Summary
Fehlt ein wichtiger Leber Geber, und Kriterien für die Leber Spender wurden erweitert. Normothermic ex Vivo Leber Perfusion (NEVLP) wurde entwickelt, um zu bewerten und Organfunktion zu ändern. Diese Studie zeigt einem Rattenmodell der NEVLP und testet, ob der pegylierten-Katalase, um Verletzungen der Leber Erhaltung zu mildern.
Abstract
Gibt es ein erheblicher Mangel an Leber Allografts für Transplantation zur Verfügung, und als Reaktion der Spender-Kriterien wurden erweitert. Infolgedessen ist normothermic ex Vivo Leber Perfusion (NEVLP) eingeführt worden, als eine Methode zum bewerten und Ändern von Organfunktionen. NEVLP hat viele Vorteile im Vergleich zu unterkühlt und Subnormothermic einschließlich der Perfusion reduziert Verletzungen Erhaltung, Wiederherstellung der normalen Organfunktion unter physiologischen Bedingungen, Bewertung von Orgelspiel und als Plattform für Orgel Reparatur , Umbau und Modifikation. Murinen und Schweinen NEVLP Modelle sind beschrieben worden. Wir zeigen einem Rattenmodell der NEVLP und verwenden Sie dieses Modell, um eines ihrer wichtigsten Anwendungen zeigen – die Verwendung eines therapeutischen Moleküls Leber Perfusat hinzugefügt. Katalase ist eine endogene reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS)-Schnitzeljagd und Ischämie-Reperfusion im Auge, Gehirn und Lunge zu verringern nachgewiesen. PEGylierung nachweislich Katalase des Endothels ausrichten. Hier wir die Basis Perfusat pegylierten-Katalase (PEG-CAT) hinzugefügt und demonstriert seine Fähigkeit, Leber Erhaltung Verletzungen zu mindern. Ein Vorteil unserer Nager NEVLP Modells ist, dass es preiswert im Vergleich zu größeren Tiermodelle. Eine Einschränkung dieser Studie ist, dass es derzeit keine Post-Perfusion Lebertransplantation beinhaltet. Vorhersage der Funktion nach Organtransplantation kann daher mit Sicherheit gemacht werden. Jedoch die Lebertransplantation Rattenmodell ist gut etabliert und könnte sicherlich in Verbindung mit diesem Modell verwendet werden. Zusammenfassend haben wir eine preiswerte, einfache, leicht replizierbar NEVLP Modell mit Ratten nachgewiesen. Anwendungen dieses Modells zählen testen neuartige Perfusates und Perfusat Zusatzstoffe, Test-Software für Orgel Bewertung und Experimente entwickelt, um Organe zu reparieren.
Introduction
Es gibt 14.578 Patienten auf der Warteliste für eine Lebertransplantation und ca. 7.000 Transplantationen pro Jahr1,2durchgeführt werden. Als Reaktion auf diesen Mangel wichtiger Geber haben die Kriterien für die Leber Geber ausgebaut; Diese werden häufig als marginale Organe oder erweiterte Kriterien Geber und werden voraussichtlich weniger gut nach der Transplantation als Standardkriterien Allografts, mit höheren Raten von primären Graft Dysfunktion und verzögerte Transplantat Funktion3durchführen, 4,5,6. Infolgedessen wurde NEVLP eingeführt, als eine Methode zum bewerten und Ändern von Organ-Funktion6,7. Wir haben einem Rattenmodell der NEVLP entworfen und verwendet dieses Modell eines seine wichtigeren Anwendungsmöglichkeiten – die Prüfung von neuartigen Moleküls Additive zur Leber Perfusat nachweisen.
NEVLP wurde in Murine (Ratte) und Schweinen Modelle sowie in ausrangierten menschlichen Organen6,8,9bewertet. Die Ergebnisse der ersten menschlichen Studien des NEVLP wurden auch kürzlich veröffentlichten10. Obwohl hypothermen Maschine Perfusion der Standard für die Erhaltung der Niere deutlich geworden ist, ist die Temperatur in die Leber, die Maschine Perfusion erfolgen darf nach wie vor umstritten. NEVLP hat viele vorgeschlagene Vorteile im Vergleich zu unterkühlt und Subnormothermic Perfusion. Dazu gehören Verletzungen reduzierte Erhaltung, Wiederherstellung der normalen Organfunktion unter physiologischen Bedingungen, die Fähigkeit, Orgelspiel, zu beurteilen und als Plattform für Orgel Reparatur, Umbau und Änderung7,11 12,13,14,15,16,17.
Eine beträchtliche Anzahl von Studien wurden abgeschlossen mit Schweinen NEVLP Modelle. Obwohl diese Modelle vergleichsweise günstig sind, wenn in Anbetracht Modelle mit menschlichen Organen oder klinischen Studien am Menschen verworfen, sind sie sehr teuer im Vergleich zu unserer kleinen NEVLP Tiermodell. Ein wesentlicher Bestandteil der pro Experiment kostet die Perfusat. Wir sind ein 4 h Perfusion mit 300 mL von Perfusat auf einem relativ niedrigen Kosten abschließen. Darüber hinaus sind die Kosten von kleinen Tieren einschließlich Ratten sehr gering im Vergleich zu den Kosten von Schweinen.
Im Vergleich zu anderen Modellen der NEVLP bei der Ratte das hier vorgestellte Modell ist relativ einfach zu implementieren und hat eine breite Palette von Anwendungen. Die Perfusion Verschaltung ist in Abbildung 1ersichtlich. Die Perfusat beginnt im Perfusat Behälter (1), die eine doppelwandige Wasserbehälter ist. Perfusat gezogen aus dem Reservoir mittels einer Walze Pumpe (2) und in einem Windkessel (3) und dann die Oxygenator (4) geschoben. Der Oxygenator soll für Gegenstrom Gas und Perfusat Flow maximale Gasaustausch zur Verfügung zu stellen. Die Perfusat dann Erlöse zu einer Erwärmung Spule (5) innerhalb die Perfusion Kammer um sicherzustellen, dass bei physiologischen Temperatur und eine Blase-Falle (6), Perfusion von Luftblasen dort zu verhindern sind Pre-Orgel (7) und Post-Orgel (8) Probe Häfen, die dem Perfusat zu ermöglichen abgetastet. Die Perfusat tritt dann die Leber durch die Pfortader-Kanüle. Die Pfortader Kanüle ist ein Druckwächter beigefügt, die die Werte auf der Datenerfassungs-Software-charts. Die Perfusat dann verlässt die Leber durch die IVC-Kanüle und mündet in den Druck-Equalizer-Block (9). Schließlich ist die Perfusat aus dem Druck Block zurück durch die Walze Pumpe gezogen und in den Behälter zu entleeren. Dieses Modell beinhaltet kontinuierliche Perfusion, die Pfortader und überlässt den pulsierender Fluss der leberarterie und Dialyse in einigen anderen Modellen verwendet, von denen jede eine gesonderte und zusätzliche Schaltung erfordert, aber wurden bisher nicht nachgewiesen erforderliche9,13.
