Summary
Hay una escasez de donantes de hígado significativa, y se han ampliado los criterios de los donantes de hígado. Perfusión normotérmica ex vivo hígado (NEVLP) ha sido desarrollada para evaluar y modificar la función del órgano. Este estudio muestra un modelo de rata de NEVLP y pone a prueba la capacidad de pegilado-catalasa, para mitigar la lesión hepática de preservación.
Abstract
Existe una escasez importante de allografts del hígado para el trasplante, y en respuesta se han ampliado los criterios de los donantes. Como resultado, perfusión normotérmica ex vivo hígado (NEVLP) se ha introducido como un método para evaluar y modificar la función del órgano. NEVLP tiene muchas ventajas en comparación con hipotermia y subnormothermic perfusión incluyendo reduce lesiones de preservación, restauración de la función normal del órgano en condiciones fisiológicas, evaluación de funcionamiento del órgano y como una plataforma para la reparación de órganos , remodelación y modificación. Modelos NEVLP murinos y porcinos se han descrito. Nos muestran un modelo de rata de NEVLP y utilizar este modelo para mostrar una de sus importantes aplicaciones, el uso de una molécula terapéutica añadida a la solución de hígado. La catalasa es un limpiador de endógeno reactivas del oxígeno (ROS) las especies y se ha demostrado para disminuir la isquemia reperfusión en el ojo, cerebro y pulmón. La pegilación ha demostrado a catalasa al endotelio. Aquí, hemos añadido pegilado-catalasa (PEG-CAT) a la solución base y demostrado su capacidad para mitigar la lesión hepática de preservación. Una ventaja de nuestro modelo NEVLP roedor es que es barato en comparación con los modelos animales más grandes. Una limitación de este estudio es que actualmente no incluir perfusión después del trasplante del hígado. Por lo tanto, la predicción de la función del post-trasplante de órganos no se puede realizar con certeza. Sin embargo, el modelo de trasplante de hígado de rata está bien establecido y ciertamente podría ser utilizado en conjunción con este modelo. En conclusión, hemos demostrado un modelo NEVLP barato, simple y fácilmente replicable con ratas. Las aplicaciones de este modelo pueden incluir pruebas de perfusates novela y aditivos de la solución, prueba software diseñado para la evaluación del órgano y experimentos diseñados para reparar órganos.
Introduction
Hay 14.578 pacientes en lista de espera para el trasplante hepático y aproximadamente 7.000 trasplantes se realizan por año1,2. En respuesta a esta escasez de donantes importantes, se han ampliado los criterios de los donantes de hígado; Estos se refieren a menudo como órganos marginales o donantes criterios extendidos y se esperan que realice menos bien después del trasplante de aloinjertos de criterios estándar, con tasas mayores de disfunción primaria del injerto y de la función retardada del injerto3, 4,5,6. Como resultado, NEVLP se ha introducido como un método para evaluar y modificar la función de órgano6,7. Hemos diseñado un modelo de rata de NEVLP y utiliza este modelo para demostrar uno de sus potenciales aplicaciones importantes – las pruebas de aditivos de la novedosa molécula a solución de hígado.
NEVLP se ha evaluado en modelos porcinos y murino (rata), así como en órganos humanos desechados6,8,9. Los resultados de los primeros ensayos humanos de NEVLP recientemente han sido publicados10. Aunque la perfusión hipotérmica de la máquina se ha convertido claramente en el estándar para la preservación del riñón, la temperatura en que máquina hígado ocurre perfusión es aún controversial. NEVLP tiene muchas ventajas propuestas en comparación con hipotermia y perfusión de subnormothermic. Estos incluyen lesión menor preservación, restauración de la función normal del órgano en condiciones fisiológicas, la capacidad para evaluar el funcionamiento del órgano y como una plataforma para la reparación de órganos, remodelación y modificación7,11, 12,13,14,15,16,17.
Se han completado un número significativo de estudios utilizando modelos NEVLP porcinos. Aunque estos modelos son comparativamente baratos teniendo en cuenta modelos descartados los órganos humanos o ensayos clínicos en humanos, son muy caros en comparación con nuestro modelo NEVLP animal pequeño. Un componente significativo de la por experimento costo es la solución. Somos capaces de terminar una perfusión de 4 h con 300 mL de solución a un costo relativamente bajo. Además, el costo de pequeños animales tales como ratas es muy bajo en comparación con el costo de los cerdos.
En comparación con otros modelos de NEVLP en la rata, el modelo presentado aquí es relativamente fácil de implementar y tiene una amplia gama de aplicaciones. El circuito de perfusión puede verse en la figura 1. La solución comienza en el depósito de la solución (1), que es un recipiente con camisa de agua. Solución es extraído del depósito por una bomba de rodillos (2) y empujó en un windkessel (3) y, a continuación, el oxigenador (4). El oxigenador se encuentra gas a contracorriente y flujo de la solución para proporcionar intercambio gaseoso máximo. La solución entonces procede a un calentamiento de la bobina interior (5) la cámara de perfusión para asegurarse de que está a temperatura fisiológica, y una trampa de burbujas (6) para evitar la perfusión de burbujas de aire que son pre-órgano (7) y post-órgano (8) puertos de la muestra, que permiten la solución a ser muestreadas. La solución entonces entra en el hígado a través de la cánula de la vena porta. La cánula de la vena porta está conectada a un monitor de presión que traza los valores en el software de colección de datos. La solución entonces sale del hígado a través de la cánula de la vena cava inferior y desemboca en el bloque de ecualizador de presión (9). Finalmente, la solución es extraída el bloque de presión por la bomba de rodillo y vaciar en el depósito. Este modelo incluye una perfusión continua a la vena porta y deja fuera el flujo pulsátil de la arteria hepática y la diálisis en algunos otros modelos, cada uno de ellos requiere un circuito independiente y adicional, pero anteriormente se han demostrado para no ser requiere9,13.
