Summary
Há uma escassez de doadores de fígado significativo, e expandiram-se critérios para doadores de fígado. Normotérmica ex vivo fígado perfusão (NEVLP) foi desenvolvido para avaliar e modificar a função do órgão. Este estudo demonstra um modelo do rato de NEVLP e testa a capacidade do peguilado-catalase, para atenuar a lesão hepática de preservação.
Abstract
Há uma escassez significativa de aloenxertos fígados disponíveis para transplante, e em resposta aos critérios de doador foram ampliados. Como resultado, normotérmico ex vivo fígado perfusão (NEVLP) foi introduzido como um método para avaliar e modificar a função do órgão. NEVLP tem muitas vantagens em comparação com hipotermia e subnormothermic perfusão incluindo reduziu o prejuízo de preservação, restauração da função normal do órgão em condições fisiológicas, avaliação de desempenho do órgão e como uma plataforma para o reparo de órgãos , remodelação e modificação. Modelos NEVLP de murino e suínos têm sido descritos. Podemos demonstrar um modelo do rato de NEVLP e use este modelo para mostrar uma de suas aplicações importantes — o uso de uma molécula terapêutica adicionado ao perfusato hepático. Catalase é um limpador de espécies (ROS) endógena reativas de oxigênio e tem demonstrado para diminuir a isquémia-reperfusão no olho, cérebro e pulmão. Pegylation mostrou alvo da catalase para o endotélio. Aqui, nós adicionamos peguilado-catalase (PEG-CAT) para o perfusato base e demonstrou a sua capacidade de atenuar a lesão hepática de preservação. Uma vantagem do nosso modelo NEVLP roedor é que é barato em comparação com modelos animais maiores. Uma limitação deste estudo é que ele não inclui atualmente pós-perfusão transplante hepático. Portanto, a previsão da função da pós-transplante de órgãos não pode ser feito com certeza. No entanto, o modelo de transplante de fígado de rato está bem estabelecido e certamente poderia ser usado em conjunto com este modelo. Em conclusão, demonstramos um modelo de baixo custo, simples e facilmente replicável NEVLP usando ratos. Aplicações deste modelo podem incluir testes romance perfusates e aditivos de perfusato, software projetado para avaliação do órgão testes e experimentos destinados a reparar órgãos.
Introduction
Há 14.578 pacientes em lista de espera para transplante hepático e aproximadamente 7.000 transplantes são realizados por ano1,2. Em resposta a esta escassez significativa de doadores, expandiram-se os critérios para os doadores de fígado; Estes são frequentemente referidos como órgãos marginais ou critérios estendidos doadores e são esperados para executar menos bem após transplante de aloenxertos critérios padrão, com taxas mais elevadas de disfunção primária do enxerto e enxerto retardado função3, 4,5,6. Como resultado, foi introduzido como um método para avaliar e modificar a função de órgão6,7NEVLP. Temos desenhado um modelo do rato de NEVLP e usou este modelo para demonstrar uma de suas aplicações potenciais importantes – o teste de aditivos de molécula romance ao fígado perfusato.
NEVLP foi avaliado em murino (rato) e modelos de suínos, bem como em órgãos humanos descartados6,8,9. Os resultados dos primeiros ensaios humanos de NEVLP foram também recentemente publicado10. Apesar de perfusão hipotérmica máquina tornou-se claramente o padrão para a preservação do rim, a temperatura na qual máquina fígada perfusão deve ocorrer é ainda controversa. NEVLP tem muitas vantagens propostas em comparação com hipotermia e perfusão subnormothermic. Estes incluem lesão reduzida de preservação, restauração da função normal do órgão em condições fisiológicas, a capacidade de avaliar o desempenho do órgão e como uma plataforma para órgão reparação, remodelação e modificação7,11, 12,13,14,15,16,17.
Um número significativo de estudos foram concluído usando modelos de suínos NEVLP. Embora estes modelos são comparativamente baratos quando considerando modelos usando descartados órgãos humanos ou testes clínicos em humanos, eles são muito caros quando comparados ao nosso modelo de NEVLP de animais pequeno. Um componente significativo do por experiência o custo é o perfusato. Somos capazes de concluir uma perfusão de 4h com 300 mL de perfusato a um custo relativamente baixo. Além disso, o custo de pequenos animais, incluindo ratos é muito baixo em comparação com o custo de suínos.
Em comparação com outros modelos de NEVLP no rato, o modelo apresentado aqui é relativamente simples de implementar e tem uma ampla gama de aplicações. O circuito de perfusão pode ser visto na Figura 1. O perfusato começa no reservatório de perfusato (1), que é um recipiente de água encamisadas. Perfusato é retirado do reservatório por uma bomba de roletes (2) e empurrado para uma windkessel (3) e, em seguida, o oxigenador (4). O oxigenador é definido para o gás em contracorrente e fluxo de perfusato para fornecer a troca gasosa máxima. O perfusato, em seguida, receitas para um aquecimento da bobina (5) dentro da câmara de perfusão para garantir que ele está na temperatura fisiológica e um borbulhador (6) para evitar a perfusão de bolhas de ar lá são pre-órgão (7) e pós-órgão (8) portos de amostra, que permitem o perfusato ser amostrados. O perfusato, em seguida, entra o fígado através da cânula da veia porta. A cânula da veia porta está ligada a um monitor de pressão que gráficos os valores do software de coleta de dados. O perfusato então sai do fígado através da cânula da veia cava inferior e flui para o bloco de equalização de pressão (9). Finalmente, o perfusato é retirado do bloco de pressão através da bomba de roletes e esvaziado no reservatório. Este modelo inclui uma perfusão contínua para a veia porta e deixa de fora o fluxo pulsátil para a artéria hepática e diálise usado em alguns outros modelos, cada um deles requer um circuito separado e adicional, mas ter previamente demonstrado não ser necessário9,13.
