Summary
Der mangler en væsentlig lever donor, og kriterier for leveren er blevet udvidet. Normothermic ex vivo lever perfusion (NEVLP) er blevet udviklet for at evaluere og redigere organfunktion. Denne undersøgelse viser en rotte model af NEVLP og tester pegyleret-katalase, evne til at afbøde lever bevarelse skade.
Abstract
Der findes en betydelig mangel på leveren allografts til transplantation, og svar er blevet udvidet, donor kriterierne. Som et resultat, der er indført normothermic ex vivo lever perfusion (NEVLP) som en metode til at evaluere og redigere organfunktion. NEVLP har mange fordele i forhold til hypotermiske og subnormothermic perfusion herunder reduceret bevarelse skade, genoprettelse af normale organfunktion fysiologiske betingelser, vurdering af orgel ydeevne, og som en platform for orgel reparation , ombygning og modifikation. Både murine og svin NEVLP modeller er blevet beskrevet. Vi demonstrere en rotte model af NEVLP og bruge denne model til at vise en af sine vigtige applikationer – brug af en terapeutisk molekyle føjet til leveren perfusate. Katalase er en endogen reaktive ilt arter (ROS) skyllevæske og har vist sig for at mindske iskæmi-reperfusion i øjet, hjernen og lungekræft. Pegylation har vist sig at målrette katalase til endotelet. Her, vi tilføjet pegyleret-katalase (PIND-kat) til den base perfusate og demonstreret sin evne til at afbøde lever bevarelse skade. En fordel ved vores gnaver NEVLP model er, at det er billigt i forhold til større dyremodeller. En begrænsning af denne undersøgelse er, at det ikke i øjeblikket omfatter efter perfusion levertransplantation. Derfor, forudsigelse af funktionen efter organtransplantation kan ikke stilles med sikkerhed. Men rat levertransplantation model er veletableret og sikkert kunne bruges sammen med denne model. Afslutningsvis har vi påvist en billig, enkel, let replikerbar NEVLP model ved hjælp af rotter. Anvendelser af denne model kan omfatte testning roman perfusates og perfusate tilsætningsstoffer, test software designet for orgel evaluering og forsøg på at reparere organer.
Introduction
Der er 14,578 patienter på ventelisten til levertransplantation og cirka 7.000 transplantationer udføres pr. år1,2. Som svar på denne betydelige donor knaphed, har kriterierne for leveren donorer udvidet; disse er ofte omtales som marginale organer eller udvidede kriterier donorer og forventes at udføre mindre godt efter transplantation end standard kriterier allografts, med højere satser for primære graft dysfunktion og forsinket graft funktion3, 4,5,6. Som et resultat, der er indført NEVLP som en metode til at evaluere og redigere orgel funktion6,7. Vi har designet en rotte model af NEVLP og anvendt denne model til at vise en af sine vigtige potentielle applikationer – afprøvning af roman molekyle tilsætningsstoffer til leveren perfusate.
NEVLP er blevet evalueret i både murine (rotte) og Porcin modeller samt i kasserede menneskelige organer6,8,9. Resultaterne af de første humane forsøg af NEVLP har også for nylig blevet offentliggjort10. Selvom hypotermiske maskine perfusion er klart blevet standard for nyre bevarelse, er temperaturen på hvilke lever apparat perfusion skulle opstå stadig kontroversielt. NEVLP har mange foreslåede fordele i forhold til hypotermiske og subnormothermic perfusion. Disse omfatter reduceret bevarelse skade, genoprettelse af normale organfunktion under fysiologisk forhold, evnen til at vurdere orgel ydeevne, og som en platform for orgel reparation, ombygning og ændring7,11, 12,13,14,15,16,17.
Et betydeligt antal undersøgelser er blevet gennemført ved hjælp af svin NEVLP modeller. Selv om disse modeller er forholdsvis billige, når overvejer modeller ved hjælp af kasseret menneskelige organer eller humane kliniske forsøg, er de meget dyre i forhold til vores lille dyremodel for NEVLP. En betydelig del af den pr. eksperiment koster perfusate. Vi er i stand til at fuldføre en 4 h perfusion med 300 mL af perfusate til en relativt lav pris. Derudover er udgifterne til små dyr herunder rotter meget lav i forhold til prisen på svin.
I forhold til andre modeller af NEVLP i rotter, model præsenteres her er forholdsvis enkelt at implementere og har en bred vifte af applikationer. Perfusion kredsløb kan ses i figur 1. Perfusate starter i perfusate reservoir (1), som er en dobbeltvægget vandbeholder. Perfusate er trukket fra reservoiret af en rulle pumpe (2) og skubbet ind i en windkessel (3) og derefter oxygenator (4). Oxygenator er sat til modstrøms gas og perfusate flow til at give maksimal gasudveksling. Perfusate derefter provenuet til en opvarmning spole (5) indersiden perfusion herhen for at sikre, at det er ved fysiologisk temperatur, og en boble fælden (6) at forhindre perfusion af luftbobler der er før orgel (7) og post orgel (8) prøve havne, som tillader perfusate at være stikprøven. I perfusate indtaster derefter leveren via portalen vene kanyle. Portalen vene kanyle er knyttet til et pres skærm, der kortlægger værdier på data collection software. Perfusate derefter afslutter lever gennem IVC kanyle og flyder ud i pres equalizer blok (9). Endelig, perfusate er trukket fra pres blok tilbage gennem rulle pumpe og tømmes i reservoiret. Denne model omfatter kontinuerlig perfusion til Vena og udelader pulsatile strømmen til hepatisk arterie og dialyse bruges i nogle andre modeller, som hver kræver en særskilt og supplerende kredsløb, men har tidligere vist sig ikke at være kræves9,13.