Para explorar la adición de una molécula terapéutica novedosa para la solución, optamos por la enzima catalasa. La catalasa es un limpiador ROS endógeno que participa en el mecanismo interno de defensa de las células para mitigar los efectos de ROS18. Expresión de catalasa se incrementa en hepática isquemia reperfusión lesiones19. Experimental además de catalasa se ha demostrado para disminuir la isquemia reperfusión en el ojo, cerebro y pulmón20,21,22,23,24. La pegilación ha demostrado a catalasa al endotelio y ayuda en la absorción de catalasa en las células endoteliales25. PEG-CAT se ha administrado sistémicamente con limitada eficacia en la reducción de lesión de la isquemia-reperfusión hepática; sin embargo, la hipótesis de que añadir QUE PEG-CAT a un circuito de perfusión de órgano aislado conduciría a mejores resultados26,27,28. Aquí, añadimos PEG-CAT a nuestra solución base y demostrar su capacidad de mitigar la lesión hepática de preservación.
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Protocol
Todos los procedimientos fueron realizados según los lineamientos de la atención institucional de Animal y Consejo Nacional de investigación de la guía para el cuidado humanitario y uso de laboratorio de animales (IACUC) y ha sido objeto de aprobación por el Comité de estado de Ohio Universidad IACUC.
1. primera instalación
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Preparar la solución de perfusión mediante la combinación de lo siguiente: 86 mL de albúmina 25%, 184 mL de medio de Williams, 30 mL de penicilina/estreptomicina (10 U/mL penicilina y 0.01 mg/mL estreptomicina), insulina (50 U/L), heparina (0.01 U/mL), L-glutamina (0,292 g/L), y hidrocortisona (0,010 g/L) para un volumen total de 300 mL. Para el grupo de PEG-CAT y solución base, añadir 625 U/mL de PEG-CAT.
- Tampón de la solución solución tris (hidroximetil) aminometano (THAM) a pH 7,4. Utilice una máquina de gas de sangre arterial para confirmar el pH de la solución.
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Establecer el circuito (figura 1).
- Encender el baño de agua caliente y ponerlo a 37 ° C. Permita que la cámara de órgano calentar.
- Vierta la solución mixta y amortiguada en el tanque y comenzar la circulación.
Nota: La solución en este paso se preparó en el paso 1.1.1. - Encienda el gas oxigenante (95% oxígeno y 5% dióxido de carbono) el contador de flujo a través del oxigenador en línea.
- Abra el software de colección de datos y haga clic en "start" grabar para la duración del experimento.
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Configurar el microscopio quirúrgico y la sala de operaciones (figura 2).
- Encienda todos los equipos incluyendo la placa de calentamiento, electrocauterización y la anestesia y signos vitales (saturación y oxígeno del corazón), equipo de monitoreo.
Nota: La configuración del microscopio variará según el microscopio y se puede ajustar a la comodidad del usuario. - Llene la jeringa de anestesia de 10 mL con 10 mL de isoflurano líquido para inhalación (peso molecular 184.5 g/mol) y en la unidad de anestesia.
- Coloque una jeringa de 0.5 mL de heparina (50 U), los instrumentos quirúrgicos, 4-0 y 7-0 seda sutura, torundas de algodón estériles y esponjas de Gasa de 4 x 4 cm no tejido adecuadamente (figura 2).
- Encienda todos los equipos incluyendo la placa de calentamiento, electrocauterización y la anestesia y signos vitales (saturación y oxígeno del corazón), equipo de monitoreo.
- Preparar la cámara de isoflurano.
2. inducción de la anestesia
- Use el siguiente equipo de protección personal (EPP): Mascarilla quirúrgica, guantes quirúrgicos, vestido disponible.
- Peso de la rata.
Nota: Utilizamos ratas Sprague-Dawley entre 250-350 g. - Encienda el compresor de oxígeno y el isoflurano. Lugar la rata, después de ser pesado, en la cámara de isoflurano y asegure la tapa. Inducir la anestesia con isoflurano 6% entregado con 2 L/min de oxígeno.
Nota: La dosis de isoflurano exacta utilizada dependerá el sistema de anestesia específico utilizado. - Uso electrónicos cortauñas de clip pelo abdominal del animal.
- Vuelva a colocar el animal en la cámara de isoflurano.
- Encienda la unidad de anestesia en el quirófano.
- Quite la rata de la cámara de isoflurano cuando completamente se induce la anestesia. Confirmar la profundidad de la anestesia utilizando una pizca del dedo del pie.