Para explorar a adição de uma molécula terapêutica novela para o perfusato, escolhemos da catalase enzima. Catalase é um limpador ROS endógeno que é parte do mecanismo de defesa interno de células para atenuar os efeitos da ROS18. Expressão da catalase é aumentada em isquemia hepática reperfusão lesão19. Para diminuir a isquémia-reperfusão no olho, cérebro e pulmão20,21,22,23,24, demonstrou-se adição experimental da catalase. Pegylation mostrou alvo da catalase ao endotélio e ajuda na captação de catalase em células endoteliais25. PEG-CAT tem sido administrada sistemicamente com limitada eficácia na redução de lesões de isquémia-reperfusão hepática; no entanto, formulamos a hipótese que adicionar QUE PEG-CAT para um circuito de perfusão de órgão isolado levaria para melhorar resultados de27,26,28. Aqui, nós adicionamos o PEG-CAT a nosso base perfusato e demonstrar a sua capacidade atenuar a lesão hepática de preservação.
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Protocol
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes do cuidado Animal institucional e Conselho Nacional de pesquisa do guia para o cuidado humano e uso de animais de laboratório (IACUC) e foi objecto de aprovação pelo Comité IACUC de Universidade de estado de Ohio.
1. set-up inicial
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Preparar a solução de perfusão combinando-se o seguinte: 86 mL de albumina 25%, 184 mL de mídia Williams, 30 mL de penicilina/estreptomicina (10 U/mL penicilina e 0,01 mg/mL Estreptomicina), insulina (50 U/L), heparina (0,01 U/mL), L-glutamina (0,292 g/L), e Hidrocortisona (0,010 g/L) para um volume total de 300 mL. Para o perfusato base e grupo PEG-CAT, adicione 625 U/mL de PEG-CAT.
- Tampão da solução de perfusato usando tris (hidroximetil) aminometano (THAM) para pH 7,4. Use uma máquina de gás de sangue arterial para confirmar o pH de perfusato.
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Montar o circuito (Figura 1).
- Prepara o banho de água quente e defina-a 37 ° C. Permitir que a câmara de órgão para se aquecer.
- Despeje o perfusato misto e no buffer do reservatório e começar a circulação.
Nota: O perfusato mencionado nesta etapa foi elaborado na etapa 1.1.1. - Liga o gás oxigenação (95% oxigênio e 5% de dióxido de carbono) para o contador de fluxo através do Oxigenador em linha.
- Ativar o software de coleta de dados e clique em "start" para gravar para a duração do experimento.
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Configure o microscópio cirúrgico e a sala de cirurgia (Figura 2).
- Ligue todos os equipamentos, incluindo a placa de aquecimento, eletrocautério e a anestesia e sinais vitais (coração taxa e oxigênio saturação) equipamento de monitorização.
Nota: As configurações de microscópio irão variar com baseadas no microscópio usado e podem ser ajustadas para o conforto do usuário. - Encha a seringa de anestesia de 10 mL com 10ml de isoflurano líquido para inalação (peso molecular 184,5 g/mol) e coloque na unidade de anestesia.
- Posicione uma seringa de 0,5 mL de heparina (50 U), os instrumentos cirúrgicos, 4-0 e 7-0 de seda sutura, cotonetes estéreis e esponjas de gaze 4 x 4 cm não tecida apropriadamente (Figura 2).
- Ligue todos os equipamentos, incluindo a placa de aquecimento, eletrocautério e a anestesia e sinais vitais (coração taxa e oxigênio saturação) equipamento de monitorização.
- Prepare a câmara de isoflurano.
2. a indução da anestesia
- Usar o seguinte equipamento de protecção pessoal (PPE): máscara cirúrgica, luvas cirúrgicas, vestido descartável.
- Pese o rato.
Nota: Nós usamos ratos Sprague-Dawley entre 250-350 g. - Ligue o compressor de oxigênio e isoflurano. Coloque o rato, depois de ser ponderado, na câmara de isoflurano e fixe a tampa. Induzi a anestesia com isoflurano 6% entregado com 2 L/min de oxigênio.
Nota: A dose exata de isoflurano usada dependerá do sistema de anestesia específica sendo usado. - Use o cortador eletrônico para fazer um corte de cabelo de abdominal do animal.
- Substitua o animal na câmara de isoflurano.
- Liga o aparelho de anestesia localizado na sala de cirurgia.
- Remova o rato da câmara isoflurano quando é totalmente a indução anestésica. Confirme a profundidade de anestesia utilizando uma pitada de dedo do pé.
3. o concurso
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Prepare a braçadeira portal 16G (Figura 3).
- Começar com um angiocatheter de 16 G. Corte uma parte de 7 mm do tubo. Determinar o ponto médio da seção 7 mm medindo 3,5 mm. entalha no ponto médio e remover a metade anterior da tubulação.
- Use uma pinça hemostática para esmagar esta parte agora plana. Use um isqueiro para derreter a outra extremidade do angiocatheter para criar um lábio. Não coloque a ponta diretamente para a chama, ou isso vai inflamar.
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Prepare a cânula do ducto biliar.
- Pegue um angiocath 27 G e cortar o orifício de injecção, deixando apenas o cateter. Conectar-se a esta para uma seção de 10 cm do tubo de cannular 27 G.
- Posicione o rato com o nariz do cone de nariz de anestesia e suas quatro extremidades imobilizado. Monitore os sinais vitais, anexando o monitor à extremidade traseira esquerda. Execute uma pitada de dedo do pé para confirmar a profundidade apropriada da anestesia. Continuar a anestesia com isoflurano 4% (para os animais que pesam > 250 g).
- Pulverize o abdômen do animal com álcool isopropílico a 70%. Deixe-a secar. Coloque um pano estéril sobre o animal.
- Fazer uma incisão de xifoide ao púbis usando afiada tesoura e estendendo-se através da pele (Figura 4). Suavemente Insira o peritônio e entalha o músculo. Tome cuidado para não danificar a bexiga no aspecto inferior desta incisão e o fígado no aspecto superior desta incisão.
- Estenda a incisão lateralmente à esquerda e à direita para formar uma cruz no nível da borda inferior do fígado.
- Transformar a anestesia caiu para 2% (para animais com peso > 250 g).
- Retrai o processo xifoide, usando uma pinça mosquito curvo e as costelas utilizando retractores costela (Figura 5).
- Cortar o pinçamento, frênico e ligamentos menor com uma tesoura afiada.
- Localize e gravata-fora a veia frênica com uma sutura de 7-0 como perto de sua origem quanto possível para evitar fugas.