For at udforske tilføjelsen af en ny terapeutisk molekyle til perfusate, valgte vi enzymet katalase. Katalase er en endogen ROS skyllevæske, der er en del af celler intern forsvar mekanisme til at afbøde virkningerne af ROS18. Katalase udtryk er øget hepatisk iskæmi reperfusion skade19. Eksperimentelle tilsætning af katalase har vist sig for at mindske iskæmi-reperfusion i øjet, hjernen og lungekræft20,21,22,23,24. Pegylation har vist sig at målrette katalase endothelium og støtte i katalase optagelse i endothelial celler25. PIND-kat er blevet administreret systemisk med begrænset virkning på reduktion af hepatisk iskæmi-reperfusion skade; men vi hypotese at tilføje PIND-kat til et isoleret organ perfusion kredsløb vil føre til forbedrede resultater26,27,28. Her, vi tilføje PIND-kat til vores base perfusate og demonstrere sin evne afbøde lever bevarelse skade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer er udført efter retningslinjerne for den institutionelle Animal Care og National Research Council's Guide for human pleje og brug af laboratoriet dyr (IACUC) og har undergået godkendelse af Ohio State University IACUC udvalg.
1. indledende opsætning
-
Forberede perfusion løsning ved at kombinere følgende: 86 mL 25% albumin, 184 mL af Williams' medier, 30 mL af penicillin/streptomycin (10 U/mL penicillin og 0,01 mg/mL streptomycin), insulin (50 U/L), heparin (0,01 U/mL), L-glutamin (0,292 g/L), og hydrocortison (0.010 g/L) til en samlet maengde paa 300 mL. Base perfusate og PIND-kat gruppe, tilføje 625 U/mL af PEG-kat.
- Buffer perfusate løsning ved hjælp af tris (hydroxymethyl) aminomethane (THAM) til pH 7,4. Brug en arterielt blod gas maskine til at bekræfte perfusate pH.
-
Nedsat kredsløb (figur 1).
- Tænd vandbadet varmere og Indstil det til 37 ° C. Tillad orgel kammer at varme op.
- Hæld den blandet og "buffered" perfusate i reservoiret og starte omsætning.
Bemærk: Perfusate er nævnt i dette trin blev udarbejdet i trin 1.1.1. - Tænd den iltning gas (95% ilt og 5% kuldioxid) til tælleren flow gennem rækkemotor oxygenator.
- Slå data collection software og klik på "start" for at registrere for varigheden af forsøget.
-
Konfigurer den kirurgisk mikroskop og operationsstuen (figur 2).
- Slå alle udstyr herunder opvarmning bestyrelsen, Elektrokauterisation, og anæstesi og vitale tegn (heart rate og oxygen mætning) overvågningsudstyr.
Bemærk: Indstillingerne mikroskop vil variere baseret på mikroskop bruges og kan justeres til brugerens komfort. - Fylde 10 mL anæstesi sprøjten med 10 mL flydende isofluran til inhalation (Molekylær vægt 184.5 g/mol) og placere i anæstesi enhed.
- Placer en 0,5 mL sprøjte af heparin (50 U), de kirurgiske instrumenter, 4-0 og 7-0 silke sutur, sterile bomuld svaberprøver og 4 cm x 4 cm ikke-vævede gaze svampe korrekt (figur 2).
- Slå alle udstyr herunder opvarmning bestyrelsen, Elektrokauterisation, og anæstesi og vitale tegn (heart rate og oxygen mætning) overvågningsudstyr.
- Forberede isofluran kammer.
2. induktion af anæstesi
- Bære den følgende personlige værnemidler (PPE): kirurgisk maske, kirurgiske handsker, engangs kjole.
- Veje rotten.
Bemærk: Vi bruger Sprague-Dawley rotter mellem 250-350 g. - Tænd for ilt kompressor og isofluran. Placere rotten, efter bliver vejet ind i isofluran kammeret og sikre låget. Fremkalde anæstesi ved hjælp af 6% isofluran leveres med 2 L/min ilt.
Bemærk: Den nøjagtige isofluran dosis anvendes vil afhænge af den specifikke anæstesi system bliver brugt. - Brug elektroniske neglesaks til klip dyrets abdominal hår.
- Erstatte dyret i isofluran kammer.
- Drej på anæstesi enhed beliggende på operationsstuen.
- Fjerne rotten fra isofluran kammer, når anæstesi er fuldt induceret. Bekræfte dybde af anæstesi ved hjælp af en tå knivspids.
3. udbudsprocedure
-
Forberede 16 G portal manchet (figur 3).
- Begynde med en 16 G angiocatheter. Skære en 7 mm sektion af slangen. Bestemme midtpunktet af afsnittet 7 mm ved at måle 3,5 mm. Incise ved midtpunktet og fjerne den forreste halvdel af slangen.
- Brug en hemostat til at knuse denne nu flade del. Bruge en lighter til at smelte anden enden af angiocatheter til at oprette en læbe. Placer ikke spidsen direkte ind i flammen, eller det vil antænde.
-
Forberede galdegang kanyle.
- Tage en 27 G angiocath og afskære injektion port forlader kun kateteret. Tilslut det til en 10 cm sektion af 27 G cannular slanger.
- Placere rotten med sin næse i anæstesi næsen kegle, og dens fire ekstremiteter immobiliseret. Overvåge de vitale tegn ved at tilslutte skærmen til den venstre bagben ende. Udføre en tå knivspids for at bekræfte passende dybde af anæstesi. Fortsætte anæstesi på 4% isofluran (for dyr, der vejer > 250 g).
- Spray dyrets maven med 70% isopropylalkohol. Lad det tørre. Placer en steril drapere over dyret.
- Gøre en midterlinjen snit formet som et sværd til pubis bruger skarpe saks og udvide gennem huden (figur 4). Forsigtigt Angiv bughinden og incise musklen. Sørge for at undgå at beskadige blære i ringere aspekt af dette indsnit og lever i den overlegne aspekt af dette indsnit.
- Udvide incision lateralt til venstre og højre til at danne et kors på niveau med den ringere kanten af leveren.
- Drej anæstesi til 2% (for dyr vejer > 250 g).
- Trække formet som et sværd proces ved hjælp af en buet myg klemme og ribben ved hjælp af rib retraktorer (figur 5).
- Skære falciform, phrenic, og gastrohepatiske ledbånd med en skarp saks.
- Find og slips-off den phrenic vene med en 7-0 sutur som tæt på oprindelsesstedet som muligt for at undgå utæt.