Zur Erkundung den Zusatz eines neuartigen therapeutischen Moleküls zu dem Perfusat, wählten wir das Enzym Katalase. Katalase ist eine endogene ROS-Fänger, der die Zellen interne Abwehrmechanismus zur Minderung der Auswirkungen von ROS18gehört. Katalase-Ausdruck wird in hepatischen Ischämie Reperfusion Verletzungen19erhöht. Experimentelle Zugabe von Katalase nachgewiesen, um Ischämie-Reperfusion im Auge, Gehirn und Lunge20,21,22,23,24zu verringern. PEGylierung nachweislich Katalase das Endothel und Hilfe Katalase Aufnahme in Endothelzellen25ausrichten. PEG-CAT hat mit begrenzten Wirksamkeit bei der Verringerung der hepatischen Ischämie-Reperfusion Verletzungen systemisch verabreicht wurde; jedoch vermutet wir, dass26,27,28ergibt sich hinzufügen, dass PEG-CAT, ein isoliertes Organ Perfusion Schaltung zu einer verbesserten führen würde. Hier, wir unsere Basis Perfusat PEG-CAT hinzufügen und seine Fähigkeit unter Beweis stellen Leber Erhaltung Schädigung zu mildern.
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Protocol
Alle Verfahren wurden nach den Richtlinien des institutionellen Animal Care durchgeführt und National Research Council's Guide für die Humane Pflege und Verwendung von Labor Tiere (IACUC) und Zustimmung der Ohio State University IACUC durchgemacht hat.
1. Ersteinrichtung
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Bereiten Sie die Perfusion-Lösung durch die folgende Kombination: 86 mL 25 % Albumin, 184 mL Williams Medien, 30 mL Penicillin/Streptomycin (10 U/mL Penicillin und 0,01 mg/mL Streptomycin), Insulin (50 U/L), Heparin (0,01 U/mL), L-Glutamin (0,292 g/L), und Hydrocortison (0,010 g/L) auf ein Gesamtvolumen von 300 mL. Fügen Sie für die Basis Perfusat und PEG-CAT Group 625 U/mL PEG-Katze.
- Puffer mit Tris (Hydroxymethyl) Aminomethane (THAM) auf pH 7.4 Perfusat-Lösung. Verwenden Sie eine arterielle Blut-Gas-Maschine den Perfusat pH-Wert zu bestätigen.
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Richten Sie die Schaltung (Abbildung 1).
- Schalten Sie das Wasserbad wärmer und setzen Sie ihn auf 37 ° C. Die Orgel-Kammer zum Aufwärmen zu ermöglichen.
- Das Reservoir der gemischten und gepufferten Perfusat Gießen und Umlauf starten.
Hinweis: Die Perfusat erwähnt in diesem Schritt wurde im Schritt 1.1.1 vorbereitet. - Schalten Sie den Sauerstoff Gas (95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid) auf den Fluss Zähler durch die Inline-Oxygenator.
- Schalten Sie die Datenerfassungs-Software und klicken Sie auf "start", um für die Dauer des Experiments zu erfassen.
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Richten Sie das Operationsmikroskop und den OP-Saal (Abbildung 2).
- Schalten Sie alle Geräte inklusive der Erwärmung, elektrokauter, und der Anästhesie und Vitalfunktionen (Herz Rate und Sauerstoffsättigung) Überwachungseinrichtungen.
Hinweis: Die Mikroskop-Einstellungen variieren basierend auf dem Mikroskop verwendet und Komfort des Benutzers angepasst werden können. - Füllen der 10 mL-Anästhesie-Spritze mit 10 mL liquid Isofluran Inhalation (Molekulargewicht 184,5 g/Mol) und in der Anästhesie-Einheit.
- Positionieren Sie eine 0,5 mL Spritze mit Heparin (50 U), chirurgische Instrumente, 4: 0 und 7: 0 Seide Naht, sterilen Wattestäbchen und 4 x 4 cm Vlies Gaze Schwämme angemessen (Abbildung 2).
- Schalten Sie alle Geräte inklusive der Erwärmung, elektrokauter, und der Anästhesie und Vitalfunktionen (Herz Rate und Sauerstoffsättigung) Überwachungseinrichtungen.
- Bereiten Sie die Isofluran-Kammer.
(2) Induktion der Anästhesie
- Tragen Sie die folgenden persönlichen Schutzausrüstung (PSA): Mundschutz, OP-Handschuhe, Einweg-Kleid.
- Wiegen Sie die Ratte.
Hinweis: Wir verwenden Sprague-Dawley Ratten zwischen 250-350 g. - Schalten Sie den Kompressor Sauerstoff und Isofluran. Die Ratte nach wird gewogen, in die Kammer Isoflurane und sichern Sie den Deckel. Anästhesie mit 6 % Isofluran geliefert mit 2 L/min Sauerstoff zu induzieren.
Hinweis: Die genaue Isofluran verwendete Dosis hängt von der spezifischen Anästhesiesystem verwendet wird. - Verwendung elektronischer Clippers Clip des Tieres Abdominal-Haar.
- Ersetzen Sie das Tier in der Isofluran-Kammer.
- Schalten Sie den Anästhesie-Einheit befindet sich im OP-Saal.
- Entfernen Sie die Ratte aus der Isofluran Kammer, wenn Anästhesie vollständig induziert wird. Bestätigen Sie die Tiefe der Narkose mit einer Zehe-Klemme.