3. procedimiento de contratación
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Prepare el brazalete portal 16 G (figura 3).
- Comenzar con un angiocatéter 16 G. Corte una sección de 7 mm de la tubería. Determinar el punto medio de la sección 7 mm midiendo 3,5 mm. incide en el punto medio y retire la mitad anterior de la tubería.
- Use una pinza hemostática para triturar esta porción ahora plana. Utilizar un encendedor para derretir el otro extremo del angiocatéter para crear un labio. No coloque la punta directamente en la llama o se inflama.
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Preparar la cánula del conducto biliar.
- Tomar un angiocath de 27 G y corte el puerto de inyección dejando sólo el catéter. Conecte una sección de 10 cm de la tubería de canular 27 G.
- Posición de la rata con su nariz en el cono de nariz de anestesia y sus cuatro extremidades inmovilizadas. Monitorear los signos vitales conectando el monitor a la extremidad trasera izquierda. Realizar un pellizco del dedo del pie para confirmar la adecuada profundidad de la anestesia. Continuar la anestesia en el 4% de isoflurano (para animales que pesan > 250 g).
- Rocíe el abdomen del animal con alcohol isopropílico al 70%. Deje que se seque. Colocar un paño estéril sobre el animal.
- Hacer una incisión de línea media desde el xifoides al pubis usando afiladas tijeras y que se extiende a través de la piel (figura 4). Suavemente entre el peritoneo y haga una incisión en el músculo. Tenga cuidado para evitar daños a la vejiga en el aspecto inferior de esta incisión y el hígado en el aspecto superior de esta incisión.
- Extender la incisión lateralmente a la izquierda y derecha para formar una cruz a nivel del borde inferior del hígado.
- Gire a la anestesia al 2% (para animales de peso > 250 g).
- Retraer el proceso de xiphoid utilizando una pinza de mosquito curva y las costillas con los retractores de la costilla (figura 5).
- Corte el falciforme, el frénico y los ligamentos gastrohepático con unas tijeras afiladas.
- Localice y amarre la vena frénica con una sutura 7-0 como cerca de su origen como sea posible para evitar fugas.
- Desentrañan la rata usando un aplicador de punta de algodón estéril humedecido y envuelva el intestino en una gasa humedecida con solución salina normal 0.9%. Tenga cuidado de no para estirar la vasculatura del intestino.
- Disecar en la vena cava inferior (IVC) para eliminar el exceso de tejido. Disecar detrás de la vena cava inferior apenas superior a la bifurcación y pasar un bucle de una sutura de seda 4-0 para su uso posterior (figura 6).
- Retraiga el riñón derecho para proporcionar la exposición a la vena suprarrenal derecha. Retracción del lóbulo derecho del hígado superiormente con una gasa. Atar la vena suprarrenal derecha con una sutura de seda 7-0 a la vena cava inferior como sea posible y cauterizar a través de lo distal a la ligadura (figura 7).
- Cuidadosamente diseca hacia fuera de la vena esplénica, atar apagado usando dos suturas de seda 7-0 y atraviesan entre las dos suturas.
- Atar y ligar las venas adicionales utilizando sutura seda 7-0 para la longitud adicional en la vena porta, si es necesario.
Nota: A veces hay pequeñas ramas de la infrahepatic IVC entre la vena suprarrenal derecha y el hígado inferior. - Diseccionar alrededor de la arteria gastroduodenal, ate la arteria gastroduodenal con una sutura de seda 7-0 y ligar la arteria gastroduodenal.
- Diseccionar alrededor de la arteria hepática y luego un empate de 7-0 sutura seda alrededor (figura 8).
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Disecan hacia fuera de la vía biliar.
- Comprobar la longitud de la vía biliar. Ate la vía biliar en el extremo distal con una sutura de seda 7-0. Colocar un lazo de sutura seda 7-0 alrededor de la vía biliar proximal como sea posible.
- Corte un agujero que es la mitad del diámetro del conducto con una pequeña tijera y colocar un catéter de 27 G en el conducto biliar proximal. Atar el catéter en su lugar usando una sutura de lazo de sandalia romana (figura 9).
- Inyectar 0,5 mL de heparina (50 U) en la vena del pene o IVC del animal utilizando una aguja de 27 G.
Nota: Una jeringa de insulina 27 G puede usarse en su lugar. - Sujetar y atar la vena cava inferior usando previamente colocado sutura seda 4-0.
- Ate la arteria hepática utilizando previamente colocado sutura seda 7-0.
- Abrazadera de la vena porta con un clip de microcirugía. Canule la vena porta con un angiocatéter de 22 G. Ras, la vena porta con 60 mL de frío 0,9% suero fisiológico con heparina 1 mL (100 U) hasta el hígado palidece (figura 10).
Nota: Si el hígado no blanch inmediatamente puede ser masajeado con aplicadores de punta de algodón estéril. - Exponer la suprahepática IVC y cortan como alta en el pecho como sea posible.
- Realizar una hepatectomía como sigue. Cortar alrededor del diafragma, cortar la arteria hepática, cortar la vena cava inferior, cortar la vena porta, cortar cualquier ligamentos adicionales y sacar el hígado. Colocar el hígado en hielo frío 0,9% solución salina normal (figura 11).
