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Medicine

Ex वीवो Normothermic लिवर छिड़काव का एक छोटा सा एनिमल मॉडल

Published: June 27, 2018 doi: 10.3791/57541
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2, 1, 1, 3, 4, 2, 1,3, 1,2
1Collaboration for Organ Perfusion, Protection, Engineering and Regeneration (COPPER) Lab, Division of Transplant, Department of Surgery, Comprehensive Transplant Center, Ohio State University Wexner Medical Center, 2Department of Surgery, Division of Transplant, Ohio State University Wexner Medical Center, 3Department of Surgery, Division of CardioThoracic Surgery, Ohio State University Wexner Medical Center, 4Department of Medicine, Ohio State University Wexner Medical Center

Summary

वहां एक महत्वपूर्ण जिगर दाता की कमी है, और जिगर दाताओं के लिए मानदंड का विस्तार किया गया है । Normothermic ex vivo जिगर छिड़काव (NEVLP) का मूल्यांकन और अंग समारोह को संशोधित करने के लिए विकसित किया गया है. यह अध्ययन NEVLP के एक चूहे के मॉडल को दर्शाता है और pegylated-catalase की क्षमता का परीक्षण करता है, जिगर संरक्षण चोट को कम करने के लिए ।

Abstract

प्रत्यारोपण के लिए उपलब्ध जिगर allografts की एक महत्वपूर्ण कमी है, और जवाब में दाता मानदंड का विस्तार किया गया है । नतीजतन, normothermic पूर्व vivo जिगर छिड़काव (NEVLP) के मूल्यांकन और अंग समारोह को संशोधित करने के लिए एक विधि के रूप में पेश किया गया है । NEVLP hypothermic और subnormothermic छिड़काव की तुलना में कम संरक्षण चोट सहित कई फायदे हैं, शारीरिक स्थितियों के तहत सामांय अंग समारोह की बहाली, अंग प्रदर्शन के आकलन, और अंग की मरंमत के लिए एक मंच के रूप में , रिमॉडलिंग, और संशोधन । दोनों murine और सुअर का NEVLP मॉडल बताए गए हैं । हम NEVLP के एक चूहे के मॉडल का प्रदर्शन और इस मॉडल का उपयोग करने के लिए अपने महत्वपूर्ण आवेदनों में से एक-एक चिकित्सीय अणु का उपयोग दिखाने के जिगर perfusate को जोड़ा । Catalase एक अंतर्जात प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) मेहतर है और ischemia कमी करने के लिए प्रदर्शन किया गया है-आंख, मस्तिष्क, और फेफड़ों में reperfusion । Pegylation को endothelium के catalase को टारगेट करते दिखाया गया है । यहां, हम pegylated-catalase (खूंटी बिल्ली) के आधार perfusate को जोड़ा और अपनी जिगर संरक्षण चोट को कम करने की क्षमता का प्रदर्शन किया । हमारे मूषक NEVLP मॉडल का एक लाभ यह है कि यह बड़ा पशु मॉडलों की तुलना में सस्ती है । इस अध्ययन की एक सीमा है कि यह वर्तमान में पोस्ट छिड़काव जिगर प्रत्यारोपण शामिल नहीं है । इसलिए, अंग पद प्रत्यारोपण के समारोह की भविष्यवाणी निश्चितता के साथ नहीं किया जा सकता है । हालांकि, चूहे जिगर प्रत्यारोपण मॉडल अच्छी तरह से स्थापित है और निश्चित रूप से इस मॉडल के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । अंत में, हम एक सस्ती, सरल, आसानी से replicable NEVLP चूहों का उपयोग कर मॉडल का प्रदर्शन किया है । इस मॉडल के अनुप्रयोगों के परीक्षण उपन्यास perfusates और perfusate additives शामिल कर सकते हैं, अंग मूल्यांकन के लिए बनाया गया परीक्षण सॉफ्टवेयर, और अंगों की मरंमत करने के लिए डिज़ाइन प्रयोग ।

Introduction

वहां जिगर प्रत्यारोपण के लिए प्रतीक्षा सूची पर १४,५७८ रोगियों और लगभग ७,००० प्रत्यारोपण कर रहे है प्रति वर्ष प्रदर्शन कर रहे है1,2। इस महत्वपूर्ण दाता की कमी के जवाब में, जिगर दाताओं के लिए मानदंड का विस्तार किया है; ये अक्सर सीमांत अंगों या विस्तारित मानदंड दाताओं के रूप में जाना जाता है और कम अच्छी तरह से मानक मानदंड allografts से प्रत्यारोपण के बाद, प्राथमिक भ्रष्टाचार शिथिलता और विलंबित भ्रष्टाचार3समारोह की उच्च दर के साथ प्रदर्शन की उंमीद कर रहे हैं, 4,5,6. नतीजतन, NEVLP एक विधि के रूप में मूल्यांकन और अंग6,7को संशोधित करने के लिए शुरू किया गया है । हम NEVLP के एक चूहे मॉडल तैयार किया है और इस मॉडल का इस्तेमाल अपने महत्वपूर्ण संभावित आवेदनों में से एक का प्रदर्शन-उपंयास अणु additives के जिगर perfusate को परीक्षण ।

NEVLP दोनों murine (चूहा) और सुअर का मॉडल में मूल्यांकन किया गया है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में त्याग मानव अंगों में6,8,9। NEVLP के प्रथम मानव परीक्षणों के परिणाम भी हाल ही में१०प्रकाशित हुए हैं. हालांकि hypothermic मशीन छिड़काव स्पष्ट रूप से गुर्दे के संरक्षण के लिए मानक बन गया है, जो तापमान पर जिगर की मशीन छिड़काव होना चाहिए अभी भी विवादास्पद है । NEVLP hypothermic और subnormothermic छिड़काव की तुलना में कई प्रस्तावित लाभ है । ये कम संरक्षण चोट शामिल हैं, शारीरिक स्थितियों के तहत सामांय अंग समारोह की बहाली, अंग प्रदर्शन का आकलन करने की क्षमता, और अंग की मरंमत के लिए एक मंच के रूप में, remodeling, और संशोधन7,11, 12,13,14,15,16,17.

सुअर का NEVLP मॉडलों का प्रयोग करते हुए काफी संख्या में अध्ययन पूरा किया गया है । हालांकि इन मॉडलों अपेक्षाकृत सस्ती कर रहे है जब मॉडल त्याग मानव अंगों या मानव नैदानिक परीक्षणों का उपयोग कर विचार, वे बहुत महंगे है जब हमारे छोटे जानवर NEVLP मॉडल की तुलना में । प्रति प्रयोग लागत का एक महत्वपूर्ण घटक perfusate है । हम एक अपेक्षाकृत कम कीमत पर perfusate के ३०० मिलीलीटर के साथ एक 4 एच छिड़काव पूरा करने में सक्षम हैं । इसके अतिरिक्त, चूहों सहित छोटे जानवरों की लागत सूअरों की लागत की तुलना में बहुत कम है.