(3) die Vergabeverfahren
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Bereiten Sie die 16 G-Portal-Manschette (Abbildung 3).
- Beginnen Sie mit einer 16 G-Angiocatheter. Schneiden Sie einen 7 mm Abschnitt von Schläuchen. Bestimmen Sie den Mittelpunkt des Abschnitts 7 mm durch Messung 3,5 mm. Incise am Mittelpunkt und entfernen Sie die vordere Hälfte der Schläuche zu.
- Nutzen Sie eine Gefäßklemme um diese jetzt flachen Teil zu vernichten. Verwenden Sie ein Feuerzeug, um das andere Ende des Angiocatheter eine Lippe erstellen zu schmelzen. Setzen Sie die Spitze nicht direkt in die Flamme, oder es wird sich entzünden.
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Bereiten Sie die Gallengang-Kanüle.
- Nehmen Sie ein 27 G Angiocath und die Injektion Hafen verlassen nur die Katheter abgeschnitten. Schließen Sie diesen an einen 10 cm Abschnitt der 27 G Rohrdraht Schläuche.
- Positionieren Sie die Ratte mit der Nase in die bugnase Anästhesie und seiner vier Extremitäten immobilisiert. Überwachen Sie die Vitalfunktionen durch Anfügen des Monitors an der hinteren Extremität. Führen Sie eine Zehe Prise um angemessene Tiefe der Narkose zu bestätigen. Anästhesie bei 4 % Isofluran weiter (für Tiere, die wiegen > 250 g).
- Sprühen Sie das Tier Bauch mit 70 % Isopropylalkohol. Trocknen lassen. Legen Sie ein steriles Tuch über das Tier.
- Machen Sie einen Mittellinie Schnitt aus dem Xiphoid auf dem Schambein mit scharfe Schere und erstreckt sich durch die Haut (Abbildung 4). Vorsichtig betreten Sie das Peritoneum und Einschneiden Sie des Muskels. Achten Sie darauf, um eine Beschädigung der Blase in den minderwertigen Aspekt dieser Einschnitt und die Leber in der überlegene Aspekt dieser Einschnitt.
- Erweitern Sie den Schnitt seitlich nach links und rechts ein Kreuz auf der Ebene der unteren Grenze der Leber zu bilden.
- Drehen Sie die Narkose bis zu 2 % (für Tiere mit einem Gewicht von > 250 g).
- Ziehen Sie den Xiphoid Prozeß mit einer gebogenen Moskito-Klemme und die Rippen mit Rippe Retraktoren (Abbildung 5).
- Schneiden Sie die sitzt, phrenicus, und Gastrohepatic Bänder mit einer scharfen Schere.
- Suchen Sie und vernähen der phrenicus Ader mit einer 7-0-Naht als nah an seinen Ursprung wie möglich, um auslaufen zu verhindern.
- Ausweiden Sie die Ratte mit einem sterilen feuchten Baumwolle Spitze Applikator und wickeln Sie den Darm in Gaze mit 0,9 % normale Kochsalzlösung befeuchtet. Achten Sie darauf, nicht um das Gefäßsystem des Dünndarms zu dehnen.
- Sezieren Sie über der unteren Hohlvene (IVC), überschüssiges Gewebe zu entfernen. Hinter der IVC nur überlegen die Bifurkation sezieren Sie und übergeben Sie eine Schleife von einer 4-0 Seide Naht zur späteren Verwendung (Abbildung 6).
- Zurückziehen der rechten Niere um Exposition gegenüber der rechten Nebenniere Ader zu bieten. Ziehen Sie den rechten leberlappen souverän mit Gaze. Binden Sie die rechts Nebennieren Vene mit einer 7-0 Seide Naht so nah wie möglich die IVC und kauterisieren über sie distal die Krawatte (Abbildung 7).
- Sorgfältig zu sezieren Sie, die Milz Vene, binden Sie es mit zwei 7-0 Seide Nähte und es zwischen die beiden Fäden durchziehen.
- Binden Sie und verbinden Sie zusätzliche Adern mit 7: 0 Seide Naht für zusätzliche Länge auf die Pfortader zu, wenn nötig.
Hinweis: Manchmal gibt es kleine Äste von Infrahepatic IVC zwischen der rechten Nebenniere Ader und die minderwertigen Leber. - Um der Gastroduodenal Arterie zu sezieren, binden Sie die Gastroduodenal Arterie mit einer 7-0 Seide Naht und Verbinden der Gastroduodenal Arterie.
- Rund um die leberarterie sezieren Sie und legen Sie dann eine 7-0 Seide Naht Krawatte herum (Abbildung 8).
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Der Gallengang zu sezieren.
- Überprüfen Sie die Länge des gallenganges. Binden Sie den Gallengang am distalen Ende mit einem 7: 0 Seide Naht. Legen Sie eine Schleife von 7-0 Seide Naht um den Gallengang proximal möglich.
- Schneiden Sie ein Loch, das ist der halbe Durchmesser des Kanals mit einer kleinen Schere und 27 G Katheter in den Gallengang proximal. Binden Sie den Katheter mit einer römischen Sandale Tie Naht (Abbildung 9).
- Injizieren Sie 0,5 mL Heparin (50 U) in den Penis Vene oder IVC des Tieres mit einer 27 G Nadel.
Hinweis: Eine 27 G Insulin Spritze kann auch stattdessen verwendet werden. - Klemmen Sie und binden Sie die IVC unter Verwendung der zuvor platzierte 4-0 Seide Naht.
- Binden Sie die leberarterie mit dem zuvor platzierten 7-0 Seide Naht.
- Klemmen Sie aus der Pfortader mittels eines mikrochirurgischen Clips. Cannulate die Pfortader mit einem 22 G Angiocatheter. Die Pfortader mit 60 mL kalte 0,9 % normale Kochsalzlösung mit 1 mL Heparin (100 U) bis die Leber blanches bündig (Abbildung 10).
Hinweis: Wenn die Leber nicht sofort Blanchieren kann es mit sterilen watteträger Tipp massiert werden. - Setzen Sie der Suprahepatic IVC aus und über ihn so hoch in der Brust wie möglich schneiden.