- Eviscerar o rato usando um aplicador de ponta de algodão umedecido estéril e embrulhe o intestino em gaze umedecida com solução salina normal 0,9%. Tome cuidado para não esticar a vasculatura do intestino.
- Disse sobre a veia cava inferior (VCI) para remover o excesso de tecido. Dissecar para trás a veia cava inferior apenas superior até a bifurcação e passar um loop de uma sutura de seda 4-0 para uso posterior (Figura 6).
- Retrai o rim direito para oferecer exposição a veia adrenal direita. Retrai o lobo direito do fígado superiormente com gaze. Amarrar a veia adrenal direita com uma sutura de seda de 7-0 mais próximo a veia cava inferior quanto possível e cauterizar através dele distal para o empate (Figura 7).
- Cuidadosamente dissecar para fora da veia esplênica, amarrá-la usando duas suturas de seda de 7-0 e cortar através dele entre as duas suturas.
- Amarrar e ligate veias adicionais usando sutura seda 7-0 para o comprimento adicional na veia porta, se necessário.
Nota: Às vezes existem pequenos ramos do infrahepatic veia cava inferior entre o fígado inferior e a veia adrenal direita. - Dissecar a artéria gastroduodenal, amarrar a artéria gastroduodenal com uma sutura de seda de 7-0 e ligate a artéria gastroduodenal.
- Dissecar a artéria hepática e coloque uma gravata de seda de sutura 7-0 em torno dele (Figura 8).
-
Disse o ducto biliar.
- Verifica o comprimento do ducto biliar. Gravata do ducto biliar na extremidade distal, usando uma sutura de seda de 7-0. Coloque um laço de uma sutura de seda de 7-0 ao redor do ducto biliar como proximalmente quanto possível.
- Corte um buraco que é metade do diâmetro do duto com tesouras pequenas e colocar um cateter de 27 G no canal colédoco proximal. Amarre o cateter no lugar usando uma sutura de gravata sandália romana (Figura 9).
- Injete 0,5 mL de heparina (50 U) da veia peniana ou veia cava inferior do animal usando uma agulha 27G.
Nota: Uma seringa de insulina de 27 G também pode ser usada em vez disso. - Braçadeira e amarrar a veia cava inferior usando o previamente colocado sutura de seda 4-0.
- Amarre a artéria hepática usando o previamente colocado sutura seda 7-0.
- Braçadeira da veia porta usando um clipe microcirúrgico. Canule a veia porta usando um angiocatheter de 22g. Nivelado a veia porta com 60 mL de solução salina de 0,9% frio com heparina 1 mL (100 U) até o fígado blanches (Figura 10).
Nota: Se o fígado não Escalde imediatamente podem ser massageado com aplicadores de ponta de algodão estéril. - Expor o suprahepatic veia cava inferior e cortar através dele tão alto no peito como possível.
- Execute um hepatectomy como segue. Corte em torno do diafragma, cortar a artéria hepática, cortar a veia cava inferior, cortar a veia porta, cortar qualquer ligamentos adicionais e tirar o fígado. Coloque o fígado em gelo frio 0,9% soro fisiológico normal (Figura 11).
- Coloque uma braçadeira vascular de 16 G na veia portal (Figura 12). Coloque o fígado no circuito de perfusão hepática normotérmica ex vivo .
4. Ex Vivo de perfusão hepática normotérmica
Nota: O perfusato utilizado aqui foi elaborado na etapa de protocolo 1.1.1.
- Coloque a cânula da veia porta para a veia portal algemada (Figura 13).
- Durante a colocação de cânula da veia porta, manter o fluxo do perfusato através do circuito em 2 mL/min para começar. Observar o monitor para qualquer picos na pressão da veia porta; Isso pode indicar que o navio tem tornam-se obstruídos e reposicionamento da cânula é necessária.
- Sutura na cânula da veia cava inferior para o fluxo de retorno do perfusato usando uma sutura de seda de 7-0.
- Uma vez que ambas as cânulas estão no lugar, comece transformando-se o fluxo de 1 mL/min até atingir uma pressão fisiológica na faixa de 10 a 16 cmH2O.
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Tome uma amostra de 1 mL de pré e pós-portas em 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 e 240 min de perfusão. Divida a amostra de 1 mL em duas amostras de 0,5 mL.
Nota: 0,5 mL e 0,5 mL de isto será usado na etapa de protocolo 4.5.1 serão usado na etapa de protocolo 4.5.2.- Snap freeze 0,5 mL desta amostra em tubos criogênicos em nitrogênio líquido.
- Execute uma análise de gás de sangue arterial utilizando os restante 0,5 mL de perfusato.
- Depois de executar a análise de gás de sangue em cada ponto do tempo (0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 e 240 min) examinar os níveis de pH e buffer o perfusato conforme necessário para retornar ao pH 7,4.
- Na conclusão de 4 h de perfusão, desconecte o fígado do circuito da perfusão. Divida o fígado em segmentos de 0,5 g. Snap congelar o tecido do fígado em tubos criogênicos em nitrogênio líquido.
5. análise pós-experiência de
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Determine a alanina aminotransferase (ALT) nível o perfusato em 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 e 240 min usando um kit de ensaio colorimetric comercial.
- Em breve, incubar o perfusato com os reagentes de mistura de reação a 37 ° C por 60 min. medir a densidade óptica valores a 570 nm, utilizando um leitor de microplacas.
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Homogeneizar a 0,5 g de tecido hepático com 100 µ l de tampão de Lise e analisar o tecido lisado de trifosfato de adenosina (ATP), glutationa (GSH) e malondialdeído (MDA).
- Em breve, medir os níveis de ATP das amostras de tecido do fígado usando um kit de ensaio comercial. Misturar a amostra com o amortecedor da reação e incubar a temperatura ambiente por 30 min. medida da densidade óptica a 570 nm, utilizando um leitor de microplacas.
- Medir os níveis GSH das amostras de tecido do fígado usando um kit de ensaio comercial. Misture as amostras de tecido com o coquetel de ensaio. Medir os valores de densidade óptica a 405 – 414 nm.
