração de fatores de crescimento, as células primárias, vetores adenovírus e drogas pequena molécula mostrou para apoiar a função da glândula no cenário do ferimento. Nós anteriormente demonstraram a eficácia de uma estratégia de siRNA nanoparticle retroductally injetada para manter a função da glândula após irradiação. Aqui, um método altamente eficaz e reprodutível para administrar nanomateriais para a glândula submandibular murino através do ducto de Wharton é Detalhado (Figura 1). Descrevemos a acessar a cavidade oral e descrevem as etapas necessárias ao duto de cannulate da Wharton, com novas observações servindo como verificações de qualidade durante todo o procedimento.
Introduction
Disfunção da glândula salivar tem várias etiologias, incluindo a síndrome de Sjögren, uma auto-imune mediada por perda de tecido secretor funcional e radiação induzida hipossalivação (RIH), uma comum sequelas de cabeça e pescoço câncer radioterapia1. Perda da função salivar devido qualquer condição predispõe indivíduos a infecção oral e sistêmica, cárie dentária, disfunção digestiva e deglutição, Imparidade de discurso e depressão1,2,3. Como resultado, qualidade de vida significativamente sofre, com intervenções limitadas a paliação dos sintomas ao invés de cura4. Para investigar novas terapias na vivo, é de interesse para administrar compostos bioativos diretamente à glândula salivar.
Injeção de Retroductal é um método valioso para entregar compostos bioativos diretamente para as glândulas salivares e testar a eficácia na doença, lesão, ou sob a homeostase do tecido normal. As três principais glândulas salivares são as parótidas (PG), a submandibular (SMG) e a sublingual (SLG), todos que vazio na cavidade oral através de ductos excretores. A anatomia do murino SMG permite acesso direto através de cateterização do ducto de Wharton, localizado no assoalho da boca sob a língua5. Após a cateterização, solvated drogas podem ser administradas diretamente para a SMG. Após o parto retroductal, difusão extra glandular é restrito pela cápsula de tecido circundante, que regula a troca de material com em torno de estruturas6. O SMG e seu ducto estruturam-se da mesma forma em seres humanos e rotineiramente são acessados durante SMG cirurgia e sialoendoscopy7. Em humanos e ratos, o PG é igualmente acessível através do duto de Stensen na mucosa bucal8.
Em modelos murino da RIH, injeção de retroductal SMG tem sido utilizada para entregar terapêutica incluindo fatores de crescimento, as células primárias, vetores adenovírus, citocinas e compostos antioxidantes modular a resposta celular a lesões, e reduzir o tecido danos5,9,10,11,12,13,14,15,16. O mais notável sucesso clínico da injeção de retroductal é a administração do vetor adenovírus para direcionar a expressão de um canal de água (aquaporina 1; AQP1) em pacientes após a radiação para câncer de cabeça e pescoço17.
Anteriormente, desenvolvemos e demonstrado a eficácia de um sistema de nanopartículas poliméricas-siRNA retroductally injetado para proteger a função da glândula salivar de RIH11,18,19,20. Como uma extensão de nossos trabalhos anteriores, aqui, demonstramos nosso protocolo para injeção de SMG retroductal usando uma nanopartícula fluorescente etiquetada (NP) capaz de carregar e entregar outra forma pouco solúvel drogas21,22, 23.
Podemos ter sintetizado o NP de um copolímero de diblock composto de poli (estireno-alt-hidrazida anhydride)-b-poly(styrene) (PSMA) através da polimerização de fragmentação (balsa) de cadeia de adição reversível, conforme descrito anteriormente,21. Através da troca de solvente, estes polímeros espontaneamente auto-montagem em estruturas de NP micelle com um hidrofóbico hidrofílico e interior exterior21. O NPs é rotulado com o fluoróforo Texas-vermelho para permitir a verificação da entrega NP nas glândulas sem sacrificar o animal. Viver a imagem animal e imuno-histoquímica SMG é mostrado em 1 h e 1 dia após a injeção.
Esta actualizado e protocolo de canulação reprodutível deve permitir que outros conseguir injeção de retroductal. Esperamos que esta técnica refinada se torne crítica para estudos em vivo e desenvolvimento terapêutico24,25.
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Protocol
Todos na vivo os procedimentos descritos abaixo foram aprovados pela Comissão Universidade recursos animais na Universidade de Rochester, Rochester, NY.
1. preparação
- Usando o tubo de cateter intracraniano 32G com inserir fio, corte 3 cm do tubo para formar uma ponta chanfrada, aproximadamente 45° ao eixo longo. Confirme que o fio é mais do que o tubo de pelo menos 1 cm.