- Führen Sie eine Hepatektomie wie folgt. Schnitt um das Zwerchfell, schneiden die leberarterie, schneiden die IVC, schneiden die Pfortader, zusätzliche Bänder geschnitten und die Leber herausnehmen. Legen Sie die Leber in Eis kalt 0,9 % normale Kochsalzlösung (Abbildung 11).
- Legen Sie eine 16 G vaskuläre Manschette in die Pfortader (Abbildung 12). Legen Sie die Leber auf die ex Vivo normothermic Leber Perfusion Schaltung.
4. Normothermic Leber Perfusion Ex Vivo
Hinweis: Die hier verwendete Perfusat wurde im Protokoll Schritt 1.1.1 vorbereitet.
- Legen Sie die Pfortader-Kanüle in die Handschellen Pfortader (Abbildung 13).
- Während die Pfortader Kanüle Platzierung behalten Sie Informationsfluss Perfusat durch die Schaltung mit 2 mL/min zu starten bei. Sehen Sie den Monitor für alle Spitzen in der Pfortader Druck; Dies kann darauf hindeuten das Gefäß verschlossen werden und Neupositionierung der Kanüle ist notwendig.
- Naht in der IVC Kanüle für den Rückfluss der Perfusat mit einem 7: 0 Seide Naht.
- Sobald beide Kanülen vorhanden sind, beginnen Sie, bis die Strömung bei 1 mL/min drehen, bis Sie ein physiologische Druck im Bereich von 10 – 16 CmH2O erreicht.
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Nehmen Sie eine 1 mL Probe von Pre- und Post-Anschlüsse auf 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 und 240 min. der Perfusion. Teilen Sie 1 mL Probe in zwei 0,5 mL Proben.
Hinweis: 0,5 mL davon wird im Protokoll Schritt 4.5.1 verwendet, und 0,5 mL wird im Protokoll Schritt 4.5.2 verwendet werden.- Snap Einfrieren in flüssigem Stickstoff 0,5 mL dieses Beispiels in kryogenen Röhren.
- Führen Sie eine arterielle Blut Gasanalyse die restliche 0,5 mL Perfusat Verwendung.
- Nach dem Ausführen der Blut-Gas-Analyse zu jedem Zeitpunkt (0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 und 240 min) untersuchen die pH-Werte und Puffern die Perfusat Bedarf pH 7.4 zurückzukehren.
- Zum Ende des 4 h der Perfusion trennen Sie die Leber die Perfusion-Schaltung. Unterteilen Sie die Leber in 0,5 g Segmente. Snap Einfrieren in flüssigem Stickstoff das Lebergewebe in kryogenen Röhren.
5. nach dem Experiment Analyse
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Bestimmen Sie Alanin Aminotransferase (ALT) im Perfusat bei 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 und 240 min mit einem kommerziellen farbmetrischen Assay-Kit.
- In Kürze inkubieren Perfusat mit der Reaktion Mischung Reagenzien bei 37 ° C für 60 min. Maß die optische Dichte bei 570 Werte nm mit einer Mikrotestplatte Reader.
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Homogenisieren Sie 0,5 g des Lebergewebes mit 100 µL der Lyse Puffer zu und analysieren Sie das Gewebe lysate für Adenosintriphosphat (ATP), Glutathion (GSH) und malondialdehyd (MDA).
- Kurz gesagt, Messen Sie die ATP-Werte der Lebergewebe Proben mit einem kommerziellen Assay-Kit. Mischen Sie die Probe mit der Reaktion-Puffer und Inkubation bei Raumtemperatur für 30 min. Maß der optischen Dichte bei 570 nm mit einer Mikrotestplatte Reader.
- Die GSH-Ebenen der Lebergewebe Proben mit einem kommerziellen Assay-Kit zu messen. Mischen Sie die Gewebeproben mit der Assay-Cocktail. Die optische Dichte-Werte bei 405-414 nm zu messen.
- Messen Sie die MDA-Ebenen der Lebergewebe Proben mit einem kommerziellen Assay-Kit. Mischen der Proben mit TBA und Wärme bis 95 ° C für 60 min. Zentrifuge der Reaktionspartner und den überstand auf eine 96-Well-Platte übertragen. Messung die optische Dichte bei 532 nm.
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Homogenisieren Sie 0,5 g des Lebergewebes mit 100 µL der Lyse Puffer zu und analysieren Sie das Gewebe lysate für relative Caspase-3/7-Aktivität mit einem kommerziellen Assay-Kit.
- Lysate Gewebe mit der Caspase-3-7 Reagenz testpuffer vermischen und bei Raumtemperatur für 30 min inkubieren.
- Messung der Fluoreszenz-Ebene in jede gut mit Hilfe eines Mikrotestplatte Lesers.
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Bestimmen Sie den Grad der Apoptotic Zellen in der Leber Gewebeproben mit einem kommerziellen in Situ Tod Detection Kit.
- Vorbehandlung der 0,5 g Gewebe Abschnitte mit 10 U/mL Proteinase K für 10 min und dann mit der Reaktionsmischung bei 37 ° C für 60 min. durchführen der Analyse mit einem fluoreszierenden Mikroskop inkubieren.
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Representative Results
Eine Stichprobengröße von drei Ratten pro Gruppe diente. ALT war bei 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 und 240 min. der Perfusion gemessen. Wir nutzten die Student- t-Tests zum Vergleichen von Ergebnissen zwischen der Basis Perfusat und base Perfusat plus PEG-CAT-Gruppen zu jedem Zeitpunkt. Bei einem Vergleich der Basis Perfusat und base Perfusat plus PEG-CAT Gruppen, gibt es deutlich weniger (p < 0,05) ALT in der Basis Perfusat plus PEG-CAT Group bei 150, 180, 210 und 240 min. (Bild 14A).
Lebergewebe wurde beschafft, um Gewebeschäden aus der Basis Perfusat und base Perfusat plus PEG-CAT Gruppen zu analysieren. Wir nutzten die Student- t-Tests Ergebnisse zwischen der Basis Perfusat und base Perfusat plus PEG-CAT Gruppen zu vergleichen. Gewebe ATP blieb in der Basis Perfusat plus PEG-CAT-Gruppe im Vergleich zu der Basis Perfusat allein Gruppe (Abbildung 14 b, p < 0,05). MDA tissueproduktion war signifikant höher in der Basis Perfusat-Gruppe als in der Basis Perfusat plus PEG-CAT Gruppe (Abbildung 14, p < 0,05). Insgesamt GSH blieb in der Basis Perfusat plus PEG-CAT-Gruppe im Vergleich zu der Basis Perfusat allein Gruppe (Abbildung 14, p < 0,05).