- Medir os níveis MDA das amostras de tecido do fígado usando um kit de ensaio comercial. Misturar as amostras com TBA e calor para 95 ° C por 60 min. centrifugar o reagente e transferir o sobrenadante para uma placa de 96 poços. Medir a densidade óptica em 532 nm.
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Homogeneizar a 0,5 g de tecido hepático com 100 µ l de tampão de Lise e analisar o tecido lisado para actividade de caspase-3/7 relativa usando um kit de ensaio comercial.
- Misture o lisado de tecido com o buffer de ensaio do caspase-3-7 reagente e incubar a temperatura ambiente por 30 min.
- Medir o nível de fluorescência em cada poço usando um leitor de microplacas.
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Determine o nível de células apoptóticas nas amostras de tecido do fígado usando um kit de deteção de morte comercial em situ .
- Pré-tratamento de 0.5 g tecido seções com 10 U/mL Proteinase K por 10 min e incubar em seguida com a mistura de reação a 37 ° C por 60 min. executar a análise usando um microscópio fluorescente.
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Representative Results
Utilizou-se um tamanho de amostra de três ratos por grupo. ALT foi medido em 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 e 240 min de perfusão. Usamos o Student t-testes para comparar os resultados entre o perfusato base e base perfusato além de grupos de PEG-CAT em cada ponto de tempo. Comparando o perfusato base e base perfusato além de grupos de PEG-CAT, lá é significativamente menor (p < 0,05) ALT na base perfusato plus grupo PEG-CAT em 150, 180, 210 e 240 min (figura 14A).
Tecido do fígado foi adquirido a fim de analisar o dano tecidual de tanto o perfusato base e base perfusato além de grupos de PEG-CAT. Usamos o Student t-testes para comparar os resultados entre o perfusato base e base perfusato além de grupos de PEG-CAT. Tecido ATP foi mantido na base perfusato plus grupo PEG-CAT em comparação com o grupo de perfusato base sozinho (Figura 14B, p < 0,05). Produção de tecido MDA foi significativamente maior no grupo de perfusato base do que no perfusato base plus PEG-CAT grupo (Figura 14, p < 0,05). GSH total manteve-se na base perfusato plus grupo PEG-CAT em comparação com o grupo de perfusato base sozinho (Figura 14, p < 0,05).
Para analisar a apoptose, atividade de caspase 3/7 do tecido do fígado foi comparada entre os grupos. Fluorescência foi medida em cada poço. Usamos o Student t-testes para comparar os resultados entre o perfusato base e base perfusato além de grupos de PEG-CAT. Atividade da caspase 3/7 foi diminuiu significativamente na base perfusato plus grupo PEG-CAT em comparação com o grupo de perfusato base sozinho (Figura 15A, p < 0,05). Coloração do terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dUTP Nick-final rotulagem (TUNEL) foi utilizado para comparar a apoptose entre os grupos. A porcentagem de células apoptóticas foi significativamente menor na base perfusato plus grupo PEG-CAT em comparação com o grupo sozinho base perfusato (Figura 15B, p < 0,05).
Figura 1: circuito de perfusão. Componentes do circuito são rotulados. O perfusato começa no reservatório de perfusato (1), que é um recipiente de água encamisadas. Perfusato é retirado do reservatório por uma bomba de roletes (2) e empurrado para uma windkessel (3) e, em seguida, o oxigenador (4). O oxigenador é definido para o gás em contracorrente e fluxo de perfusato para fornecer a troca gasosa máxima. O perfusato em seguida procede a uma bobina de aquecimento (5) dentro da câmara de perfusão para garantir é a temperatura fisiológica e um borbulhador (6) para evitar a perfusão de bolhas de ar. Há pre-órgão (7) e pós-órgão (8) portos de amostra, que permitem o perfusato amostrar. O perfusato, em seguida, entra o fígado através da cânula da veia porta. A cânula da veia porta está ligada a um monitor de pressão, que regula o equalizador de pressão (9). Finalmente, o perfusato é retirado do bloco de pressão através da bomba de roletes e esvaziado no reservatório. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: sala de cirurgia e afinação do instrumento cirúrgico. O microscópio cirúrgico (1) deve ser ajustado para a altura adequada e ampliação para o usuário. Isoflurano pode ser Pre-carregado dentro da máquina de anestesia (2). O nariz do animal é colocado no nariz cone (3). Instrumentos cirúrgicos devem ser dispostos onde eles podem ser facilmente acessados (4). É útil ter eletrocautério (5) nas proximidades. Suturas (6) devem ser pré-cortados para que peças podem ser obtidas rapidamente quando necessário e extra devem ser disponível (7). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: preparar a braçadeira de veia porta de 16 G. Começar com um angiocatheter de 16 G. Corte uma parte de 7 mm do tubo. Determinar o ponto médio da seção 7 mm medindo 3,5 mm. entalha aqui e retire a metade anterior da tubulação. Use uma pinça hemostática para esmagar esta parte agora plana. Use um isqueiro para queimar a outra extremidade do angiocatheter para criar um lábio. Não coloque a ponta diretamente para a chama, ou isso vai inflamar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: incisão mediana. Fazer uma incisão de xifoide (1) para o púbis (2) usando afiada tesoura e estendendo-se através da pele e músculo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: obter adequada retração. Retrai o processo xifoide (1) usando uma pinça mosquito curva (2) e a costela, colocando retractores de costela (3, 4). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: dissecação de veia cava Inferior (VCI). Flip o fígado até expor o rim direito (1) e a veia porta (2). Dissecar próximo a veia cava inferior (3) e coloque um laço de sutura de 7-0 para uso futuro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: ligadura da veia adrenal direita. Retrai o rim direito (1) para fornecer a exposição para a veia adrenal direita. Amarrar a veia adrenal direita e cortar através dele. Uma gaze umedecida (2) pode ser usada para proteger o fígado durante esta manobra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: dissecação da artéria hepática. Dissecar ao redor e colocar um laço à volta da artéria hepática (1) perto de onde ele passa sob a veia porta (2). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: ducto biliar canulação. Cannulate do ducto biliar (1) usando o angiocatheter de 27 G (2) ligado para o tubo de 27 G (3). Isto ajudará a coletar a bile durante a perfusão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: resplendor fígado. Lave o fígado (1) com 60 cc de solução salina de 0,9% frio com 100 U (1 mL) de heparina, usando um angiocatheter de 16 G (2). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 11: após a hepatectomy. Executar um hepatectomy e coloque o fígado em soro fisiológico frio. Tome cuidado para não deslocar a cânula do ducto biliar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 12: veia porta modendo. Localize a veia porta. Use uma pinça grande (1) para segurar a veia deixando um vários milímetros-lábio de veia acima da braçadeira. Use fórceps microcirúrgico (2, 3) Coloque uma braçadeira vascular de 16 G (4) na veia portal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 13: braçadeira de veia porta e a cateterização da veia cava superior. Canule a veia porta manga (1) e a veia cava superior (2). Deve ter grande cuidado para não deslocar a cânula do ducto biliar (3). Além disso, tome cuidado para não torcer a veia cava superior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 14: análise do dano tecidual no perfusato somente perfusato e base base e mais grupos de PEG-CAT (N = 3/grupo). Barras de erro representam o desvio padrão. (A) alanina aminotransferase (ALT) níveis. Comparando os níveis ALT entre o perfusato base e base perfusato plus grupo peguilado-catalase (PEG-CAT), lá é significativamente menos ALT na base perfusato plus grupo PEG-CAT em 150, 180, 210 e 240 min (p < 0,05). Níveis de adenosina trifosfato (B). Tecido de trifosfato de adenosina (ATP) foi mantido na base perfusato plus grupo PEG-CAT em comparação com o grupo de perfusato base sozinho (p <0,05). Níveis de malondialdeído (C). Produção de malondialdeído (MDA) de tecido foi significativamente maior no grupo de perfusato base do que no perfusato base plus PEG-CAT grupo (p < 0,05). (D) os níveis de glutationa. Total glutationa (GSH) foi mantida na base perfusato plus grupo PEG-CAT em comparação com o grupo de perfusato base sozinho (p < 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 15: análise da apoptose em base somente perfusato e base perfusato e mais grupos de PEG-CAT (N = 3/grupo). Barras de erro representam o desvio padrão. (A) atividade da Caspase-3/7 Activity.Caspase 3/7 foi diminuiu significativamente na base perfusato plus grupo PEG-CAT em comparação com o grupo de perfusato base sozinho (p < 0,05). (B) Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dUTP Nick-final rotulagem (TUNEL) de coloração. Imagens foram tiradas usando um microscópio fluorescente de 4x. A porcentagem de células apoptóticas foi significativamente menor na base perfusato plus grupo PEG-CAT em comparação com o perfusato base (p < 0,05). Verde: pilhas apoptotic. Azul: nuclear. Escala de barras = 1.000 µm. TUNEL positivo de células foram quantificadas através da contagem de células de 4 campos de microscópicos aleatórios. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Há uma escassez significativa de aloenxertos fígados disponíveis para transplante e em resposta a critérios de doador tem sido expandida1,2,3,4,5. Como resultado da escassez de doadores, NEVLP foi introduzido como um método para avaliar e modificar a função de órgão6,7. Nós projetamos um modelo do rato de NEVLP. Além disso, nós usamos este modelo para demonstrar uma de suas aplicações potenciais importantes — o teste de aditivos de molécula romance ao fígado perfusato. Aqui, nós adicionamos o PEG-CAT para o perfusato base e demonstrou a sua capacidade de atenuar a lesão hepática de preservação.
Passos críticos
O circuito de perfusão de fígado foi comprado e usado sem modificação. O circuito pode ser visualizado na Figura 1. O reservatório de perfusato utilizado é um contêiner water-jacketed que é usado para manter o perfusato na temperatura fisiológica. No reservatório de perfusato é puxado por um rolo bombeado e empurrado para uma câmara de windkessel. Esta câmara ajuda a amortecer o fluxo pulsátil do perfusato e torná-lo mais laminar de entrada para o órgão. Após o windkessel câmara os fluxos de perfusato para o oxigenador. O oxigenador é definida para o fluxo de gás e o perfusato contracorrente proporcionando a troca de gás máximo para o perfusato com 95% de oxigênio. O perfusato depois passa para uma bobina de aquecimento para assegurar que é ainda a temperatura fisiológica. Um borbulhador mesmo antes do órgão impede a perfusão de bolhas de ar. O perfusato é então bombeado fora o borbulhador e através da cânula da veia porta para o fígado. A cânula da veia porta tem um pequeno ramo fora dela para o monitor de pressão. A tubulação para o sensor deve ser ferrada com fluido não ar, então não há nenhuma perda de pressão para o sensor. Depois de oxigenar o órgão, o perfusato escorre para fora do fígado através da cânula da veia inferior para um equalizador de pressão. O bloco de equalização de pressão ajuda a evitar sobrepressurização do circuito ou órgão. Finalmente, o perfusato é retirado do bloco de pressão através da bomba de roletes e esvaziado no reservatório.
Antes de iniciar cada perfusão inspeção visual do circuito deve ser realizada para identificar qualquer dano ou acúmulo nos componentes de circuito ou tubulação. Se houver um acúmulo de bactérias ou outras substâncias no circuito, as peças devem ser substituídas ou limpos, se possível. Em seguida, a solução de detergente, mantendo os componentes internos deve ser enxaguada para fora. Como os componentes estão sendo lavados fora o sensor de pressão e linha de pressão deve ser purgada de quaisquer bolhas de ar com água desionizada. Também, o fluxo deve ser ajustado em intervalos regulares para certificar-se de que a leitura da pressão está respondendo adequadamente às mudanças. Se o sensor de pressão não está respondendo adequadamente, todos os itens na linha para o sensor devem ser verificados e recalibrados se necessário. No início de uma perfusão é crucial certificar-se os vasos do fígado não tornar-se dobrado ou torcidos ao conectar o fígado para o circuito. Se isso ocorreu lá será um pico de pressão imediata visto no monitor em uma tendência logarítmica. O erro mais comum é uma dor na veia portal com uma cânula mal posicionada. Esta questão pode ser resolvida movendo a nave em uma posição mais natural por puxá-lo ligeiramente para fora e endireitando a veia porta. O monitor de pressão indica a resolução deste problema com uma queda na pressão e consistência melhorada. Em seguida, ao se conectar a braçadeira da veia porta para a cânula da veia porta o navio pode tornar-se torcido impedindo a perfusão do órgão. Ajustar a braçadeira e corrigir esse erro irá resultar em um aumento súbito da pressão da veia porta que deve em seguida imediatamente retornar a uma pressão mais baixa e nível fora em um fluxo consistente. Um IVC dobrado ou torcido rapidamente pode ser identificado pelo nenhum fluxo da cânula e um abaulamento do navio. Ambos esses erros na veia cava também resultará em um aumento da pressão, no entanto, ao contrário dos problemas de veia porta esta pressão é exercida sobre o órgão e deve ser resolvida rapidamente. Esta questão deve ser resolvida dentro de 10 min ou o experimento deve ser cancelado. Uma indicação imediata para cancelar o experimento é ver clara edema no órgão dentro o primeiro 20 min.