- Colocar un manguito vascular 16 G en la vena porta (figura 12). Ponga el hígado sobre el circuito de perfusión hepática normotérmica ex vivo .
4. perfusión hepática normotérmica Ex Vivo
Nota: La solución utilizada aquí fue preparada en el paso 1.1.1 de protocolo.
- Coloque la cánula de la vena porta y la vena porta con manguito (figura 13).
- Durante la colocación de la cánula de la vena porta, mantener el flujo de la solución a través del circuito en 2 mL/min para empezar. Mira al monitor para cualquier picos en la presión de la vena porta; Esto puede indicar que el buque ha ocluirse y recolocación de la cánula es necesario.
- Sutura en la cánula de la vena cava inferior para el flujo de vuelta de la solución usando una sutura de seda 7-0.
- Una vez ambas cánulas, comenzar a subir el flujo de 1 mL/min hasta una presión fisiológica en el rango de 10 – 16 cmH2O.
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Tomar una muestra de 1 mL de pre y post-puertos en 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 y 240 min de la perfusión. Dividir la muestra de 1 mL en dos muestras de 0,5 mL.
Nota: se utilizará en el paso de protocolo 4.5.2 0.5 mL de este se utilizará en el paso de protocolo 4.5.1 y 0.5 mL.- Snap freeze 0,5 mL de esta muestra en tubos criogénicos de nitrógeno líquido.
- Ejecutar un análisis de gas de sangre arterial con la restante 0,5 mL de solución.
- Después de ejecutar el análisis del gas de sangre en cada momento (0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 y 240 min) examinar los niveles de pH y el tampón de la solución según sea necesario para volver a pH 7,4.
- En la conclusión de 4 h de perfusión, desconecte el hígado desde el circuito de perfusión. Dividen el hígado en segmentos de 0.5 g. Complemento congelar el tejido del hígado en tubos criogénicos de nitrógeno líquido.
5. experimento posterior al análisis
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Determinar alanina aminotransferasa (ALT) en la solución a 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 y 240 min usando un kit de ensayo colorimétrico comercial.
- En Resumen, incubar la solución con los reactivos de la mezcla de reacción a 37 ° C durante 60 min medida de los valores de la densidad óptica a 570 nm utilizando un lector de microplacas.
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0.5 g de tejido hepático con 100 μl de tampón de lisis de homogeneizar y analizar el tejido lisado de trifosfato de adenosina (ATP), glutatión (GSH) y malondialdehído (MDA).
- En Resumen, medir los niveles de ATP de las muestras de tejido del hígado utilizando un kit de análisis comercial. Mezclar la muestra con el tampón de reacción e incubar a temperatura ambiente durante 30 min medir la densidad óptica a 570 nm utilizando un lector de microplacas.
- Medir los niveles GSH de las muestras de tejido del hígado utilizando un kit de análisis comercial. Mezclar las muestras de tejido con el cóctel de ensayo. Medir los valores de densidad óptica a 405-414 nm.
- Medir los niveles MDA de las muestras de tejido del hígado utilizando un kit de análisis comercial. Mezclar las muestras con TBA y calor a 95 ° C por 60 minutos, centrifugar el reactivo y transferir el sobrenadante a una placa de 96 pocillos. Medir la densidad óptica a 532 nm.
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0.5 g de tejido hepático con 100 μl de tampón de lisis de homogeneizar y analizar el tejido lisado para actividad de caspasa-3/7 relativa utilizando un kit de análisis comercial.
- Mezclar el tejido lisado con el tampón de ensayo de caspasa-3-7 reactivo e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
- Medir el nivel de fluorescencia en cada bien con un lector de microplacas.
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Determinar el nivel de células apoptóticas en las muestras de tejido del hígado utilizando un kit de detección comercial en situ la muerte.
- Tratamiento previo de 0.5 g de tejido secciones con 10 U/mL proteinasa K durante 10 minutos y luego incubar con la mezcla de reacción a 37 ° C durante 60 minutos realizar el análisis utilizando un microscopio de fluorescencia.
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Representative Results
Se utilizó un tamaño de muestra de tres ratas por grupo. ALT se midió a 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 y 240 min de la perfusión. Utilizamos del estudiante t-pruebas para comparar resultados entre la solución base y solución base más grupos PEG-CAT en cada momento. En la comparación de la solución base y solución base más grupos PEG-CAT, que es significativamente menor (p < 0,05) ALT en la solución base plus grupo PEG-CAT de 150, 180, 210 y 240 min (Figura 14A).
Tejido hepático fue procurado para analizar el daño tisular debido a la solución base y solución base más grupos PEG-CAT. Utilizamos del estudiante t-pruebas para comparar resultados entre la solución base y solución base más grupos PEG-CAT. Tejido ATP se mantuvo en la solución base plus grupo PEG-gato en comparación con el grupo solo solución base (Figura 14B, p < 0.05). Producción de MDA del tejido fue significativamente mayor en el grupo de la solución base que en la solución base y PEG-CAT grupo (figura 14, p < 0.05). GSH total se mantuvo en la solución base plus grupo PEG-gato en comparación con el grupo solo solución base (figura 14, p < 0.05).