चूहे में NEVLP के अंय मॉडलों की तुलना में, यहां प्रस्तुत मॉडल अपेक्षाकृत लागू करने के लिए सरल है और आवेदनों की एक व्यापक रेंज है । छिड़काव सर्किट चित्रा 1में देखा जा सकता है । perfusate perfusate जलाशय (1), जो एक पानी जैकेट कंटेनर है में शुरू होता है । Perfusate जलाशय से एक रोलर पंप द्वारा खींच लिया है (2) और एक windkessel (3) और फिर oxygenator (4) में धकेल दिया । oxygenator countercurrent गैस और perfusate प्रवाह के लिए अधिकतम गैस विनिमय प्रदान करने के लिए निर्धारित है । perfusate तो एक हीटिंग का तार करने के लिए आय (5) छिड़काव कक्ष के अंदर यह सुनिश्चित करने के लिए शारीरिक तापमान पर है, और एक बुलबुला जाल (6) हवा के बुलबुले के छिड़काव को रोकने के लिए वहां पूर्व अंग है (7) और बाद अंग (8) नमूना बंदरगाहों, जो perfusate की अनुमति नमूना. perfusate तो पोर्टल नस प्रवेशनी के माध्यम से जिगर में प्रवेश करती है । पोर्टल शिरा प्रवेशनी एक दबाव मॉनिटर है कि डेटा संग्रह सॉफ्टवेयर पर मानों चार्ट से जुड़ा हुआ है । perfusate तो IVC प्रवेशनी के माध्यम से जिगर से बाहर निकलता है और दबाव तुल्यकारक ब्लॉक (9) में बहती है । अंत में, perfusate रोलर पंप के माध्यम से दबाव ब्लॉक वापस से खींच लिया और जलाशय में खाली कर दिया है । इस मॉडल पोर्टल नस के लिए सतत छिड़काव शामिल है और यकृत धमनी और कुछ अंय मॉडलों में इस्तेमाल किया डायलिसिस के लिए गुणवाला प्रवाह बाहर छोड़ देता है, जिनमें से प्रत्येक एक अलग और अतिरिक्त सर्किट की आवश्यकता है, लेकिन पहले नहीं किया जा करने के लिए प्रदर्शन किया गया है आवश्यक९,१३.

perfusate के लिए एक उपंयास चिकित्सकीय अणु के अलावा का पता लगाने के लिए, हम एंजाइम catalase चुना है । Catalase एक अंतर्जात ROS मेहतर है कि कोशिकाओं का हिस्सा है आंतरिक सुरक्षा तंत्र ROS18के प्रभाव को कम करने के लिए । Catalase अभिव्यक्ति यकृत ischemia reperfusion चोट19में वृद्धि हुई है । catalase के प्रयोगात्मक इसके अलावा ischemia कम करने के लिए प्रदर्शन किया गया है-आंख, मस्तिष्क में reperfusion, और फेफड़ों20,21,22,23,24। Pegylation के लिए endothelium और catalase में endothelial कोशिकाओं में सहायता करने के लिए catalase लक्ष्य दिखाया गया है25। खूंटी-बिल्ली यकृत ischemia-reperfusion चोट को कम करने में सीमित प्रभावकारिता के साथ प्रणालीबद्ध प्रशासित किया गया है; हालांकि, हम एक अलग अंग छिड़काव सर्किट करने के लिए खूंटी-बिल्ली जोड़ने की कल्पना26,27,28में सुधार परिणाम के लिए नेतृत्व करेंगे । यहां, हम खूंटी-बिल्ली हमारे आधार perfusate को जोड़ने और अपनी क्षमता को कम करने जिगर संरक्षण चोट का प्रदर्शन ।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं मानव देखभाल और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग के लिए संस्थागत पशु देखभाल और राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद के गाइड के दिशा निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया (IACUC) और ओहियो राज्य विश्वविद्यालय IACUC समिति द्वारा अनुमोदन आया है ।

1. प्रारंभिक सेट-अप

  1. निंनलिखित के संयोजन से छिड़काव समाधान तैयार करें: ८६ 25% एल्ब्युमिन की मिलीलीटर, ' विलियंस मीडिया के १८४ मिलीलीटर, पेनिसिलिन/streptomycin (10 u/एमएल पेनिसिलिन और ०.०१ मिलीग्राम/एमएल streptomycin), इंसुलिन (५० u/l), हेपरिन (०.०१ u/एमएल), एल-glutamine (०.२९२ g/l) के 30 मिलीलीटर, और hydrocortisone (०.०१० g/L) को कुल मात्रा में ३०० मि. ग्रा. आधार perfusate और खूंटी-बिल्ली समूह के लिए, खूंटी-बिल्ली के ६२५ U/एमएल जोड़ें ।
    1. tris (hydroxymethyl) aminomethane (perfusate) का उपयोग कर पीएच ७.४ को थामे समाधान बफ़र । perfusate पीएच की पुष्टि करने के लिए एक धमनी रक्त गैस मशीन का प्रयोग करें ।
  2. सर्किट सेट (चित्रा 1) ।
    1. पानी स्नान गर्म पर बारी और ३७ ° c करने के लिए यह निर्धारित किया है । अंग कक्ष को गर्म करने की अनुमति दें ।
    2. मिश्रित और बफर perfusate जलाशय में डालो और संचलन शुरू करते हैं ।
      नोट: इस चरण में उल्लिखित perfusate 1.1.1 चरण में तैयार किया गया था.
    3. oxygenating गैस पर मुड़ें (९५% ऑक्सीजन और 5% कार्बन डाइऑक्साइड) में लाइन oxygenator के माध्यम से प्रवाह काउंटर के लिए ।
    4. डेटा संग्रह सॉफ़्टवेयर चालू करें और प्रयोग की अवधि के लिए रिकॉर्ड करने के लिए "प्रारंभ" पर क्लिक करे ।
  3. सर्जिकल माइक्रोस्कोप और ऑपरेटिंग कमरे (चित्रा 2) सेट करें ।
    1. वार्मिंग बोर्ड, electrocautery, और संज्ञाहरण और महत्वपूर्ण लक्षण (हृदय की दर और ऑक्सीजन संतृप्ति) निगरानी उपकरण सहित सभी उपकरणों पर बारी ।
      नोट: माइक्रोस्कोप सेटिंग्स इस्तेमाल किया माइक्रोस्कोप के आधार पर भिन्न हो जाएगा और उपयोगकर्ता के आराम करने के लिए समायोजित किया जा सकता है.
    2. सांस लेना के लिए तरल isoflurane के 10 मिलीलीटर के साथ 10 मिलीलीटर संज्ञाहरण सिरिंज भरें (आणविक वजन १८४.५ g/
    3. स्थिति एक ०.५ एमएल सिरिंज की हेपरिन (५० यू), सर्जिकल उपकरण, 4-0 और 7-0 रेशम सीवन, बाँझ कपास झाड़ू, और 4 सेमी x 4 सेमी गैर बुना धुंध स्पंज (चित्रा 2).
  4. isoflurane चैंबर तैयार करते हैं ।

2. संज्ञाहरण के प्रेरण

  1. सर्जिकल मास्क, सर्जिकल दस्ताने, डिस्पोजेबल गाउन: निंनलिखित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनें ।
  2. चूहा तौलना ।
    नोट: हम 250 – 350 ग्राम के बीच Sprague-Dawley चूहों का उपयोग करते हैं ।
  3. ऑक्सीजन कंप्रेसर और isoflurane पर बारी । चूहा, तौला जा रहा है, के बाद isoflurane कक्ष में जगह और ढक्कन सुरक्षित । 6% isoflurane का उपयोग कर संज्ञाहरण प्रेरित 2 एल के साथ दिया/
    नोट: सटीक isoflurane खुराक इस्तेमाल किया जा रहा विशिष्ट संज्ञाहरण प्रणाली पर निर्भर करेगा ।
  4. पशु के पेट के बालों को क्लिप करने के लिए इलेक्ट्रॉनिक कतरनी का उपयोग करें।
  5. isoflurane चैंबर में पशु की जगह ।
  6. संज्ञाहरण इकाई ऑपरेटिंग कमरे में स्थित चालू करें ।
  7. संज्ञाहरण पूरी तरह से प्रेरित है जब isoflurane चैंबर से चूहे को हटा दें । एक पैर की अंगुली चुटकी का उपयोग संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें ।