Se houver um vazamento do fígado ou de uma das conexões cânula será importante monitorar o nível do reservatório de perfusato. Acabando o perfusato e bombear o ar podem ser catastróficos para o experimento. Uma vez que o ar é bombeado para as linhas... não é possível pausar o experimento e prime novamente as linhas de tubulação. A correção só é possível é para o borbulhador capturar o ar injetado.
Modificações e solução de problemas
Uma vez que o circuito é liberado o oxigenador pode ser colocado em linha e em seguida o circuito pode ser carregado com perfusato. Corretamente, purga ar do oxigenador pode levar alguns minutos, mas é um passo crucial no sentido de assegurar que uma embolia aérea não é gerada no meio de uma perfusão. Depois o oxigenador é completamente ferrado com o borbulhador deve ser preenchido ao lado de perfusato capture quaisquer bolhas de ar que se formam. Neste ponto o fluxo do circuito deve ser definido como um fluxo de 1 ou 2 mL/min para manter o perfusato em movimento até que o fígado está pronto para canulação.
Após canulação da veia porta e a veia cava inferior do fígado, a pressão deve aumentar e estabilizar-se em seguida. Como o fluxo é aumentado para uma pressão fisiológica normal a pressão gravada deve começar a aumentar de forma gradual semelhante. Uma vez que o fluxo desejado (8 – 16 mmHg) foi alcançado, a pressão deve permanecer razoavelmente constante. Podemos apontar para uma pressão de 10 mmHg e ajustar o fluxo da mesma forma. O fluxo necessário para alcançar uma pressão de 10 mmHg pode variar conforme o órgão. Pode haver um pequeno vazamento de perfusato do órgão, mas este perfusato pode ser retornado ao reservatório e coletar.
O circuito deve ser limpo após cada perfusão para manter a câmara e o reservatório e para preservar o tubo descartável e portos. Todos perfusato deve ser removido do circuito. O circuito deve ser irrigado imediatamente com um mínimo de 300 mL de água desionizada. Enquanto a água desionizada libera a tubagem do circuito as partes externas devem ser limpos apropriadamente. Componentes externos devem ser enxaguados fora ou gentilmente limpou e permitiu ao ar secos. Componentes do circuito são frágeis e podem ser facilmente danificados. Portanto, é de extrema importância para limpá-lo suavemente. O circuito interno deve ser preservado em uma solução de 5% de detergente alcalino em água desionizada, quando não estiver em uso. O detergente no circuito ajuda a prolongar a vida útil da tubulação e evitar o acúmulo de outros componentes, tais como o borbulhador e equalizador de pressão.
A maioria das dificuldades com o circuito podem ser evitadas com limpeza e manutenção do circuito depois de cada utilização. Isso ajuda a garantir que não há nenhum acúmulo de perfusato residual que pode levar a tubulação obstruída ou cânulas. Tubos e componentes de circuito devem ser inspecionados regularmente e substituídos conforme necessário antes de cada uso para certificar-se de que não há contaminação ou restrição no fluxo.
Limitações
Uma limitação deste modelo de NEVLP animal pequeno é que não inclui atualmente pós-perfusão transplante. Portanto, é impossível avaliar a função hepática do enxerto após transplante. Esta é uma área importante para futuras pesquisas. Além disso, utilizar o circuito pequeno animal requer conhecimento e habilidade.
Significado em relação a modelos existentes
Suínos e murino modelos (rato) de perfusão hipotérmica, subnormothermic e normotérmica ex vivo hepática têm sido descritos na literatura. Embora a polêmica ainda existe em relação a temperatura de perfusão, mostrou que a perfusão de máquina pode melhorar a função do fígado enxertos independentemente da temperatura9. O modelo NEVLP apresentado aqui é simples, facilmente replicável, baixo custo e tem uma ampla gama de aplicações. Este modelo não inclui diálise ou fluxo pulsátil na artéria hepática, que são incluídos em alguns outros modelos, como eles foram mostrados para ser desnecessário9,13. Além disso, os resultados dos ensaios primeiros humanos usando NEVLP demonstraram isso de ser um método eficaz de preservação de fígado — portanto, este modelo é ideal para testar aplicações futuras do ex vivo de perfusão de fígado10.
Aplicações futuras
Uma variedade de aplicações futuras para NEVLP têm sido propostos na literatura. Cada um deles terá de ser metodicamente testada em modelos animais antes de serem testadas em órgãos humanos descartados e depois em fígados humanos. O modelo apresentado aqui é ideal para testar estas aplicações futuras romance como é facilmente replicável, elimina etapas de estranhas e é de baixo custo. Uma das mais importantes aplicações potenciais deste modelo é o demonstrado aqui - o teste da novela perfusato farmacológicos aditivos. Outras aplicações propostas incluem reparação de órgãos danificados, ressecamento dos fígados para permitir que a transplantação de órgãos steatotic, introdução de resistência viral de hepatite C, terapia de células-tronco mesenquimais, modificação genética e perfusão com imunossupressor agentes11,31,32,33,34,35,36,37,38.