- Carrega 50 µ l de solução de nanopartículas PSMA (Figura 1), ou outro material de injeção, em uma seringa de Hamilton. Para reduzir a probabilidade de barotrauma durante a injeção, fixe o tubo do cateter, com o estilete removido, a seringa e expulsar o volume morto.
- Inspecione a solução de injeção para assegurar que as nanopartículas é totalmente solvated para evitar obstrução ductal após a administração.
- Prepare a solução de atropina em 0,1 mg/mL.
Nota: Porque a atropina é sensível à luz e degrada ao longo do tempo, esta solução deve ser feita no dia da injeção e protegida da luz até administrado.
2. acesso e visualização Ductal ponto de entrada
- Pese de camundongos C57/BL6 usando uma balança analítica.
- Utilizando uma seringa de 0,5 mL com agulha 29 x ½", anestesia os ratos com uma solução salina estéril intraperitonealmente injetado de 100 mg/kg quetamina e 10 mg/kg de xilazina. Prossiga para a etapa seguinte quando o mouse não responde mais aos estímulos, que geralmente ocorre dentro de 5 a 10 min após a injeção.
Nota: Este procedimento também pode ser realizado com isoflurano, mas exigirá um cone de nariz personalizado que permite o acesso à cavidade oral. - Para evitar o ressecamento durante o procedimento, aplique o lubrificante para os olhos e coloque o mouse em posição num palco personalizado.
Nota: Para manter as condições adequadas para um procedimento intra-oral, ferramentas devem ser desinfectadas ou esterilizadas antes de cada utilização. - Abra a cavidade oral por assegurar os incisivos sobre uma viga de metal e usar uma faixa elástica para aplicar tensão para baixo por trás dos incisivos mandibulares (Figura 2A).
- Alinhe o mouse sob o microscópio de dissecação, tal que a base da mandíbula é visualizada.
- Para alargar a boca, use um afastador de aço personalizado, curvo para aplicar tensão bilateralmente na mucosa bucal.
- Para visualizar a papila submandibulares, segure e levante suavemente a língua do chão da boca usando fórceps rombudo.
Nota: As papilas aparecerá como duas saliências pálidas debaixo da língua (Figura 2B). - Para facilitar a visualização e outra manipulação dentro da cavidade oral, coloque algodão entre a língua e mucosa bucal.
3. ductal canulação e colocação de linha
- Usando bem, pinça curva, segure tubo do cateter com a inserção do fio. Para melhor controle manual durante a cateterização, alinhe o tubo com a curvatura da pinça (Figura 3A).
- Usando o microscópio de dissecação, mova o fórceps e fio para o campo de visão.
Nota: O fio deve ser salientes da tubagem. - Aplica suavemente a pressão na base de uma papila submandibular usando o fio de encastrar para produzir uma perfuração pequena, superficial, da mucosa (0,076 mm de diâmetro) que facilitará a posterior entrada do tubo de cateter (0,25 mm de diâmetro). Se encontrar resistência, corte pontas biseladas frescas sobre a tubulação e a inserção do fio com tesoura afiada de dissecação.
- Após a entrada, retirar o estilete e, usando o microscópio de dissecação, confirmar a presença de saliva no local da punção. Evite movimento enérgico ou súbito (retirada ou inserção) do estilete que pode causar sangramento ou comprometer a integridade ductal.
- Retire o estilete dentro da tubulação (Figura 3B).
- Para garantir que tubulação de injeção vai caber no ducto de Wharton abertura, inserir o tubo contendo o estilete como um guia rígido para a punção feita anteriormente (Figura 2 C).
Nota: Se não executada rapidamente, inchaço local pode evitar re-inserção. - Para evitar a pressão traseira de obstrução ductal prolongada, retire o tubo. Inspecione para verificar que uma abertura, visível sob microscopia, pode ser vista na papila submandibular. Se o sangramento visível ocorre, retire o estilete e tente novamente de passo 3.2 sobre as papilas submandibulares opostas.
- Sem mover o mouse, administre injeção intraperitoneal de solução de atropina 1 mg/kg, para reduzir a salivação durante o procedimento. Espere 5-10 min.
- Segure a extremidade do tubo de seringa e introduza no orifício usando o microscópio de dissecação (Figura 3). Se encontrar resistência, corte uma extremidade chanfrada fresca para a tubulação e a tentativa.
- Uma vez que o tubo está no lugar dentro da papila submandibular, avance lentamente 3-5 mm para o ducto. Lançamento da tubulação da pinça.
- Para melhorar a vedação entre o tubo e a papila submandibular, seca a interface pela mancha suavemente com gaze durante 1 min.
- Inspecione para confirmar que a posição do tubo não mudou durante a secagem.
4. injeção
- Injete o material a uma taxa de 10 µ l/min. verificar para confirmar que o mouse permanece sedado e não mostra sinais de aflição (Figura 2D).