3. अधिप्राप्ति प्रक्रिया

  1. 16 जी पोर्टल कफ (figure3) तैयार करें ।
    1. एक 16 जी angiocatheter के साथ शुरू करो । टयूबिंग के एक 7 मिमी अनुभाग में कटौती । मध्यबिंदु का निर्धारण 7 मिमी खंड के मध्यबिंदु पर ३.५ mm. Incise को मापने और टयूबिंग के पूर्वकाल आधा हटाने के द्वारा ।
    2. इस अब सपाट हिस्से को कुचलने के लिए एक hemostat का प्रयोग करें । angiocatheter के दूसरे छोर को पिघला कर एक होंठ बनाने के लिए हल्का सा प्रयोग करें । टिप सीधे लौ में जगह नहीं है या यह प्रज्वलित करना होगा ।
  2. पित्त वाहिनी प्रवेशनी तैयार करें ।
    1. एक 27 जी angiocath ले लो और केवल कैथेटर छोड़ने इंजेक्शन बंदरगाह से काट । 27 जी cannular टयूबिंग के एक 10 सेमी अनुभाग के लिए इस कनेक्ट ।
  3. संज्ञाहरण नाक शंकु में अपनी नाक के साथ चूहे की स्थिति, और उसके चार उग्रवाद मैटीरियल । वाम हिंद अतिवाद के लिए निगरानी संलग्न द्वारा महत्वपूर्ण संकेत की निगरानी । संज्ञाहरण के उचित गहराई की पुष्टि करने के लिए एक पैर की अंगुली चुटकी प्रदर्शन । 4% isoflurane पर संज्ञाहरण जारी रखें (है कि वजन के पशुओं के लिए > 250 ग्राम) ।
  4. ७०% isopropyl शराब के साथ पशुओं के पेट का छिड़काव । शुष्क करने की अनुमति दें । पशु पर एक बाँझ कपड़ा प्लेस ।
  5. तेज कैंची का उपयोग कर जघनरोम करने के लिए असिरूप से एक midline चीरा बनाने और त्वचा के माध्यम से विस्तार (चित्रा 4). धीरे से, और incise मांसपेशियों में प्रवेश । इस चीरा और इस चीरा के बेहतर पहलू में जिगर के अवर पहलू में मूत्राशय को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए ध्यान रखना.
  6. छोड़ दिया और जिगर के अवर सीमा के स्तर पर एक क्रॉस फार्म करने के लिए सही करने के लिए बाद में चीरा का विस्तार ।
  7. संज्ञाहरण बारी 2% (वजन जानवरों के लिए > 250 ग्राम) के लिए ।
  8. एक घुमावदार मच्छर दबाना और पसली का उपयोग पसलियों (5 चित्रा) का उपयोग कर असिरूप प्रक्रिया को वापस लेना ।
  9. तेज कैंची से falciform, phrenic, और gastrohepatic बंधनों को काट लें ।
  10. स्थिति जानें और टाई-बंद एक 7-0 टांका के रूप में अपने मूल के करीब के रूप में रिसाव को रोकने के लिए संभव के साथ phrenic नस ।
  11. अंतड़ी एक बाँझ गीला कपास टिप applicator का उपयोग कर चूहा और धुंध में आंत्र लपेटो ०.९% सामांय खारा के साथ गीला । ध्यान रखें कि छोटी आंत के vasculature को स्ट्रेच न करें ।
  12. अधिक ऊतक निकालने के लिए अवर वेना कावा (IVC) पर काटना. IVC के पीछे काटना बस विभाजन से बेहतर है और बाद में उपयोग (चित्रा 6) के लिए एक 4-0 रेशम सीवन के एक पाश पारित ।
  13. सही अधिवृक्क नस करने के लिए जोखिम प्रदान करने के लिए सही गुर्दे वापस लेना । धुंध के साथ बेहतर जिगर की सही पालि वापस लेना । एक 7-0 रेशम सीवन के साथ सही अधिवृक्क नस टाई के रूप में संभव के रूप में IVC के करीब है और यह भर में टाई (7 चित्रा) के लिए बाहर दाग़ना ।
  14. ध्यान से प्लीहा नस बाहर काटना, यह टाई दो 7-0 रेशम टांके का उपयोग कर इसे भर में दो टांके के बीच में कटौती ।
  15. टाई और ligate अतिरिक्त 7-0 रेशम टांका पोर्टल नस पर अतिरिक्त लंबाई के लिए उपयोग कर, अगर जरूरत है ।
    नोट: सही अधिवृक्क नस और अवर जिगर के बीच infrahepatic IVC की छोटी शाखाओं कभी-कभार कर रहे हैं ।
  16. gastroduodenal धमनी के आसपास काटना, एक 7-0 रेशम सीवन के साथ gastroduodenal धमनी से टाई, और gastroduodenal धमनी ligate ।
  17. यकृत धमनी के आसपास काटना और फिर यह चारों ओर एक 7-0 रेशम सीवन टाई जगह (8 चित्रा) ।
  18. पित्त नलिका को बाहर काटना ।
    1. पित्त नली की लंबाई की जांच करें । एक 7-0 रेशम सीवन का उपयोग कर बाहर के छोर पर पित्त नलिका टाई । संभव के रूप में समीपस्थ के रूप में पित्त नली के आसपास एक 7-0 रेशम सीवन के एक पाश प्लेस ।
    2. एक छेद है कि छोटे कैंची के साथ वाहिनी के आधा व्यास है और समीपस्थ पित्त नलिका में एक 27 ग्राम कैथेटर जगह काट । जगह में कैथेटर टाई एक रोमन चप्पल टाई सीवन (9 अंक) का उपयोग कर ।
  19. हेपरिन के ०.५ मिलीलीटर (५० यू) शिश्न नस या एक 27 जी सुई का उपयोग कर जानवर के IVC में सुई ।
    नोट: इसके बजाय 27 ग्राम इंसुलिन सिरिंज का भी इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  20. क्लैंप और पहले से रखा 4-0 रेशम सीवन का उपयोग कर IVC टाई ।
  21. यकृत धमनी से टाई पहले से रखा 7-0 रेशम सीवन का उपयोग कर ।
  22. एक microsurgical क्लिप का उपयोग कर पोर्टल नस बंद दबाना । Cannulate a 22 G angiocatheter का उपयोग कर पोर्टल नस । पोर्टल नस को 1 मिलीलीटर हेपरिन (१०० U) के साथ ठंडा ०.९% सामान्य खारा के साथ ६० मिलीलीटर जिगर के आधे उबले (चित्रा 10) तक फ्लश ।
    नोट: यदि जिगर तुरंत सफेद नहीं है यह बाँझ कपास टिप applicators के साथ मालिश किया जा सकता है ।
  23. suprahepatic IVC बेनकाब और यह भर में काट के रूप में संभव के रूप में छाती में उच्च ।
  24. एक hepatectomy निम्नानुसार कार्य करें । डायाफ्राम के आसपास कट, यकृत धमनी में कटौती, IVC कटौती, पोर्टल नस में कटौती, किसी भी अतिरिक्त बंधन में कटौती, और जिगर बाहर ले । बर्फ ठंडा ०.९% सामांय खारा में जिगर प्लेस (11 चित्रा) ।
  25. एक 16 जी संवहनी कफ पोर्टल नस (12 चित्रा) में रखें । पूर्व vivo normothermic liver छिड़काव सर्किट पर लिवर लगाएं ।