Conclusões
Em conclusão, demonstramos um modelo de baixo custo, facilmente replicável NEVLP usando ratos. Uso deste modelo requer preparação cuidadosa, prática e conhecimento, mas pode ser implementado a baixo custo. Aplicações deste modelo podem incluir testes de perfusato novos aditivos, como foi demonstrado nos resultados representativos. Aplicações adicionais deste modelo podem incluir teste software projetado para avaliação do órgão, perfusates diferentes e transportadores de oxigênio baseados em hemoglobina ou artificial e destinado a reparar órgãos.
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Disclosures
Todos os autores relatam que eles não têm nenhum divulgações pertinentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIH T32AI 106704-01A1 e o Flesch de T. para a transplantação de órgãos, a perfusão, a engenharia e a regeneração no The Ohio State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusate | |||
| 8% Albumin | CLS Behring, King of Prussia, PA | 0053-7680-32 | |
| Williams Media | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | W1878 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | P4333 | |
| Insulin | Eli Lilly, Indianapolis, IL | 0002-8215-91 | |
| Heparin | Fresnius Lab, Lake Zurich, IL | C504701 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | G3126 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | H0888 | |
| THAM | Hospira, Inc, | 0409-1593-04 | |
| Polyethylene Glycol - Catalase | Sigma Aldrich | S9549 SIGMA | |
| Personal Protective Equipment | |||
| Surgical Mask | Generic | N/A | |
| Protective Gown | Generic | N/A | |
| Surgical Gloves | Generic | N/A | |
| Liver Procurement | |||
| Sprague-Dawley Rat | Harlan Sprague Dawley Inc. | 250 -350 grams | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Charcoal Canisters | Kent Scientific | SOMNO-2001-8 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | N/A | |
| Pressure-Lok Precision Analytical Syringe | Valco Instruments Co, Inc. | SOMNO-10ML | |
| Electrosurgical Unit | Macan | MV-7A | |
| Warming Pad | Braintree Scientific | HHP2 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
| Isoflurane chamber | Kent Scientific | SOMNO-0530LG | |
| SurgiVet | Isotec | CDS 9000 Tabletop | |
| Oxygen | Praxair | 98015 | |
| Rib retractors | Kent Scientific | INS600240 | |
| GenieTouch | Kent Scientific | GenieTouch | |
| Normal Saline | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
| 4x4 Non-Woven Sponges | Criterion | 104-2411 | |
| Sterile Q-Tips | Henry Schein Animal Health | 1009175 | |
| U-100 27 Gauge Insulin Syringe | Terumo | 22-272328 | |
| 5mL Syringe | BD | REF 309603 | |
| 4-0 Braided Silk Suture | Deknatel, Inc. | 198737LP | |
| 7-0 Braided Silk Suture | Teleflex Medical | REF 103-S | |
| 16 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4252586-02 | |
| 14 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4251717-02 | |
| Bile Duct Cannular Tubing | Altec | 01-96-1727 | |
| Liver Perfusion Circuit Components | |||
| Water Bath Warmer | Lauda Ecoline Staredition | E103 | |
| Data Collection Software | ADInstruments | Labchart 7 | |
| Liver Perfusion Circuit | Harvard Apparatus | 73-2901 | |
| Membrane Oxygenator | Mediac SPA | M03069 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM827B | |
| Gas (95% oxygen and 5% carbon dioxide) | Praxair | 98015 | |
| Organ Chamber | Harvard Apparatus | ILP-2 | |
| 1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube | USA Scientific | 1418-7410 | |
| Mucasol | Sigma-Aldrich | Z637181 | |
| Microsurgical Instruments | |||
| Small Scissors | Roboz | RS-5610 | |
| Large Scissors | S&T | SAA-15 | |
| Forceps - Large Angled | S&T | JFCL-7 | |
| Forceps - Small Angled | S&T | FRAS-15 RM-8 | |
| Clip Applier | ROBOZ | RS-5440 | |
| Scissors - non micro | FST 14958-11 | 14958-11 | |
| Forceps - Straight Tip | S&T | FRS-15 RM8TC | |
| Large Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-02 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-03 | |
| Small Mosquito Clamps | Generic | N/A | |
| Post-Experiment Analysis | |||
| Alanine Aminotransferase (ALT) Activity Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K752 | |
| Adenosine Triphosphate (ATP) Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K354 | |
| Glutathione Assay Kit | Cayman Chemical | 703002 | |
| Lipid Peroxidation (MDA) Assay Kit | Abcam | ab118970 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8090 | |
| POLARstar OMEGA Microplate Reader | BMG LABTECH | N/A |
References
- Network, O. P. aT. National Data. Overall by Organ. Current U.S. Waiting List. Based on OPTN data as of October 19, 2017. , Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov/data/view-data-reports/national-data/# (2017).
- OPTN, O. P. aT. N. National Data, Transplants by Donor Type, U.S. Transplants Performed January 1, 1988 - December 31, 2016, For Organ = Liver. , Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov/data/view-data-reports/national-data/# (2017).
- Nemes, B., et al. Extended criteria donors in liver transplantation Part I: reviewing the impact of determining factors. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 827-839 (2016).
- Nemes, B., et al. Extended-criteria donors in liver transplantation Part II: reviewing the impact of extended-criteria donors on the complications and outcomes of liver transplantation. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 841-859 (2016).
- Pezzati, D., Ghinolfi, D., De Simone, P., Balzano, E., Filipponi, F. Strategies to optimize the use of marginal donors in liver transplantation. World J Hepatol. 7 (26), 2636-2647 (2015).
- Marecki, H., et al. Liver ex situ machine perfusion preservation: A review of the methodology and results of large animal studies and clinical trials. Liver Transpl. 23 (5), 679-695 (2017).
- Barbas, A. S., Knechtle, S. J. Expanding the Donor Pool With Normothermic Ex Vivo Liver Perfusion: The Future Is Now. Am J Transplant. 16 (11), 3075-3076 (2016).
- Dries, S., et al. Ex vivo normothermic machine perfusion and viability testing of discarded human donor livers. Am J Transplant. 13 (5), 1327-1335 (2013).
- Westerkamp, A. C., et al. End-ischemic machine perfusion reduces bile duct injury in donation after circulatory death rat donor livers independent of the machine perfusion temperature. Liver Transpl. 21 (10), 1300-1311 (2015).