Nota: Injeções de 15-50 µ l são bem toleradas. Injeção de volumes maiores pode provocar barotrauma. - Após a injeção, manter a pressão de seringa por 5 min melhorar a retenção de material dentro de duto da Wharton e SMG (Figura 4). Inspecione a papila submandibular periodicamente para assegurar que a tubulação não sair o orifício ductal.
- Usando a pinça fina, agarrar e retirar o tubo delicadamente as papilas submandibulares.
Nota: É normal observar algum fluido egresso das papilas. - Remova o retractor e algodão da cavidade oral antes de mover o mouse do palco.
Nota: O animal não deve ser deixado sem supervisão até que recuperou a consciência suficiente para manter a prostração esternal. Além disso, certifique-se de que o mouse não está alojado com outros ratos até totalmente recuperado.
5. verificação e análise
Nota: Um na vivo Imaging System (IVIS) pode ser usado para avaliar a retenção de nanopartículas fluorescente etiquetadas após injeção (como mostrado 1 h e 24 h após a injeção na Figura 5).
- Para visualizar melhor sinal fluorescente dentro do SMG através da pele, remova a pele ventral sobrejacente as SMGs por depilar ou usar um creme depilatório químico.
Nota: Após a eutanásia, tecido SMG também pode ser colhido, fixo (pernoite em paraformaldeído 4%) e manchado usando imuno-histoquímica para confirmar a persistência de NP fluorescente etiquetada um dia depois da injeção (Figura 6).
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Representative Results
Injeção de Retroductal pode ser usada para administrar o NPs para a SMG murino (Figura 1). Aqui, nós entregamos a 50 µ g PSMA NPs rotulado com vermelho Texas fluoróforo.
Colocação adequada do mouse permite fácil acesso e visualização do assoalho da boca (Fig. 2A-B). As papilas submandibulares são identificadas como duas saliências carnudas debaixo da língua. Seguindo a canulação (Figura 2) e injeção de atropina, tubo seringa pode ser colocado nas papilas submandibulares (Figura 2D).
Para facilitar a cateterização, uma pequena punção na papila submandibular primeiro feita usando o estilete de arame dentro do tubo do cateter (Figura 3A). Quando isso for feito, o estilete deve ser recolhido dentro do tubo para servir como um guia rígido enquanto é feita uma abertura maior (Figura 3B). O estilete tem um diâmetro de 0,076 mm, enquanto o tubo de cateter tem um diâmetro exterior de 0,25 mm. Após a criação da abertura maior, o cateter pré-carregado, tubulação, anexado para a seringa de injeção, pode então ser guiado no orifício ductal (Figura 3).
Após a injeção, é recomendável que a seringa ser imobilizada e pressão de injeção mantida. Se a pressão não é aplicada, a entrega será bem sucedida, embora com menos eficiência e reprodutibilidade. Isso é demonstrado pela injeção de 50 µ l de corante de azul de toluidina 1% bilateralmente e observando a coloração mais fraca na glândula sem pressão mantida após a injeção (Figura 4).
Para verificar se a entrega de NP, a IVIS pode ser usado para detectar um sinal fluorescente dentro do mouse, que é lateralized à administração região injetado h 1 post (Figura 5). Esta abordagem permite a confirmação sem eutanásia o mouse e pode ser continuada no sentido longitudinal até o sinal não é mais detectável26,,27.
Para confirmar a persistência do NP na injeção SMG 24 h seguinte, glândulas podem ser seccionadas e vistas por imagem fluorescente. Aqp5 e IHC Krt5 marcam células secretoras e Ductais da SMG, respectivamente e mostram o NPs em ambos os compartimentos (Figura 6).