4. Ex वीवो Normothermic लिवर छिड़काव

नोट: perfusate यहां इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल कदम 1.1.1 में तैयार किया गया था ।

  1. पोर्टल शिरा प्रवेशनी को कफ पोर्टल शिरा (चित्रा १३) में रखें.
  2. पोर्टल शिरा प्रवेशनी प्लेसमेंट के दौरान, सर्किट के माध्यम से perfusate के प्रवाह को बनाए रखने के लिए 2 मिलीलीटर/ पोर्टल नस दबाव में किसी भी spikes के लिए निगरानी देखो; यह संकेत हो सकता है पोत occluded बन गया है और प्रवेशनी की स्थिति की जरूरत है ।
  3. एक 7-0 रेशम सीवन का उपयोग perfusate के वापसी प्रवाह के लिए IVC प्रवेशनी में सीवन ।
  4. एक बार दोनों cannulas जगह में हैं, 1 मिलीलीटर/मिनट में 10 की सीमा में एक शारीरिक दबाव जब तक मोड़ शुरू-16 cmH2हे तक पहुंच गया है ।
  5. 0, 30, ६०, ९०, १२०, १५०, १८०, २१०, और छिड़काव के २४० मिनट पर पूर्व और बाद बंदरगाहों से एक 1 मिलीलीटर नमूना ले लो । 1 एमएल के नमूने को दो ०.५ एमएल के नमूनों में बांट लें ।
    नोट: यह की ०.५ मिलीलीटर प्रोटोकॉल चरण 4.5.1 में उपयोग किया जाएगा, और ०.५ ml प्रोटोकॉल चरण 4.5.2 में उपयोग किया जाएगा ।
    1. स्नैप तरल नाइट्रोजन में क्रायोजेनिक ट्यूबों में इस नमूने के ०.५ मिलीलीटर फ्रीज ।
    2. भागो एक धमनी रक्त गैस perfusate के शेष ०.५ मिलीलीटर का उपयोग कर विश्लेषण ।
    3. प्रत्येक समय बिंदु (0, 30, ६०, ९०, १२०, १५०, १८०, २१०, और २४० मिनट) में रक्त गैस विश्लेषण चलाने के बाद पीएच स्तर की जांच करें और perfusate बफर के रूप में पीएच ७.४ लौटने की जरूरत है ।
  6. छिड़काव के 4 ज के समापन पर, छिड़काव सर्किट से जिगर डिस्कनेक्ट । ०.५ ग्राम खंडों में लिवर को विभाजित कर लें । स्नैप तरल नाइट्रोजन में क्रायोजेनिक ट्यूबों में जिगर ऊतक फ्रीज ।

5. पोस्ट-प्रयोग विश्लेषण

  1. perfusate में alanine aminotransferase (ALT) स्तर निर्धारित करें 0, 30, ६०, ९०, १२०, १५०, १८०, २१०, और २४० मिनट एक वाणिज्यिक वर्णमिति परख किट का उपयोग कर ।
    1. संक्षेप में, एक microplate रीडर का उपयोग ५७० एनएम में ऑप्टिकल घनत्व मूल्यों को मापने के लिए ६० मिनट के लिए ३७ ° c पर प्रतिक्रिया मिश्रण reperfusate के साथ मशीन ।
  2. Homogenize ०.५ lysis बफर के १०० µ एल के साथ जिगर ऊतक के जी और adenosine ट्राइफॉस्फेट (एटीपी), glutathione (GSH), और malondialdehyde (एमडीए) के लिए ऊतक lysate का विश्लेषण ।
    1. संक्षेप में, एक वाणिज्यिक परख किट का उपयोग कर जिगर ऊतक नमूनों के एटीपी स्तर को मापने । मिश्रण प्रतिक्रिया बफर के साथ नमूना और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी ५७० एनएम एक microplate रीडर का उपयोग करने पर ऑप्टिकल घनत्व उपाय ।
    2. एक वाणिज्यिक परख किट का उपयोग कर जिगर ऊतक नमूनों के GSH स्तर को मापने । मिश्रण परख कॉकटेल के साथ ऊतक के नमूने । 405 पर ऑप्टिकल घनत्व मूल्यों को मापने-414 एनएम ।
    3. एक वाणिज्यिक परख किट का उपयोग कर जिगर ऊतक नमूनों के एमडीए स्तर को मापने । ६० मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस के लिए टीबीए और गर्मी के साथ नमूनों को मिलाएं । प्रतिक्रिया और एक ९६ अच्छी तरह से प्लेट के लिए supernatant स्थानांतरण । ५३२ एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व को मापने ।
  3. lysis बफर के १०० µ एल के साथ जिगर ऊतक के Homogenize ०.५ जी और रिश्तेदार caspase के लिए ऊतक lysate का विश्लेषण-3/7 गतिविधि एक वाणिज्यिक परख किट का उपयोग कर ।
    1. मिश्रण caspase के साथ ऊतक lysate-3-7 reएजेंट परख बफर और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी ।
    2. एक अच्छी तरह से एक microplate पाठक का उपयोग में प्रतिदीप्ति स्तर को मापने ।
  4. जिगर ऊतक नमूनों में अपोप्तोटिक कोशिकाओं के स्तर का निर्धारण एक वाणिज्यिक का उपयोग कर सीटू मौत का पता लगाने किट.
    1. 10 मिनट के लिए 10 यू/एमएल Proteinase कश्मीर के साथ ०.५ जी ऊतक वर्गों पूर्व इलाज और फिर ६० मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया मिश्रण के साथ मशीन । एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर विश्लेषण प्रदर्शन ।

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Representative Results

प्रति समूह तीन चूहों का एक नमूना आकार का इस्तेमाल किया गया था । ALT 0, 30, ६०, ९०, १२०, १५०, १८०, २१०, और छिड़काव के २४० मिनट पर मापा गया था । हम हर समय बिंदु पर आधार perfusate और आधार perfusate प्लस खूंटी बिल्ली समूहों के बीच परिणामों की तुलना करने के लिए छात्र के टी-परीक्षणों का इस्तेमाल किया । आधार perfusate और बेस perfusate प्लस खूंटी-बिल्ली समूहों की तुलना में, १५०, १८०, २१०, और २४० मिनट (चित्रा 14A) में आधार perfusate प्लस खूंटी-कैट समूह में काफी कम (p < 0.05) ALT है ।