- Rense rotte ved hjælp af en steril fugtede bomuld spids applikator og Pak tarmen ind i gaze fugtet med 0,9% normal saltvand. Passe på ikke for at strække Vaskulaturen af tyndtarmen.
- Dissekere over den ringere vena cava (IVC) at fjerne overskydende væv. Dissekere bag IVC bare overlegen til tvedeling og passere en løkke af en 4-0 silke sutur til senere brug (figur 6).
- Trække den højre nyre for at give eksponering til højre binyre vene. Trække den højre lap af leveren overlegent med gaze. Tie off den højre binyre vene med en 7-0 silke sutur så tæt på IVC som muligt og ætse på tværs af det distalt for uafgjort (figur 7).
- Omhyggeligt dissekere ud i milt vene, binde det ud ved hjælp af to 7-0 silke suturer og går på tværs af det mellem de to suturer.
- Tie off og ligate yderligere blodårer ved hjælp af 7-0 silke sutur for ekstra længde på Vena, hvis nødvendigt.
Bemærk: Der er nogle gange små grene af infrahepatic IVC mellem den højre binyre vene og ringere leveren. - Dissekere omkring den gastroduodenale arterie, binde off den gastroduodenale arterie med en 7-0 silke sutur og ligate den gastroduodenale arterie.
- Dissekere omkring hepatisk arterie og derefter placere en 7-0 silke sutur slips omkring det (figur 8).
-
Dissekere ud galdegang.
- Kontroller længden af galdegang. Tie off galden kanalen i den distale ende ved hjælp af en 7-0 silke sutur. Placer en løkke af en 7-0 silke sutur omkring galdegang som proksimalt som muligt.
- Skær et hul, der er halvt diameter af kanalen med en lille saks og placere en 27 G kateter ind i galdegang proksimalt. Binde kateteret på plads ved hjælp af en romersk sandal slips sutur (figur 9).
- Indsprøjtes 0,5 mL af heparin (50 U) i penis vene eller IVC af dyret ved hjælp af en 27 G nål.
Bemærk: En 27 G insulin sprøjte kan også bruges i stedet. - Klemme og binde off IVC ved hjælp af de tidligere indsatte 4-0 silke sutur.
- Tie off leverens arterie ved hjælp af den tidligere placeret 7-0 silke sutur.
- Klemme off Vena ved hjælp af en microsurgical klip. Kanyleres portalen vene ved hjælp af en 22 G angiocatheter. Skyl blanches portåren med 60 mL koldt 0,9% normal saltvand med 1 mL heparin (100 U) indtil leveren (figur 10).
Bemærk: Hvis leveren ikke Blancher umiddelbart kan det være masseres med steril bomuld tip applikatorer. - Udsætte suprahepatic IVC og går på tværs af det så højt i brystet som muligt.
- Udføre en hepatectomy som følger. Skær omkring mellemgulvet, skære leverens arterie, skære IVC, skåret Vena, skære enhver yderligere ledbånd, og tage leveren. Placer leveren i is koldt 0,9% normal saltvand (Figur 11).
- Placer en 16 G vaskulære manchet i portåren (figur 12). Placer leveren på ex vivo normothermic lever perfusion kredsløb.
4. Ex Vivo Normothermic lever Perfusion
Bemærk: Perfusate brugt her blev udarbejdet i protokollen trin 1.1.1.
- Placer portåren kanyle ind i cuffed portal vene (Figur 13).
- Portalen vene kanyle placering, opretholde strømmen af perfusate gennem kredsløb på 2 mL/min. til start. Watch skærm for eventuelle stigninger i portåren pres; Dette kan indikere fartøjet har blive tilstoppet og Repositionering af kanylen er nødvendig.
- Sutur i IVC tungeholder til vende tilbage strømmen af perfusate ved hjælp af en 7-0 silke sutur.
- Når begge cannulas er på plads, begynde at dreje op for strømmen ved 1 mL/min., indtil en fysiologisk pres i rækken af 10 – 16 cmH2O er nået.
-
Tage en 1 mL prøve fra før og efter havne på 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 og 240 min af perfusion. Opdele 1 mL prøve i to 0,5 mL prøver.
Bemærk: 0,5 mL af dette vil blive brugt i protokollen trin 4.5.1 og 0,5 mL vil blive brugt i protokollen trin 4.5.2.- Snap fryse 0,5 mL af dette eksempel i kryogene rør i flydende kvælstof.
- Køre en arterielt blod gas analyse ved hjælp af de resterende 0,5 mL af perfusate.
- Efter at have kørt blod gas analyse for hvert tidspunkt (0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 og 240 min) undersøge pH niveauer og buffer til perfusate efter behov for at vende tilbage til pH 7,4.
- Ved afslutningen af 4 h af perfusion, afbryde leveren fra perfusion kredsløb. Opdele leveren i 0,5 g segmenter. Snap fryse levervæv i kryogene rør i flydende kvælstof.
5. efter eksperiment analyse
-
Bestemme alanin aminotransferase (ALT) niveau i perfusate på 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 og 240 min. ved hjælp af en kommerciel kolorimetriske assay kit.
- Kort sagt, Ruger perfusate med reaktionen mix reagenser ved 37 ° C i 60 min. foranstaltning ekstinktionen værdier på 570 nm med en mikrotiterplade læser.
-
Homogeniseres 0,5 g af levervævet med 100 µL af lysisbuffer og analysere væv lysate for adenosin trifosfat (ATP), glutathion (GSH) og malondialdehyde (MDA).
- Kort sagt, måle ATP niveauet af levervævet prøver ved hjælp af en kommerciel assay kit. Proeven blandes med reaktion buffer og inkuberes ved stuetemperatur i 30 min. foranstaltning ekstinktion ved 570 nm med en mikrotiterplade læser.
- Måle GSH niveauer af levervævet prøver ved hjælp af en kommerciel assay kit. Bland vævsprøver med assay cocktail. Måling af ekstinktionen værdier på 405-414 nm.
- Måle MDA niveauer af levervævet prøver ved hjælp af en kommerciel assay kit. Bland prøverne med TBA og opvarmes til 95 ° C i 60 min. Centrifuge reaktant og overføre supernatanten til en 96-brønd plade. Måle den optisk tæthed på 532 nm.