Para analizar el apoptosis, actividad de caspasas 3/7 de tejido del hígado se comparó entre los grupos. La fluorescencia fue medida en cada pocillo. Utilizamos del estudiante t-pruebas para comparar resultados entre la solución base y solución base más grupos PEG-CAT. Actividad de caspasas 3/7 fue disminuida significativamente en la solución base plus grupo PEG-gato en comparación con el grupo solo solución base (figura 15A, p < 0.05). Terminal deoxynucleotidyl transferasa (TdT) dUTP Nick-End etiquetado (TUNEL) tinción se utilizó para comparar apoptosis entre los grupos. El porcentaje de células apoptóticas fue significativamente menor en la solución base plus grupo PEG-gato en comparación con el grupo solo base solución (figura 15B, p < 0.05).
Figura 1: circuito de perfusión. Componentes del circuito están etiquetados. La solución comienza en el depósito de la solución (1), que es un recipiente con camisa de agua. Solución es extraído del depósito por una bomba de rodillos (2) y empujó en un windkessel (3) y, a continuación, el oxigenador (4). El oxigenador se encuentra gas a contracorriente y flujo de la solución para proporcionar intercambio gaseoso máximo. La solución entonces se procede a una bobina de calefacción (5) dentro de la cámara de perfusión para que esté a temperatura fisiológica y una trampa de burbujas (6) para evitar la perfusión de burbujas de aire. Hay pre-órgano (7) y post-órgano (8) puertos de la muestra, que permiten la solución a ser muestreado. La solución entonces entra en el hígado a través de la cánula de la vena porta. La cánula de la vena porta está conectada a un monitor de presión, que regula el ecualizador de presión (9). Finalmente, la solución es extraída el bloque de presión por la bomba de rodillo y vaciar en el depósito. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: instalación instrumento quirúrgico y sala de operaciones. El microscopio quirúrgico (1) debe ajustarse a la altura adecuada y el aumento para el usuario. Isoflurano puede ser cargado en la máquina de anestesia (2). Nariz del animal se coloca en el cono de nariz (3). Los instrumentos quirúrgicos deben ser presentados donde pueden ser fácilmente accedidos (4). Electrocauterización (5) cerca es útil. Suturas (6) deben ser cortadas pedazos pueden obtenerse rápidamente cuando sea necesario y adicional deben estar disponible (7). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Prepare el brazalete de la vena porta de 16 G. Comenzar con un angiocatéter 16 G. Corte una sección de 7 mm de la tubería. Determinar el punto medio de la sección 7 mm midiendo 3,5 mm. incide aquí y quitar la mitad anterior de la tubería. Use una pinza hemostática para triturar esta porción ahora plana. Usar un encendedor para quemar el otro extremo del angiocatéter para crear un labio. No coloque la punta directamente en la llama o se inflama. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: incisión del Midline. Hacer una incisión del midline de la xifoides (1) en el pubis (2) usando afiladas tijeras y extendiéndose a través de la piel y el músculo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: obtener retracción adecuada. Retraiga el proceso xifoides (1) usando una pinza mosquito curvo (2) y la costilla mediante la colocación de retractores de costilla (3, 4). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: disección de la vena cava Inferior (IVC). Voltear el hígado hasta exponer el riñón derecho (1) y (2) de la vena porta. Disecar en la vena cava inferior (3) y colocar un lazo de sutura 7-0 para uso futuro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: la ligadura de la vena suprarrenal derecho. Retraiga el riñón derecho (1) para proporcionar la exposición a la vena suprarrenal derecho. Atar la vena suprarrenal derecha y corte a través de él. Una gasa humedecida (2) puede utilizarse para proteger el hígado durante esta maniobra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: disección de la arteria hepática. Diseccionar todo y poner un lazo alrededor de la arteria hepática (1) cerca de donde pasa por debajo de la vena porta (2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: la canulación biliar. Cannulate la vía biliar (1) usando el angiocatéter de 27 G (2) conectado a la tubería de 27 G (3). Esto le ayudará a recoger la bilis durante la perfusión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10: descarga hígado. Lave el hígado (1) con 60 cc de frío 0,9% solución salina normal con 100 U (1 mL) de heparina con un angiocatéter 16 G (2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 11: después de la hepatectomía. Realizar una hepatectomía y colocar el hígado en solución salina fría. Tenga cuidado de no para desplazar la cánula del conducto biliar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 12: infiltración de la vena porta. Localizar la vena porta. Utilice una abrazadera grande (1) sostener la vena dejando un labio varios de milímetros de la vena por encima de la abrazadera. Utilice fórceps microsurgical (2, 3) para colocar un manguito vascular 16 G (4) en la vena porta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 13: pun ¢ o de la vena porta y la canulación de la vena cava inferior superior. Canule la vena porta brazalete (1) y superior vena cava inferior (2). Debe tener gran cuidado no para desalojar a la cánula de la vía biliar (3). Además, tenga cuidado de no para torcer la superior vena cava inferior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 14: Análisis de daño de tejido en solución sólo solución y base base y además grupos de PEG-CAT (N = 3/Grupo). Barras de error representan la desviación estándar. (A) alanina aminotransferasa (ALT) niveles. Al comparar los niveles de ALT entre la solución base y solución base plus grupo pegilado-catalasa (PEG-CAT), hay significativamente menos ALT en la solución base plus grupo PEG-CAT de 150, 180, 210 y 240 min (p < 