Um Apoptose zu analysieren, wurde Lebergewebe Caspase 3/7 Aktivität zwischen den Gruppen verglichen. Fluoreszenz wurde in jedem Bohrloch gemessen. Wir nutzten die Student- t-Tests Ergebnisse zwischen der Basis Perfusat und base Perfusat plus PEG-CAT Gruppen zu vergleichen. Caspase 3/7 Aktivität wurde in der Basis Perfusat plus PEG-CAT-Gruppe im Vergleich zu der Basis Perfusat allein Gruppe deutlich zurückgegangen (Abb. 15A, p < 0,05). Klemme Deoxynucleotidyl Transferase (TdT) dUTP Nick-End Kennzeichnung (TUNEL) Färbung wurde zur Apoptose zwischen den Gruppen zu vergleichen. Der Anteil der Apoptotic Zellen war deutlich weniger in der Basis Perfusat plus PEG-CAT-Gruppe im Vergleich zur Basis Perfusat allein Gruppe (Abbildung 15 b, p < 0,05).
Abbildung 1: Perfusion Circuit. Komponenten der Schaltung sind beschriftet. Die Perfusat beginnt im Perfusat Behälter (1), die eine doppelwandige Wasserbehälter ist. Perfusat gezogen aus dem Reservoir mittels einer Walze Pumpe (2) und in einem Windkessel (3) und dann die Oxygenator (4) geschoben. Der Oxygenator soll für Gegenstrom Gas und Perfusat Flow maximale Gasaustausch zur Verfügung zu stellen. Die Perfusat fährt dann mit einer Heizwendel (5) in der Perfusion Kammer um sicherzustellen, dass es bei physiologischen Temperatur und eine Blase-Falle (6), Perfusion von Luftblasen zu verhindern. Es gibt Pre-Orgel (7) und Post-Orgel (8) Probe Ports, die die Perfusat zu untersuchenden ermöglichen. Die Perfusat tritt dann die Leber durch die Pfortader-Kanüle. Die Pfortader Kanüle ist ein Druckwächter, regelt den Druck Equalizer (9) beigefügt. Schließlich ist die Perfusat aus dem Druck Block zurück durch die Walze Pumpe gezogen und in den Behälter zu entleeren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: OP-Saal und chirurgischen Instrumenten-Set-up. Das Operationsmikroskop (1) sollte auf die entsprechende Höhe und Vergrößerung des Benutzers angepasst werden. Isofluran kann in die anästhesiemaschine (2) vorinstalliert. Nase des Tieres befindet sich in der Nase Kegel (3). Chirurgische Instrumente sollten angelegt, wo sie leicht zugänglich (4) werden können. Elektrokauterisation (5) ist in der Nähe hilfreich. Nähte (6) sollte sollte so vorgeschnittene Stücke schnell erhalten können, wenn nötig, und extra (7) zur Verfügung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: vorbereiten die Pfortader Manschette 16 G. Beginnen Sie mit einer 16 G-Angiocatheter. Schneiden Sie einen 7 mm Abschnitt von Schläuchen. Bestimmen Sie den Mittelpunkt des Abschnitts 7 mm durch Messung 3,5 mm. Incise hier und entfernen Sie die vordere Hälfte der Schläuche zu. Nutzen Sie eine Gefäßklemme um diese jetzt flachen Teil zu vernichten. Verwenden Sie ein Feuerzeug, um das andere Ende des Angiocatheter eine Lippe erstellen zu verbrennen. Setzen Sie die Spitze nicht direkt in die Flamme, oder es wird sich entzünden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Midline Schnitt. Machen Sie einen Mittellinie Schnitt aus dem Xiphoid (1) das Schambein (2) mit scharfe Schere und erstreckt sich durch die Haut und Muskeln. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: erhalten angemessene Retraktion. Ziehen Sie den Xiphoid-Prozess (1) mit einer gebogenen Moskito-Klemme (2) und die Rippe indem man Rippe Retraktoren (3, 4). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Dissektion der unteren Hohlvene (IVC). Drehen Sie die Leber bis aussetzen der rechten Niere (1) und Pfortader (2). Rund um die IVC (3) sezieren Sie und legen Sie eine Schleife von 7-0 Nahtmaterial für die zukünftige Verwendung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7: Unterbindung der rechten Nebenniere Ader. Zurückziehen Sie die rechte Niere (1) um die Exposition auf der rechten Nebenniere Vene. Binden Sie die rechts Nebennieren Vene und es durchziehen. Eine befeuchtete Gaze (2) kann verwendet werden, zum Schutz der Leber während dieses Manövers. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 8: leberarterie Dissektion. Um zu sezieren Sie und legen Sie eine Krawatte um den hepatischen Arterie (1) in der Nähe wo es unter die Pfortader (2 geht). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 9: Gallengang Kanülierung. Cannulate an den 27 G-Schläuche (3) der Gallengang (1) mit 27 G Angiocatheter (2) angeschlossen. Dies wird helfen, um die Galle während der Perfusion zu sammeln. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 10: Leber Flush. Spülen Sie die Leber (1) mit 60 ccm kaltes 0,9 % normale Kochsalzlösung mit 100 U (1 mL) von Heparin mit einer 16 G-Angiocatheter (2). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 11: nach der Hepatektomie. Führen Sie eine Hepatektomie und Lagern Sie die Leber in kalten Kochsalzlösung. Achten Sie darauf, nicht um die Gallengang Kanüle zu verdrängen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 12: Pfortader abbruchmaschine. Suchen Sie die Pfortader. Verwenden Sie eine große Klammer (1), die Vene eine mehrere Millimeter-Lippe Vene oberhalb der Klemme verlassen zu halten. Verwenden Sie mikrochirurgische Pinzetten (2, 3), um eine 16 G vaskuläre Manschette (4) in die Pfortader zu platzieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 13: Pfortader Manschette und überlegene IVC Kanülierung. Cannulate die Pfortader Manschette (1) und überlegene IVC (2). Große Vorsicht ist geboten, nicht zu die Gallengang Kanüle (3) zu verdrängen. Darüber hinaus achten Sie darauf, nicht die überlegene IVC drehen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 14: Analyse der Gewebeschädigung in base Perfusat und base Perfusat und plus PEG-CAT-Gruppen (N = 3/Gruppe). Fehlerbalken darzustellen Standardabweichung. (A)-Alanin-Aminotransferase (ALT)-Levels. Bei einem Vergleich ALT Ebenen zwischen der Basis Perfusat und base Perfusat plus pegyliertes-Katalase (PEG-CAT) Gruppe, gibt es deutlich weniger ALT in der Basis Perfusat plus PEG-CAT Group bei 150, 180, 210 und 240 min. (p < 0,05). (B) Adenosintriphosphat Niveaus. Gewebe-Adenosintriphosphat (ATP) hielt in der Basis Perfusat plus PEG-CAT-Gruppe im Vergleich zu der Basis Perfusat allein Gruppe (p <0,05). (C) Malondialdehyd-Spiegel. Malondialdehyd (MDA) tissueproduktion war signifikant höher in der Basis Perfusat Gruppe als Gruppe in der Basis Perfusat plus PEG-CAT (p < 0,05). (D) Glutathion-Spiegel. Insgesamt Glutathion (GSH) wurde in der Basis Perfusat plus PEG-CAT-Gruppe im Vergleich zu der Basis Perfusat allein Gruppe beibehalten (p < 0,05). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 15: Analyse der Apoptose in base Perfusat und base Perfusat und plus PEG-CAT-Gruppen (N = 3/Gruppe). Fehlerbalken darzustellen Standardabweichung. (A) Caspase-3/7 Activity.Caspase 3/7 Aktivität wurde in der Basis Perfusat plus PEG-CAT-Gruppe im Vergleich zu der Basis Perfusat allein Gruppe deutlich verringert (p < 0,05). (B) Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT) dUTP Nick-End Kennzeichnung (TUNEL) Färbung. Bilder wurden mit einem 4-fach Fluoreszenz-Mikroskop. Der Anteil der Apoptotic Zellen war deutlich weniger in der Basis Perfusat plus PEG-CAT-Gruppe im Vergleich zur Basis Perfusat (p < 0,05). Grün: Apoptotic Zellen. Blau: nukleare. Skalieren von Balken = 1.000 µm. TUNEL positive Zellen wurden durch das zählen von Zellen aus 4 mikroskopische ZUFALLSFELDER quantifiziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Es gibt ein erheblicher Mangel an Leber Allografts zur Transplantation und Reaktion Spender Kriterien wurden erweiterte1,2,3,4,5. Als Folge der Spender-Knappheit wurde NEVLP eingeführt, als eine Methode zum bewerten und Ändern von Organ-Funktion6,7. Wir haben einem Rattenmodell der NEVLP entwickelt. Darüber hinaus haben wir dieses Modell verwendet, um eine seiner wichtigen potentiellen Anwendungen demonstrieren – die Prüfung von neuartigen Moleküls Additive zur Leber Perfusat. Hier wir die Basis Perfusat PEG-CAT hinzugefügt und demonstriert seine Fähigkeit, Leber Erhaltung Verletzungen zu mindern.
Wichtige Schritte
Die Leber Perfusion Schaltung wurde gekauft und ohne Änderung verwendet. Die Schaltung kann in Abbildung 1visualisiert werden. Das Perfusat Reservoir verwendet ist ein wasserummantelten Container, der verwendet wird, um die Perfusat bei physiologischen Temperatur zu halten. Aus dem Vorratsbehälter wird durch eine Walze gepumpt und schob in einer Kammer Windkessel Perfusat herausgezogen. Diese Kammer hilft, dämpfen die pulsierende Strömung von dem Perfusat und machen es für den Eintritt in die Orgel mehr laminar. Nach der Windkessel Kammer Perfusat fließt, der Oxygenator. Der Oxygenator dürfte für Gegenstrom Gas und Perfusat Fluss bietet maximale Gasaustausch zu dem Perfusat mit 95 % Sauerstoff. Die Perfusat fährt dann mit einem Heizwendel um sicherzustellen, dass es noch physiologische Temperatur erreicht hat. Eine Blase Falle kurz bevor das Organ Perfusion von Luftblasen verhindert. Die Perfusat wird dann aus der Blase-Falle und durch die Kanüle Pfortader in die Leber gepumpt. Die Pfortader Kanüle hat einen kleinen Zweig aus der es für den Druck-Monitor. Der Schlauch zum Sensor sollte mit Flüssigkeit nicht Luft grundiert werden, so gibt es keinen Verlust der Druck auf den Sensor. Nach Sauerstoff das Organ, dem Perfusat fließt aus der Leber durch die minderwertige Vene Kanüle auf eine Druck-Equalizer. Der Druck-Equalizer-Block verhindert, dass über Druckbeaufschlagung der Schaltung oder Orgel. Schließlich ist die Perfusat aus dem Druck Block zurück durch die Walze Pumpe gezogen und in den Behälter zu entleeren.