-
Homogeniseres 0,5 g af levervævet med 100 µL af lysisbuffer og analysere væv lysate til relative caspase-3/7 aktivitet ved hjælp af en kommerciel assay kit.
- Bland væv lysate med analysebuffer caspase-3-7 reagens og inkuberes ved stuetemperatur i 30 min.
- Måle niveauet fluorescens i hver brønd med en mikrotiterplade læser.
-
Bestemme graden af de apoptotiske celler i leveren vævsprøver ved hjælp af en kommerciel i situ død detection kit.
- Pre behandle 0,5 g væv sektioner med 10 U/mL Proteinase K i 10 min og derefter inkuberes med reaktionsblanding ved 37 ° C i 60 min. udføre analyse ved hjælp af et mikroskop for fluorescerende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En stikprøvestørrelse på tre rotter pr. gruppe blev brugt. ALT blev målt til 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 og 240 min af perfusion. Vi anvendte Student's t-test for at sammenligne resultater mellem base perfusate og base perfusate plus PIND-kat grupper på hvert tidspunkt. Sammenligning af base perfusate og base perfusate plus PIND-kat grupper, der er betydeligt mindre (p < 0,05) ALT i base perfusate plus PIND-kat gruppe på 150, 180, 210 og 240 min (figur 14A).
Levervævet var indkøbt for at analysere vævsskader fra både base perfusate og base perfusate plus PIND-kat grupper. Vi anvendte Student's t-test for at sammenligne resultater mellem base perfusate og base perfusate plus PIND-kat grupper. Væv ATP blev opretholdt i den base perfusate plus PIND-kat gruppe i forhold til gruppen base perfusate alene (figur 14B, p < 0,05). Væv MDA produktion var betydeligt højere i base perfusate gruppen end i base perfusate plus PIND-kat gruppe (figur 14C, p < 0,05). Samlede GSH blev opretholdt i den base perfusate plus PIND-kat gruppe i forhold til gruppen base perfusate alene (figur 14D, p < 0,05).
For at analysere apoptose, sammenlignet levervæv caspase 3/7 aktivitet mellem grupperne. Fluorescens blev målt i hver brønd. Vi anvendte Student's t-test for at sammenligne resultater mellem base perfusate og base perfusate plus PIND-kat grupper. Caspase 3/7 aktivitet var faldt betydeligt i den base perfusate plus PIND-kat gruppe i forhold til gruppen base perfusate alene (figur 15A, p < 0,05). Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dUTP Nick-ende mærkning (TUNEL) farvning blev brugt til at sammenligne apoptose mellem grupperne. Procentdelen af apoptotiske celler var betydeligt mindre i base perfusate plus PIND-kat gruppe i forhold til base perfusate alene gruppe (figur 15B, p < 0,05).
Figur 1: Perfusion kredsløb. Komponenter i kredsløbet er mærket. Perfusate starter i perfusate reservoir (1), som er en dobbeltvægget vandbeholder. Perfusate er trukket fra reservoiret af en rulle pumpe (2) og skubbet ind i en windkessel (3) og derefter oxygenator (4). Oxygenator er sat til modstrøms gas og perfusate flow til at give maksimal gasudveksling. Perfusate derefter provenuet til en varmespiral (5) inde perfusion herhen for at sikre, at det er ved fysiologisk temperatur, og en boble fælden (6) at forhindre perfusion af luftbobler. Der er før orgel (7) og post orgel (8) prøve havne, som tillader perfusate at udtages. I perfusate indtaster derefter leveren via portalen vene kanyle. Portalen vene kanyle er knyttet til en monitor, pres, som regulerer trykket equalizer (9). Endelig, perfusate er trukket fra pres blok tilbage gennem rulle pumpe og tømmes i reservoiret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: operationsstuen og kirurgisk instrument set-up. Den kirurgisk mikroskop (1) bør justeres til den passende højde og forstørrelse for brugeren. Isofluran kan være forudinstalleret i anæstesi maskine (2). Dyrets næse er placeret i næsen kegle (3). Kirurgiske instrumenter bør fastsættes ud af, hvor de kan være let adgang til (4). At have Elektrokauterisation (5) i nærheden er nyttigt. Suturer (6) skal være præ-cut, så brikker kan opnås hurtigt når det er nødvendigt, og ekstra bør være tilgængelige (7). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: forberede 16 G portal vene manchet. Begynde med en 16 G angiocatheter. Skære en 7 mm sektion af slangen. Bestemme midtpunktet af afsnittet 7 mm ved at måle 3,5 mm. Incise her og fjerne den forreste halvdel af slangen. Brug en hemostat til at knuse denne nu flade del. Bruge en lighter til at brænde anden enden af angiocatheter til at oprette en læbe. Placer ikke spidsen direkte ind i flammen, eller det vil antænde. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: midterlinjen indsnit. Gøre en midterlinjen snit formet som et sværd (1) til pubis (2) med skarpe saks og strækker sig gennem hud og muskel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: få tilstrækkelig retraktion. Trække formet som et sværd proces (1) med en buet myg klemme (2) og ribben ved at anbringe rib retraktorer (3, 4). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: ringere vena cava (IVC) dissektion. Flip lever op til expose til højre nyre (1) og portal vene (2). Dissekere omkring IVC (3) og placere en løkke af 7-0 sutur til fremtidig brug. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: ligatur af den højre binyre vene. Trække den højre nyre (1) for at give eksponering til højre binyre vene. Tie off højre binyre venen og går på tværs af det. En fugtet gaze (2) kan bruges til at beskytte leveren under denne manøvre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: hepatisk arterie dissektion. Dissekere rundt og Placer et slips omkring hepatisk arterie (1) i nærheden af hvor den passerer under Vena (2). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: galdegang cannulation. Cannulate galdegang (1) ved hjælp af 27 G angiocatheter (2) tilsluttet 27 G slangen (3). Dette vil bidrage til at indsamle galden under perfusion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10: leveren flush. Skyl leveren (1) med 60 cc af kolde 0,9% normal saltvand med 100 U (1 mL) af heparin ved hjælp af en 16 G angiocatheter (2). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 11: efter hepatectomy. Udføre en hepatectomy og placere leveren i kolde saltvand. Passe på ikke for at løsne galdegang kanyle. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 12: Portal vene infiltration. Find Vena. Brug en stor klemme (1) til at holde op venen forlader en flere millimeter-læbe af vene over klemmen. Bruge microsurgical pincet (2, 3) for at placere en 16 G vaskulære manchet (4) i portalen vene. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 13: Portal vene manchet og overlegen IVC cannulation. Kanyleres portalen vene manchet (1) og overlegen IVC (2). Stor omhu skal tages ikke til dislodge galdegang kanyle (3). Desuden passe på ikke for at vride den overlegne IVC. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 14: analyse af vævsskader i base perfusate-only og base perfusate og plus PIND-kat grupper (N = 3 eller gruppe). Fejllinjer udgør standardafvigelse. (A) alanin aminotransferase (ALT) niveauer. Sammenligne ALT niveauer mellem base perfusate og base perfusate plus pegyleret-katalase (PIND-kat) gruppe, der er betydeligt mindre ALT i base perfusate plus PIND-kat gruppe på 150, 180, 210 og 240 min (p < 0,05). (B) adenosin trifosfat niveauer. Væv adenosintrifosfat (ATP) blev opretholdt i den base perfusate plus PIND-kat gruppe i forhold til gruppen base perfusate alene (p <0,05). (C) Malondialdehyde niveauer. Væv malondialdehyde (MDA) produktion var betydeligt højere i base perfusate gruppen end i base perfusate plus PIND-kat gruppe (p < 0,05). (D) glutathion niveauer. Samlede glutathion (GSH) blev opretholdt i den base perfusate plus PIND-kat gruppe i forhold til gruppen base perfusate alene (p < 0,05). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 15: analyse af apoptose i base perfusate-only og base perfusate og plus PIND-kat grupper (N = 3 eller gruppe). Fejllinjer udgør standardafvigelse. (A) Caspase-3/7 Activity.Caspase 3/7 aktivitet var faldt betydeligt i den base perfusate plus PIND-kat gruppe i forhold til gruppen base perfusate alene (p < 0,05). (B) Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dUTP Nick-ende mærkning (TUNEL) farvning. Billeder blev taget med en 4 X fluorescerende mikroskop. Procentdelen af apoptotiske celler var betydeligt mindre i base perfusate plus PIND-kat gruppe i forhold til base perfusate (p < 0,05). Grøn: apoptotiske celler. Blå: nukleare. Skalere barer = 1.000 µm. TUNEL positive celler blev kvantificeres ved at tælle celler fra 4 tilfældige mikroskopiske felter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der findes en betydelig mangel på leveren allografts til transplantation og svar donor kriterier har været udvidet1,2,3,4,5. Som følge af mangel på donor er NEVLP blevet indført som en metode til at evaluere og redigere orgel funktion6,7. Vi har designet en rotte model af NEVLP. Desuden, vi har brugt denne model for at vise en af sine vigtige potentielle anvendelser — prøvning af roman molekyle tilsætningsstoffer til leveren perfusate. Her, vi tilføjet PIND-kat til den base perfusate og demonstreret sin evne til at afbøde lever bevarelse skade.
Kritiske trin
Leveren perfusion kredsløb blev købt og anvendes uden ændringer. Banen kan være visualiseret i figur 1. Perfusate reservoir anvendte er en water-jacketed objektbeholder, der bruges til at holde perfusate ved fysiologisk temperatur. Fra reservoiret trækkes perfusate af en rulle pumpes og skubbet ind i en windkessel kammer. Parlamentet bidrager til at dæmpe den pulsatile flow af perfusate og gøre det mere laminar for indrejse i orgel. Efter windkessel kammer perfusate strømme til oxygenator. Oxygenator er indstillet til modstrøms gas og perfusate flow giver maksimal gasudveksling til perfusate med 95% ilt. Den perfusate derefter provenuet til en varmespiral til at sikre, at det er stadig ved fysiologisk temperatur. En boble fælde lige før orglet forhindrer perfusion af luftbobler. Perfusate er derefter pumpes ud af boblen fælde og gennem Vena kanyle ind i leveren. Portalen vene kanyle har en lille gren ud af det for pres skærm. Slanger til sensoren bør klargøres med væske ikke luft, så er der ingen tab af pres på sensoren. Efter oxygenating orglet, perfusate flyder ud af leveren gennem ringere vene kanyle til et pres equalizer. Pres equalizer blok hjælper med at forhindre over opretholdelse tryk i hovedbrandledningssystemet kredsløb eller orgel. Endelig, perfusate er trukket fra pres blok tilbage gennem rulle pumpe og tømmes i reservoiret.
Før du begynder hver perfusion bør besigtigelse af kredsløbet udføres for at identificere skader eller oprustning på kredsløb komponenter eller slanger. Hvis der er en ophobning af bakterier eller andre stoffer på kredsløb, bør dele udskiftes eller rengøres, hvis det er muligt. Dernæst bør rengøringsmiddel opretholde de interne komponenter skylles. Da komponenterne er ved at blive skyllet ud pres sensor og pres linje skal være renset for eventuelle luftbobler med deioniseret vand. Også, flow bør tilpasses med jævne mellemrum for at sikre, trykket læsning reagerer passende ændringer. Hvis pres sensor ikke svarer korrekt, bør alle elementer i linjen til sensoren kontrolleret og justeret hvis nødvendigt. I starten af en perfusion er det afgørende at sikre fartøjer af leveren ikke bliver snoet eller snoet ved tilslutning leveren til kredsløbet. Hvis dette er sket der vil en øjeblikkelig pres spike ses på skærmen i en logaritmisk tendens. De mest almindelige fejl er en knækket i portåren med et dårligt placerede kanyle. Dette problem kan løses ved at flytte fartøjet ind i en mere naturlig position ved at trække det lidt ud og glatning Vena. Pres skærmen angiver løsning af dette problem med et fald i trykket og forbedret sammenhæng. Næste, ved tilslutning af portalen vene manchetten til Vena kanyle fartøjet kan blive snoet hindrer perfusion af orglet. Justering af manchetten og korrigere denne fejl vil resultere i en pludselig stigning i portåren pres, der bør derefter straks tilbage til et lavere tryk og niveau ud på en konsekvent strøm. En bøjet eller snoet IVC kan hurtigt identificeres ved ingen flow fra kanylen og en eventuel udbuling af fartøjet. Begge disse fejl i vena cava vil også resultere i en øget pres, men i modsætning til Vena problemer dette pres er udøvet på orgel og skal løses hurtigt. Problemet skal løses inden for 10 min eller eksperimentet skal annulleres. En umiddelbar indikation for annullering af eksperimentet er at se klart ødem i organ inden for de første 20 min.