जिगर ऊतक के क्रम में दोनों आधार perfusate और बेस perfusate प्लस खूंटी बिल्ली समूहों से ऊतक क्षति का विश्लेषण करने के लिए खरीद की गई थी । हम छात्र टीपरीक्षण का इस्तेमाल किया आधार perfusate और बेस perfusate प्लस खूंटी बिल्ली समूहों के बीच परिणामों की तुलना । टिशू एटीपी बेस perfusate अलोन समूह (चित्रा 14B, पी < 0.05) की तुलना में बेस perfusate प्लस पेग-कैट ग्रुप में बनाए रखा गया था । बेस perfusate प्लस पेग-कैट ग्रुप (फिगर 14C, पी < 0.05) की तुलना में बेस perfusate ग्रुप में टिशू एमडीएस प्रोडक्शन काफी अधिक था । बेस perfusate अलोन समूह (figure 14D, p < 0.05) की तुलना में बेस perfusate प्लस पेग-कैट ग्रुप में कुल GSH बनाए रखा गया ।

apoptosis का विश्लेषण करने के लिए, जिगर ऊतक caspase 3/7 गतिविधि समूहों के बीच की तुलना में था । प्रतिदीप्ति प्रत्येक कुआं में मापा गया था । हम छात्र टीपरीक्षण का इस्तेमाल किया आधार perfusate और बेस perfusate प्लस खूंटी बिल्ली समूहों के बीच परिणामों की तुलना । बेस perfusate अलोन समूह (चित्रा 15A, p < 0.05) की तुलना में बेस perfusate प्लस पेग-कैट ग्रुप में Caspase 3/7 गतिविधि में काफी कमी आई । टर्मिनल deoxynucleotidyl ट्रांस्फ़्रेज़ (TdT) dUTP निक-एंड लेबलिंग (TUNEL) धुंधला को समूहों के बीच apoptosis तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । बेस perfusate अलोन समूह (आरेख 15B, p < 0.05) की तुलना में अपोप्तोटिक कक्षों का प्रतिशत बेस perfusate प्लस पेग-कैट समूह में काफी कम था.

Figure 1
चित्रा 1: छिड़काव सर्किट । सर्किट के घटक लेबल हैं । perfusate perfusate जलाशय (1), जो एक पानी जैकेट कंटेनर है में शुरू होता है । Perfusate जलाशय से एक रोलर पंप द्वारा खींच लिया है (2) और एक windkessel (3) और फिर oxygenator (4) में धकेल दिया । oxygenator countercurrent गैस और perfusate प्रवाह के लिए अधिकतम गैस विनिमय प्रदान करने के लिए निर्धारित है । perfusate तो एक हीटिंग का तार करने के लिए आय (5) छिड़काव कक्ष के अंदर यह सुनिश्चित करने के लिए शारीरिक तापमान पर है, और एक बुलबुला जाल (6) हवा के बुलबुले के छिड़काव को रोकने के लिए । वहां पूर्व अंग है (7) और बाद अंग (8) नमूना बंदरगाहों, जो perfusate का नमूना लिया जा करने के लिए अनुमति देते हैं । perfusate तो पोर्टल नस प्रवेशनी के माध्यम से जिगर में प्रवेश करती है । पोर्टल नस प्रवेशनी एक दबाव मॉनिटर, जो दबाव तुल्यकारक (9) को विनियमित करने के लिए संलग्न है । अंत में, perfusate रोलर पंप के माध्यम से दबाव ब्लॉक वापस से खींच लिया और जलाशय में खाली कर दिया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: ऑपरेटिंग कमरे और शल्य चिकित्सा साधन सेट-अप । सर्जिकल माइक्रोस्कोप (1) उपयुक्त ऊंचाई और उपयोगकर्ता के लिए आवर्धन करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए । Isoflurane संज्ञाहरण मशीन (2) में पूर्व लोड किया जा सकता है । पशु की नाक नाक कोन (3) में रखी है । सर्जिकल उपकरण बाहर रखी जानी चाहिए जहां वे आसानी से पहुंचा जा सकता है (4) । electrocautery (5) पास करने में सहायक है । टांके (6) पूर्व होना चाहिए ताकि टुकड़े जल्दी से प्राप्त किया जा सकता है जब जरूरत है, और अतिरिक्त (7) उपलब्ध होना चाहिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3:16 जी पोर्टल नस कफ तैयार करें । एक 16 जी angiocatheter के साथ शुरू करो । टयूबिंग के एक 7 मिमी अनुभाग में कटौती । ३.५ mm. Incise को मापने के द्वारा 7 मिमी खंड के मध्यबिंदु का निर्धारण यहां और टयूबिंग के पूर्वकाल आधा हटा दें । इस अब सपाट हिस्से को कुचलने के लिए एक hemostat का प्रयोग करें । angiocatheter के दूसरे छोर को एक होंठ बनाने के लिए जला हल्का प्रयोग करें । टिप सीधे लौ में जगह नहीं है या यह प्रज्वलित करना होगा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा ४: Midline चीरा. असिरूप (1) से जघनरोम (2) तेज कैंची का प्रयोग और त्वचा और मांसपेशियों के माध्यम से विस्तार करने के लिए एक midline चीरा बनाओ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: पर्याप्त कर्षण प्राप्त करें । असिरूप प्रक्रिया (1) एक घुमावदार मच्छर दबाना (2) और रिब (3, 4) पसली रखने के द्वारा रिब का उपयोग कर वापस लेना । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा ६: अवर वेना कावा (IVC) विच्छेदन. जिगर फ्लिप करने के लिए सही गुर्दे (1) और पोर्टल नस (2) बेनकाब । IVC (3) के आसपास काटना और भविष्य में उपयोग के लिए 7-0 टांका के एक पाश जगह है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: सही अधिवृक्क नस के बंधाव । सही गुर्दे (1) सही अधिवृक्क नस के लिए जोखिम प्रदान करने के लिए वापस लेना । सही अधिवृक्क नस टाई और यह भर में कटौती । एक गीला धुंध (2) इस पैंतरेबाज़ी के दौरान जिगर की रक्षा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्रा 8: यकृत धमनी विच्छेदन । चारों ओर काटना और यकृत धमनी (1) के आसपास एक टाई जगह है जहां यह पोर्टल नस (2) के तहत गुजरता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 9
चित्र 9: पित्त वाहिनी cannulation । Cannulate पित्त वाहिनी (1) 27 जी angiocatheter (2) 27 जी टयूबिंग (3) से जुड़े का उपयोग कर । इससे छिड़काव के दौरान पित्त को इकट्ठा करने में मदद मिलेगी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 10
चित्र 10: लिवर फ्लश । जिगर फ्लश (1) ६० cc विथ कोल्ड ०.९% नॉर्मल खारा विथ १०० यू (1 mL) विथ हेपरिन a 16 G angiocatheter (2). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 11
चित्र 11: hepatectomy के बाद । एक hepatectomy का प्रदर्शन करें और लिवर को ठंडे खारा में लगाएं । पित्त नलिका प्रवेशनी को उखाड़ फेंकना नहीं ध्यान रखना । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 12
चित्र 12: पोर्टल नस कफ । पोर्टल नस की स्थिति जानें । एक बड़े क्लैंप का प्रयोग करें (1) एक कई मिलीमीटर छोड़ने नस दबाना ऊपर नस के होंठ को पकड़ने के लिए । का प्रयोग करें microsurgical संदंश (2, 3) एक 16 जी संवहनी कफ (4) पोर्टल नस में जगह है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 13
चित्र 13: पोर्टल नस कफ और बेहतर IVC cannulation । पोर्टल नस कफ (1) और सुपीरियर IVC (2) को Cannulate । महान देखभाल पित्त डक्ट प्रवेशनी (3) को उखाड़ फेंकना नहीं लिया जाना चाहिए । इसके अतिरिक्त, बेहतर IVC मोड़ नहीं ध्यान रखना । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 14
चित्र 14: आधार perfusate में ऊतक क्षति का विश्लेषण-केवल और आधार perfusate और अधिक खूंटी-बिल्ली समूहों (N = 3/ त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । (A) Alanine aminotransferase (ALT) स्तर । बेस perfusate और बेस perfusate प्लस pegylated-catalase (खूंटी-कैट) समूह के बीच alt स्तरों की तुलना में, १५०, १८०, २१० और २४० मिनट (p < 0.05) पर बेस perfusate प्लस पेग-कैट समूह में काफी कम alt है । (ख) Adenosine ट्राइफॉस्फेट स्तर । बेस perfusate अलोन समूह (p <०.०५) की तुलना में टिशू adenosine ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) बेस perfusate प्लस पेग-कैट ग्रुप में बनाए रखा गया । (ग) Malondialdehyde का स्तर । टिशू malondialdehyde (एमडीएस) का उत्पादन बेस perfusate प्लस पेग-कैट ग्रुप (p < 0.05) की तुलना में बेस perfusate ग्रुप में काफी अधिक था । (घ) Glutathione का स्तर । बेस perfusate अलोन समूह (p < 0.05) की तुलना में आधार perfusate plus खूंटी-CAT समूह में कुल glutathione (GSH) बनाए रखा गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 15
चित्र 15: आधार perfusate में apoptosis का विश्लेषण-केवल और आधार perfusate और अधिक खूंटी-बिल्ली समूह (N = 3/ त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । (क) Caspase-3/Caspase 3/7 गतिविधि बेस perfusate अलोन समूह (p < 0.05) की तुलना में आधार perfusate plus पेग-CAT समूह में काफी कमी आई । (ख) टर्मिनल deoxynucleotidyl ट्रांस्फ़्रेज़ (TdT) dUTP निक-एंड लेबलिंग (TUNEL) धुंधलान । छवियां एक 4x फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर लिया गया । बेस perfusate (p < 0.05) की तुलना में अपोप्तोटिक कक्षों का प्रतिशत आधार perfusate plus पेग-CAT समूह में काफी कम था । हरा: अपोप्तोटिक कोशिकाओं । नीला: नाभिकीय । स्केल पट्टियां = १,००० µm. TUNEL सकारात्मक कोशिकाओं 4 यादृच्छिक सूक्ष्म क्षेत्रों से कोशिकाओं की गिनती से quantified थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