Vor Beginn jeder Perfusion sollte Sichtprüfung der Schaltung durchgeführt werden, um Schäden oder Anhaftungen an Schaltungsteile oder Schläuche zu identifizieren. Ist eine Ansammlung von Bakterien oder andere Stoffe auf der Rennstrecke, sollte Teile ausgetauscht oder gereinigt, wenn möglich. Als nächstes sollte die Reinigungslösung, die Aufrechterhaltung der internen Komponenten ausgespült werden. Wie die Komponenten der Drucksensor ausgespült wird sind und Druckleitung der Luftblasen mit entionisiertem Wasser gelöscht werden sollte. Zudem sollten Durchfluss eingestellt werden, in regelmäßigen Abständen, um sicherzustellen, dass der Druck entsprechend auf Änderungen reagiert. Wenn der Drucksensor nicht angemessen reagiert, sollten alle Elemente in der Zeile mit dem Sensor überprüft und neu kalibriert bei Bedarf. Zum Jahresbeginn eine Perfusion ist es entscheidend, um sicherzustellen, dass die Gefäße der Leber nicht geknickt oder verdreht, wenn die Leber an den Stromkreis anschließen werden. Wenn diese dort stattgefunden hat wird einen unmittelbaren Druck Spike auf dem Monitor in einem logarithmischen Trend gesehen. Der häufigste Fehler ist ein Knick in der Pfortader mit einer schlecht positionierte Kanüle. Dieses Problem kann behoben werden, durch Bewegung des Schiffes in einer natürlicheren Position leicht heraus ziehen und Begradigung der Pfortader. Der Druckwächter zeigt Lösung dieses Problems mit einem Rückgang der Druck und verbesserte Konsistenz. Als nächstes beim Anschluss der Pfortader-Manschette an der Pfortader Kanüle kann das Schiff behindern Perfusion der Orgel verdreht werden. Anpassung der Manschette und Behebung dieses Fehlers führen einen plötzlichen Anstieg der Pfortader Druck, die dann sofort zu einem niedrigeren Druck und Niveau aus auf einen konstanten Durchfluss zurückgeben sollte. Geknickt oder verdreht IVC kann durch keine Strömung aus der Kanüle und eine Vorwölbung des Schiffes schnell erkannt werden. Beide dieser Fehler in der Vena Cava führt auch ein erhöhter Druck, aber im Gegensatz zu Pfortader Probleme dieser Druck, an der Orgel ausgeübt wird und schnell gelöst werden sollte. Dieses Problem sollte innerhalb von 10 min gelöst werden oder das Experiment abgebrochen werden soll. Eine sofortige Angabe für den Abbruch des Experiments sieht klare Ödem im Organ innerhalb der ersten 20 Minuten.
Wenn es ein Leck von der Leber oder einer der Kanüle Verbindungen werden wichtige Perfusat Reservoir Niveau zu überwachen. Running Out of Perfusat und Pumpen von Luft können das Experiment katastrophal. Sobald Luft in die Leitungen gepumpt wird ist es nicht möglich, das Experiment pausieren und wieder prime die Schlauch-Linien. Die einzig mögliche Korrektur ist für die Blase-Falle, die eingespritzte Luft zu erfassen.
Modifikationen und Fehlerbehebung
Sobald die Schaltung geleert wird der Oxygenator in Zeile gesetzt werden kann und dann kann die Schaltung mit Perfusat grundiert werden. Richtig spülen Luft aus dem Oxygenator kann ein paar Minuten aber ist ein entscheidender Schritt, um sicherzustellen, dass eine Luft-Embolie nicht in der Mitte eine Perfusion erzeugt wird. Nachdem der Oxygenator voll mit Perfusat grundiert ist, die die Blase Falle neben gefüllt werden sollte erfassen Sie Luftblasen bilden. An dieser Stelle sollte die Schaltung fließen zu einem Strom von 1 oder 2 mL/min festgelegt werden, halten die Perfusat bewegt, bis die Leber zur Kanülierung bereitsteht.
Nach der Pfortader und der IVC der Leber Metallspirale, sollte der Druck erhöhen und dann einpendeln. Mit zunehmender Strömung auf einen normalen physiologischen Druck sollten der aufgezeichneten Druck beginnen, in gewissem Sinne ähnlich schrittweise zu erhöhen. Sobald die gewünschte Fördermenge (8 – 16 MmHg) erreicht worden ist sollte der Druck relativ konstant bleiben. Wir streben nach einem Druck von 10 MmHg und die Strömung entsprechend anzupassen. Der erforderliche Durchfluss zu einen Druck von 10 MmHg erreichen variieren je nach Organ. Möglicherweise gibt es ein kleines Leck Perfusat vom Organ kann dieser Perfusat jedoch sammeln und wieder in das Reservoir.
Die Schaltung sollte nach jeder Perfusion zur Erhaltung der Kammer und Stausee und zur Erhaltung der Einweg-Schläuche und Anschlüsse gereinigt werden. Alle Perfusat sollte aus dem Kreislauf entfernt werden. Die Schaltung sollte sofort mit einem Minimum von 300 mL entionisiertem Wasser gespült werden. Während deionisiertes Wasser die Schaltung Schläuche spült sollten die äußeren Teile entsprechend gereinigt werden. Externe Komponenten sollten abgespült oder sanft abgewischt und erlaubt an der Luft trocknen. Schaltungskomponenten sind zerbrechlich und können leicht beschädigt werden. Es ist daher von größter Bedeutung, um es vorsichtig zu reinigen. Die interne Schaltung sollte in einer 5 % igen Lösung von alkalischen Reinigungsmittel in entionisiertem Wasser aufbewahrt werden. Das Waschmittel in der Schaltung hilft, verlängern Sie die Lebensdauer der Schläuche und verhindern Anhaftungen an andere Komponenten wie die Blase Falle und Druck Equalizer.
Die meisten Schwierigkeiten mit der Schaltung können nach jedem Gebrauch mit gründliche Reinigung und Wartung der Schaltung verhindert werden. Dadurch wird sichergestellt, dass gibt es keine Ansammlung von passives Perfusat, die verstopfte Schläuche oder Kanülen führen kann. Schaltungskomponenten und Schläuche sollten regelmäßig inspiziert und Bedarf vor jeder Benutzung sicherstellen, dass keine Kontamination oder Einschränkung im Fluss ersetzt.
Einschränkungen
Eine Einschränkung dieses kleine Tier NEVLP Modell ist, dass es derzeit keine Post-Perfusion Transplantation umfasst. Es ist daher unmöglich, Leber Organfunktion nach der Transplantation zu bewerten. Dies ist ein wichtiger Bereich für die zukünftige Forschung. Darüber hinaus erfordert nutzen die kleinen tierische Schaltung Kenntnisse und Fertigkeiten.
Bedeutung im Hinblick auf bestehende Modelle
Schweine und murinen (Ratte) Modelle der unterkühlt, subnormothermic und normothermic ex Vivo Leber Durchblutung sind in der Literatur beschrieben worden. Obwohl immer noch Kontroverse bezüglich Perfusion Temperatur vorhanden ist, hat sich gezeigt, dass diese Maschine Perfusion Funktion der Leber Transplantationen unabhängig von Temperatur9verbessern kann. Das hier vorgestellte NEVLP-Modell ist einfach, leicht replizierbar, low-cost und hat eine breite Palette von Anwendungen. Dieses Modell beinhaltet keine Dialyse oder pulsierender Durchfluss zu der leberarterie, die bei einigen anderen Modellen enthalten sind, wie sie gezeigt haben, um unnötige9,13Jahre alt sein. Darüber hinaus haben die Ergebnisse der ersten Studien am Menschen mit NEVLP Dies ist eine wirksame Methode zur Erhaltung der Leber gezeigt – daher ist dieses Modell ideal für zukünftige Anwendungen von ex-Vivo Leber Perfusion10testen.