0,05). (B) niveles de trifosfato de adenosina. Tejido adenosín trifosfato (ATP) se mantuvo en la solución base plus grupo PEG-gato en comparación con el grupo solo solución base (p <0.05). Niveles de malondialdehído (C). Producción de malondialdehído (MDA) del tejido fue significativamente mayor en el grupo de la solución base que en la solución base y PEG-CAT grupo (p < 0,05). (D) niveles de glutatión. Glutatión total (GSH) se mantuvo en la solución base plus grupo PEG-gato en comparación con el grupo solo solución base (p < 0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 15: Análisis de apoptosis en fluido para perfusión sólo solución y base base y además grupos de PEG-CAT (N = 3/Grupo). Barras de error representan la desviación estándar. (A) actividad de caspasa-3/7 Activity.Caspase 3/7 fue disminuida significativamente en la solución base plus grupo PEG-gato en comparación con el grupo solo solución base (p < 0,05). (B) Terminal deoxynucleotidyl transferasa (TdT) dUTP Nick-End etiquetado (TUNEL) de tinción. Imágenes fueron tomadas usando un microscopio 4 X fluorescente. El porcentaje de células apoptóticas fue significativamente menor en la solución base plus grupo PEG-gato en comparación con la solución base (p < 0,05). Verde: células apoptóticas. Azul: nuclear. Barras de escala = 1.000 μm. TUNEL positivo se cuantificaron células contando las células de 4 campos microscópicos al azar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Existe una escasez importante de allografts del hígado para el trasplante y en respuesta criterios de donante han ampliado1,2,3,4,5. Como consecuencia de la escasez de donantes, NEVLP se ha introducido como un método para evaluar y modificar la función de órgano6,7. Hemos diseñado un modelo de rata de NEVLP. Además, hemos utilizado este modelo para demostrar una de sus importantes aplicaciones potenciales, la prueba de aditivos de la novedosa molécula a solución de hígado. Aquí, se añadió PEG-CAT a la solución base y demostrado su capacidad para mitigar la lesión hepática de preservación.
Pasos críticos
El circuito de perfusión hepática fue comprado y utilizado sin modificación. El circuito puede visualizarse en la figura 1. El depósito de solución utilizado es un contenedor de agua que se utiliza para mantener la solución a temperatura fisiológica. Depósito de la solución se saca por un rodillo impulsado y empujado en una cámara de windkessel. Esta Asamblea contribuye a amortiguar el flujo pulsátil de la solución y hacer más laminar para la entrada en el órgano. Después de la windkessel del compartimiento de los flujos de solución para el oxigenador. El oxigenador se establece para el flujo a contracorriente de gas y solución proporciona intercambio de gas máxima para la solución de 95% de oxígeno. La solución entonces se procede a una bobina de calefacción para que esté todavía a temperatura fisiológica. Una trampa de la burbuja justo antes de que el órgano impide la perfusión de burbujas de aire. La solución es bombeada fuera de la trampa de burbujas y a través de la cánula de la vena porta en el hígado. La cánula de la vena porta tiene un rama pequeño de él para el monitor de presión. El tubo en el sensor se debe imprimar con fluido de aire no hay ninguna pérdida de presión en el sensor. Después de la oxigenación del órgano, la solución sale del hígado a través de la cánula de la vena inferior para un ecualizador de presión. El bloque de ecualizador de presión ayuda a evitar el exceso de presurización del circuito o del órgano. Finalmente, la solución es extraída el bloque de presión por la bomba de rodillo y vaciar en el depósito.
Antes de comenzar cada perfusión debe realizarse una inspección visual del circuito para identificar cualquier daño o acumulación de componentes del circuito o tubería. Si hay una acumulación de bacterias u otras sustancias en el circuito, piezas deben reemplazar o limpiar, si es posible. Luego, debe enjuagar la solución detergente que mantiene los componentes internos. Como los componentes están siendo enjuagar el sensor de presión y línea de presión debe ser purgada de burbujas de aire con agua desionizada. También, el flujo debe ajustarse a intervalos regulares para asegurarse de que la lectura de la presión es responder adecuadamente a los cambios. Si el sensor de presión no está respondiendo adecuadamente, todos los elementos de la línea al sensor deben comprobar y calibrar si es necesario. En el inicio de una perfusión es crucial para asegurarse de que los vasos del hígado no ser doblados o torcidos cuando se conecta el hígado al circuito. Si esto ha ocurrido hay un pico de presión inmediata verá en el monitor en una tendencia logarítmica. El error más común es un estrechamiento de la vena porta con una cánula de malposiciones. Este problema se puede resolver moviendo el vaso en una posición más natural tirando un poquito hacia afuera y enderezar la vena porta. El monitor de presión indica la resolución de este problema con una caída de presión y consistencia mejorada. A continuación, cuando se conecta el manguito de la vena porta a la cánula de la vena porta la nave puede se retuerzan impiden la perfusión del órgano. El manguito de ajuste y corrección de este error dará lugar a un aumento repentino en la presión de la vena porta que debe inmediatamente volver a una presión más baja y el nivel de un flujo constante. Un retorcido o trenzado IVC puede identificarse rápidamente por ningún flujo de la cánula y un abultamiento de la embarcación. Ambos de estos errores en la vena cava también resultará en un aumento de la presión, sin embargo, a diferencia de los problemas de vena porta esta presión es ejercida sobre el órgano y debe ser resuelto rápidamente. Este problema debe ser resuelto en 10 minutos o se debe cancelar el experimento. Indicación inmediata para cancelar el experimento es ver claro edema en el órgano dentro de los primeros 20 minutos.