Hvis der er en lækage fra leveren eller fra en af kanylen forbindelser vil det være vigtigt at overvåge perfusate reservoir niveau. Kører ud af perfusate og pumpe luft kan være katastrofale til eksperimentet. Når luft er pumpet ind i linjerne er det ikke muligt at afbryde forsøget og re prime slanger linjer. Den eneste mulige korrektion er til boble fælden at fange den injicerede luft.
Ændringer og fejlfinding
Når kredsløbet er skyllet oxygenator kan sættes i kø og derefter kredsløbet kan være grundes med perfusate. Korrekt udrensning luft fra oxygenator kan tage et par min, men er et afgørende skridt i at sikre emboli luft ikke genereres midt i en perfusion. Efter oxygenator er fuldt grundes med perfusate boble fælden skal fyldes ud for fange eventuelle luftbobler, der udgør. På dette tidspunkt bør kredsløb flow indstilles til en strøm af 1 eller 2 mL/min. til at holde perfusate flytte indtil leveren er klar til cannulation.
Efter cannulating Vena og IVC af leveren, bør trykket stige og derefter niveau. Da flow er øget til en normal fysiologisk pres bør indspillet presset begynde at stige i en trinvis ensartet. Når den ønskede flow (8 – 16 mmHg) har opnået presset skal fortsat være nogenlunde konstant. Vi sigter efter et tryk på 10 mmHg og justere strømmen i overensstemmelse hermed. Den nødvendige flow at nå frem til et tryk på 10 mmHg kan variere efter orgel. Der kan være en lille lækage af perfusate fra orglet men denne perfusate kan indsamle og returnerede til reservoiret.
Kredsløbet skal rengøres efter hver perfusion at opretholde kammer og reservoir og bevare den disponible slanger og havne. Alle perfusate skal fjernes fra kredsløbet. Kredsløbet skal tømmes straks med et minimum af 300 mL deioniseret vand. Mens den deioniseret vand skyller kredsløb slangen skal de ydre dele rengøres korrekt. Eksterne komponenter bør skylles eller forsigtigt aftørre og tilladt til luft tørre. Kredsløb komponenter er skrøbelige og kan blive beskadiget nemt. Det er derfor af største vigtighed at rense det forsigtigt. De interne kredsløb bør bevares i en 5% opløsning af alkalisk rengøringsmiddel i ionbyttet vand når den ikke er i brug. Vaskemiddel i kredsløbet hjælper med at forlænge levetiden af slangen og forhindre oprustning på andre komponenter, såsom den boble fælde og pres equalizer.
De fleste problemer med kredsløb kan forebygges med grundig rengøring og vedligeholdelse af kredsløbet efter hver brug. Dette medvirker til at sikre, at der ingen oprustning af resterende perfusate, der kan føre til tilstoppede slanger eller cannulas. Kredsløb komponenter og slanger skal inspiceres regelmæssigt og erstattes efter behov før hver brug sørge for der er ingen forurening eller begrænsning i flow.
Begrænsninger
En begrænsning af dette lille dyrs NEVLP model er, at det ikke i øjeblikket omfatter efter perfusion transplantation. Det er derfor umuligt at vurdere lever graft funktion efter transplantation. Dette er et vigtigt område for fremtidig forskning. Desuden kræver udnytter de små dyr kredsløb både viden og færdighed.
Betydning med hensyn til eksisterende modeller
Svin og murine (rotte) modeller af hypotermiske, subnormothermic og normothermic ex vivo lever perfusion er blevet beskrevet i litteraturen. Selv om kontroversen stadig eksisterer vedrørende perfusion temperatur, har det vist sig, at maskinen perfusion kan forbedre funktionen af leveren grafts uanset temperatur9. Den NEVLP model præsenteres her er enkel, let replikerbar, lav pris, og har en bred vifte af applikationer. Denne model omfatter ikke dialyse eller pulsatile flow til leverens arterie, som findes i nogle andre modeller, som de har vist sig at være unødvendigt9,13. Endvidere, resultaterne af de første humane forsøg ved hjælp af NEVLP har vist at det er en effektiv metode til leveren bevarelse — derfor, denne model er ideel til at teste fremtidige anvendelser af ex vivo lever perfusion10.
Fremtidige ansøgninger
En bred vifte af fremtidige ansøgninger om NEVLP er blevet foreslået i litteraturen. Hver af disse skal være metodisk testet i dyremodeller inden prøvningen kasserede organhandel og derefter i menneskets lever. Modellen præsenteres her er ideel til teste disse roman fremtidige programmer, da det er nemt replikerbar, eliminerer uvedkommende trin og er billigt. En af de vigtigste potentielle anvendelser af denne model er den vist her - afprøvning af nye farmakologiske perfusate tilsætningsstoffer. Andre foreslåede anvendelser omfatter reparation af beskadigede organer, affedtende af lever for at tillade transplantation af steatotic organer, indførelsen af hepatitis C virus modstand, mesenkymale stamcelleterapi, gen modifikation og perfusion med immunsupprimerende agenter11,31,32,33,34,35,36,37,38.