Zukünftige Anwendungen
Eine Vielzahl von Anwendungen der NEVLP wurden in der Literatur vorgeschlagen. Jede davon wird methodisch in Tiermodellen vor dem Test in ausrangierten menschlicher Organe und dann in menschlichen Leber geprüft werden müssen. Das hier vorgestellte Modell ist ideal für diese neuartigen künftige Anwendungen testen, wie es leicht replizierbar ist, überflüssige Schritte beseitigt und kostengünstig ist. Eines der wichtigsten Anwendungsmöglichkeiten dieses Modells ist die demonstriert hier - die Prüfung der neuartige pharmakologische Perfusat Zusatzstoffe. Andere vorgeschlagene Anwendungen umfassen die Reparatur von Organschäden, Entfettung der Leber erlauben steatotic Organtransplantation, Einführung der Hepatitis C Virusresistenz, mesenchymale Stammzellen-Therapie und gentechnische Veränderung Perfusion mit Immunsuppressiva Mittel11,31,32,33,34,35,36,37,38.
Schlussfolgerungen
Zusammenfassend haben wir eine preiswerte und leicht reproduzierbare NEVLP Modell mit Ratten nachgewiesen. Verwendung dieses Modells erfordert sorgfältige Vorbereitung, Übung und wissen, sondern kostengünstig umgesetzt werden kann. Anwendungen dieses Modells zählen Erprobung neuartiger Perfusat Zusatzstoffe, wie in die repräsentativen Ergebnisse zeigte. Zusätzliche Anwendungen dieses Modells gehören Tests Software für Orgel, verschiedene Perfusates und künstliche oder Hämoglobin basierende Sauerstoffträger und Agenten entwickelt, um Organe zu reparieren.
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Disclosures
Alle Autoren Berichten, dass sie keine relevanten Angaben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von NIH T32AI 106704-01A1 und T. Flesch Fonds für Organtransplantation, Perfusion, Engineering und Regeneration an der Ohio State University unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusate | |||
| 8% Albumin | CLS Behring, King of Prussia, PA | 0053-7680-32 | |
| Williams Media | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | W1878 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | P4333 | |
| Insulin | Eli Lilly, Indianapolis, IL | 0002-8215-91 | |
| Heparin | Fresnius Lab, Lake Zurich, IL | C504701 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | G3126 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | H0888 | |
| THAM | Hospira, Inc, | 0409-1593-04 | |
| Polyethylene Glycol - Catalase | Sigma Aldrich | S9549 SIGMA | |
| Personal Protective Equipment | |||
| Surgical Mask | Generic | N/A | |
| Protective Gown | Generic | N/A | |
| Surgical Gloves | Generic | N/A | |
| Liver Procurement | |||
| Sprague-Dawley Rat | Harlan Sprague Dawley Inc. | 250 -350 grams | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Charcoal Canisters | Kent Scientific | SOMNO-2001-8 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | N/A | |
| Pressure-Lok Precision Analytical Syringe | Valco Instruments Co, Inc. | SOMNO-10ML | |
| Electrosurgical Unit | Macan | MV-7A | |
| Warming Pad | Braintree Scientific | HHP2 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
| Isoflurane chamber | Kent Scientific | SOMNO-0530LG | |
| SurgiVet | Isotec | CDS 9000 Tabletop | |
| Oxygen | Praxair | 98015 | |
| Rib retractors | Kent Scientific | INS600240 | |
| GenieTouch | Kent Scientific | GenieTouch | |
| Normal Saline | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
| 4x4 Non-Woven Sponges | Criterion | 104-2411 | |
| Sterile Q-Tips | Henry Schein Animal Health | 1009175 | |
| U-100 27 Gauge Insulin Syringe | Terumo | 22-272328 | |
| 5mL Syringe | BD | REF 309603 | |
| 4-0 Braided Silk Suture | Deknatel, Inc. | 198737LP | |
| 7-0 Braided Silk Suture | Teleflex Medical | REF 103-S | |
| 16 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4252586-02 | |
| 14 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4251717-02 | |
| Bile Duct Cannular Tubing | Altec | 01-96-1727 | |
| Liver Perfusion Circuit Components | |||
| Water Bath Warmer | Lauda Ecoline Staredition | E103 | |
| Data Collection Software | ADInstruments | Labchart 7 | |
| Liver Perfusion Circuit | Harvard Apparatus | 73-2901 | |
| Membrane Oxygenator | Mediac SPA | M03069 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM827B | |
| Gas (95% oxygen and 5% carbon dioxide) | Praxair | 98015 | |
| Organ Chamber | Harvard Apparatus | ILP-2 | |
| 1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube | USA Scientific | 1418-7410 | |
| Mucasol | Sigma-Aldrich | Z637181 | |
| Microsurgical Instruments | |||
| Small Scissors | Roboz | RS-5610 | |
| Large Scissors | S&T | SAA-15 | |
| Forceps - Large Angled | S&T | JFCL-7 | |
| Forceps - Small Angled | S&T | FRAS-15 RM-8 | |
| Clip Applier | ROBOZ | RS-5440 | |
| Scissors - non micro | FST 14958-11 | 14958-11 | |
| Forceps - Straight Tip | S&T | FRS-15 RM8TC | |
| Large Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-02 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-03 | |
| Small Mosquito Clamps | Generic | N/A | |
| Post-Experiment Analysis | |||
| Alanine Aminotransferase (ALT) Activity Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K752 | |
| Adenosine Triphosphate (ATP) Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K354 | |
| Glutathione Assay Kit | Cayman Chemical | 703002 | |
| Lipid Peroxidation (MDA) Assay Kit | Abcam | ab118970 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8090 | |
| POLARstar OMEGA Microplate Reader | BMG LABTECH | N/A |
References
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