वहां जिगर प्रत्यारोपण के लिए उपलब्ध allografts की एक महत्वपूर्ण कमी है और प्रतिक्रिया दाता मानदंड में1,2,3,4,5का विस्तार किया गया है । दाता की कमी के परिणामस्वरूप, NEVLP एक विधि के रूप में मूल्यांकन और अंग6,7को संशोधित करने के लिए शुरू किया गया है । हमने NEVLP का चूहा मॉडल तैयार किया है । इसके अलावा, हम इस मॉडल का इस्तेमाल किया है अपने महत्वपूर्ण संभावित आवेदनों में से एक का प्रदर्शन-उपंयास अणु additives के जिगर perfusate के परीक्षण । यहां, हम खूंटी-बिल्ली आधार perfusate को जोड़ा और अपने जिगर संरक्षण चोट को कम करने की क्षमता का प्रदर्शन किया ।

महत्वपूर्ण कदम

जिगर छिड़काव सर्किट खरीदा और संशोधन के बिना इस्तेमाल किया गया था । सर्किट चित्र 1में visualized किया जा सकता है । इस्तेमाल किया perfusate जलाशय एक पानी की जैकेट कंटेनर कि शारीरिक तापमान पर perfusate रखने के लिए प्रयोग किया जाता है । जलाशय perfusate से एक पंप और एक windkessel चैंबर में धकेल दिया रोलर द्वारा बाहर निकाला जाता है । इस चैंबर में मदद करता है perfusate के गुणवाला प्रवाह गीला हो जाना और यह अंग में प्रवेश के लिए और अधिक लामिना बनाते हैं । windkessel चैंबर के बाद oxygenator के लिए perfusate बहती है । oxygenator countercurrent गैस और perfusate ९५% ऑक्सीजन के साथ perfusate के लिए अधिकतम गैस विनिमय प्रदान प्रवाह के लिए निर्धारित है । perfusate तो एक हीटिंग का तार करने के लिए आगे बढ़ना सुनिश्चित करने के लिए कि यह अभी भी शारीरिक तापमान पर है । एक बुलबुला जाल ठीक पहले अंग हवा बुलबुले के छिड़काव रोकता है । perfusate तो बुलबुला जाल के बाहर और पोर्टल नस जिगर में प्रवेशनी के माध्यम से पंप है । पोर्टल शिरा प्रवेशनी दबाव की निगरानी के लिए इसे बंद एक छोटी सी शाखा है । सेंसर करने के लिए टयूबिंग तरल पदार्थ नहीं हवा के साथ प्रधानमंत्री होना चाहिए तो सेंसर करने के लिए दबाव का कोई नुकसान नहीं है । अंग को oxygenating के बाद perfusate को हीन शिरा प्रवेशनी के माध्यम से लिवर के बाहर प्रवाहित करने से एक दाब तुल्यकारक हो जाता है । दबाव तुल्यकारक ब्लॉक सर्किट या अंग के प्रणा पर रोकने में मदद करता है । अंत में, perfusate रोलर पंप के माध्यम से दबाव ब्लॉक वापस से खींच लिया और जलाशय में खाली कर दिया है ।

सर्किट घटकों या टयूबिंग पर किसी भी क्षति या buildup की पहचान करने के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए के प्रत्येक छिड़काव दृश्य निरीक्षण की शुरुआत करने से पहले । अगर सर्किट पर बैक्टीरिया या अन्य पदार्थों का buildup है, तो पार्ट्स को बदला जाना चाहिए या फिर साफ करना चाहिए, यदि संभव हो तो. अगले, डिटर्जेंट आंतरिक घटकों को बनाए रखने के समाधान बाहर कुल्ला किया जाना चाहिए । के रूप में घटक बाहर दबाव संवेदक और दबाव लाइन कुल्ला किया जा रहा है पानी के साथ किसी भी हवा के बुलबुले से मिटा दिया जाना चाहिए । इसके अलावा, प्रवाह नियमित अंतराल पर समायोजित किया जाना चाहिए सुनिश्चित करने के लिए दबाव पढ़ने उचित परिवर्तन करने के लिए जवाब है । यदि दबाव संवेदक उचित जवाब नहीं है, सेंसर करने के लिए लाइन में सभी मदों की जाँच की और यदि आवश्यक हो तो reतुले होना चाहिए. एक छिड़काव के शुरू में यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है जिगर की वाहिकाओं या नहीं बन मुड़ जब सर्किट करने के लिए जिगर को जोड़ने. यदि यह हुआ है वहां एक तत्काल दबाव कील एक लघुगणकीय प्रवृत्ति में निगरानी पर देखा जाएगा । सबसे आम त्रुटि एक खराब स्थिति प्रवेशनी के साथ पोर्टल नस में एक गुत्थी है । यह समस्या पोत को थोड़ा बाहर खींच कर और पोर्टल शिरा को सीधा करके एक अधिक प्राकृतिक स्थिति में ले जाने से हल किया जा सकता है । दबाव मॉनिटर दबाव में एक बूंद और बेहतर स्थिरता के साथ इस समस्या का समाधान इंगित करता है । अगला, पोर्टल नस कफ पोर्टल नस प्रवेशनी के लिए कनेक्ट करते समय अंग के छिड़काव मुड़ हाइड्रोपावर बन सकता है । कफ समायोजित करने और इस त्रुटि को ठीक करने में अचानक स्पाइक पोर्टल शिरा दबाव में परिणाम होगा कि तो तुरंत एक कम दबाव और एक सुसंगत प्रवाह पर बंद स्तर पर वापस जाना चाहिए । एक गांठदार या मुड़ IVC जल्दी से प्रवेशनी और पोत के एक उभार से कोई प्रवाह द्वारा पहचाना जा सकता है । वेना कावा में इन त्रुटियों के दोनों भी एक बढ़ा दबाव में परिणाम होगा, लेकिन पोर्टल नस मुसीबतों के विपरीत यह दबाव अंग पर लागू है और जल्दी से हल किया जाना चाहिए । यह समस्या 10 मिनट के भीतर हल किया जाना चाहिए या प्रयोग रद्द किया जाना चाहिए । प्रयोग रद्द करने के लिए एक तत्काल संकेत पहले 20 मिनट के भीतर अंग में स्पष्ट सूजन देख रहा है ।