Si hay una fuga de hígado o de una de las conexiones de la cánula será importante monitorear el nivel del depósito de solución. Quedando sin solución y bombear el aire pueden ser catastróficos para el experimento. Una vez que el aire se bombea en las líneas no es posible detener el experimento y vuelva a cebar las líneas de tubería. La corrección solo es para que la trampa de burbujas capturar el aire inyectado.
Modificaciones y la resolución de problemas
Una vez que se vacía el circuito el oxigenador puede poner en línea y luego el circuito se puede imprimar con solución. Correctamente para purgar el aire desde el oxigenador puede tomar algunos minutos pero es un paso crucial en asegurarse de que una embolia no se genera en medio de una perfusión. Después de que el oxigenador es totalmente preparado con solución a que la trampa de la burbuja debe ser llenada junto capturar burbujas de aire que se forman. En este punto el flujo del circuito debe ajustarse a un flujo de 1 o 2 mL/min para mantener la solución en movimiento hasta que el hígado esté listo para la canulación.
Tras canular la vena porta y la vena cava inferior del hígado, la presión debe aumentar y luego nivele. Es aumento de flujo a una presión fisiológica normal la presión registrada comienza a aumentar de manera gradual similar. Una vez alcanzado el flujo deseado (8 – 16 mmHg) la presión debe permanecer constante. Apunte para una presión de 10 mmHg y ajustar en consecuencia el flujo. De órgano puede variar el caudal necesario para llegar a una presión de 10 mmHg. Puede haber una leve fuga de fluido para perfusión del órgano, pero esta solución puede ser recogida y devuelta al depósito.
El circuito debe limpiarse después de cada perfusión para mantener la cámara y el depósito y conservar los puertos y tubos desechables. Toda solución debe retirarse del circuito. El circuito debe enjuagarse inmediatamente con un mínimo de 300 mL de agua desionizada. Mientras que el agua desionizado limpia la tubería del circuito las piezas externas deben limpiarse adecuadamente. Componentes externos se deben enjuagar o limpiar suavemente y permitió al aire seco. Componentes del circuito son frágiles y pueden dañarse fácilmente. Por lo tanto es de suma importancia para limpiar suavemente. El circuito interno debe conservarse en una solución de 5% de detergente alcalino en agua desionizada cuando no esté en uso. El detergente en el circuito ayuda a prolongar la vida útil de la tubería y evitar la acumulación en otros componentes, como la trampa de la burbuja y ecualización de la presión.
Dificultades con el circuito pueden prevenirse con la limpieza y mantenimiento del circuito después de cada uso. Esto ayuda a asegurar que no hay ninguna acumulación de solución residual que puede producir Tubería obstruida o cánulas. Tubería y componentes de circuito deben inspeccionarse regularmente y reemplazar según sea necesario antes de cada uso para asegurarse de que no hay contaminación ni restricción en el flujo.
Limitaciones
Una limitación de este modelo NEVLP animal pequeños es que no se incluyen actualmente perfusión posterior al trasplante. Por lo tanto, es imposible evaluar la función del injerto hepático después del trasplante. Esta es un área importante para futuras investigaciones. Además, utilizando el pequeño circuito animal requiere conocimientos y habilidades.
Importancia con respecto a los modelos existentes
Porcino y murine modelos (rata) de perfusión hipotérmica, subnormothermic y normotérmica ex vivo hepática se han descrito en la literatura. Aunque todavía existe controversia con respecto a la temperatura de perfusión, se ha demostrado que esa perfusión máquina puede mejorar la función de los injertos de hígado independientemente de la temperatura9. El modelo NEVLP presentado aquí es simple, fácilmente replicables, de bajo costo y tiene una amplia gama de aplicaciones. Este modelo no incluye diálisis o flujo pulsátil de la arteria hepática, que se incluyen en algunos otros modelos, como han demostrado ser innecesarios9,13. Además, los resultados de los primeros ensayos humanos con NEVLP han demostrado esto para ser un método eficaz de preservación del hígado, por lo tanto, este modelo es ideal para las pruebas futuras aplicaciones ex vivo perfusión hepática10.