- Selzner, M., et al. Normothermic ex vivo liver perfusion using steen solution as perfusate for human liver transplantation: First North American results. Liver Transpl. 22 (11), 1501-1508 (2016).
- Whitson, B. A., Black, S. M. Organ assessment and repair centers: The future of transplantation is near. World J Transplant. 4 (2), 40-42 (2014).
- Tolboom, H., et al. Subnormothermic machine perfusion at both 20°C and 30°C recovers ischemic rat livers for successful transplantation. J Surg Res. 175 (1), 149-156 (2012).
- Nagrath, D., et al. Metabolic preconditioning of donor organs: defatting fatty livers by normothermic perfusion ex vivo. Metab Eng. 11 (4-5), 274-283 (2009).
- Boehnert, M. U., et al. Normothermic acellular ex vivo liver perfusion reduces liver and bile duct injury of pig livers retrieved after cardiac death. Am J Transplant. 13 (6), 1441-1449 (2013).
- Schön, M. R., et al. Liver transplantation after organ preservation with normothermic extracorporeal perfusion. Ann Surg. 233 (1), 114-123 (2001).
- Reddy, S., et al. Non-heart-beating donor porcine livers: the adverse effect of cooling. Liver Transpl. 11 (1), 35-38 (2005).
- Banan, B., et al. Novel strategy to decrease reperfusion injuries and improve function of cold-preserved livers using normothermic ex vivo liver perfusion machine. Liver Transpl. 22 (3), 333-343 (2016).
- Held, P. An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in Cells. , BioTek Instruments, Inc. Vinooski, Vermont. 1-14 (2012).
- Chen, C. F., et al. Reperfusion liver injury-induced superoxide dismutase and catalase expressions and the protective effects of N-acetyl cysteine. Transplant Proc. 39 (4), 858-860 (2007).
- Chen, B., Tang, L. Protective effects of catalase on retinal ischemia/reperfusion injury in rats. Exp Eye Res. 93 (5), 599-606 (2011).
- He, Y. Y., Hsu, C. Y., Ezrin, A. M., Miller, M. S. Polyethylene glycol-conjugated superoxide dismutase in focal cerebral ischemia-reperfusion. Am J Physiol. 265 (1 Pt 2), H252-H256 (1993).
- Işlekel, S., Işlekel, H., Güner, G., Ozdamar, N. Alterations in superoxide dismutase, glutathione peroxidase and catalase activities in experimental cerebral ischemia-reperfusion. Res Exp Med (Berl). 199 (3), 167-176 (1999).
- Li, G., Chen, Y., Saari, J. T., Kang, Y. J. Catalase-overexpressing transgenic mouse heart is resistant to ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol. 273 (3 Pt 2), H1090-H1095 (1997).
- Nowak, K., et al. Immunotargeting of catalase to lung endothelium via anti-angiotensin-converting enzyme antibodies attenuates ischemia-reperfusion injury of the lung in vivo. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 293 (1), L162-L169 (2007).
- Beckman, J. S., et al. Superoxide dismutase and catalase conjugated to polyethylene glycol increases endothelial enzyme activity and oxidant resistance. J Biol Chem. 263 (14), 6884-6892 (1988).
- Yabe, Y., Nishikawa, M., Tamada, A., Takakura, Y., Hashida, M. Targeted delivery and improved therapeutic potential of catalase by chemical modification: combination with superoxide dismutase derivatives. J Pharmacol Exp Ther. 289 (2), 1176-1184 (1999).
- Yabe, Y., et al. Prevention of neutrophil-mediated hepatic ischemia/reperfusion injury by superoxide dismutase and catalase derivatives. J Pharmacol Exp Ther. 298 (3), 894-899 (2001).
- Ushitora, M., et al. Prevention of hepatic ischemia-reperfusion injury by pre-administration of catalase-expressing adenovirus vectors. J Control Release. 142 (3), 431-437 (2010).
- Kakizaki, Y., et al. The Effects of Short-Term Subnormothermic Perfusion after Cold Preservation on Liver Grafts from Donors after Cardiac Death: An Ex Vivo Rat Model. Transplantation. , (2018).
- Kumar, R., Chung, W. Y., Dennison, A. R., Garcea, G. Ex Vivo Porcine Organ Perfusion Models as a Suitable Platform for Translational Transplant Research. Artif Organs. , (2017).
- Nativ, N. I., et al. Liver defatting: an alternative approach to enable steatotic liver transplantation. Am J Transplant. 12 (12), 3176-3183 (2012).
- Yeung, J. C., et al. Ex vivo adenoviral vector gene delivery results in decreased vector-associated inflammation pre- and post-lung transplantation in the pig. Mol Ther. 20 (6), 1204-1211 (2012).
- Goldaracena, N., et al. Inducing Hepatitis C Virus Resistance After Pig Liver Transplantation-A Proof of Concept of Liver Graft Modification Using Warm Ex Vivo Perfusion. Am J Transplant. 17 (4), 970-978 (2017).
- Van Raemdonck, D., Neyrinck, A., Rega, F., Devos, T., Pirenne, J. Machine perfusion in organ transplantation: a tool for ex vivo graft conditioning with mesenchymal stem cells? Curr Opin Organ Transplant. 18 (1), 24-33 (2013).
- Pratschke, S., et al. Results of the TOP Study: Prospectively Randomized Multicenter Trial of an Ex Vivo Tacrolimus Rinse Before Transplantation in EDC Livers. Transplant Direct. 2 (6), e76 (2016).
- Pratschke, S., et al. Protocol TOP-Study (tacrolimus organ perfusion): a prospective randomized multicenter trial to reduce ischemia reperfusion injury in transplantation of marginal liver grafts with an ex vivo tacrolimus perfusion. Transplant Res. 2 (1), 3 (2013).
- Nativ, N. I., et al. Elevated sensitivity of macrosteatotic hepatocytes to hypoxia/reoxygenation stress is reversed by a novel defatting protocol. Liver Transpl. 20 (8), 1000-1011 (2014).
- Lonze, B. E., et al. In vitro and ex vivo delivery of short hairpin RNAs for control of hepatitis C viral transcript expression. Arch Surg. 147 (4), 384-387 (2012).