यदि जिगर से एक रिसाव है या प्रवेशनी कनेक्शन के एक से यह perfusate जलाशय स्तर पर नजर रखने के लिए महत्वपूर्ण हो जाएगा । perfusate और पंप हवा से बाहर चल प्रयोग करने के लिए भयावह हो सकता है । एक बार हवा लाइनों यह प्रयोग और पुनः थामने के लिए संभव नहीं है में पंप है टयूबिंग लाइनों प्रधानमंत्री । केवल संभव सुधार इंजेक्शन हवा पर कब्जा करने के लिए बुलबुला जाल के लिए है ।

संशोधन और समस्या निवारण

एक बार सर्किट फ्लश oxygenator लाइन में रखा जा सकता है और फिर सर्किट perfusate के साथ प्रधानमंत्री किया जा सकता है । oxygenator से हवा को ठीक से मिटाने के कुछ मिनट लग सकते हैं, लेकिन यह सुनिश्चित करने में एक महत्वपूर्ण कदम है कि एक हवा आवेश छिड़काव के बीच में उत्पन्न नहीं होती है । के बाद oxygenator पूरी तरह से perfusate के साथ प्रधानमंत्री बुलबुला जाल के लिए किसी भी हवाई बुलबुले कि फार्म का कब्जा करने के लिए अगले भरा जाना चाहिए है । इस बिंदु पर सर्किट प्रवाह 1 या 2 मिलीलीटर के प्रवाह के लिए सेट किया जाना चाहिए/perfusate जब तक जिगर cannulation के लिए तैयार है चलती रखने के लिए ।

cannulating के बाद पोर्टल नस और लिवर के IVC पर दबाव बढ़ाना चाहिए और उसके बाद लेवल ऑफ हो जाना चाहिए । प्रवाह के रूप में एक सामांय शारीरिक दबाव में वृद्धि हुई है दर्ज दबाव को एक समान stepwise तरीके से वृद्धि शुरू कर देना चाहिए । एक बार वांछित प्रवाह (8-16 mmHg) प्राप्त किया गया है दबाव काफी लगातार रहना चाहिए । हम 10 mmHg के दबाव के लिए लक्ष्य है, और तदनुसार प्रवाह को समायोजित । 10 mmHg के दबाव तक पहुंचने के लिए आवश्यक प्रवाह अंग के अनुसार भिंन हो सकता है । अंग से perfusate का मामूली रिसाव हो सकता है लेकिन इस perfusate को इकट्ठा कर जलाशय में लौटाया जा सकता है ।

सर्किट हर छिड़काव के बाद साफ किया जाना चाहिए चैंबर और जलाशय बनाए रखने के लिए और प्रयोज्य टयूबिंग और बंदरगाहों के संरक्षण के लिए । सभी perfusate को सर्किट से हटा देना चाहिए । सर्किट तुरंत पानी की ३०० मिलीलीटर की एक ंयूनतम के साथ फ्लश किया जाना चाहिए । जबकि जल सर्किट ट्यूबिंग बाहरी भागों flushes उचित साफ किया जाना चाहिए । बाहरी घटकों से कुल्ला किया जाना चाहिए या धीरे नीचे पोंछा और शुष्क हवा की अनुमति दी । सर्किट घटकों नाजुक है और आसानी से क्षतिग्रस्त हो सकता है । यह अत्यंत महत्वपूर्ण है इसलिए इसे धीरे साफ । आंतरिक सर्किट एक 5% में पानी में क्षारीय डिटर्जेंट के समाधान में संरक्षित किया जाना चाहिए जब उपयोग में नहीं है । सर्किट में डिटर्जेंट टयूबिंग के जीवन का विस्तार करने के लिए और ऐसे बुलबुला जाल और दबाव तुल्यकारक के रूप में अन्य घटकों पर buildup को रोकने में मदद करता है.

सर्किट के साथ सबसे कठिनाइयों पूरी तरह से सफाई और प्रत्येक उपयोग के बाद सर्किट के रखरखाव के साथ रोका जा सकता है । यह सुनिश्चित करने में मदद करता है वहां अवशिष्ट perfusate कि भरा टयूबिंग या cannulas के लिए नेतृत्व कर सकते है की कोई buildup है । सर्किट घटकों और टयूबिंग नियमित रूप से निरीक्षण किया जाना चाहिए और प्रत्येक के लिए सुनिश्चित करें कि वहां कोई संक्रमण या प्रवाह में प्रतिबंध है बनाने के प्रयोग से पहले की जरूरत के रूप में प्रतिस्थापित ।

सीमाओं

इस छोटे जानवर NEVLP मॉडल की एक सीमा है कि यह वर्तमान में पोस्ट छिड़काव प्रत्यारोपण शामिल नहीं है । यह प्रत्यारोपण के बाद जिगर भ्रष्टाचार समारोह का मूल्यांकन करने के लिए इसलिए असंभव है । यह भविष्य के अनुसंधान के लिए एक महत्वपूर्ण क्षेत्र है । इसके अतिरिक्त, छोटे जानवर सर्किट का उपयोग दोनों ज्ञान और कौशल की आवश्यकता है ।

मौजूदा मॉडलों के संबंध में महत्व

साहित्य में सुअर का और murine (चूहा) के मॉडल्स hypothermic, subnormothermic, और normothermic ex वीवो लिवर छिड़काव बताए गए हैं । हालांकि विवाद अभी भी छिड़काव तापमान के बारे में मौजूद है, यह दिखाया गया है कि मशीन छिड़काव जिगर भ्रष्टाचार के समारोह में सुधार कर सकते है तापमान9की परवाह किए बिना । NEVLP यहां प्रस्तुत मॉडल सरल है, आसानी से replicable, कम लागत, और आवेदनों की एक व्यापक रेंज है । इस मॉडल को शामिल नहीं करता है डायलिसिस या यकृत धमनी, जो कुछ अंय मॉडलों में शामिल है के लिए गुणवाला प्रवाह, के रूप में वे अनावश्यक9,13को दिखाया गया है । इसके अलावा, पहले मानव NEVLP का उपयोग कर परीक्षणों के परिणाम यह पता चला है जिगर संरक्षण का एक प्रभावी तरीका है-इसलिए, इस मॉडल के भविष्य के अनुप्रयोगों के परीक्षण के लिए आदर्श है पूर्व vivo जिगर छिड़काव10।