Futuras aplicaciones
Se han propuesto una variedad de aplicaciones futuras para NEVLP en la literatura. Cada uno de estos tendrá que probarse metódicamente en modelos animales antes de la prueba en órganos humanos desechados y luego en hígados humanos. El modelo presentado aquí es ideal para probar estas aplicaciones futuras de novela ya que es fácilmente replicable, elimina pasos extraños y es de bajo costo. Una de las más importantes aplicaciones potenciales de este modelo es la demostrada aquí - las pruebas de aditivos de la solución farmacológica novela. Otros usos propuestos incluyen la reparación de órganos dañados, desengrase de hígados para permitir el trasplante de órganos steatotic, introducción de resistencia viral de hepatitis C, terapia de células madre mesenquimales, modificación genética y de la perfusión con inmunosupresoras agentes11,31,32,33,34,35,36,37,38.
Conclusiones
En conclusión, hemos demostrado un modelo NEVLP barato, fácilmente replicable con ratas. Uso de este modelo requiere una cuidadosa preparación, práctica y conocimiento, pero se puede implementar a bajo costo. Aplicaciones de este modelo pueden incluir pruebas de solución nuevos añadidos, como fue demostrado en los resultados representativos. Aplicaciones adicionales de este modelo pueden incluir pruebas de software diseñado para la evaluación de órgano, diferentes perfusates y portadores de oxígeno basados en hemoglobina o artificiales y los agentes diseñados para reparar órganos.
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Disclosures
Todos los autores informan que no tienen ninguna información relevante.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por NIH T32AI 106704-01A1 y T. Flesch fondo para trasplante de órganos, la perfusión, ingeniería y regeneración en la Universidad Estatal de Ohio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusate | |||
| 8% Albumin | CLS Behring, King of Prussia, PA | 0053-7680-32 | |
| Williams Media | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | W1878 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | P4333 | |
| Insulin | Eli Lilly, Indianapolis, IL | 0002-8215-91 | |
| Heparin | Fresnius Lab, Lake Zurich, IL | C504701 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | G3126 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | H0888 | |
| THAM | Hospira, Inc, | 0409-1593-04 | |
| Polyethylene Glycol - Catalase | Sigma Aldrich | S9549 SIGMA | |
| Personal Protective Equipment | |||
| Surgical Mask | Generic | N/A | |
| Protective Gown | Generic | N/A | |
| Surgical Gloves | Generic | N/A | |
| Liver Procurement | |||
| Sprague-Dawley Rat | Harlan Sprague Dawley Inc. | 250 -350 grams | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Charcoal Canisters | Kent Scientific | SOMNO-2001-8 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | N/A | |
| Pressure-Lok Precision Analytical Syringe | Valco Instruments Co, Inc. | SOMNO-10ML | |
| Electrosurgical Unit | Macan | MV-7A | |
| Warming Pad | Braintree Scientific | HHP2 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
| Isoflurane chamber | Kent Scientific | SOMNO-0530LG | |
| SurgiVet | Isotec | CDS 9000 Tabletop | |
| Oxygen | Praxair | 98015 | |
| Rib retractors | Kent Scientific | INS600240 | |
| GenieTouch | Kent Scientific | GenieTouch | |
| Normal Saline | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
| 4x4 Non-Woven Sponges | Criterion | 104-2411 | |
| Sterile Q-Tips | Henry Schein Animal Health | 1009175 | |
| U-100 27 Gauge Insulin Syringe | Terumo | 22-272328 | |
| 5mL Syringe | BD | REF 309603 | |
| 4-0 Braided Silk Suture | Deknatel, Inc. | 198737LP | |
| 7-0 Braided Silk Suture | Teleflex Medical | REF 103-S | |
| 16 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4252586-02 | |
| 14 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4251717-02 | |
| Bile Duct Cannular Tubing | Altec | 01-96-1727 | |
| Liver Perfusion Circuit Components | |||
| Water Bath Warmer | Lauda Ecoline Staredition | E103 | |
| Data Collection Software | ADInstruments | Labchart 7 | |
| Liver Perfusion Circuit | Harvard Apparatus | 73-2901 | |
| Membrane Oxygenator | Mediac SPA | M03069 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM827B | |
| Gas (95% oxygen and 5% carbon dioxide) | Praxair | 98015 | |
| Organ Chamber | Harvard Apparatus | ILP-2 | |
| 1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube | USA Scientific | 1418-7410 | |
| Mucasol | Sigma-Aldrich | Z637181 | |
| Microsurgical Instruments | |||
| Small Scissors | Roboz | RS-5610 | |
| Large Scissors | S&T | SAA-15 | |
| Forceps - Large Angled | S&T | JFCL-7 | |
| Forceps - Small Angled | S&T | FRAS-15 RM-8 | |
| Clip Applier | ROBOZ | RS-5440 | |
| Scissors - non micro | FST 14958-11 | 14958-11 | |
| Forceps - Straight Tip | S&T | FRS-15 RM8TC | |
| Large Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-02 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-03 | |
| Small Mosquito Clamps | Generic | N/A | |
| Post-Experiment Analysis | |||
| Alanine Aminotransferase (ALT) Activity Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K752 | |
| Adenosine Triphosphate (ATP) Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K354 | |
| Glutathione Assay Kit | Cayman Chemical | 703002 | |
| Lipid Peroxidation (MDA) Assay Kit | Abcam | ab118970 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8090 | |
| POLARstar OMEGA Microplate Reader | BMG LABTECH | N/A |
References
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