Figura 1 . Retrograde injeção esquemática. Após canulação ductal e colocação de seringa, 50 µ l de solução de NP polimérica de 1 mg/mL é injetado a SMG. Micrografia eletrônica de transmissão representativas (TEM) mostra monodisperso (índice de polidispersividade = 0,2) população de NP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Retrograde passos injeção. (A) acesse a cavidade oral, separando os incisivos maxilares e mandibulares. (B) Visualize as papilas (box) abaixo a língua no chão da boca, que marcam o local do ducto de Wharton. (C) usando um cateter com inserir fio, suavemente Canule a base da papila submandibular. (D) após canulação, o tubo do cateter pode ser trocado com tubulação de seringa clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Eficaz o posicionamento do cateter e estilete para canulação do ducto de Wharton. (A) , alinhe o tubo com a curvatura da pinça e corte uma extremidade chanfrada no tubo e arame para punção inicialmente a papila sublingual. (B) Retire o estilete dentro do tubo para fazer um guia rígido para inserir o tubo dentro da papila sublingual. (C) inserir o tubo de cateter (estilete removido), juntou-se a seringa de injeção, dentro do orifício feito anteriormente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Manter o seguinte de pressão seringa injeção melhora a retenção de material. Após injeções retroductal de 50 µ l de toluidina 1% azul, pressão de seringa também foi mantida por 5 min (direito SMG - primeira injeção) ou a seringa foi retirada imediatamente após a injeção (esquerda SMG - segunda injeção). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . Confirmação de injeção de pós entrega retroductal NP. (A) Na vivo Imaging System (IVIS) mostra a lateralização do sinal fluorescente vermelha ao lado (esquerdo) Tratado da injeção do mouse h 1 post. (B) sinal de NP IVIS em 24h diminuiu significativamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 . Confirmação de injeção de pós retroductal NP persistência 24 h. A, C. Uninjected controle SMG manchado para Aqp5 e Krt5, marcação células acinares e Ductais secretórias, respectivamente. B, D. Em retroductal NP injetado SMG, manchas Aqp5 e Krt5 mostram a morfologia da glândula normal e NPs retomado em ácinos e ductos (escala bares: 75 µm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Retroductal injeção é fundamental para a entrega de drogas localizadas à glândula salivar. Essa técnica tem aplicações na triagem de agentes terapêuticos para condições, incluindo a síndrome de Sjogren e RIH9,10,28. Entrega da droga direto para a SMG através da injeção de retroductal fornece uma vantagem chave sobre administração sistémica no seu potencial para reduzir os efeitos fora do alvo, incluindo ativação imune11. A capacidade de maximizar a entrega de drogas local, sem acúmulo nos tecidos circundantes também pode habilitar o teste terapêutico em uma escala mais larga da dose do que poderia ser alcançado sistemicamente.
Podemos apresentar este protocolo, com qualidade e solução de problemas Verifique os passos, como um método detalhado e atualizado para entregar a SMG murino20-poliméricos nanomateriais através do ducto de Wharton. Por exemplo, a utilização adequada de um fio guia facilita a colocação da cânula. Além disso, usando a mancha seca em vez de colas de cianoacrilato para segurar a cânula no lugar durante a injeção, o risco de trauma da mucosa é minimizado. Esse método pode ser usado para tratar ratos com uma gama de compostos e pode ser realizado ao longo de vários dias com o mesmo mouse para avaliar um timecourse de repetição administração11.
Secreção da glândula normal irá fornecer um mecanismo de autorização simples e direta para carga em excesso, embora esta estratégia deve ser otimizada para diferentes aplicações, pela cuidadosa seleção de substância injetada e titulação da dosagem de atropina. Neste caso, o NPs persistem na SMG pelo menos 24 h. Usando o NPs capaz de carregamento de droga, ou similares, nanomateriais, aplicações futuras deste trabalho incluem superar o limite de solubilidade que impediria, caso contrário, teste agentes hidrofóbicos com injeção de retroductal20,21.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Pesquisa reportada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de dentária e Craniofacial Research (NIDCR) e o National Cancer Institute (NCI) do institutos nacionais da saúde sob prêmio número R56 DE025098, DE027695 UG3 e CA206296 F30. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde. Este trabalho também foi apoiado pela NSF DMR 1206219 e a inovação IADR no prêmio de cuidado Oral (2016).
Gostaríamos de agradecer sua ajuda na realização de experimentos IVIS Jayne Gavrity. Gostaríamos de agradecer a Karen Bentley para sua entrada e assistência na realização de EM. Gostaríamos de agradecer sua ajuda com IHC Pei-Lun Weng. Gostaríamos de agradecer a Matthew Ingalls por sua assistência na preparação de figura. Gostaríamos de agradecer o Dr. Elaine Smolock e Emily Wu para leitura crítica deste manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma Aldrich | P6503 | Pilocarpine |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-9 | Spring Scissors for Tracheostomy |
| Sterile Saline Solution | Medline | RDI30296H | Saline |
| Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | Curved Forceps |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Straight Forceps |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | Blunt Forceps |
| Fine Scissors- Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Dissection Scissors |
| Microhematocrit Heparinized Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22362566 | Capillary tubes |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh | N/A | Refresh Lacri-Lube |
| Goat polyclonal anti-Nkcc1 | Santa Cruz Biotech | SC-21545 | Nkcc1 Antibody |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | DAPI |
| GraphPad Prism | GraphPad | ver6.0 | Statistical Software |
| Cotton tipped applicator | Medline | MDS202000 | Applicator for eye ointment |
| 0.5cc Insulin Syringe, 29G x 1/2" | BD | 7629 | Syringe for intraperitoneal injection |
References
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