भविष्य अनुप्रयोगों

NEVLP के लिए भावी आवेदनों की एक किस्म साहित्य में प्रस्तावित किया गया है । इनमें से प्रत्येक के लिए प्रक्रिया को छोड़ मानव अंगों में परीक्षण करने से पहले पशु मॉडल में परीक्षण किया जा करने की आवश्यकता होगी और फिर मानव जिगर में । मॉडल यहां प्रस्तुत इन उपंयास भविष्य अनुप्रयोगों के परीक्षण के लिए आदर्श के रूप में यह आसानी से replicable है, बाहरी कदम समाप्त, और कम लागत है । इस मॉडल की सबसे महत्वपूर्ण संभावित आवेदनों में से एक है यहां का प्रदर्शन किया-उपंयास औषधीय perfusate additives के परीक्षण । अन्य प्रस्तावित अनुप्रयोगों क्षतिग्रस्त अंगों की मरंमत, जिगर के defatting steatotic अंगों के प्रत्यारोपण की अनुमति के लिए, हेपेटाइटिस सी वायरल प्रतिरोध की शुरूआत, mesenchymal स्टेम सेल थेरेपी, जीन संशोधन, और छिड़काव के साथ शामिल immunosuppressant एजेंटों11,31,३२,३३,३४,३५,३६,३७,३८।

निष्कर्ष

अंत में, हम एक सस्ती, आसानी से replicable NEVLP चूहों का उपयोग कर मॉडल का प्रदर्शन किया है । इस मॉडल का उपयोग सावधान तैयारी, अभ्यास, और ज्ञान की आवश्यकता है, लेकिन कम कीमत पर लागू किया जा सकता है । इस मॉडल के अनुप्रयोगों के परीक्षण उपंयास perfusate additives शामिल कर सकते हैं, के रूप में प्रतिनिधि परिणामों में प्रदर्शन किया गया । इस मॉडल के अतिरिक्त अनुप्रयोगों के अंग मूल्यांकन, अलग perfusates, और कृत्रिम या हीमोग्लोबिन आधारित ऑक्सीजन वाहक और अंगों की मरंमत के लिए डिज़ाइन एजेंटों के लिए डिज़ाइन परीक्षण सॉफ्टवेयर शामिल हो सकते हैं ।

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Disclosures

सभी लेखकों की रिपोर्ट है कि वे कोई प्रासंगिक प्रकटीकरण है ।

Acknowledgments

यह काम NIH T32AI 106704-01A1 और अंग प्रत्यारोपण, फ़्लेश, इंजीनियरिंग और ओहियो राज्य विश्वविद्यालय में उत्थान के लिए छिड़काव कोष द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Perfusate
8% Albumin CLS Behring, King of Prussia, PA 0053-7680-32
Williams Media Sigma Aldrich, St. Louis, MO W1878
Penicillin/Streptomycin Sigma Aldrich, St. Louis, MO P4333
Insulin Eli Lilly, Indianapolis, IL 0002-8215-91
Heparin Fresnius Lab, Lake Zurich, IL C504701
L-glutamine Sigma Aldrich, St. Louis, MO G3126
Hydrocortisone Sigma Aldrich, St. Louis, MO H0888
THAM Hospira, Inc, 0409-1593-04
Polyethylene Glycol - Catalase Sigma Aldrich S9549 SIGMA
Personal Protective Equipment
Surgical Mask Generic N/A
Protective Gown Generic N/A
Surgical Gloves Generic N/A
Liver Procurement
Sprague-Dawley Rat Harlan Sprague Dawley Inc. 250 -350 grams
Surgical Microscope Leica M500-N w/ OHS
Charcoal Canisters Kent Scientific SOMNO-2001-8
Isoflurane Piramal Healthcare N/A
Pressure-Lok Precision Analytical Syringe  Valco Instruments Co, Inc. SOMNO-10ML
Electrosurgical Unit Macan MV-7A
Warming Pad Braintree Scientific HHP2
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System Kent Scientific SS-MVG-Module
PhysioSuite Kent Scientific PS-MSTAT-RT
Isoflurane chamber Kent Scientific SOMNO-0530LG
SurgiVet Isotec CDS 9000 Tabletop
Oxygen Praxair 98015
Rib retractors Kent Scientific INS600240
GenieTouch Kent Scientific GenieTouch
Normal Saline Baxter NDC 0338-0048-04
4x4 Non-Woven Sponges Criterion 104-2411
Sterile Q-Tips Henry Schein Animal Health 1009175
U-100 27 Gauge Insulin Syringe Terumo 22-272328
5mL Syringe BD REF 309603
4-0 Braided Silk Suture Deknatel, Inc. 198737LP
7-0 Braided Silk Suture Teleflex Medical REF 103-S
16 gauge Catheters BBraun Introcan Safety 4252586-02
14 gauge Catheters BBraun Introcan Safety 4251717-02
Bile Duct Cannular Tubing Altec 01-96-1727       
Liver Perfusion Circuit Components
Water Bath Warmer Lauda Ecoline Staredition E103
Data Collection Software ADInstruments  Labchart 7
Liver Perfusion Circuit Harvard Apparatus 73-2901
Membrane Oxygenator Mediac SPA M03069
Roller Pump Ismatec ISM827B
Gas (95% oxygen and 5% carbon dioxide) Praxair 98015
Organ Chamber Harvard Apparatus ILP-2
1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube USA Scientific 1418-7410
Mucasol Sigma-Aldrich Z637181
Microsurgical Instruments
Small Scissors Roboz RS-5610
Large Scissors S&T SAA-15
Forceps - Large Angled S&T JFCL-7
Forceps - Small Angled S&T FRAS-15 RM-8
Clip Applier ROBOZ RS-5440
Scissors - non micro FST 14958-11 14958-11
Forceps - Straight Tip S&T FRS-15 RM8TC
Large Microsurgical Clip Fine Scientific Tools 18055-01
Small Microsurgical Clip Fine Scientific Tools 18055-01
Small Microsurgical Clip Fine Scientific Tools 18055-02
Small Microsurgical Clip Fine Scientific Tools 18055-03
Small Mosquito Clamps Generic N/A
Post-Experiment Analysis
Alanine Aminotransferase (ALT) Activity Colorimetric/Fluorometric Assay Kit BioVision K752
Adenosine Triphosphate (ATP) Colorimetric/Fluorometric Assay Kit BioVision K354
Glutathione Assay Kit Cayman Chemical 703002
Lipid Peroxidation (MDA) Assay Kit Abcam ab118970
Caspase-Glo 3/7 Assay Systems Promega G8090
POLARstar OMEGA Microplate Reader BMG LABTECH N/A

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References

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मेडिसिन इश्यू १३६ Normothermic ex वीवो लिवर छिड़काव NEVLP सीमांत अंग विस्तारित मापदंड दानदाता छोटे जानवर का मॉडल कुतर चूहा
<em>Ex वीवो </em>Normothermic लिवर छिड़काव का एक छोटा सा एनिमल मॉडल
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