Konklusioner
Afslutningsvis har vi påvist en billig, let replikerbar NEVLP model ved hjælp af rotter. Brug af denne model kræver forsigtig forberedelse, praksis og viden, men kan gennemføres til en lav pris. Anvendelser af denne model kan omfatte test roman perfusate tilsætningsstoffer, som blev påvist i de repræsentative resultater. Yderligere anvendelser af denne model kan omfatte test software designet for orgel evaluering, forskellige perfusates, og kunstige eller hæmoglobin-baserede ilt luftfartsselskaber og agenter designet reparation organer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere rapporterer, at de har ingen relevante oplysninger.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH T32AI 106704-01A1 og T. Flesch fond for organtransplantation, Perfusion, teknik og Regeneration ved The Ohio State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusate | |||
| 8% Albumin | CLS Behring, King of Prussia, PA | 0053-7680-32 | |
| Williams Media | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | W1878 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | P4333 | |
| Insulin | Eli Lilly, Indianapolis, IL | 0002-8215-91 | |
| Heparin | Fresnius Lab, Lake Zurich, IL | C504701 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | G3126 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | H0888 | |
| THAM | Hospira, Inc, | 0409-1593-04 | |
| Polyethylene Glycol - Catalase | Sigma Aldrich | S9549 SIGMA | |
| Personal Protective Equipment | |||
| Surgical Mask | Generic | N/A | |
| Protective Gown | Generic | N/A | |
| Surgical Gloves | Generic | N/A | |
| Liver Procurement | |||
| Sprague-Dawley Rat | Harlan Sprague Dawley Inc. | 250 -350 grams | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Charcoal Canisters | Kent Scientific | SOMNO-2001-8 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | N/A | |
| Pressure-Lok Precision Analytical Syringe | Valco Instruments Co, Inc. | SOMNO-10ML | |
| Electrosurgical Unit | Macan | MV-7A | |
| Warming Pad | Braintree Scientific | HHP2 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
| Isoflurane chamber | Kent Scientific | SOMNO-0530LG | |
| SurgiVet | Isotec | CDS 9000 Tabletop | |
| Oxygen | Praxair | 98015 | |
| Rib retractors | Kent Scientific | INS600240 | |
| GenieTouch | Kent Scientific | GenieTouch | |
| Normal Saline | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
| 4x4 Non-Woven Sponges | Criterion | 104-2411 | |
| Sterile Q-Tips | Henry Schein Animal Health | 1009175 | |
| U-100 27 Gauge Insulin Syringe | Terumo | 22-272328 | |
| 5mL Syringe | BD | REF 309603 | |
| 4-0 Braided Silk Suture | Deknatel, Inc. | 198737LP | |
| 7-0 Braided Silk Suture | Teleflex Medical | REF 103-S | |
| 16 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4252586-02 | |
| 14 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4251717-02 | |
| Bile Duct Cannular Tubing | Altec | 01-96-1727 | |
| Liver Perfusion Circuit Components | |||
| Water Bath Warmer | Lauda Ecoline Staredition | E103 | |
| Data Collection Software | ADInstruments | Labchart 7 | |
| Liver Perfusion Circuit | Harvard Apparatus | 73-2901 | |
| Membrane Oxygenator | Mediac SPA | M03069 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM827B | |
| Gas (95% oxygen and 5% carbon dioxide) | Praxair | 98015 | |
| Organ Chamber | Harvard Apparatus | ILP-2 | |
| 1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube | USA Scientific | 1418-7410 | |
| Mucasol | Sigma-Aldrich | Z637181 | |
| Microsurgical Instruments | |||
| Small Scissors | Roboz | RS-5610 | |
| Large Scissors | S&T | SAA-15 | |
| Forceps - Large Angled | S&T | JFCL-7 | |
| Forceps - Small Angled | S&T | FRAS-15 RM-8 | |
| Clip Applier | ROBOZ | RS-5440 | |
| Scissors - non micro | FST 14958-11 | 14958-11 | |
| Forceps - Straight Tip | S&T | FRS-15 RM8TC | |
| Large Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-02 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-03 | |
| Small Mosquito Clamps | Generic | N/A | |
| Post-Experiment Analysis | |||
| Alanine Aminotransferase (ALT) Activity Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K752 | |
| Adenosine Triphosphate (ATP) Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K354 | |
| Glutathione Assay Kit | Cayman Chemical | 703002 | |
| Lipid Peroxidation (MDA) Assay Kit | Abcam | ab118970 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8090 | |
| POLARstar OMEGA Microplate Reader | BMG LABTECH | N/A |
References
- Network, O. P. aT. National Data. Overall by Organ. Current U.S. Waiting List. Based on OPTN data as of October 19, 2017. , Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov/data/view-data-reports/national-data/# (2017).
- OPTN, O. P. aT. N. National Data, Transplants by Donor Type, U.S. Transplants Performed January 1, 1988 - December 31, 2016, For Organ = Liver. , Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov/data/view-data-reports/national-data/# (2017).
- Nemes, B., et al. Extended criteria donors in liver transplantation Part I: reviewing the impact of determining factors. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 827-839 (2016).
- Nemes, B., et al. Extended-criteria donors in liver transplantation Part II: reviewing the impact of extended-criteria donors on the complications and outcomes of liver transplantation. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 841-859 (2016).
- Pezzati, D., Ghinolfi, D., De Simone, P., Balzano, E., Filipponi, F. Strategies to optimize the use of marginal donors in liver transplantation. World J Hepatol. 7 (26), 2636-2647 (2015).
- Marecki, H., et al. Liver ex situ machine perfusion preservation: A review of the methodology and results of large animal studies and clinical trials. Liver Transpl. 23 (5), 679-695 (2017).
- Barbas, A. S., Knechtle, S. J. Expanding the Donor Pool With Normothermic Ex Vivo Liver Perfusion: The Future Is Now. Am J Transplant. 16 (11), 3075-3076 (2016).
- Dries, S., et al. Ex vivo normothermic machine perfusion and viability testing of discarded human donor livers. Am J Transplant. 13 (5), 1327-1335 (2013).
- Westerkamp, A. C., et al. End-ischemic machine perfusion reduces bile duct injury in donation after circulatory death rat donor livers independent of the machine perfusion temperature. Liver Transpl. 21 (10), 1300-1311 (2015).
- Selzner, M., et al. Normothermic ex vivo liver perfusion using steen solution as perfusate for human liver transplantation: First North American results. Liver Transpl. 22 (11), 1501-1508 (2016).
- Whitson, B. A., Black, S. M. Organ assessment and repair centers: The future of transplantation is near. World J Transplant. 4 (2), 40-42 (2014).
- Tolboom, H., et al. Subnormothermic machine perfusion at both 20°C and 30°C recovers ischemic rat livers for successful transplantation. J Surg Res. 175 (1), 149-156 (2012).
- Nagrath, D., et al. Metabolic preconditioning of donor organs: defatting fatty livers by normothermic perfusion ex vivo. Metab Eng. 11 (4-5), 274-283 (2009).
- Boehnert, M. U., et al. Normothermic acellular ex vivo liver perfusion reduces liver and bile duct injury of pig livers retrieved after cardiac death. Am J Transplant. 13 (6), 1441-1449 (2013).
- Schön, M. R., et al. Liver transplantation after organ preservation with normothermic extracorporeal perfusion. Ann Surg. 233 (1), 114-123 (2001).
- Reddy, S., et al. Non-heart-beating donor porcine livers: the adverse effect of cooling. Liver Transpl. 11 (1), 35-38 (2005).
- Banan, B., et al. Novel strategy to decrease reperfusion injuries and improve function of cold-preserved livers using normothermic ex vivo liver perfusion machine. Liver Transpl. 22 (3), 333-343 (2016).
- Held, P. An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in Cells. , BioTek Instruments, Inc. Vinooski, Vermont. 1-14 (2012).
- Chen, C. F., et al. Reperfusion liver injury-induced superoxide dismutase and catalase expressions and the protective effects of N-acetyl cysteine. Transplant Proc. 39 (4), 858-860 (2007).
- Chen, B., Tang, L. Protective effects of catalase on retinal ischemia/reperfusion injury in rats. Exp Eye Res. 93 (5), 599-606 (2011).
- He, Y. Y., Hsu, C. Y., Ezrin, A. M., Miller, M. S. Polyethylene glycol-conjugated superoxide dismutase in focal cerebral ischemia-reperfusion. Am J Physiol. 265 (1 Pt 2), H252-H256 (1993).
- Işlekel, S., Işlekel, H., Güner, G., Ozdamar, N. Alterations in superoxide dismutase, glutathione peroxidase and catalase activities in experimental cerebral ischemia-reperfusion. Res Exp Med (Berl). 199 (3), 167-176 (1999).
- Li, G., Chen, Y., Saari, J. T., Kang, Y. J. Catalase-overexpressing transgenic mouse heart is resistant to ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol. 273 (3 Pt 2), H1090-H1095 (1997).
- Nowak, K., et al. Immunotargeting of catalase to lung endothelium via anti-angiotensin-converting enzyme antibodies attenuates ischemia-reperfusion injury of the lung in vivo. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 293 (1), L162-L169 (2007).
- Beckman, J. S., et al. Superoxide dismutase and catalase conjugated to polyethylene glycol increases endothelial enzyme activity and oxidant resistance. J Biol Chem. 263 (14), 6884-6892 (1988).
- Yabe, Y., Nishikawa, M., Tamada, A., Takakura, Y., Hashida, M. Targeted delivery and improved therapeutic potential of catalase by chemical modification: combination with superoxide dismutase derivatives. J Pharmacol Exp Ther. 289 (2), 1176-1184 (1999).
- Yabe, Y., et al. Prevention of neutrophil-mediated hepatic ischemia/reperfusion injury by superoxide dismutase and catalase derivatives. J Pharmacol Exp Ther. 298 (3), 894-899 (2001).
- Ushitora, M., et al. Prevention of hepatic ischemia-reperfusion injury by pre-administration of catalase-expressing adenovirus vectors. J Control Release. 142 (3), 431-437 (2010).
- Kakizaki, Y., et al. The Effects of Short-Term Subnormothermic Perfusion after Cold Preservation on Liver Grafts from Donors after Cardiac Death: An Ex Vivo Rat Model. Transplantation. , (2018).
- Kumar, R., Chung, W. Y., Dennison, A. R., Garcea, G. Ex Vivo Porcine Organ Perfusion Models as a Suitable Platform for Translational Transplant Research. Artif Organs. , (2017).
- Nativ, N. I., et al. Liver defatting: an alternative approach to enable steatotic liver transplantation. Am J Transplant. 12 (12), 3176-3183 (2012).
- Yeung, J. C., et al. Ex vivo adenoviral vector gene delivery results in decreased vector-associated inflammation pre- and post-lung transplantation in the pig. Mol Ther. 20 (6), 1204-1211 (2012).
- Goldaracena, N., et al. Inducing Hepatitis C Virus Resistance After Pig Liver Transplantation-A Proof of Concept of Liver Graft Modification Using Warm Ex Vivo Perfusion. Am J Transplant. 17 (4), 970-978 (2017).
- Van Raemdonck, D., Neyrinck, A., Rega, F., Devos, T., Pirenne, J. Machine perfusion in organ transplantation: a tool for ex vivo graft conditioning with mesenchymal stem cells? Curr Opin Organ Transplant. 18 (1), 24-33 (2013).
- Pratschke, S., et al. Results of the TOP Study: Prospectively Randomized Multicenter Trial of an Ex Vivo Tacrolimus Rinse Before Transplantation in EDC Livers. Transplant Direct. 2 (6), e76 (2016).
- Pratschke, S., et al. Protocol TOP-Study (tacrolimus organ perfusion): a prospective randomized multicenter trial to reduce ischemia reperfusion injury in transplantation of marginal liver grafts with an ex vivo tacrolimus perfusion. Transplant Res. 2 (1), 3 (2013).
- Nativ, N. I., et al. Elevated sensitivity of macrosteatotic hepatocytes to hypoxia/reoxygenation stress is reversed by a novel defatting protocol. Liver Transpl. 20 (8), 1000-1011 (2014).
- Lonze, B. E., et al. In vitro and ex vivo delivery of short hairpin RNAs for control of hepatitis C viral transcript expression. Arch Surg. 147 (4), 384-387 (2012).
